BR112020026394A2

BR112020026394A2 - método, sistema e aparelho de detecção

Info

Publication number: BR112020026394A2
Application number: BR112020026394-0A
Authority: BR
Inventors: Boyan Boyanov; Sergio Peisajovich; Jeffrey G. Mandell
Original assignee: Illumina, Inc.
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-03-23
Also published as: CN112689760A; IL279519A; CA3103296A1; MX2020014061A; TWI753333B; AU2019403889A1; SG11202012396QA; WO2020131352A1; PH12020552296A1; US11782006B2; TW202032118A; US20200200693A1; IL279519B1; KR20210095796A; JP2022510063A; EP3899542A4; EP3899542A1

Abstract

Um sistema de detecção inclui um sensor de carga incluindo dois eletrodos e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos. O sistema de detecção também inclui uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor. A molécula carregada inclui um sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um marcador de um nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento é ligado ao marcador. A configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada. O sistema de detecção inclui, adicionalmente, uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada.

Description

SISTEMAS DE DETECÇÃO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Número de Série U.S. 62/783.951, depositado em 21 de dezembro de 2018; o conteúdo do qual é incorporado a título de referência à presente invenção em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0002] Vários protocolos em pesquisa biológica ou química envolvem a realização de um grande número de reações controladas em superfícies de suporte locais ou dentro de câmaras de reação predefinidas. As reações designadas podem, então, ser observadas ou detectadas, e a análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar propriedades de substâncias químicas envolvidas na reação. Em alguns exemplos, as reações controladas geram fluorescência e, desse modo, um sistema óptico pode ser usado para detecção. Em outros exemplos, as reações controladas alteram a carga, condutividade ou alguma outra propriedade elétrica e, desse modo, um sistema eletrônico pode ser usado para detecção.

INTRODUÇÃO

[0003] Um primeiro aspecto revelado na presente invenção é um sistema de detecção que compreende um sensor de carga incluindo: dois eletrodos e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: inclui um sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma etiqueta de um nucleotídeo marcado, tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada, e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento é ligado ao marcador, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada.

[0004] Em um exemplo deste primeiro aspecto, a molécula carregada é um aptâmero carregado. Neste exemplo, o aptâmero carregado é selecionado a partir do grupo que consiste em um aptâmero de DNA, um aptâmero de RNA e um análogo do mesmo.

[0005] Em um exemplo deste primeiro aspecto, a molécula carregada é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína carregada e um peptídeo carregado.

[0006] Em um exemplo deste primeiro aspecto, a molécula carregada: inclui, ainda, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta de um segundo nucleotídeo marcado e tem uma segunda conformação favorecida associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento é ligado ao segundo marcador; inclui, ainda, um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma terceiro etiqueta de um terceiro nucleotídeo marcado e tem uma terceira conformação favorecida associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento é ligado ao terceiro marcador; e inclui, ainda, um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta de um quarto nucleotídeo marcado e tem uma quarta conformação favorecida associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento é ligado ao quarto marcador; e a conformação favorecida não ligada associada à configuração de carga não ligada ocorre quando cada um dentre o sítio de reconhecimento, o segundo sítio de reconhecimento, o terceiro sítio de reconhecimento e o quarto sítio de reconhecimento não é ligado.

[0007] Em um exemplo deste primeiro aspecto, o sistema de detecção compreende, ainda, uma segunda molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a segunda molécula carregada: inclui um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta de um segundo nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada de segunda molécula carregada associada a uma configuração de carga não ligada de segunda molécula carregada; e tem uma conformação favorecida de segunda molécula carregada associada a uma configuração de carga de segunda molécula carregada quando o segundo sítio de reconhecimento é ligado ao segundo marcador. Neste exemplo, o sistema de detecção também pode compreender, ainda, uma terceira molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a terceira molécula carregada: inclui um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma terceira etiqueta de um terceiro nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada de terceira molécula carregada associada a uma configuração de carga não ligada de terceira molécula carregada; e tem uma conformação favorecida de terceira molécula carregada associada a uma configuração de carga de terceira molécula carregada quando o terceiro sítio de reconhecimento é ligado ao terceiro marcador; e uma quarta molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a quarta molécula carregada: inclui um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta de um quarto nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada de quarto molécula carregada associada a uma configuração de carga não ligada de quarta molécula carregada; e tem uma conformação favorecida de quarta molécula carregada associada a uma configuração de carga de quarta molécula carregada quando o quarto sítio de reconhecimento é ligado ao quarto marcador.

[0008] Em um exemplo deste primeiro aspecto, a molécula carregada inclui,

ainda, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta de um segundo nucleotídeo marcado e tem uma segunda conformação favorecida associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento é ligado ao segundo marcador; e o sistema de detecção compreende, ainda, uma segunda molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a segunda molécula carregada: inclui um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma terceira etiqueta de um terceiro nucleotídeo marcado, e um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta de um quarto nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada de segunda molécula carregada associada a uma configuração de carga não ligada de segunda molécula carregada; tem uma terceira conformação favorecida associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento é ligado ao terceiro marcador; e tem uma quarta conformação favorecida associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento é ligado ao quarto marcador.

[0009] Em um exemplo deste primeiro aspecto, a molécula carregada inclui, ainda, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta do nucleotídeo marcado.

[0010] Deve-se entender que quaisquer recursos do sistema de detecção revelado na presente invenção podem ser combinados entre si de qualquer modo e/ou configuração desejável.

[0011] Um segundo aspecto revelado na presente invenção é um aparelho de captação que compreende uma célula de fluxo, e um sistema de detecção integrado à célula de fluxo, o sistema de detecção inclui um sensor de carga incluindo um canal eletricamente condutor; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando um sítio de reconhecimento da molécula carregada é ligado a uma etiqueta de um nucleotídeo marcado, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada.

[0012] Em um exemplo deste segundo aspecto, o aparelho de captação compreende, ainda, um sistema de entrega de reagente para introduzir, seletivamente, um reagente em uma entrada da célula de fluxo. Em alguns exemplos, o reagente está em um recipiente de amostra, o reagente inclui o nucleotídeo marcado, incluindo: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato do nucleotídeo; e uma etiqueta específica de sítio de reconhecimento ligada à molécula de ligação.

[0013] Em um exemplo deste segundo aspecto, o aparelho de captação compreende, ainda, um detector para detectar uma resposta do sensor de carga.

[0014] Deve-se entender que quaisquer recursos do aparelho de captação podem ser combinados entre si de qualquer modo desejável. Além disso, deve-se entender que qualquer combinação de recursos do sistema de detecção e/ou do aparelho de captação pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dentre os exemplos revelados na presente invenção.

[0015] Um terceiro aspecto revelado na presente invenção é um método que compreende introduzir uma cadeia polinucleotídica de molde a um sistema de detecção incluindo: um sensor de carga incluindo dois eletrodos e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada inclui um sítio de reconhecimento; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada; introduzir reagentes que incluem nucleotídeos marcados ao sistema de detecção, em que um nucleotídeo de um dentre os nucleotídeos marcados se associa à polimerase e a uma etiqueta específica de sítio de reconhecimento do um dentre os nucleotídeos marcados se associa ao sítio de reconhecimento para induzir uma mudança conformacional da molécula carregada; e, em resposta à mudança conformacional da molécula carregada, detectar uma resposta do sensor de carga.

[0016] Em um exemplo deste terceiro aspecto, o método compreende, ainda, associar a resposta do sensor de carga ao marcador específica de sítio de reconhecimento associada; e com base na etiqueta específica de sítio de reconhecimento associada, identificar o nucleotídeo do um dentre os nucleotídeos marcados.

[0017] Em um exemplo deste terceiro aspecto, a molécula carregada inclui uma pluralidade de sítios de reconhecimento diferentes, cada um é para ligar, reversivelmente, uma etiqueta diferente de um nucleotídeo marcado diferente em uma taxa distinta. Em alguns exemplos, o método compreende, ainda, detectar uma pluralidade de respostas do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando diferentes nucleotídeos marcados se associam, respectivamente, à polimerase e diferentes etiquetas específicas de sítio de reconhecimento dos diferentes nucleotídeos marcados se ligam, respectivamente, a um dentre a pluralidade de diferentes sítios de reconhecimento; e identificar os diferentes nucleotídeos marcados respectivamente associados pelas taxas distintas.

[0018] Em um exemplo deste terceiro aspecto, o sítio de reconhecimento é para ligar, reversivelmente, uma pluralidade de diferentes etiquetas de uma pluralidade de diferentes nucleotídeos marcados em uma pluralidade de taxas distintas, e em que o método compreende, ainda: detectar uma pluralidade de respostas do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando pelo menos alguns dos diferentes nucleotídeos marcados se associam, respectivamente, à polimerase e pelo menos algumas dentre as diferentes etiquetas se ligam, respectivamente, ao sítio de reconhecimento; e identificar os diferentes nucleotídeos marcados respectivamente associados pelas taxas distintas.

[0019] Em um exemplo deste terceiro aspecto, o sítio de reconhecimento é para ligar, reversivelmente, até quatro nucleotídeos marcados diferentes, e em que o método compreende, ainda: detectar até quatro respostas diferentes do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando até quatro nucleotídeos marcados diferentes se associam, respectivamente, à polimerase e ao sítio de reconhecimento, em que cada um dentre até quatro respostas diferentes tem uma magnitude distinta; e identificar os nucleotídeos marcados diferentes respectivamente associados pelas magnitudes distintas.

[0020] Deve-se entender que quaisquer recursos do método podem ser combinados entre si de qualquer modo desejável. Além disso, deve-se entender que qualquer combinação de recursos do método e/ou do sistema de detecção e/ou do aparelho de captação pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dentre os exemplos revelados na presente invenção.

[0021] Um quarto aspecto revelado na presente invenção é um sistema de detecção que compreende um sensor de carga incluindo: dois eletrodos e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: inclui um sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma etiqueta de um nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento é ligado ao marcador, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada a pelo menos um dentre os dois eletrodos ou a um substrato no qual o sensor de carga é posicionado.

[0022] Em um exemplo do quarto aspecto, o substrato é um substrato padronizado, em que o sensor de carga é posicionado em uma depressão do substrato padronizado, e em que a polimerase é ligada a uma superfície da depressão.

[0023] Deve-se entender que quaisquer recursos deste sistema de detecção podem ser combinados entre si de qualquer modo desejável. Além disso, deve-se entender que qualquer combinação de recursos deste sistema de detecção e/ou do método e/ou do outro sistema de detecção e/ou do aparelho de captação pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dentre os exemplos revelados na presente invenção.

[0024] Um quinto aspecto revelado na presente invenção é um aparelho de captação, que compreende uma célula de fluxo; e um sistema de detecção integrado à célula de fluxo, o sistema de detecção inclui: um sensor de carga incluindo um canal eletricamente condutor; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando um sítio de reconhecimento da molécula carregada é ligado a uma etiqueta de um nucleotídeo marcado, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada a pelo menos um dentre os dois eletrodos ou a um substrato da célula de fluxo.

[0025] Em um exemplo do quinto aspecto, o substrato é um substrato padronizado, em que o sensor de carga é posicionado em uma depressão do substrato padronizado, e em que a polimerase é ligada a uma superfície da depressão.

[0026] Deve-se entender que quaisquer recursos deste aparelho de captação podem ser combinados entre si de qualquer modo desejável. Além disso, deve-se entender que qualquer combinação de recursos deste aparelho de captação e/ou do método e/ou sistemas de captação e/ou do outro aparelho de captação pode ser usada em conjunto, e/ou combinada com qualquer um dentre os exemplos revelados na presente invenção.

[0027] Ainda de modo adicional, deve-se entender que quaisquer recursos de qualquer um dentre os métodos e/ou de qualquer um dentre os sistemas de captação e/ou qualquer um dentre os aparelhos de captação podem ser combinados entre si de qualquer modo desejável, e/ou podem ser combinados com qualquer um dentre os exemplos revelados na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] Os recursos de exemplos da presente invenção se tornarão evidentes a título de referência à descrição detalhada a seguir e desenhos, em que referências numéricas iguais correspondem a componentes similares, talvez não idênticos. Por questão de concisão, referências numéricas ou recursos que têm uma função previamente descrita podem ou não ser descritos em conexão com outros desenhos em que os mesmos aparecem.

[0029] A Figura 1A é um diagrama esquemático de um exemplo de um sensor revelado na presente invenção, tanto quando a molécula carregada está em sua conformação favorecida não ligada (mostrada em “(i)") quanto sua conformação favorecida (mostrada em “(ii)”);

[0030] A Figura 1B é um diagrama esquemático de outro exemplo de um sensor revelado na presente invenção, tanto quando a molécula carregada está em sua conformação favorecida não ligada (mostrada em “(i)") quanto sua conformação favorecida (mostrada em “(ii)”);

[0031] A Figura 2 é um diagrama esquemático de outro exemplo de um sensor revelado na presente invenção;

[0032] As Figuras 3A a 3E são diagramas esquemáticos que ilustram outro exemplo de um sensor incluindo uma molécula carregada que tem quatro sítios de reconhecimento diferentes;

[0033] A Figura 4 é um diagrama esquemático em perspectiva de um exemplo de um sistema de detecção incluindo uma célula de fluxo e um exemplo do sensor revelado na presente invenção;

[0034] A Figura 5 ilustra, de forma esquemática, um exemplo de um método revelado na presente invenção;

[0035] As Figuras 6A e 6B são gráficos que ilustram respostas potenciais dos sensores revelados na presente invenção;

[0036] A Figura 7A é uma vista de topo de outro exemplo de uma célula de fluxo; e

[0037] A Figura 7B é uma vista ampliada e parcialmente em recorte de um exemplo de sensores posicionados na arquitetura da célula de fluxo da Figura 7A.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0038] Um sistema de detecção é revelado na presente invenção que pode ser usado para detecção de única molécula em procedimentos de sequenciamento de ácido nucleico. O sistema de detecção inclui uma porção química carregada ligada a um canal eletricamente condutor de um sensor de carga. A porção química carregada é ligada ao canal eletricamente condutor de tal modo que não é detectada até que um evento ocorra (por exemplo, ligação de uma etiqueta-alvo) que reconfigura a porção química carregada para ser detectável pelo sensor de carga. Mais especificamente, a porção química carregada tem a capacidade de ser submetida à ligação reversível com uma etiqueta-alvo que é ligada a um nucleotídeo que tem a capacidade de ser incorporado por uma polimerase. Como resultado da ligação da etiqueta-alvo com a porção química de carga, a porção química ligada carregada é submetida a uma mudança de conformação que altera a distribuição espacial das cargas. Devido à proximidade da porção química carregada em relação ao canal eletricamente condutor no sensor de carga, o sensor de carga responde às cargas recém-apresentadas e produz um sinal detectável. O sinal detectável é produzido até mesmo em concentrações biologicamente relevantes ou fisiológicas de íons de sal, em que os comprimentos de triagem Debye são tipicamente menores que 1 nm. Conforme exemplos, uma conformação que move uma porção química negativamente carregada para mais perto do canal eletricamente condutor pode diminuir a transcondutância, enquanto uma conformação que move a porção química negativamente carregada para longe do canal eletricamente condutor pode aumentar a transcondutância. Como tal, as conformações diferentes de porção química carregada resultam em sinais detectáveis distintos. Visto que as cargas detectáveis residem na porção química carregada, cargas não precisam residir na etiqueta-alvo, que pode ser vantajoso.

[0039] Nos exemplos revelados na presente invenção, uma etiqueta-alvo pode ser adaptada para um nucleotídeo particular que tem a capacidade de ser incorporado por uma polimerase. Visto que a etiqueta-alvo induz uma mudança conformacional desejada na porção química carregada, o sinal resultante pode ser usado para identificar um nucleotídeo particular. Além disso, além da magnitude de carga, as taxas de ativação e desativação entre etiquetas-alvo e uma ou mais porções químicas carregadas podem ser usadas para gerar sinais de padrão único que se manifestam com frequências únicas, que podem ser usados para identificar respectivos nucleotídeos ligados às etiquetas-alvo.

[0040] Referindo-se às Figuras 1A e 1B, dois exemplos do sistema de detecção 10, 10’ são retratados respectivamente. Cada um dentre os sistemas de captação 10, 10’ inclui um sensor de carga 11, 11’, incluindo dois eletrodos 12, 14 e um canal eletricamente condutor 16 conectando os dois eletrodos 12, 14. Os sistemas de captação 10, 10’ também incluem uma molécula carregada 18 ou 18’ ligada ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’, e uma polimerase 20 ligada ao canal eletricamente condutor 16 (Figura 1A) ou à molécula carregada 18’ (Figura 1B).

[0041] Em outros exemplos do sistema de detecção, a polimerase 20 pode ser ligada a outros componentes do sistema de detecção 10, 10’ (por exemplo, a um eletrodo 12 ou 14) e/ou a outros componentes de uma célula de fluxo em que o sistema de detecção 10, 10’ é integrado. A polimerase 20 pode ser ligada a qualquer área adjacente ao sensor de carga 11, 11’ desde que uma etiqueta de um nucleotídeo sendo incorporado pela polimerase 20 possa ser ligada, reversivelmente, à molécula carregada 18 ou 18’. Em alguns exemplos, a polimerase 20 é ligada dentro de uma distância de cerca de 5 nm a cerca de 50 nm da molécula carregada 18 ou 18’.

[0042] O sensor de carga 11, 11’ pode ser um transistor de efeito de campo (FET), tal como um FET à base de nanotubo de carbono (CNT), FET à base de nanotubo de carbono de parede única (SWNT), FET de nanofio de silício (SiNW), FET de nanotubo de silício, um FET de nanofio de polímero, um FET de nanofita de grafeno (e FETs de nanofita relacionados fabricados a partir de materiais 2D, tais como MoS2, siliceno, etc.), um FET semicondutor de óxido de metal (MOSFET), um FET de túnel (TFET) ou qualquer outro dispositivo com condutância que pode ser modulado por um campo externo, por exemplo, um CNT metálico ou um CNT de múltiplas paredes. No FET, os eletrodos 12, 14 são os terminais de fonte e drenagem e o canal eletricamente condutor 16 é o terminal de porta. O transistor de efeito de campo pode ser um PMOS, ou canal p, que tem terminais de fonte e drenagem do tipo p em um substrato do tipo n, ou um NMOS, ou canal n, que tem terminais de fonte e drenagem do tipo n em um substrato do tipo p.

[0043] Os eletrodos 12, 14 podem compreender qualquer material condutor adequado. Exemplos de materiais de fonte e drenagem adequados incluem cobalto, siliceto de cobalto, níquel, siliceto de níquel, alumínio, tungstênio, cobre, titânio, molibdênio, óxido de índio estanho (ITO), óxido de índio zinco, ouro, platina, carbono, etc.

[0044] O canal eletricamente condutor 16 pode ser uma nanoestrutura que tem pelo menos uma dimensão na nanoescala (na faixa de 1 nm a menos de 1 µm). Em um exemplo, a pelo menos uma dimensão se refere à maior dimensão.

[0045] O canal eletricamente condutor 16 também pode ter qualquer geometria adequada, tal como uma estrutura tubular, uma estrutura de fio, uma estrutura plana, etc., e pode ser de qualquer material semicondutor ou condutor adequado. Conforme exemplos, o canal eletricamente condutor 16 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em uma nanoestrutura semicondutora, uma nanoestrutura de grafeno, uma nanoestrutura metálica, uma nanoestrutura de polímero condutor ou um fio molecular. Em alguns exemplos, a nanoestrutura pode ser um nanotubo de única ou múltiplas paredes, um nanofio, uma nanofita, etc. Conforme exemplos específicos, a nanoestrutura pode ser um nanotubo de carbono, um nanotubo de carbono de parede única, um nanofio de silício, um nanotubo de silício, um nanofio de polímero, uma nanofita de grafeno, uma nanofita de MoS2, uma nanofita de silício, etc.

[0046] No sistema 10, 10’, a molécula carregada 18, 18’ é ligada, de modo covalente ou não covalente, ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’. A molécula carregada 18, 18’ pode ser ligada diretamente ao canal eletricamente condutor 16, ou pode ser ligada indiretamente ao canal eletricamente condutor 16 através de um tirante (tether). A fixação da molécula carregada 18, 18’ mantém a molécula carregada 18, 18’ nas proximidades, por exemplo, dentro de algum comprimento de Debye, do canal eletricamente condutor 16. Qualquer molécula carregada adequada 18, 18’ pode ser usada que pode ser submetida à ligação reversível com uma etiqueta-alvo 24 de um nucleotídeo marcado 26. Mais particularmente, a molécula carregada 18, 18’ inclui um sítio de reconhecimento 28 que tem a capacidade de se ligar, reversivelmente, ao marcador 24, tem uma conformação favorecida não ligada A associada a uma configuração de carga não ligada (consulte a porção superior (com referência (i))

em cada uma dentre a Figura 1A e a Figura 1B), e tem uma conformação favorecida B associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento 28 é ligado ao marcador 24 (consulte a porção inferior (com referência (ii) em cada uma dentre a Figura 1A e a Figura 1B)).

[0047] O termo “conformação favorecida não ligada” se refere a uma disposição espacial que é preferencialmente exibida pela molécula carregada 18, 18’ quando a etiqueta 24 não é ligada à mesma. A molécula carregada 18, 18’ pode se mover dinamicamente entre algumas conformações diferentes quando a etiqueta 24 não é ligada. Entretanto, a molécula carregada 18, 18’ tem uma disposição espacial preferencial que é exibida com mais frequência do que as outras disposições espaciais quando a etiqueta-alvo 24 não é ligada. Neste exemplo, essa disposição espacial preferencial (ou disposição espacial preferencialmente exibida) é a disposição mais provável, por exemplo, devido à estabilidade de molécula e/ou ser seu mais baixo estado de energia e, desse modo, é a conformação favorecida não ligada A. A conformação favorecida não ligada A pode ser, em alguns casos, a conformação mais estável e/ou a conformação de energia mais baixa.

[0048] A conformação favorecida não ligada A é associada a uma configuração de carga não ligada. A configuração de carga não ligada é a distribuição das cargas da molécula carregada 18, 18’ quando a mesma está em sua conformação favorecida não ligada A.

[0049] O termo “conformação favorecida” se refere a uma disposição espacial que é preferencialmente exibida pela molécula carregada 18, 18’ quando a etiqueta 24 é ligada, reversivelmente, à mesma. A conformação favorecida B da molécula carregada 18, 18’ é diferente da conformação favorecida não ligada A. Quando a molécula-alvo se liga à molécula carregada 18, 18’, a molécula carregada 18, 18’ se move para uma disposição espacial preferencial que é exibida com mais frequência do que as outras disposições espaciais quando a etiqueta-alvo é ligada. Neste exemplo, essa disposição espacial preferencial é a disposição mais provável, por exemplo, devido à estabilidade de molécula, quando a etiqueta-alvo é ligada e, desse modo, é a conformação favorecida. Em um exemplo, a molécula carregada 18, 18’ tem múltiplas conformações em equilíbrio, e a etiqueta 24 tem a capacidade de estabilizar uma das conformações.

[0050] A conformação favorecida B é associada a uma configuração de carga. A configuração de carga é a distribuição das cargas da molécula carregada 18, 18’ quando a mesma está em sua conformação favorecida B. A configuração de carga associada à conformação favorecida B é diferente, de forma detectável, da configuração de carga não ligada. A configuração de carga pode ser detectável (pelo sensor de carga) como uma magnitude aumentada ou diminuída, ou uma mudança de frequência, etc.

[0051] Conforme mencionado, a etiqueta 24 do nucleotídeo marcado 26 tem a capacidade de se ligar, reversivelmente, ao sítio de reconhecimento 28. Como tal, o sítio de reconhecimento 28 é um receptor temporário para a etiqueta 24.

[0052] As porções superiores (etiquetadas (i)) da Figura 1A e Figura 1B mostram a molécula carregada 18, 18’ na conformação favorecida não ligada A. Conforme mencionado na presente invenção, a conformação favorecida não ligada A se refere à orientação preferencial ou disposição espacial da molécula carregada 18, 18’ quando o sítio de reconhecimento 28 não tem a etiqueta 24 ligada à mesma. A conformação não ligada A (mostrada em (i) na Figura 1A e Figura 1B) é associada a uma configuração de carga não ligada. A configuração de carga não ligada é a distribuição das cargas da molécula carregada 18, 18’ quando a mesma está em sua conformação favorecida não ligada A. Na Figura 1A e na Figura 1B, o centroide da distribuição de carga é mostrado como “•” e a distância entre o centroide de carga e a superfície do canal eletricamente condutor 16 é mostrada como “δ 18A” (Figura 1A) e “δ18’A” (Figura 1B). Conforme ilustrado nessas figuras, a distribuição de carga, o centroide e a distância δ18A, δ18’A são diferentes para cada molécula carregada 18, 18’, e podem ser alterados quando a molécula carregada 18, 18’ se liga ao marcador-alvo 24.

[0053] As porções inferiores (etiquetadas (ii)) da Figura 1A e Figura 1B mostram a molécula carregada 18, 18’ na conformação favorecida B, isto é, quando a etiqueta-alvo 24 é ligada ao sítio de reconhecimento 28. Conforme mencionado na presente invenção, a conformação favorecida B (mostrada em (ii) na Figura 1A e na Figura 1B) se refere à orientação preferencial ou disposição espacial da molécula carregada 18, 18’ quando a etiqueta 24 é ligada ao sítio de reconhecimento 28. A conformação favorecida B é associada a uma configuração de carga. A configuração de carga é a distribuição das cargas da molécula carregada 18, 18’ quando a mesma está em sua conformação favorecida B. Na Figura 1A(ii), a conformação favorecida B da molécula carregada 18 move a molécula carregada 18 para mais perto da superfície do canal eletricamente condutor 16 quando comparado à conformação favorecida não ligada A. Neste exemplo da conformação favorecida B, δ18B é menor do que δ18A e as cargas negativas ou positivas da molécula carregada 18 estão mais próximas ao canal eletricamente condutor 16. Na Figura 1B(ii), a conformação favorecida B da molécula carregada 18’ move a molécula carregada 18’ para longe da superfície do canal eletricamente condutor 16 quando comparado à conformação favorecida não ligada A. Neste exemplo da conformação favorecida B, δ18’B é maior do que δ18’A e as cargas negativas ou positivas da molécula carregada

18 estão mais distantes do canal eletricamente condutor 16. A condutividade do canal eletricamente condutor 16 muda em resposta ao movimento da carga da molécula carregada 18, 18’. Nos exemplos revelados na presente invenção, o sinal da mudança nas duas direções de movimento são opostos um ao outro; e o sinal real depende da natureza do sistema de detecção 10, 10’. Conforme exemplos, o sinal da resposta e repulsão ou retração depende de o sensor de carga 11, 11’ ser um FET e, se for um FET, se o FET está no modo depleção ou inversão, e se os carreadores de canal são elétrons e orifícios.

[0054] A molécula carregada 18, 18’ pode ser um aptâmero carregado, uma proteína carregada ou um peptídeo carregado. Conforme usado na presente invenção, o termo “aptâmero carregado” se refere a um ácido nucleico estruturado e carregado com a capacidade de: 1) se ligar, reversivelmente, a uma etiqueta, e 2) mudar sua conformação favorecida e, desse modo, a distribuição de cargas, mediante ligação reversível com a etiqueta; o termo “proteína carregada” se refere a uma macromolécula estruturada e carregada com a capacidade de: 1) se ligar, reversivelmente, a uma etiqueta, e 2) mudar sua conformação favorecida e, desse modo, a distribuição de cargas, mediante ligação reversível com a etiqueta; e o termo “peptídeo carregado” se refere a uma cadeia curta estruturada e carregada de monômeros de aminoácido ligados por ligações peptídicas (amida): 1) se ligar, reversivelmente, a uma etiqueta, e 2) mudar sua conformação favorecida e, desse modo, a distribuição de cargas, mediante ligação reversível com a etiqueta.

[0055] Em alguns exemplos, a molécula carregada 18, 18’ é carregada negativamente. Exemplos de moléculas negativamente carregadas adequadas 18, 18’ incluem aptâmeros negativamente carregados, proteínas negativamente carregadas, peptídeos negativamente carregados e outras moléculas negativamente carregadas. Alguns exemplos específicos de aptâmeros negativamente carregados incluem aptâmeros de DNA, aptâmeros de RNA ou análogos dos mesmos. Alguns exemplos específicos de proteínas negativamente carregadas incluem HSF1 (-17), SHFM1 (-21), NFKBIA (-25), RBBP4 (-26), APP (-55), PJA2 (-87) e muitas outras. Exemplos de peptídeos negativamente carregados incluem poliglutamato e poliaspartato, bem como peptídeos mais estruturados, tais como bobinas em espiral com superfícies negativamente carregadas.

[0056] Em alguns exemplos, a molécula carregada é carregada positivamente. Exemplos de moléculas carregadas positivamente adequadas 18, 18’ incluem aptâmeros positivamente carregados, proteínas positivamente carregadas, peptídeos positivamente carregados e outras moléculas positivamente carregadas. Alguns exemplos específicos de proteínas positivamente carregadas incluem H2AFX (+17), PARP1 (+21), ELN (+40), TERT (+98) e muitas outras. Exemplos de peptídeos positivamente carregados incluem polilisina e poliarginina, bem como peptídeos mais estruturados, tais como bobinas em espiral com superfícies positivamente carregadas.

[0057] Em um exemplo, a molécula carregada 18, 18’ não é uma polimerase.

[0058] A molécula carregada 18, 18’ pode ser ligada ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’ direta ou indiretamente e/ou através de ligação covalente ou ligação não covalente. O tipo de ligação formada entre a molécula carregada 18, 18’ e o canal eletricamente condutor 16 dependerá da molécula 18, 18’ e canal 16 usados. Quando um aptâmero é usado como a molécula carregada 18, 18’, o canal eletricamente condutor 16 pode ser silanizado para gerar silanos terminados em amina, que podem se ligar a aptâmeros tiolados. Outros exemplos de química de superfície adequada que pode ser usada para ligar a molécula carregada 18, 18’ podem incluir (hidrocloreto de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC), diarilciclooctina (DBCO), azidas que podem ser submetidas à reação de click catalisada com cobre, etc. Em outros exemplos, um tirante (tether) pode ser usado para fixar a molécula carregada 18, 18’ ao canal eletricamente condutor 16. Esse tirante (tether) pode ser qualquer um dentre os exemplos descritos na presente invenção para tirante (tether) 22.

[0059] No exemplo mostrado na Figura 1A, a polimerase 20 é imobilizada no canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’. No exemplo mostrado na Figura 1B, a polimerase 20 é imobilizada na molécula carregada 18’. Em outros exemplos, a polimerase 20 é imobilizada em um dentre os eletrodos 12 ou 14 (consulte a Figura 7B). Em ainda outros exemplos, a polimerase 20 é imobilizada em um substrato, por exemplo, que suporta o sensor de carga 11, 11’ (consulte a Figura 7B). Em qualquer caso, a polimerase 20 pode ser imobilizada por meio de um tirante (tether) 22. O tirante (tether) 22 é usado como uma âncora para a polimerase 20. Um exemplo de um tirante (tether) adequado 22 inclui polietilenoglicol (PEG). Em alguns exemplos, o tirante (tether) 22 mantém a polimerase 20 pelo menos 10 nm distante do canal eletricamente condutor 16 ou da molécula carregada 18. Isso pode ser desejável, por exemplo, de modo que mudanças conformais na polimerase 20, cargas da polimerase 20 e/ou cargas da cadeia polinucleotídica alvo/molde mantidas pela polimerase 20 não interfiram na operação de captação do sensor de carga 11, 11’.

[0060] Qualquer polimerase adequada 20 pode ser usada. Exemplos incluem polimerases da família A, tais como Bsu Polimerase, Bst Polimerase, Taq Polimerase, T7 Polimerase e muitas outras; polimerases da família B, tais como Phi29 polimerase, Pfu Polimerase, KOD Polimerase e muitas outras; polimerases da família C, tais como Escherichia coli DNA Pol III, e muitas outras, polimerases da família D, tais como Pyrococcus furiosus DNA Pol II, e muitas outras; polimerases da família X, tais como DNA Pol µ, DNA Pol β, DNA Pol σ, e muitas outras.

[0061] Deve-se entender que a polimerase 20 não é liberada como resultado da etiqueta-alvo 24 que se liga à molécula carregada 18, 18’. Em vez disso, a polimerase 20 permanece ligada por tirante (tether), por exemplo, ao canal 16 ou à molécula carregada 18, 18’ ou a algum outro componente de célula de fluxo, à medida que o evento de ligação ocorre e após o evento de ligação ocorrer.

[0062] Em alguns exemplos revelados na presente invenção, a molécula carregada 18, 18’ e a polimerase 20 são entidades diferentes (separadas e distintas) que têm diferentes papéis/funções que, em conjunto, possibilitam captação de única molécula. Em um exemplo de captação de única molécula, um sinal é detectado no sensor de carga 11, 11’ à medida que um nucleotídeo é incorporado em uma fita nascente que é formada ao longo de uma cadeia molde. Durante um evento de incorporação de nucleotídeo exemplificativo, a polimerase 20 mantém uma cadeia polinucleotídica molde e incorpora um nucleotídeo à fita nascente que é complementar a um nucleotídeo ao longo do molde, enquanto a molécula carregada 18, 18’ liga, reversivelmente, uma etiqueta (que é ligada ao nucleotídeo que está sendo incorporado) e é submetida a uma mudança conformacional que resulta em um sinal identificável no sensor de carga 11, 11’. Conforme mencionado na presente invenção, em alguns exemplos, pode ser desejável configurar a polimerase 20 (por exemplo, ajustando-se o comprimento do tirante (tether) 22) de modo que quaisquer mudanças conformacionais da polimerase 20 não interfiram no sinal gerado pela mudança conformacional da molécula carregada 18, 18’.

[0063] Conforme mostrado nas Figuras 1A(ii) e 1B(ii), o nucleotídeo marcado 26 é introduzido ao sistema de detecção 10, 10’. O nucleotídeo marcado 26 inclui um nucleotídeo 30, uma molécula de ligação 32 ligada a um grupo fosfato do nucleotídeo 30, e uma etiqueta específica de sítio de reconhecimento 24 (também denominada a etiqueta 24 ou a etiqueta-alvo 24) ligada à molécula de ligação 32. O nucleotídeo marcado 26 pode ser considerado um nucleotídeo não natural ou sintético visto que é distinto de modo estrutural ou químico de um nucleotídeo natural.

[0064] O nucleotídeo 30 do nucleotídeo marcado 26 pode ser um nucleotídeo natural. Os nucleotídeos naturais incluem uma base heterocíclica contendo nitrogênio, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. Exemplos de nucleotídeos naturais incluem, por exemplo, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Em um ribonucleotídeo, o açúcar é uma ribose e, em um desoxirribonucleotídeo, o açúcar é uma desoxirribose (isto é, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na posição 2' em ribose). Em um exemplo, o nucleotídeo 30 está na forma de polifosfato, visto incluindo vários grupos fosfato (por exemplo, tri-fosfato (isto é, gama fosfato), tetra-fosfato, penta-fosfato, hexa-fosfato (conforme mostrado na Figura 5), etc.). A base heterocíclica (isto é, nucleobase) pode ser uma base purina ou uma base pirimidina ou qualquer outro análogo à nucleobase. Bases purina incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos dos mesmos. Bases pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), e derivados modificados ou análogos dos mesmos. O átomo C-1 de desoxirribose é ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina.

[0065] O nucleotídeo marcado 26 também inclui a molécula de ligação 32. A molécula de ligação 32 pode ser qualquer molécula de cadeia longa que pode ser ligada quimicamente, em uma extremidade, ao grupo(s) fosfato do nucleotídeo 30 e que pode ser ligada quimicamente, na outra extremidade, ao marcador 24. A molécula de ligação 32 também pode ser selecionada de modo que não interaja com a polimerase 20. A molécula de ligação 32 é selecionada de modo que seja longa o bastante para permitir que a etiqueta 24 se associe ao sítio de reconhecimento 28 da molécula carregada 18, 18’ enquanto, por exemplo, o nucleotídeo 30 é retido pela polimerase 20.

[0066] Conforme exemplos, a molécula de ligação 32 pode incluir uma cadeia de alquila, uma cadeia de poli(etilenoglicol), um grupo amido, um grupo fosfato, um heterociclo, tal como um triazol, nucleotídeos ou combinações dos mesmos. Exemplos da cadeia de alquila podem incluir pelo menos 6 átomos de carbono e exemplos da cadeia de poli(etilenoglicol) podem incluir pelo menos 3 unidades de etilenoglicol.

[0067] O exemplo a seguir ilustra um exemplo do nucleotídeo marcado 26, em que a molécula de ligação 32 compreende uma cadeia de alquila, um grupo amida, uma cadeia de poli(etilenoglicol) e um triazol: Sítio de reconhecimento marcador específico

[0068] O exemplo a seguir ilustra outro exemplo do nucleotídeo marcado 26, em que a molécula de ligação 32 compreende cadeias de alquila, um grupo amida, cadeias de poli(etilenoglicol), um triazol e um grupo fosfato:

Sítio de reconhecimento marcador específico

[0069] O exemplo a seguir ilustra ainda outro exemplo do nucleotídeo marcado 26, em que a molécula de ligação 32 compreende cadeias de alquila, grupos de amida, cadeias de poli(etilenoglicol), um triazol e um grupo fosfato: Sítio de reconhecimento marcador específico

[0070] O exemplo a seguir ilustra um exemplo ainda adicional do nucleotídeo marcado 26, em que a molécula de ligação 32 compreende cadeias de alquila, um grupo amida, cadeias de poli(etilenoglicol), um triazol, um grupo fosfato e uma cadeia polinucleotídica: Sítio de reconhecimento marcador específico

[0071] Embora algumas moléculas de ligação exemplificativas 32 tenham sido descritas, deve-se entender que outras moléculas de ligação 32 podem ser usadas.

[0072] A etiqueta específica de sítio de reconhecimento 24 é uma molécula que pode ser reconhecida pela molécula carregada 18, 18’, e que pode se ligar, reversivelmente, à molécula carregada 18, 18’ no sítio de reconhecimento 28. Exemplos de etiquetas específicas de sítio de reconhecimento adequadas 24 incluem antibióticos, tais como Canamicina, Lividomicina, Tobramicina, Neomicina, Viomicina, Estreptomicina e outros; cofatores de enzima, tais como FMN, NAD, Vitamina B12, Xanteno e outros; aminoácidos, tais como arginina, citrulina, argininamida, valina, isoleucina, triptofano e outros; e muitas moléculas pequenas variadas, tais como teofilina, dopamina, sulforodamina, celobiose e outros.

[0073] A Figura 1A e a Figura 1B ilustram exemplos de uma molécula carregada 18, 18’ que tem a capacidade de se ligar a uma etiqueta-alvo 24 de um nucleotídeo marcado 26. Em outros exemplos, um nucleotídeo marcado 26 pode incluir múltiplas etiquetas 24 que podem se ligar a uma única molécula carregada 18, 18’ (Figura 2), ou uma molécula carregada 18, 18’ pode incluir múltiplos sítios de reconhecimento 28, cada um pode se ligar a uma respectiva etiqueta 24 de um respectivo nucleotídeo (Figura 3A a Figura 3E).

[0074] Na Figura 2, a molécula carregada 18’ inclui um primeiro sítio de reconhecimento 28A que é para ligar, reversivelmente, uma primeira etiqueta 24 do nucleotídeo marcado 26’, e inclui, ainda, um segundo sítio de reconhecimento 28B que é para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta 24’ do nucleotídeo marcado 26’. Esse exemplo inclui três mudanças conformacionais diferentes – uma quando somente a primeira etiqueta 24 é ligada, outra quando somente a segunda etiqueta 24’ é ligada, e ainda outra quando ambas as etiquetas 24, 24’ estão ligadas simultaneamente. Na Figura 2, a mudança conformacional específica da molécula carregada 18’ é alcançada ligando-se as duas etiquetas diferentes 24, 24’ aos dois sítios de reconhecimento diferentes 28A, 28B. Conforme ilustrado, o um nucleotídeo marcado 26’ inclui ambas as etiquetas 24 e 24’, e essas etiquetas 24, 24’ são ligadas a um nucleotídeo 30 por respectivas moléculas de ligação 32 e 32’. Quaisquer exemplos das etiquetas 24 e moléculas de ligação 32 podem ser usados neste exemplo do nucleotídeo marcado 26’, desde que as etiquetas 24 e 24’ sejam diferentes uma da outra e possam ser reconhecidas pelos sítios de reconhecimento 28A e 28B da molécula carregada 18’ tanto separadamente ou ao mesmo tempo. No exemplo mostrado, quando ambas as etiquetas 24, 24’ estão ligadas, a molécula carregada 18’ está em uma de suas conformações modificadas B e isso resulta em um sinal detectável.

[0075] Embora a molécula carregada 18’ com a polimerase 20 ligada à mesma seja mostrada na Figura 2, deve-se entender que a molécula carregada 18 e polimerase separadamente ligada 20 podem ser usadas no exemplo mostrado na Figura 2.

[0076] Em ainda outro exemplo não mostrado nos desenhos, a molécula carregada 18, 18’ inclui dois sítios de reconhecimento (por exemplo, 28A, 28B), qualquer um dos mesmos pode se ligar a uma única etiqueta 24 que é ligada ao nucleotídeo 30. Esse exemplo inclui duas mudanças conformacionais favorecidas diferentes uma quando a etiqueta 24 se liga ao primeiro sítio de reconhecimento 28A e outra quando a etiqueta 24 se liga ao segundo sítio de reconhecimento 28B.

[0077] Na Figura 3A à Figura 3E, a molécula carregada 18’ inclui quatro sítios de reconhecimento diferentes 28A, 28B, 28C, 28D, cada um tem a capacidade de se ligar, reversivelmente, a uma etiqueta-alvo diferente 24A, 24B, 24C, 24D de diferentes nucleotídeos marcados 26A, 26B, 26C, 26D. Embora a molécula carregada 18’ com a polimerase 20 ligada à mesma seja mostrada na Figura 3A a

Figura 3E, deve-se entender que a molécula carregada 18 e polimerase separadamente ligada 20 podem ser usadas no exemplo mostrado na Figura 3A à Figura 3E.

[0078] Neste exemplo, conforme mostrado na Figura 3A, a molécula carregada 18’ inclui um primeiro sítio de reconhecimento 28A para ligar, reversivelmente, uma primeira etiqueta 24A de um primeiro nucleotídeo marcado 26A, e tem uma primeira conformação favorecida B1 associada a uma primeira configuração de carga quando o primeiro sítio de reconhecimento 28A é ligado à primeira etiqueta 24A. Conforme mostrado na Figura 3B, a molécula carregada 18’ inclui, ainda, um segundo sítio de reconhecimento 28B para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta 24B de um segundo nucleotídeo marcado 26B, e tem uma segunda conformação favorecida B2 associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento 28B é ligado ao segundo marcador 24B. Conforme mostrado na Figura 3C, a molécula carregada 18’ inclui, ainda, um terceiro sítio de reconhecimento 28C para ligar, reversivelmente, uma terceira etiqueta 24C de um terceiro nucleotídeo marcado 26C, e tem uma terceira conformação favorecida B3 associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento 28C é ligado ao terceiro marcador 24C. Conforme mostrado na Figura 3D, a molécula carregada 18’ inclui, ainda, um quarto sítio de reconhecimento 28D para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta 24D de um quarto nucleotídeo marcado 26D, e tem uma quarta conformação favorecida B4 associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento 28D é ligado ao quarto marcador 24D.

[0079] A conformação favorecida não ligada A da molécula carregada 18’ é mostrada na Figura 3E. Conforme retratado, a conformação favorecida não ligada

A deste exemplo (que é associada à configuração de carga não ligada) ocorre quando cada um dentre o primeiro sítio de reconhecimento 28A, o segundo sítio de reconhecimento 28B, o terceiro sítio de reconhecimento 28C e o quarto sítio de reconhecimento 28C não é ligado (isto é, nenhum nucleotídeo marcado 26A a 26D é ligado aos sítios 28A a 28D). O centroide da distribuição de carga para a conformação favorecida não ligada A tem uma distância definida δ 0 a partir da superfície do canal eletricamente condutor 16. Esta distância δ0 é alterada dependendo do nucleotídeo marcado 26A a 26D que é ligado, reversivelmente, à molécula carregada 18’.

[0080] No exemplo mostrado na Figura 3A, o nucleotídeo marcado 26A inclui polifosfato guanina como o nucleotídeo 30A, um ligante 32A, e uma etiqueta única 24A. Quando a polimerase 20 incorpora o nucleotídeo 30A, a concentração eficaz da etiqueta 24A é aumentada de maneira eficaz na proximidade da molécula carregada 18’ (que tem um sítio de reconhecimento 24A para a etiqueta 24A), fazendo com que a molécula carregada 18’ se ligue ao marcador 24A. No exemplo mostrado na Figura 3A, a ligação faz com que a distância δ0 entre o centroide de carga e a superfície de canal aumente, conforme denotado por “δ++”.

[0081] No exemplo mostrado na Figura 3B, o nucleotídeo marcado 26B inclui polifosfato adenina como o nucleotídeo 30B, um ligante 32B, e uma etiqueta única 24B. Quando a polimerase 20 incorpora o nucleotídeo 30B, a concentração eficaz da etiqueta 24B é aumentada de maneira eficaz na proximidade da molécula carregada 18’ (que tem um sítio de reconhecimento 24B para a etiqueta 24A), fazendo com que a molécula carregada 18’ se ligue ao marcador 24B. No exemplo mostrado na Figura 3B, a ligação faz com que a distância δ0 entre o centroide de carga e a superfície de canal aumente, conforme denotado por “δ+”. Embora as mudanças conformacionais favorecidas mostradas na Figura 3A e na Figura 3B resultem em distâncias aumentadas δ++ e δ+, as distâncias δ++ e δ+ são diferentes e, desse modo, resultarão em sinais mensuráveis distintos.

[0082] No exemplo mostrado na Figura 3C, o nucleotídeo marcado 26C inclui polifosfato citosina como o nucleotídeo 30C, um ligante 32C, e uma etiqueta única 24C. Quando a polimerase 20 incorpora o nucleotídeo 30C, a concentração eficaz da etiqueta 24C é aumentada de maneira eficaz na proximidade da molécula carregada 18’ (que tem um sítio de reconhecimento 24C para a etiqueta 24C), fazendo com que a molécula carregada 18’ se ligue ao marcador 24C. No exemplo mostrado na Figura 3C, a ligação faz com que a distância δ0 entre o centroide de carga e a superfície de canal diminua, conforme denotado por “δ-”.

[0083] No exemplo mostrado na Figura 3D, o nucleotídeo marcado 26D inclui polifosfato timina como o nucleotídeo 30D, um ligante 32D e uma etiqueta única 24D. Quando a polimerase 20 incorpora o nucleotídeo 30D, a concentração eficaz da etiqueta 24D é aumentada de maneira eficaz na proximidade da molécula carregada 18’ (que tem um sítio de reconhecimento 24D para a etiqueta 24D), fazendo com que a molécula carregada 18’ se ligue ao marcador 24D. No exemplo mostrado na Figura 3D, a ligação faz com que a distância δ0 entre o centroide de carga e a superfície de canal diminua, conforme denotado por “δ--”. Embora as mudanças conformacionais favorecidas mostradas na Figura 3C e na Figura 3D resultem em distâncias diminuídas δ- e δ--, as distâncias δ- e δ-- são diferentes e, desse modo, resultarão em sinais mensuráveis distintos.

[0084] No exemplo mostrado na Figura 3A à Figura 3E, uma molécula carregada 18’ tem quatro sítios de reconhecimento diferentes 28A a 28D e, desse modo, tem quatro configurações modificadas diferentes que resultam em quatro sinais mensuráveis diferentes e distintos. Esses sinais diferentes e distintos possibilitam que quatro nucleotídeos diferentes 30A a 30D sejam identificados à medida que são incorporados, respectivamente, em uma fita molde.

[0085] Outras variações da molécula carregada de múltiplos sítios de reconhecimento também são contempladas. Por exemplo, duas moléculas carregadas 18, 18’, tendo, cada uma, dois sítios de reconhecimento diferentes 28, podem ser ligadas ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’. Para cada uma dessas moléculas carregadas 18, 18’, a conformação favorecida não ligada A será exibida quando os dois sítios de reconhecimento diferentes permanecerem não ligados. Neste exemplo, uma primeira dentre as duas moléculas carregadas 18, 18’ inclui um primeiro sítio de reconhecimento (por exemplo, 28A na Figura 3A) para ligar, reversivelmente, uma primeira etiqueta (por exemplo, 24A na Figura 3A) de um primeiro nucleotídeo marcado (por exemplo, 26A na Figura 3A) e tem uma primeira conformação favorecida (por exemplo, B1 na Figura 3A) associada a uma primeira configuração de carga quando o primeiro sítio de reconhecimento é ligado à primeira etiqueta, e inclui, ainda, um segundo sítio de reconhecimento (por exemplo, 28B na Figura 3B) para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta (por exemplo, 28B na Figura 3A à Figura 3E) de um segundo nucleotídeo marcado (por exemplo, 26B na Figura 3A à Figura 3E) e tem uma segunda conformação favorecida (por exemplo, B2 na Figura 3B) associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento é ligado ao segundo marcador. Neste exemplo, a segunda dentre as duas moléculas carregadas 18, 18’ inclui um terceiro sítio de reconhecimento (por exemplo, 28C na Figura 3C) para ligar, reversivelmente, uma terceira etiqueta (por exemplo, 24C na Figura 3C) de um terceiro nucleotídeo marcado (por exemplo, 26C na Figura 3C) e um quarto sítio de reconhecimento (por exemplo, 28D na Figura 3D) para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta (por exemplo, 24D na Figura 3D) de um quarto nucleotídeo marcado (por exemplo, 26D na Figura 3D), e também tem uma terceira conformação favorecida (por exemplo, B3 na Figura 3C) associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento é ligado ao terceiro marcador e tem uma quarta conformação favorecida (por exemplo, B4 na Figura 3D) associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento é ligado ao quarto marcador. Neste exemplo, duas moléculas carregadas diferentes 18, 18’ podem ser usadas para identificar quatro nucleotídeos marcados diferentes 26A a 26D.

[0086] Em ainda outros exemplos, o sistema de detecção 10, 10’ pode incluir algumas moléculas carregadas 18, 18’ ligadas ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11, 11’. Em um exemplo, cada uma dentre as moléculas carregadas 18, 18’ tem a capacidade de se ligar, reversivelmente, a um nucleotídeo marcado diferente 26. Um exemplo deste sistema de detecção 10’’ é mostrado na Figura 4.

[0087] Neste exemplo, quatro moléculas carregadas diferentes 18A, 18B, 18C, 18D são ligadas ao canal eletricamente condutor 16 do sensor de carga 11’’. Neste exemplo, cada uma dentre as moléculas carregadas 18A, 18B, 18C, 18D tem seu próprio sítio de reconhecimento, conformação favorecida não ligada e conformação favorecida (durante ligação de etiqueta) que é independente de cada uma dentre as outras moléculas carregadas 18A, 18B, 18C, 18D. Mais especificamente, uma primeira molécula carregada 18A ligada ao canal eletricamente condutor 16 inclui um primeiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma primeira etiqueta de um primeiro nucleotídeo marcado, uma conformação favorecida não ligada quando o primeiro sítio de reconhecimento não é ligado, e uma conformação favorecida com uma configuração de carga quando o primeiro sítio de reconhecimento é ligado à primeira etiqueta. Neste exemplo, uma segunda molécula carregada 18B ligada ao canal eletricamente condutor 16 inclui um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma segunda etiqueta de um segundo nucleotídeo marcado, uma conformação favorecida não ligada de segunda molécula carregada, e uma conformação favorecida de segunda molécula carregada com uma configuração de carga de segunda molécula carregada quando o segundo sítio de reconhecimento é ligado ao segundo marcador. Também neste exemplo, uma terceira molécula carregada 18C ligada ao canal eletricamente condutor 16 inclui um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma terceira etiqueta de um terceiro nucleotídeo marcado, uma conformação favorecida não ligada de terceira molécula carregada, e uma conformação favorecida de terceira molécula carregada com uma configuração de carga de terceira molécula carregada quando o terceiro sítio de reconhecimento é ligado ao terceiro marcador. Também neste exemplo, uma quarta molécula carregada 18D ligada ao canal eletricamente condutor 16 inclui um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, uma quarta etiqueta de um quarto nucleotídeo marcado, uma conformação favorecida não ligada de quarta molécula carregada, e uma conformação favorecida de quarta molécula carregada com uma configuração de carga de quarta molécula carregada quando o quarto sítio de reconhecimento é ligado ao quarto marcador.

[0088] Conforme mostrado na Figura 4, uma única polimerase 20 pode ser ligada ao canal eletricamente condutor 16. Neste exemplo, o comprimento de cada molécula de ligação 32 dos respectivos nucleotídeos marcados 26 pode ser selecionado de modo que, quando um respectivo nucleotídeo 30 é mantido pela polimerase 20, a respectiva etiqueta 24 possa se ligar à sua molécula carregada correspondente 18A, 18B, 18C, 18D, e não a uma molécula carregada adjacente 18A, 18B, 18C, 18D.

[0089] A Figura 4 também ilustra um exemplo do aparelho de captação 40. O exemplo do aparelho de captação 40 mostrado na Figura 4 inclui uma célula de fluxo 41 e o sistema de detecção 10’’ integrado à célula de fluxo 41. Deve-se entender que qualquer exemplo do sistema de detecção 10, 10’, 10’’ pode ser usado no aparelho de captação 40.

[0090] A célula de fluxo 41 é um vaso que contém o sistema de detecção 10’’. Deve-se entender que outros vasos, tais como um poço, tubo, canal, cuveta, placa de Petri, frasco ou similares podem conter, de modo alternativo, o sistema de detecção 10’’. Processos cíclicos, tais como reações de sequenciamento de ácido nucleico, são particularmente bem adequados para células de fluxo 41.

[0091] As células de fluxo exemplificativas 41 incluem um substrato/suporte 13 e uma tampa ligada 43 direta ou indiretamente ao mesmo ou formada integralmente com o mesmo. A célula de fluxo 41 pode incluir uma entrada de fluido 45 e uma saída de fluido 47 que possibilitam entrega de reagentes volumosos a um sistema de detecção 10’’ ou um arranjo de sistemas de captação 10’’ contido dentro da célula de fluxo 41. Qualquer célula de fluxo individual 41 pode incluir dezenas, centenas, milhares, milhões, ou até mesmo bilhões de sistemas de captação individualmente endereçáveis e legíveis 10, 10’, 10’’.

[0092] O exemplo mostrado nas Figuras 7A e 7B é um exemplo de uma célula de fluxo 41’ incluindo um arranjo de sistemas de captação 10, 10’, 10’’. O arranjo pode incluir alguns sistemas de captação 10, 10’, 10’’, cada um é posicionado em um substrato e é configurado com conjunto de circuitos eletrônicos de modo que seja individualmente endereçável e legível. Em um exemplo, cada sistema de detecção 10, 10’, 10’’ do arranjo pode ser posicionado no substrato em uma depressão individual. As depressões separam fisicamente cada um dentre os sistemas de captação 10, 10’, 10’’.

[0093] No exemplo da Figura 7A, a célula de fluxo 41’ inclui canais de fluxo 52. Embora diversos canais de fluxo 52 sejam mostrados, deve-se entender que qualquer número de canais 52 pode ser incluído na célula de fluxo 41’ (por exemplo, um único canal 52, quatro canais 52, etc.). Cada canal de fluxo 52 é uma área definida entre dois componentes ligados (por exemplo, um substrato e uma tampa ou dois substratos), que pode ter fluidos (por exemplo, aqueles descritos na presente invenção) introduzidos à mesma e removidos da mesma. Cada canal de fluxo 52 pode ser isolado de outro canal de fluxo 52 de modo que fluido introduzido em qualquer canal de fluxo particular 52 não flua para qualquer canal de fluxo adjacente 52. Alguns exemplos dos fluidos introduzidos aos canais de fluxo 52 podem introduzir componentes de reação (por exemplo, nucleotídeos marcados 26, etc.), soluções de lavagem, etc.

[0094] Um exemplo da arquitetura dentro dos canais de fluxo 52 da célula de fluxo 41’ é mostrado na Figura 7B. No exemplo mostrado na Figura 7B, a célula de fluxo 41’ inclui um substrato 13 incluindo um suporte 54 e um material padronizado 56 posicionado no suporte 54. O material padronizado 56 define depressões 58 separadas por regiões intersticiais 60. Neste exemplo, uma superfície do suporte 54 é exposta a cada uma dentre as depressões 58, e um sistema de detecção 10, 10’, 10’’ é posicionado dentro de cada depressão 58.

[0095] O suporte 54 na Figura 7B fornece suporte para os outros componentes da célula de fluxo 41’. O suporte 54 é geralmente rígido e é insolúvel em um líquido aquoso. Exemplos de suportes adequados 54 incluem epóxi siloxano, vidro, vidro modificado, plásticos, náilon, cerâmicas/óxidos cerâmicos, sílica (óxido de silício (SiO2)), sílica fundida, materiais à base de sílica, silicato de alumínio, silício, silício modificado (por exemplo, silício p+ dopado com boro), nitreto de silício (Si 3N4), pentóxido de tântalo (TaO5) ou outro óxido(s) de tântalo (TaOx), óxido de háfnio (HaO2), vidros inorgânicos ou similares. Alguns exemplos de plásticos adequados para o suporte 54 incluem acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tais como TEFLON® junto a Chemours), polímeros de olefinas cíclicas/ciclo-olefina (COP) (tais como ZEONOR® junto a Zeon), poliimidas, etc. O suporte 54 também pode ser vidro ou silício, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou outro óxido cerâmico na superfície.

[0096] A forma do suporte 54 pode ser uma pastilha, um painel, uma folha retangular, uma matriz ou qualquer outra configuração adequada. Em um exemplo, o suporte 54 pode ser uma pastilha ou painel circular que tem um diâmetro na faixa de cerca de 2 mm a cerca de 300 mm. Conforme um exemplo mais específico, o suporte 54 é uma pastilha que tem um diâmetro na faixa de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em outro exemplo, o suporte 54 pode ser uma folha ou painel retangular que tem sua maior dimensão até cerca de 3 metros (10 pés). Conforme um exemplo específico, o suporte 54 é uma matriz que tem uma largura na faixa de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Embora dimensões exemplificativas tenham sido fornecidas, deve-se entender que um suporte 54 com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado.

[0097] No exemplo mostrado na Figura 7B, o material padronizado 56 é posicionado no suporte 54. Deve-se entender que qualquer material que possa ser depositado de maneira seletiva, ou depositado e padronizado para formar as depressões 58 e as regiões intersticiais 60 pode ser usado para o material padronizado 56.

[0098] Conforme um exemplo, um óxido inorgânico pode ser aplicado seletivamente ao suporte 66 por meio de deposição a vapor, impressão por aerossol ou impressão por jato de tinta. Exemplos de óxidos inorgânicos adequados incluem óxido de tântalo (por exemplo, Ta2O5), óxido de alumínio (por exemplo, Al2O3), óxido de silício (por exemplo, SiO2), óxido de háfnio (por exemplo, HfO2), etc.

[0099] Conforme outro exemplo, uma resina pode ser aplicada ao suporte 54 e, então, padronizada. As técnicas de deposição adequadas incluem deposição química a vapor, revestimento por imersão, revestimento por mergulho, revestimento por rotação, revestimento por aspersão, dispensação por pudlagem, revestimento por aspersão ultrassônica, revestimento por lâmina, impressão por aerossol, impressão por serigrafia, impressão por microcontato, etc. As técnicas de padronização adequadas incluem fotolitografia, litografia por nanoimpressão (NIL), técnicas de estampagem, técnicas de gravação em relevo, técnicas de moldagem, técnicas de microcorrosão, técnicas de impressão, etc. Alguns exemplos de resinas adequadas incluem uma resina à base de resina de silsesquioxano oligomérico poliédrico (POSS), uma resina epóxi não POSS, uma resina de poli(etilenoglicol), uma resina de poliéter (por exemplo, epóxies de anel aberto), uma resina acrílica, uma resina de acrilato, uma resina de metacrilato, uma resina de fluoropolímero amorfo (por exemplo, CYTOP® junto a Bellex), e combinações dos mesmos.

[00100] Conforme usado na presente invenção, o termo “silsesquioxano oligomérico poliédrico” (POSS) se refere a uma composição química que é um intermediário híbrido (por exemplo, RSiO1.5) entre aquela de sílica (SiO2) e silicone (R2SiO). Um exemplo de POSS pode ser aquele descrito em Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776 a 778, que é incorporado a título de referência em sua totalidade. Em um exemplo, a composição é um composto de organossilício com a fórmula química [RSiO3/2]n, em que os grupos R podem ser iguais ou diferentes. Os grupos R exemplificativos para POSS incluem epóxi, azida/azido, um tiol, um poli(etilenoglicol), um norborneno, uma tetrazina, acrilatos e/ou metacrilatos, ou outros, por exemplo, grupos alquila, arila, alcóxi e/ou haloalquila. A composição de resina revelada na presente invenção pode compreender uma ou mais estruturas de gaiola ou núcleo diferentes como unidades monoméricas. A estrutura poliédrica pode ser uma estrutura T8, tal como: e representada por: . Essa unidade monomérica tipicamente tem oito braços de grupos funcionais R1 a R8.

[00101] A unidade monomérica pode ter uma estrutura em gaiola com 10 átomos de silício e 10 grupos R, denominada T10, tal como: , ou pode ter uma estrutura em gaiola com 12 átomos de silício e 12 grupos R, denominada T12, tal como: . O material à base de POSS pode incluir, de modo alternativo, estruturas em gaiola T6, T14 ou T16. O conteúdo em gaiola médio pode ser ajustado durante a síntese, e/ou controlado por métodos de purificação, e uma distribuição de tamanhos de gaiola da unidade(s) monomérica pode ser usada nos exemplos revelados na presente invenção.

[00102] Conforme mostrado na Figura 7B, o material padronizado 56 inclui as depressões 58 definidas no mesmo, e regiões intersticiais 60 que separam as depressões adjacentes 58. Muitos layouts diferentes das depressões 58 podem ser previstos, incluindo padrões regulares, repetidos e não regulares. Em um exemplo, as depressões 58 são dispostas em uma rede hexagonal para acondicionamento e densidade aperfeiçoada. Outros layouts podem incluir, por exemplo, layouts retilíneos (retangulares), layouts triangulares e assim por diante. Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato x-y de depressões 58 que estão em linhas e colunas. Em alguns outros exemplos, o layout ou padrão pode ser uma disposição repetida de depressões 58 e/ou regiões intersticiais 60. Em ainda outros exemplos, o layout ou padrão pode ser uma disposição aleatória de depressões 58 e/ou regiões intersticiais 60. O padrão pode incluir pontos, blocos, furos, colunas, listras, espiral, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, marcas, xadrez, diagonais, setas, quadrados e/ou hachuras.

[00103] O layout ou padrão das depressões 58 pode ser caracterizado em relação à densidade das depressões 58 (número de depressões 58) em uma área definida. Por exemplo, as depressões 58 podem estar presentes em uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2. A densidade pode ser ajustada para diferentes densidades incluindo, por exemplo, uma densidade de cerca de 100 por mm2, cerca de 1.000 por mm2, cerca de 0,1 milhão por mm2, cerca de 1 milhão por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 50 milhões por mm2, ou mais ou menos. Deve-se entender, ainda, que a densidade de depressões 58 no material padronizado 56 pode estar entre um dentre os valores inferiores e um dentre os valores superiores selecionados a partir das faixas acima. Conforme exemplos, um arranjo de alta densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 58 separadas por menos de cerca de 100 nm, um arranjo de densidade média pode ser caracterizado como tendo depressões 58 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 1 µm, e um arranjo de baixa densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 58 separadas por mais de cerca de 1 µm. Embora densidades exemplificativas tenham sido fornecidas, deve-se entender que quaisquer densidades adequadas podem ser usadas.

[00104] O layout ou padrão das depressões 58 também pode ser caracterizado, ou de modo alternativo, em termos do passo médio, ou do espaçamento do centro da depressão 58 até o centro de uma depressão adjacente 58 (espaçamento centro para centro) ou da borda de uma depressão 58 até a borda de uma depressão adjacente 58 (espaçamento borda para borda). O padrão pode ser regular, de modo que o coeficiente de variação em torno do passo médio seja pequeno, ou o padrão pode ser irregular em cujo caso o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em qualquer caso, o passo médio pode ser, por exemplo, cerca de 50 nm, cerca de 0,1 μm, cerca de 0,5 μm, cerca de 1 μm, cerca de 5 μm, cerca de 10 μm, cerca de 100 μm, ou mais ou menos. O passo médio para um padrão particular de depressões 58 pode estar entre um dentre os valores inferiores e um dentre os valores superiores selecionados a partir das faixas acima. Em um exemplo, as depressões 58 têm um passo (espaçamento centro para centro) de cerca de 1,5 μm. Embora os valores de passo médio exemplificativos tenham sido fornecidos, deve-se entender que outros valores de passo médio podem ser usados.

[00105] O tamanho de cada depressão 58 pode ser caracterizado por seu volume, profundidade e/ou diâmetro.

[00106] Cada depressão 58 pode ter qualquer volume que tenha a capacidade de confinar um fluido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar a taxa de transferência (por exemplo, multiplexidade), resolução, nucleotídeos marcados 26, ou reatividade de analito esperados para usos a jusante da célula de fluxo 41’. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos cerca de 1×10−3 μm3, pelo menos cerca de 1×10−2 μm3, pelo menos cerca de 0,1 μm3, pelo menos cerca de 1 μm3, pelo menos cerca de 10 μm3, pelo menos cerca de 100 μm3, ou mais. De modo alternativo ou adicional, o volume pode ser no máximo cerca de 1×104 μm3, no máximo cerca de 1×103 μm3, no máximo cerca de 100 μm3, no máximo cerca de 10 μm3, no máximo cerca de 1 μm3, no máximo cerca de 0,1 μm3, ou menos.

[00107] A profundidade de cada depressão 58 pode ser grande o suficiente para comportar um sistema de detecção 10, 10’, 10’’. Em um exemplo, a profundidade pode ser pelo menos cerca de 1 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 100 μm, ou mais. De modo alternativo ou adicional, a profundidade pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, no máximo cerca de 100 μm, no máximo cerca de 10 μm, ou menos. A profundidade de cada depressão 58 pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.

[00108] Em alguns casos, o diâmetro ou comprimento e largura de cada depressão 58 pode ser pelo menos cerca de 50 nm, pelo menos cerca de 0,1 μm, pelo menos cerca de 0,5 μm, pelo menos cerca de 1 μm, pelo menos cerca de 10 μm, pelo menos cerca de 100 μm, ou mais. De modo alternativo ou adicional, o diâmetro ou comprimento e largura pode ser no máximo cerca de 1×103 μm, no máximo cerca de 100 μm, no máximo cerca de 10 μm, no máximo cerca de 1 μm, no máximo cerca de 0,5 μm, no máximo cerca de 0,1 μm, ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro ou comprimento e largura de cada depressão 58 pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.

[00109] Conforme retratado na Figura 7B, cada uma dentre as depressões 58 no arranjo inclui um respectivo sensor de carga 11, 11’, 11’’. É desejável que cada sensor de carga 11, 11’, 11’’ em cada depressão 58 tenha uma molécula carregada 18, 18’ ligada ao mesmo, e tenha uma polimerase 20 ligada na proximidade do mesmo. Em alguns exemplos, cada depressão 58 tem um sensor de carga 11, 11’, 11’’, uma molécula carregada 18, 18, e uma polimerase 20 na mesma. Em outros exemplos, algumas depressões 58 têm um sensor de carga 11, 11’, 11’’, uma molécula carregada 18, 18, e uma polimerase 20 nas mesmas; enquanto outras depressões 58 têm um sensor de carga 11, 11’, 11’’, uma molécula carregada 18, 18, e mais de uma polimerase 20 nas mesmas; e ainda outras depressões 58 têm um sensor de carga 11, 11’, 11’’, uma molécula carregada 18, 18, e nenhuma polimerase 20 nas mesmas. Nestes exemplos, o número de polimerase(s) 20 ligada dentro de qualquer depressão determinada 58 pode ser aleatório e determinado pela distribuição de Poisson.

[00110] Em alguns exemplos, o sensor de carga 11, 11’, 11’’ com a molécula carregada 18, 18’ ligada ao mesmo pode ser pré-montado nas depressões 58. Para fixar as polimerases 20 dentro de respectivas depressões 58, um fluido contendo a polimerase 20 pode ser introduzido em cada faixa 52 da célula de fluxo 41’. A polimerase 20 pode incluir um tirante (tether) 22 que se fixa dentro de uma depressão 58, ou o ligante 22 pode ser pré-fixado dentro de uma depressão 58 e a polimerase 20 pode se fixar ao ligante 22. Pode-se permitir que o fluido seja incubado por um tempo desejável e a uma temperatura desejável para permitir que as polimerases 20 se fixem.

[00111] Conforme retratado na Figura 7B, a polimerase 20 pode se fixar a qualquer componente e/ou qualquer superfície dentro da célula de fluxo 41’. Em alguns exemplos, a polimerase 20 é ligada a um eletrodo 12 ou 14, uma superfície do substrato 13 (por exemplo, um fundo da depressão 58, uma parede lateral da depressão 58, etc.), no canal eletricamente condutor 16, na molécula carregada 18, 18’, etc.

[00112] Cada um dentre os sensores de carga 11, 11’, 11’’ é endereçável e legível individualmente e de forma elétrica. Como tal, os sinais que resultam de mudanças de conformação de molécula carregada que ocorrem dentro de cada depressão 58 podem ser individualmente detectados e analisados.

[00113] Quaisquer exemplos do aparelho de captação 40 também podem incluir um sistema de entrega de reagente 49 para introduzir, seletivamente, um reagente em uma entrada (por exemplo, entrada(s) de fluido 45) da célula de fluxo 41 ou uma faixa 52 de uma célula de fluxo 41’, ao longo do sistema(s) de captação 10, 10’, 10’’ e, então, para fora da saída de fluido 47. O sistema de entrega de reagente 49 pode incluir tubulação ou outros fluídicos que podem ser fixados, de modo permanente ou removível, à entrada de fluido 45. O sistema de entrega de reagente 49 pode incluir um recipiente de amostra 51. O reagente (incluindo qualquer exemplo de nucleotídeo marcado 26 a ser introduzido ao sistema de detecção 10’’) pode ser armazenado no recipiente de amostra ou preparado e introduzido ao recipiente de amostra imediatamente antes do uso. O sistema de entrega de reagente 49 também pode incluir uma bomba ou outro equipamento adequado para recuperar o reagente do recipiente de amostra 51 e entregar o mesmo na entrada de fluido 45. Em outros exemplos, o recipiente de amostra 51 é posicionado de modo que o reagente possa fluir por gravidade para a entrada de fluido 45, ao longo do sistema de detecção 10’’, e para fora da saída de fluido 47.

[00114] O sensor de carga 11, 11’, 11’’ na célula de fluxo 41, 41’ também pode ser conectado, de modo operativo, a um detector 15 para detectar mudanças de condutância do sensor de carga 11, 11’, 11’’ quando o sistema de detecção 10, 10’, 10’’ e o aparelho de captação 40 são usados.

[00115] Os sistemas de captação 10, 10’, 10’’, revelados na presente invenção, podem ser usados em um método de captação. Um exemplo do método é mostrado, de forma esquemática, na Figura 5. O método inclui: introduzir uma cadeia polinucleotídica de molde 48 a um sistema de detecção 10, 10’, 10’’ incluindo: um sensor de carga 11, 11’, 11’’ incluindo dois eletrodos 12, 14 e um canal eletricamente condutor 16 conectando os dois eletrodos 12, 14; uma molécula carregada 18, 18’ ligada ao canal eletricamente condutor 16, em que a molécula carregada 18, 18’ inclui um sítio de reconhecimento 28; e uma polimerase 20 ligada ao canal eletricamente condutor 16 ou à molécula carregada 18, 18’; introduzir reagentes que incluem nucleotídeos marcados 26 ao sistema de detecção 10, 10’, 10’’, em que um nucleotídeo 30 de um dentre os nucleotídeos marcados 26 se associa à polimerase 20 e uma etiqueta específica de sítio de reconhecimento 24 do um dentre os nucleotídeos marcados 26 se associa ao sítio de reconhecimento 28 para induzir uma mudança conformacional da molécula carregada 18, 18’; e

[00116] Em resposta à mudança conformacional da molécula carregada 18, 18’, detectar uma resposta do sensor de carga 11, 11’, 11’’.

[00117] A cadeia polinucleotídica de molde 48 pode ser qualquer amostra que deve ser sequenciada, e pode ser composta de DNA, RNA, ou análogos dos mesmos (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos). A fonte da cadeia polinucleotídica de molde (ou alvo) 48 pode ser DNA genômico, RNA mensageiro ou outros ácidos nucleicos de fontes nativas. Em alguns casos, a cadeia polinucleotídica de molde 48 que é derivada de tais fontes pode ser amplificada antes do uso em um método ou sistema 40 na presente invenção. Qualquer uma dentre uma variedade de técnicas de amplificação conhecidas pode ser usada incluindo, mas sem limitação, reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação por círculo rolante (RCA), amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) ou amplificação de Polimerase Recombinase (RPA). Deve-se entender que a amplificação da cadeia polinucleotídica de molde 48 antes do uso no método ou sistema 40 estabelecido na presente invenção é opcional. Como tal, a cadeia polinucleotídica de molde 48 não será amplificada antes do uso em alguns exemplos. As cadeias polinucleotídicas de molde/alvo 48 podem ser derivadas, opcionalmente, de bibliotecas sintéticas. Os ácidos nucleicos sintéticos podem ter composições de DNA ou RNA nativas ou podem ser análogos dos mesmos.

[00118] As amostras biológicas a partir das quais a cadeia polinucleotídica de molde 48 pode ser derivada incluem, por exemplo, aquelas de um mamífero, tais como um roedor, camundongo, rato, coelho, porquinho-da-Índia, ungulado, cavalo, carneiro, porco, cabra, vaca, gato, cachorro, primata, primata humano ou não humano; uma planta, tal como Arabidopsis thaliana, milho, sorgo, aveia, trigo, arroz, canola ou soja; uma alga, tal como Chlamydomonas reinhardtii; um nematoide, tal como Caenorhabditis elegans; um inseto, tal como Drosophila melanogaster, mosquito, mosca-das-frutas, abelha-de-mel ou aranha; um peixe, tal como peixe-zebra; um réptil; um anfíbio, tal como um sapo ou Xenopus laevis; um dictyostelium discoideum; um fungo, tal como pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, levedura, Saccharamoyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe; ou um plasmodium falciparum. As cadeias polinucleotídicas de molde 48 também podem ser derivadas de procariontes, tais como uma bactéria, Escherichia coli, staphylococci ou mycoplasma pneumoniae; um archae; um vírus, tal como vírus da Hepatite C, vírus ebola ou vírus da imunodeficiência humana; ou um viroide. As cadeias polinucleotídicas de molde 48 podem ser derivadas de uma cultura ou população homogênea dos organismos acima ou, de modo alternativo, de uma coleção de vários organismos diferentes, por exemplo, em uma comunidade ou ecossistema.

[00119] Além disso, cadeias polinucleotídicas de molde 48 podem não ser derivadas de fontes naturais, mas, em vez disso, podem ser sintetizadas com o uso de técnicas conhecidas. Por exemplo, sondas de expressão genética ou sondas de genotipagem podem ser sintetizadas e usadas nos exemplos estabelecidos na presente invenção.

[00120] Em alguns exemplos, cadeias polinucleotídicas de molde 48 podem ser obtidas como fragmentos de um ou mais ácidos nucleicos maiores. A fragmentação pode ser realizada com o uso de qualquer uma dentre uma variedade de técnicas conhecidas na arte incluindo, por exemplo, nebulização, sonicação, clivagem química, clivagem enzimática ou cisalhamento físico. A fragmentação também podem resultar do uso de uma técnica de amplificação particular que produz amplicons copiando-se apenas uma porção de uma cadeia de ácidos nucleicos maiores. Por exemplo, amplificação por PCR produz fragmentos que têm um tamanho definido pelo comprimento da sequência de nucleotídeos no molde original que está entre as localizações onde iniciadores de flanqueamento hibridizam durante amplificação. O comprimento da cadeia polinucleotídica de molde 48 pode ser em termos do número de nucleotídeos ou em termos de um comprimento métrico (por exemplo, nanômetros).

[00121] Uma população de cadeias polinucleotídicas de molde/alvo 48, ou amplicons das mesmas, pode ter um comprimento de fita médio que é desejado ou apropriado para uma aplicação particular dos métodos ou sistema 40 estabelecidos na presente invenção. Por exemplo, o comprimento de fita médio pode ser menos de cerca de 100.000 nucleotídeos, cerca de 50.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou cerca de 50 nucleotídeos. De modo alternativo ou adicional, o comprimento de fita médio pode ser maior do que cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de 50.000 nucleotídeos ou cerca de 100.000 nucleotídeos. O comprimento de fita médio para uma população de cadeias polinucleotídicas alvo 48, ou amplicons das mesmas, pode ser em uma faixa entre um valor máximo e mínimo estabelecido acima.

[00122] Em alguns casos, uma população de cadeias polinucleotídicas molde/alvo 48 pode ser produzida sob condições ou configurada, de outro modo, para ter um comprimento máximo para seus membros. Por exemplo, o comprimento máximo para os membros pode ser menos de cerca de 100.000 nucleotídeos, cerca de 50.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de

5.000 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou cerca de 50 nucleotídeos. De modo alternativo ou adicional, uma população de cadeias polinucleotídicas de molde 48, ou amplicons das mesmas, pode ser produzida sob condições ou configurada, de outro modo, para ter um comprimento mínimo para seus membros. Por exemplo, o comprimento mínimo para os membros pode ser mais de cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 1.000 nucleotídeos, cerca de 5.000 nucleotídeos, cerca de 10.000 nucleotídeos, cerca de

50.000 nucleotídeos ou cerca de 100.000 nucleotídeos. O comprimento de fita máximo e mínimo para cadeias polinucleotídicas de molde 48 em uma população pode ser em uma faixa entre um valor máximo e mínimo estabelecido acima.

[00123] Conforme mostrado na Figura 5, a cadeia polinucleotídica molde 48 introduzida ao sistema de detecção 10 (ou 10’, 10’’) pode ser retida no lugar pela polimerase 20, que, neste exemplo, é ligada por tirante (tether) ao canal eletricamente condutor 16. A cadeia polinucleotídica de molde 48 mostrada na Figura 5 é uma fita de molde de DNA. A cadeia polinucleotídica de molde 48 pode ser introduzida em uma solução biologicamente estável, em conjunto com reagentes, tais como os nucleotídeos marcados 26. A solução biologicamente estável pode ser qualquer tampão adequado para reações de incorporação de base de polimerase, tais como reação em cadeia de polimerase (PCR) ou amplificação linear. Conforme um exemplo, a solução biologicamente estável pode incluir um tampão que tem um pH próximo a 7, uma concentração de sal acima de alguns milimolar, e íons Mg2+ em concentração milimolar.

[00124] Além disso, conforme mostrado na Figura 5, o nucleotídeo marcado 26 pode incluir uma base que é complementar a um ácido nucleico alvo da cadeia polinucleotídica de molde 48. O nucleotídeo marcado 26 será mantido no lugar, em parte, pela polimerase 20 que também é ligada à cadeia polinucleotídica de molde

48. Conforme um exemplo, a polimerase 20 pode incorporar um nucleotídeo particular 30, o nucleotídeo 30 pode ser mantido durante um período de tempo na faixa de alguns (por exemplo, 2) milissegundos a algumas centenas de milissegundos.

[00125] A interação entre o nucleotídeo marcado 26 e polimerase 20 e o comprimento da molécula de ligação 32 possibilitam que a etiqueta-alvo 24 se associe na proximidade da molécula carregada 18. Quando os sistemas de captação 10, 10’, 10’’ estão presentes em um arranjo e incluem sensores de carga individualmente endereçáveis e individualmente legíveis 11, 11’, 11’’, deve-se entender que o comprimento da molécula de ligação 32 também pode proibir que qualquer etiqueta-alvo individual 24 se associe a um sistema de detecção adjacente 10, 10’, 10’’ uma vez que o nucleotídeo marcado 26 interage com a polimerase 20 de um sistema de detecção particular 10, 10’, 10’’.

[00126] Em alguns exemplos, a associação da etiqueta-alvo 24 faz com que a concentração eficaz da etiqueta 24 aumente, fazendo com que a molécula carregada 18 se ligue ao marcador-alvo 24. A molécula carregada 18 pode mudar dinamicamente sua conformação em equilíbrio e, na ausência da etiqueta-alvo 24, pode passar a maior parte do tempo em uma conformação específica (isto é, a conformação favorecida não ligada). A ligação da etiqueta-alvo 24 fará com que a molécula carregada 18 se mova para uma conformação favorecida diferente (a partir da conformação favorecida não ligada). A conformação favorecida durante a ligação é diferente da conformação favorecida não ligada (por exemplo, a conformação mais exibida pela molécula carregada 18 na ausência da etiqueta ligada 24). A distribuição de carga na conformação favorecida não ligada é diferente da distribuição de carga na conformação favorecida (por exemplo, quando a molécula carregada 18 é ligada ao marcador 24). A mudança em distribuição de carga da molécula carregada 18, por sua vez, altera a condutância no canal 16.

[00127] A resposta do sensor de carga 11, 11’, 11’’ pode ser indicativa da base incorporada do nucleotídeo marcado 26, visto que a etiqueta-alvo 24 é específica de nucleotídeo (isto é, uma etiqueta específica 24 é selecionada para uma base específica) e visto que o sítio de reconhecimento 28 da molécula carregada 18 é de etiqueta específica. Como tal, o método também pode envolver associar a resposta do sensor de carga 11, 11’, 11’’ ao marcador específica de sítio de reconhecimento associada 24 (isto é, a etiqueta 24 que alterou a conformação da molécula carregada 18) e, com base na etiqueta específica de sítio de reconhecimento associada 24, identificar o nucleotídeo (por exemplo, a base) do nucleotídeo marcado associado 26 (isto é, o nucleotídeo marcado 26 que se associou à polimerase 20 e ao sítio de reconhecimento 28).

[00128] Deve-se entender que as taxas de ativação e desativação entre a molécula(s) carregada 18, 18’ e a etiqueta(s) 24 podem ser ajustadas de modo que sinais de padrão único sejam gerados.

[00129] Para etiquetas 24 com taxas lentas de desativação, a etiqueta 24 permanecerá ligada por uma duração significativa, por exemplo, durante todo o ciclo de incorporação de nucleotídeo. Essa ligação estendida produzirá mudanças no nível de CC da corrente em direção ao canal 16 do sensor de carga 11, 11’. Isso é ilustrado de forma esquemática na Figura 6A, em que diferentes etiquetas 24 com taxas lentas de desativação são usadas para os quatro nucleotídeos diferentes, resultando em quatro sinais detectáveis diferentes e distintos. Esses sinais podem ser detectados através de uma única molécula carregada 18, 18’ com quatro sítios de reconhecimento diferentes 28, ou através de até quatro moléculas carregadas diferentes 18, 18’, cada uma com um sítio de reconhecimento de etiqueta específica 28, ou através de uma única molécula carregada 18, 18’ com um único sítio de reconhecimento 28 que pode se ligar até quatro nucleotídeos diferentes em taxas de desativação lentas distintas.

[00130] Para etiquetas 24 com taxas rápidas de ativação e desativação, a etiqueta 24 pode se associar/desassociar da molécula carregada 18, 18’ múltiplas vezes durante todo o ciclo de incorporação de nucleotídeo. Essa rápida ativação e desativação de ligação produzirá sinais similares à vibração (por exemplo, nível de CC, amplitude, frequência, níveis de percentil, distribuição característica, etc.) do sensor de carga 11, 11’. Isso é ilustrado de forma esquemática na Figura 6B, em que diferentes etiquetas 24 com taxas de ativação e desativação rápidas são usadas para os quatro nucleotídeos diferentes, resultando em quatro sinais detectáveis diferentes e distintos. Esses sinais podem ser detectados através de uma única molécula carregada 18, 18’ com quatro sítios de reconhecimento diferentes 28, ou através de até quatro moléculas carregadas diferentes 18, 18’, cada uma com um sítio de reconhecimento de etiqueta específica 28, ou através de uma única molécula carregada 18, 18’ com um único sítio de reconhecimento 28 que pode se ligar de um a quatro nucleotídeos diferentes em taxas de ativação e desativação distintas.

[00131] A frequência à qual o estado conformacional da molécula carregada 18, 18’ é mudado também pode ser monitorada.

[00132] A magnitude das respostas de sensor de carga também pode ser distinta. Em alguns exemplos, o sítio de reconhecimento 28 é para ligar,

reversivelmente, até quatro diferentes nucleotídeos marcados 26. Quando um dentre os quatro nucleotídeos marcados diferentes 26 é associado à polimerase 20 e ao sítio de reconhecimento 28, a resposta do sensor de carga 11, 11’, 11’’ tem uma magnitude distinta que pode ser usada para identificar o um dentre os quatro nucleotídeos marcados diferentes 26. Cada um dentre os quatro nucleotídeos marcados diferentes 26 também pode ter uma magnitude distinta (por exemplo, uma magnitude que é diferente das magnitudes associadas a cada um dentre os outros quatro nucleotídeos marcados diferentes 26).

[00133] Em outros exemplos, as modalidades das Figuras 6A e 6B podem ser combinadas de alguma forma. Por exemplo, em uma pluralidade de nucleotídeos marcados 26 exposta ao sistema de detecção 10, 10’, 10’’, algumas etiquetas 24 podem ser usadas as quais têm taxas de ativação e desativação lentas e outras etiquetas 24 podem ser usadas as quais têm taxas de ativação e desativação rápidas.

[00134] Como resultado do ciclo de incorporação descrito na presente invenção, a base do nucleotídeo marcado associado 26 será incorporada a uma fita nascente 50 que é hibridizada à cadeia polinucleotídica de molde 48. Quando a base é totalmente incorporada e a estrutura principal de açúcar da fita nascente 50 é estendida, o ligante 32 entre o nucleotídeo 30 e a etiqueta 24 é naturalmente clivado. Isso resulta em uma redução da concentração eficaz da etiqueta 24 de volta a níveis de base. A etiqueta-alvo 24 se desassocia e a molécula mudada 18, 18’ retorna para a sua conformação não ligada (por vezes denominada “tipo selvagem”), em que exibe, preferencialmente, a conformação favorecida não ligada.

[00135] O método revelado na presente invenção pode ser repetido por um número desejado de ciclos de sequenciamento.

[00136] Os nucleotídeos marcados 26 e sistemas de captação 10, 10’, 10’’ revelados na presente invenção podem ser usados para qualquer uma dentre uma variedade de aplicações. Conforme descrito em referência à Figura 5, uma aplicação particularmente útil é sequenciamento de ácido nucleico, tal como sequenciamento por síntese (SBS). No SBS, a extensão de um iniciador de sequenciamento de ácido nucleico ao longo de um ácido nucleico de molde 48 é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no molde. O processo químico subjacente pode ser polimerização (por exemplo, conforme catalizado por uma enzima polimerase 20, conforme descrito na presente invenção). Em um exemplo particular de SBS com base em polimerase, nucleotídeos (por exemplo, bases) são adicionados a um iniciador de sequenciamento (estendendo, desse modo, o iniciador de sequenciamento) de um modo dependente de molde de modo que a detecção da ordem e tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador para formar uma fita nascente possa ser usada para determinar a sequência do molde. Uma pluralidade de diferentes moldes 48 em diferentes sistemas de captação 10, 10’, 10’’ de um arranjo pode ser submetida a uma técnica de SBS. Eventos que ocorrem em diferentes moldes 48 podem ser distinguidos, em parte, devido à localização do sistema de detecção específico 10, 10’, 10’’ no arranjo. Os sensores de carga 11, 11’ de cada sistema de detecção 10, 10’, 10’’ no arranjo podem ser individualmente endereçáveis e legíveis e, desse modo, sinais em cada sensor 11, 11’ podem ser detectados.

[00137] Outras aplicações adequadas para os nucleotídeos marcados 26 e sistemas de captação 10, 10’, 10’’ revelados na presente invenção incluem sequenciamento por ligação e sequenciamento por hibridização.

[00138] Deve-se verificar que todas as combinações dos conceitos antecedentes e conceitos adicionais discutidos em mais detalhes abaixo (desde que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) são contempladas como sendo parte da matéria inventiva revelada na presente invenção. Em particular, todas as combinações da matéria reivindicada que aparece ao final desta invenção são contempladas como sendo parte da matéria inventiva revelada na presente invenção. Deve-se verificar também que a terminologia explicitamente empregada na presente invenção que também pode aparecer em qualquer invenção incorporada a título de referência deve ser compatível com um significado mais consistente com os conceitos particulares revelados na presente invenção.

[00139] A referência ao longo do relatório descritivo a “um (1) exemplo”, “outro exemplo”, “um exemplo”, e assim por diante, significa que um elemento particular (por exemplo, recurso, estrutura e/ou característica) descrito em conexão com o exemplo está incluído em pelo menos um exemplo descrito na presente invenção, e pode ou não estar presente em outros exemplos. Além disso, deve-se entender que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer modo adequado nos vários exemplos, a menos que o contexto estabeleça claramente de outro modo.

[00140] Os termos “substancialmente” e “cerca de”, usados ao longo desta invenção, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e considerar pequenas oscilações, tais como devido a variações em processamento. Por exemplo, os mesmos podem se referir a menos do que ou igual a ±5%, tal como menos do que ou igual a ±2%, tal como menos do que ou igual a ±1%, tal como menos do que ou igual a ±0,5%, tal como menos do que ou igual a ±0,2%, tal como menos do que ou igual a ±0,1%, tal como menos do que ou igual a ±0,05%.

[00141] Além disso, deve-se entender que as faixas fornecidas na presente invenção incluem a faixa estabelecida e qualquer valor ou subfaixa dentro da faixa estabelecida, como se fossem explicitamente citados. Por exemplo, uma faixa representada por 1 nm a menos de 1 µm, deve ser interpretada para incluir não só os limites explicitamente citados de 1 nm a menos de 1 µm, mas também para incluir valores individuais, tais como cerca de 15 nm, 22,5 nm, 45 nm, etc., e subfaixas, tais como de cerca de 20 nm a cerca de 48 nm, etc.

[00142] Embora diversos exemplos tenham sido descritos em detalhes, deve- se entender que os exemplos revelados podem ser modificados. Portanto, a descrição antecedente deve ser considerada não limitante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um sistema de detecção, compreendendo: um sensor de carga incluindo: dois eletrodos; e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada fixada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: inclui um sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um marcador de um nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento está ligado ao marcador, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada.

2. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, em que a molécula carregada é um aptâmero carregado.

3. O sistema de detecção como definido na reivindicação 2, em que o aptâmero carregado é selecionado a partir do grupo que consiste em um aptâmero de DNA, um aptâmero de RNA e um análogo do mesmo.

4. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, em que a molécula carregada é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína carregada e um peptídeo carregado.

5. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, em que:

a molécula carregada: inclui, adicionalmente, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um segundo marcador de um segundo nucleotídeo marcado e tem uma segunda conformação favorecida associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento está ligado ao segundo marcador; inclui, adicionalmente, um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um terceiro marcador de um terceiro nucleotídeo marcado e tem uma terceira conformação favorecida associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento está ligado ao terceiro marcador; e inclui, adicionalmente, um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um quarto marcador de um quarto nucleotídeo marcado e tem uma quarta conformação favorecida associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento está ligado ao quarto marcador; e a conformação favorecida não ligada associada à configuração de carga não ligada ocorre quando cada um dentre o sítio de reconhecimento, o segundo sítio de reconhecimento, o terceiro sítio de reconhecimento e o quarto sítio de reconhecimento não estão ligados.

6. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, compreendendo, adicionalmente: uma segunda molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a segunda molécula carregada: inclui um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um segundo marcador de um segundo nucleotídeo marcado;

tem uma segunda conformação favorecida não ligada a molécula carregada associada a uma segunda configuração de carga não ligada a molécula carregada; e tem uma segunda conformação favorecida de molécula carregada associada a uma segunda configuração de carga de molécula carregada quando o segundo sítio de reconhecimento está ligado ao segundo marcador.

7. O sistema de detecção como definido na reivindicação 6, compreendendo, adicionalmente: uma terceira molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a terceira molécula carregada: inclui um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um terceiro marcador de um terceiro nucleotídeo marcado; tem uma terceira conformação favorecida não ligada a molécula carregada associada a uma terceira configuração de carga não ligada a molécula carregada; e tem uma terceira conformação favorecida de molécula carregada associada a uma terceira configuração de molécula carregada quando o terceiro sítio de reconhecimento está ligado ao terceiro marcador; e uma quarta molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a quarta molécula carregada: inclui um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um quarto marcador de um quarto nucleotídeo marcado; tem uma quarta conformação favorecida não ligada a molécula carregada associada a uma quarta configuração de carga não ligada a molécula carregada; e tem uma quarta conformação favorecida de molécula carregada associada a uma quarta configuração de carga de molécula carregada quando o quarto sítio de reconhecimento está ligado ao quarto marcador.

8. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, em que: a molécula carregada inclui, adicionalmente, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um segundo marcador de um segundo nucleotídeo marcado e tem uma segunda conformação favorecida associada a uma segunda configuração de carga quando o segundo sítio de reconhecimento está ligado ao segundo marcador; e o sistema de detecção compreende, adicionalmente uma segunda molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a segunda molécula carregada: inclui: um terceiro sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um terceiro marcador de um terceiro nucleotídeo marcado; e um quarto sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um quarto marcador de um quarto nucleotídeo marcado; tem uma segunda conformação favorecida não ligada a molécula carregada associada a uma segunda configuração de carga não ligada a molécula carregada; tem uma terceira conformação favorecida associada a uma terceira configuração de carga quando o terceiro sítio de reconhecimento está ligado ao terceiro marcador; e tem uma quarta conformação favorecida associada a uma quarta configuração de carga quando o quarto sítio de reconhecimento está ligado ao quarto marcador.

9. O sistema de detecção como definido na reivindicação 1, em que a molécula carregada inclui, adicionalmente, um segundo sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um segundo marcador do nucleotídeo marcado.

10. Um sistema de detecção, compreendendo: um sensor de carga incluindo: dois eletrodos; e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: inclui um sítio de reconhecimento para ligar, reversivelmente, um marcador de um nucleotídeo marcado; tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando o sítio de reconhecimento está ligado ao marcador, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada a pelo menos um dentre os dois eletrodos ou a um substrato no qual o sensor de carga é posicionado.

11. O sistema de detecção como definido na reivindicação 10, em que o substrato é um substrato padronizado, em que o sensor de carga é posicionado em uma depressão do substrato padronizado, e em que a polimerase é ligada a uma superfície da depressão.

12. Um aparelho de detecção, compreendendo: uma célula de fluxo; e um sistema de detecção integrado à célula de fluxo, o sistema de detecção inclui: um sensor de carga incluindo um canal eletricamente condutor; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando um sítio de reconhecimento da molécula carregada está ligado a um marcador de um nucleotídeo marcado, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada.

13. O aparelho de detecção como definido na reivindicação 12, compreendendo, adicionalmente, um sistema de entrega de reagente para introduzir, seletivamente, um reagente em uma entrada da célula de fluxo.

14. O aparelho de detecção como definido na reivindicação 12, em que o reagente está em um recipiente de amostra, o reagente incluindo o nucleotídeo marcado, que inclui: um nucleotídeo; uma molécula de ligação ligada a um grupo fosfato do nucleotídeo; e um marcador específico de sítio de reconhecimento ligada à molécula de ligação.

15. O aparelho de detecção como definido na reivindicação 12, compreendendo, adicionalmente, um detector para detectar uma resposta do sensor de carga.

16. Um aparelho de detecção, compreendendo: uma célula de fluxo; e um sistema de detecção integrado na célula de fluxo, o sistema de detecção incluindo: um sensor de carga incluindo um canal eletricamente condutor; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada: tem uma conformação favorecida não ligada associada a uma configuração de carga não ligada; e tem uma conformação favorecida associada a uma configuração de carga quando um sítio de reconhecimento da molécula carregada está ligado a um marcador de um nucleotídeo marcado, em que a configuração de carga é diferente da configuração de carga não ligada; e uma polimerase ligada a pelo menos um dentre os dois eletrodos ou a um substrato da célula de fluxo.

17. O aparelho de detecção como definido na reivindicação 16, em que o substrato é um substrato padronizado, em que o sensor de carga é posicionado em uma depressão do substrato padronizado, e em que a polimerase é ligada a uma superfície da depressão.

18. Um método, compreendendo: introduzir uma cadeia polinucleotídica molde em um sistema de detecção incluindo: um sensor de carga incluindo: dois eletrodos; e um canal eletricamente condutor conectando os dois eletrodos; uma molécula carregada ligada ao canal eletricamente condutor, em que a molécula carregada inclui um sítio de reconhecimento; e uma polimerase ligada ao canal eletricamente condutor ou à molécula carregada; introduzir reagentes incluindo nucleotídeos marcados ao sistema de detecção, em que um nucleotídeo de um dentre os nucleotídeos marcados se associa à polimerase e um marcador específico de sítio de reconhecimento de um dentre os nucleotídeos marcados se associa ao sítio de reconhecimento para induzir uma mudança conformacional da molécula carregada; e em resposta à mudança conformacional da molécula carregada, detectar uma resposta do sensor de carga.

19. O método como definido na reivindicação 18, compreendendo, ainda: associar a resposta do sensor de carga ao marcador específico de sítio de reconhecimento associado; e baseado no marcador específico de sítio de reconhecimento associado, identificar o nucleotídeo de um dentre os nucleotídeos marcados.

20. O método como definido na reivindicação 18, em que a molécula carregada inclui uma pluralidade de sítios de reconhecimento diferentes, cada um dos quais é para ligar, reversivelmente, um marcador diferente de um nucleotídeo marcado diferente a uma taxa distinta.

21. O método como definido na reivindicação 20, compreendendo adicionalmente: detectar uma pluralidade de respostas do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando diferentes nucleotídeos marcados se associam, respectivamente, à polimerase e diferentes marcadores específicos de sítio de reconhecimento dos diferentes nucleotídeos marcados se ligam, respectivamente, a um dentre a pluralidade de diferentes sítios de reconhecimento; e identificar os nucleotídeos marcados diferentes respectivamente associados pelas taxas distintas.

22. O método como definido na reivindicação 18, em que o sítio de reconhecimento é para ligar, reversivelmente, uma pluralidade de marcadores diferentes de uma pluralidade de nucleotídeos marcados diferentes em uma pluralidade de taxas distintas, e em que o método compreende, adicionalmente: detectar uma pluralidade de respostas do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando pelo menos alguns dentre os diferentes nucleotídeos marcados se associam, respectivamente, à polimerase e pelo menos alguns dentre os diferentes marcadores se ligam, respectivamente, ao sítio de reconhecimento; e identificar os diferentes nucleotídeos marcados respectivamente associados pelas taxas distintas.

23. O método como definido na reivindicação 18, em que o sítio de reconhecimento é para ligar, reversivelmente, até quatro nucleotídeos marcados diferentes, e em que o método compreende, adicionalmente: detectar até quatro respostas diferentes do sensor de carga em resposta a diferentes mudanças conformacionais da molécula carregada quando até quatro nucleotídeos marcados diferentes se associam, respectivamente, à polimerase e ao sítio de reconhecimento, em que cada uma dentre até quatro respostas diferentes tem uma magnitude distinta; e identificar os diferentes nucleotídeos marcados respectivamente associados pelas magnitudes distintas.