RU2000124099A

RU2000124099A - Способ детектирования присутствия мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты в пробе

Info

Publication number: RU2000124099A
Application number: RU2000124099/13A
Authority: RU
Inventors: Мартин Алан ЛИ; Дарио Лайалл ЛЕСЛИ
Original assignee: Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2003-01-10

Claims

1. Способ детектирования присутствия мишеневой последовательности нуклеиновой кислоты в пробе, где указанный способ включает: а) постановку с указанной пробой реакции амплификации с использованием ряда нуклеотидов, по меньшей мере один из которых мечен флуоресцентной меткой; b) контактирование продукта амплификации с зондом в условиях, при которых зонд будет гибридизироваться с указанной мишеневой последовательностью, где указанный зонд включает реакционноспособную молекулу, которая способна поглощать флуоресценцию от указанного меченого флуоресцентной меткой нуклеотида или передавать ему энергию флуоресценции и с) мониторинг флуоресценции указанной пробы.

2. Способ по п. 1, где реакционноспособная молекула поглощает флуоресценцию от указанного меченого флуоресцентной меткой нуклеотида.

3. Способ по п. 2, где реакционноспособная молекула является молекулой-акцептором, которая излучает энергию при определенной длине волн.

4. Способ по п. 3, где молекула-акцептор является родаминовой краской или другими красками такими, как Сy5.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где меченый нуклеотид является меченым урацилом.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где все нуклеотиды, используемые в реакции амплификации, являются мечеными.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где реакция амплификации включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где флуоресценция как меченого нуклеотида, так и реакционноспособной молекулы контролируется и рассчитывается взаимосвязь между эмиссиями.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где зонд присутствует в течение всей реакции амплификации.

10. Способ по п. 9, где сигнал флуоресценции контролируется и результаты используются для определения количества мишеневой последовательности, присутствующей в пробе.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где зонд сконструирован таким образом, что он гидролизуется под действием ДНК-полимеразы, используемой в реакции амплификации.

12. Способ по одному из предшествующих пунктов 1-10, где зонд сконструирован таким образом, что во время фазы наращивания в реакции амплификации, зонд высвобождается интактным из мишеневой последовательности.

13. Способ по п. 12, где реакция амплификации осуществляется при использовании недостающего фермента 5'-3'-экзонуклеазы.

14. Способ по п. 13, где фермент является Stoffle-фрагментом Taq или Pwo.

15. Способ по любому из пп. 12-14, где 3'-конец зонда блокирован фосфорилированием.

16. Способ детектирования амплификации нуклеиновой кислоты, включающий: постановку амплификации нуклеиновой кислоты на мишеневом полинуклеотиде в присутствии: а) полимеразы нуклеиновой кислоты; b) по меньшей мере одного праймера, способного гибридизироваться с указанным мишеневым полинуклеотидом; с) ряда нуклеотидов, по меньшей мере один из которых мечен флуоресцентной меткой и d) олигонуклеотидного зонда, который способен связываться с указанной мишеневой полинуклеотидной последовательностью и который содержит реакционноспособную молекулу, которая способна поглощать энергию флуоресценции от указанного меченого нуклеотида или передавать ему энергию флуоресценции, и мониторинг изменений в флуоресценции во время реакции амплификации.

17. Способ по п. 16, где амплификацию проводят с использованием пары праймеров, которые сконструированы таким образом, что амплифицируется только мишеневая нуклеотидная последовательность внутри цепи ДНК.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где зонд является специфичным либо для сплайс-области РНК или интрона ДНК, так, что детектируется и/или количественно определяется только одна из амплифицированной РНК или амплифицированной ДНК.

19. Способ определения свойства последовательности, где указанный способ включает: а) амплификацию указанной последовательности с использованием ряда нуклеотидов, по меньшей мере один из которых мечен флуоресцентной меткой; b) контактирование продукта амплификации с зондом в условиях, при которых зонд будет гибридизироваться с указанной мишеневой последовательностью, где указанный зонд включает реакционноспособную молекулу, которая способна поглощать флуоресценцию от указанного меченого флуоресцентной меткой нуклеотида или передавать ему энергию флуоресценции и с) мониторинг флуоресценции указанной пробы и определение конкретного условия реакции, свойства указанной последовательности, при которых изменяется флуоресценция в результате гибридизации зонда с пробой или дестабилизации дуплекса, образованного между зондом и мишеневой последовательностью нуклеиновой кислоты.

20. Способ детектирования полиморфизмов и/или аллельной вариации, где указанный способ включает амплификацию последовательности, подозреваемой на содержание указанного полиморфизма или вариации, при использовании способа по п. 1, определение температуры, при которой зонд плавится из продукта амплификации при использовании образованного сигнала флуоресценции и соотнесение этого к наличию полиморфизма или аллельной вариации.

21. Набор для использования в способе по любому из предшествующих пунктов, который включает зонд, специфичный для мишеневой нуклеотидной последовательности, который содержит реакционноспособную молекулу, и меченый флуоресцентной меткой нуклеотид, который совместим с указанной реакционноспособной молекулой.