JP2022510063A - 感知システム - Google Patents

Abstract

感知システムは、２つの電極、および２つの電極を連結する１つの導電性チャネルを含む荷電センサーを含む。また、感知システムは、導電性チャネルに結合した荷電分子を含む。荷電分子は、標識されたヌクレオチドの標識を可逆的に結合するための認識部位を含み；非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し；および、認識部位が標識に結合する場合に、荷電配置と会合する優先構造を有する。荷電配置は非結合荷電配置とは異なる。感知システムは、さらに、導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼを含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年１２月２１日付けで出願された米国仮出願第６２／７８３，９５１号の優先権を主張し、ここに出典明示してその内容のすべてを本願明細書の一部とみなす。

（背景）
生物学的または化学的研究の種々のプロトコールは、局所的支持体表面上または所定の反応チャンバ内の多数の制御反応を行なうことを含む。次いで、指定の反応を観察または検知してもよく、後の分析は、反応に関与する化学物質の特性を識別または明らかにするのを助け得る。いくつかの例において、制御反応は蛍光を生成し、かくして、光学系を検知に用いてもよい。他の例において、制御反応は荷電、伝導性（conductivity）またはいくつかの他の電気的特性を改変し、かくして、電子システムを検知に用いてもよい。

（緒言）
本明細書に開示した第１の態様は、２つの電極、および前記２つの電極を連結する１つの導電性（electrically conductive）チャネルを含む荷電センサー；前記導電性チャネルに結合した（または付着した、attached）荷電分子、前記荷電分子は、標識されたヌクレオチドの標識を可逆的に結合するための認識部位を含み、非結合荷電配置（unbound charge configuration）と会合する非結合優先構造（favored conformation）を有し、かつ認識部位が標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、ここに、前記荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；ならびに導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼを含む感知システムである。

本第１の態様の例において、荷電分子は荷電したアプタマーである。本例において、荷電したアプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーおよびそのアナログよりなる群から選択される。

本第１の態様のある例において、荷電分子は、荷電したタンパク質および荷電したペプチドよりなる群から選択される。

本第１の態様において、荷電分子は、さらに、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み、第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電配置と会合する第２の優先構造を有し；さらに、第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位を含み、かつ第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電配置と会合する第３の優先構造を有し；さらに、第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み、第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電配置と会合する第４の優先構造を有し；および、認識部位、第２の認識部位、第３の認識部位および第４の認識部位の各々が未結合である場合に非結合荷電配置と会合した非結合優先構造が生じる。

本第１の態様の例において、感知システムは、さらに、導電性チャネルに結合した第２の荷電分子を含み、第２の荷電分子は、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み；第２の荷電分子非結合荷電配置と会合する第２の荷電分子非結合優先構造を有し；かつ第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電分子荷電配置と会合した第２の荷電分子優先構造を有する。本例において、また、感知システムは、さらに、導電性チャネルに結合した第３の荷電分子、ここに、第３の荷電分子は、第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位を含み；第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電分子荷電配置と会合する第３の荷電分子優先構造を有し；および導電性チャネルに結合した第４の荷電分子、ここに、第４の荷電分子は、第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み；第４の荷電分子非結合荷電配置と会合する第４の荷電分子非結合優先構造を有し；かつ、第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電分子荷電配置と会合する第４の荷電分子優先構造を有する、を含む。

本第１の態様の例において、荷電分子は、さらに、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み、第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電配置と会合する第２の優先構造を有し；かつ、感知システムが、さらに、導電性チャネルに結合した第２の荷電分子を含み、第２の荷電分子は、第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位および第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み；第２の荷電分子非結合荷電配置と会合した第２の荷電分子非結合優先構造を有し；第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電配置と会合する第３の優先構造を有し；かつ、第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電配置と会合する第４の優先構造を有する。

本第１の態様のある例において、荷電分子は、さらに、標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含む。

本明細書に開示した感知システムのいずれの特徴もいずれかの望ましい方法および／または配置で一緒に組み合わせてもよいと理解されるべきである。

本明細書に開示した第２の態様は、フローセルおよび前記フローセルに統合された感知システムを含む感知装置であり、感知システムは、導電性チャネルを含む荷電センサー；および導電性チャネルに結合した荷電分子を含み、ここに、荷電分子は、非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し；荷電分子の認識部位が標識されたヌクレオチドの標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；ならびに導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼを含む。

本第２の態様のある例において、感知装置は、さらに、フローセルの流入口（input）に試薬を選択的に導入するための試薬送達システムを含む。いくつかの例において、試薬は、サンプル容器内にあり、試薬は、ヌクレオチド；ヌクレオチドのリン酸基に結合した連結分子；および連結分子に結合した認識部位特異的標識を含む標識されたヌクレオチドを含む。

本第２の態様の例において、感知装置は、さらに、荷電センサーからの応答を検知するための検知器を含む。

感知装置のいずれかの特徴もいずれかの望ましい方法で一緒に組み合わせてもよいと理解されるべきである。さらに、感知システムおよび／または感知装置の特徴のいずれの組み合わせも、本明細書に開示した例のいずれとも一緒に用いても、または組み合わせてよいと理解されるべきである。

本明細書に開示した第３の態様は、２つの電極および２つの電極を連結する１つの導電性チャネルを含む荷電センサー；導電性チャネルに結合した荷電分子、ここに、荷電分子は認識部位を含み；および導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼを含む感知システムに、鋳型ポリヌクレオチド鎖を導入すること；感知システムに標識されたヌクレオチドを含む試薬を導入し、それにより、標識されたヌクレオチドの１つのヌクレオチドがポリメラーゼと会合し、標識されたヌクレオチドの１つの認識部位特異的標識が、認識部位と会合して、荷電分子の構造変化を誘導すること；および荷電分子の構造変化に応じて、荷電センサーの応答を検知することを含む方法である。

本第３の態様の例において、方法は、さらに、荷電センサーの応答を、会合した認識部位特異的標識に関連させること；および、会合した認識部位特異的標識に基づいて、標識されたヌクレオチドの１つのヌクレオチドを識別することを含む。

本第３の態様の例において、荷電分子は複数の異なる認識部位を含み、その各々は、別々の速度で異なる標識されたヌクレオチドの異なる標識を可逆的に結合するためのものである。いくつかの例において、方法は、異なる標識されたヌクレオチドがそれぞれポリメラーゼと会合し、異なる標識されたヌクレオチドの異なる認識部位特異的標識が複数の異なる認識部位の一つに結合する場合に荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの複数の応答を検知すること；および、別々の速度によってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別することをさらに含む。

本第３の態様の例において、認識部位は、複数の別々の速度にて複数の異なる標識されたヌクレオチドの複数の異なる標識を可逆的に結合し、ここに、方法は、さらに、異なる標識されたヌクレオチドの少なくともいくつかがそれぞれポリメラーゼと会合し、かつ、異なる標識の少なくともいくつかがそれぞれ認識部位に結合する場合に、荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの複数の応答を検知すること；および別々の速度によってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別することを含む。

本第３の態様の例において、認識部位は、４以下の異なる標識されたヌクレオチド可逆的に結合するためのものであり、ここに、方法は、さらに、４以下の異なる標識されたヌクレオチドがそれぞれ、ポリメラーゼおよび認識部位と会合する場合に、荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの４以下の異なる応答を検知すること、ここに、４以下の異なる応答の各々は別々の大きさを有し；および、別々の大きさによってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別することを含む。

方法のいずれの特徴もいずれかの望ましい方法で一緒に組み合わせてもよいと理解されるべきである。さらに、方法および／または感知システムおよび／または感知装置の特徴のいずれの組合せも、本明細書に開示した例のいずれかと一緒に用いても、および／または組み合わせてもよいと理解されるべきである。

本明細書に開示した第４の態様は、２つの電極および２つの電極を連結する１つの導電性チャネル；導電性チャネルに結合した荷電分子、ここに、荷電分子は、標識されたヌクレオチドの標識を可逆的に結合するための認識部位を含み；非結合荷電配置と会合する非結合優先構造；および、認識部位が標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、荷電配置は非結合荷電配置とは異なり;および２つの電極の少なくとも１つ、または荷電センサーが位置する基板に結合したポリメラーゼを含む荷電センサーを含む感知システムである。

第４の態様の１例において、基板は、パターン化（patterned）基板であり、荷電センサーはパターン化基板のくぼみ(depression)に位置し、ポリメラーゼはくばみ表面に結合する。

本感知システムのいずれかの特徴もいずれかの望ましい方法で一緒に組み合わせてもよいと理解されるべきである。さらに、本感知システムおよび／または方法および／または他の感知システムおよび／または感知装置の特徴のいずれかの組合せも、本明細書に開示した例のいずれかと一緒に用いてもならびに／あるいは組み合わせてもよいと理解されるべきである。

本明細書に開示した第５の態様は、フローセル；およびフローセルに統合された感知システムを含む感知装置であり、感知システムは、導電性チャネルを含む荷電センサー；導電性チャネルに結合した荷電分子、ここに、荷電分子は、非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し、かつ荷電分子の認識部位が標識されたヌクレオチドの標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、ここに、荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；かつ２つの電極の少なくとも１つまたはフローセルの基板に結合したポリメラーゼを含む。

第５の態様の１つの例において、基板はパターン化基板であり、荷電センサーは、パターン化基板のくぼみに位置し、ポリメラーゼはくぼみの表面に結合している。

本感知装置のいずれかの特徴もいずれかの望ましい方法で一緒に組み合わせてもよいと理解されるべきである。さらに、本感知装置および／または方法および／または感知システムおよび／または他の感知装置の特徴のいずれの組合せも、本明細書に開示した例のいずれとも一緒に用いても、および／または組み合わせてもよいと理解されるべきである。

依然としてさらに、方法のいずれかおよび／または感知システムのいずれかおよび／または感知装置のいずれかの特徴も、いずれかの望ましい方法で一緒に組み合わせても、および／または本明細書に開示した例のいずれかと組み合わせてもよいと理解されるべきである。

本開示の例の特徴は、参照数字のごとく、同様であるが、恐らく同一ではない成分に対応する以下の詳細な記載および図面への参照により明らかになるであろう。簡潔さのために、以前に記載された機能を有する参照数字または特徴は、それらが現われる他の図面に関連して記載されても記載されなくてもよい。

図１Ａは、本明細書に開示されたセンサーのある例の模式図であり、双方は、荷電分子がその非結合優先構造中（「（ｉ）」にて示される）およびその優先構造中（「（ｉｉ）」にて示される）にある場合である； 図１Ｂは、本明細書に開示されたセンサーのもう一つの例の模式図であり、双方は、荷電分子がその非結合優先構造中（「（ｉ）」にて示される）およびその優先構造（示される「（ｉｉ）」にて示される）にある場合である； 図２は、本明細書に開示したセンサーのもう一つの例の模式図である； 図３Ａ～図３Ｅは、４つの異なる認識部位を有する荷電分子を含むセンサーのもう一つの例を示す模式図である； 図４は、本明細書に開示されたフローセルおよびセンサーの例を含む、感知システムの例の透視模式図である； 図５は、本明細書に開示した方法のある例を模式的に示す； 図６Ａおよび６Ｂは、本明細書に開示したセンサーの有望な（potential）応答を示すグラフである； 図７Ａは、フローセルのもう一つの例の上面図である；および 図７Ｂは、図７Ａのフローセルの構造に位置したセンサーの例についての拡大された部分切取図である。

（詳細な記載）
核酸配列決定手順において単一分子検知に用い得る感知システムを本明細書に開示する。感知システムは、荷電センサーの導電性チャネルに結合した荷電部位（または荷電基、charged moiety）を含む。荷電部位は、荷電センサーによって検知可能な荷電部位を再形成する事象（例えば、標的標識の結合）が生じるまで、それが検知されないように導電性チャネルに結合する。より詳細には、荷電部位は、ポリメラーゼによって組込むことができるヌクレオチドに結合した標的標識との可逆的結合を受けることができる。標的標識が荷電部位に結合する結果、結合した荷電部位は、荷電の空間的分布を改変する構成変更を受ける。荷電センサー中の導電性チャネルに関しての荷電部位の接近により、荷電センサーは新たに示された荷電に応答し、検知可能なシグナルを生成する。デバイ（Debye）遮蔽長が典型的には１ｎｍ未満である場合、検知可能なシグナルは、塩イオンの生物学的に関連するかまたは生理的濃度でさえ生成される。例として、導電性チャネルにより接近して負の荷電部位を移動させる構造は、トランスコンダクタンスを減少させることができるが、一方で導電性チャネルから離れて負の荷電部位を移動させる構造は、トランスコンダクタンスを増加することができる。かくして、異なる荷電部位構造の結果として、別々の検知可能なシグナルを生じる。検知可能な荷電が荷電部位上に存在するため、荷電は標的標識上に存在する必要はなく、これは有利になりことができる。

本明細書に開示した例において、標的標識は、ポリメラーゼによって組み込むことができる特別のヌクレオチドにカスタマイズすることができる。標的標識が荷電部位における所望の構造変化を誘導するため、得られたシグナルは特別のヌクレオチドを識別するために用いることができる。さらに、荷電の大きさに加えて、標的標識および１以上の荷電部位間のオン・オフ速度を用いて、ユニークな頻度で示すユニークな指紋シグナルを生成でき、これを用いて標的標識に連結されたそれぞれのヌクレオチドを識別することができる。

図１Ａおよび１Ｂを今や参照すると、感知システム１０、１０’の２つの例がそれぞれ示されている。感知システム１０、１０’の各々は荷電センサー１１、１１’を含み、これらは２つの電極１２、１４、および２つの電極１２および１４を連結する導電性チャネル１６を含む。また、感知システム１０、１０’は、荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６に結合した荷電分子１８または１８’、および導電性チャネル１６（図１Ａ）または荷電分子１８’（図１Ｂ）に結合したポリメラーゼ２０を含む。

感知システムの他の例において、ポリメラーゼ２０は、感知システム１０、１０’の他の成分に（例えば、電極１２または１４に）および／または感知システム１０、１０’が統合されるフローセルの他の成分に結合されてもよい。組み込まれるヌクレオチドの標識をポリメラーゼ２０によって荷電分子１８または１８’に可逆的に結合することができる限りは、ポリメラーゼ２０は、荷電センサー１１、１１’に隣接するいずれの領域に結合してもよい。いくつかの例において、ポリメラーゼ２０は、荷電分子１８または１８’の約５ｎｍ～約５０ｎｍの距離内で結合される。

荷電センサー１１、１１’は、電界効果トランジスター（ＦＥＴ）、例えば、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）ベースのＦＥＴ、および単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）ベースのＦＥＴ、シリコン・ナノワイヤー（ＳｉＮＷ）ＦＥＴ、シリコン・ナノチューブＦＥＴ、ポリマー・ナノワイヤーＦＥＴ、グラフェン・ナノリボンＦＥＴ（およびＭｏＳ_２、シリコーン（silicene）のごとき２Ｄ材料から作製された関連するナノリボンＦＥＴ）、金属酸化物半導体ＦＥＴ（ＭＯＳＦＥＴ）、トンネルＦＥＴ（ＴＦＥＴ）、または外部場によって調整することができるコンダクタンスを持つ他のデバイス、例えば、金属性ＣＮＴまたは多層ＣＮＴであってもよい。ＦＥＴにおいて、電極１２、１４はソース（source）およびでドレイン端子であり、導電性チャネル１６はゲート端子である。電界効果トランジスターは、ｎ型基板中のｐ型ソースおよびドレイン端子を有するＰＭＯＳまたはｐ－チャネルであっても、あるいは、ｐ型基板中のｎ型ソースおよびドレイン端子を有するＮＭＯＳ、またはｎ－チャネルであってもよい。

電極１２、１４はいずれの適当な導電材料も含んでもよい。適当なソースおよびドレイン端子の例には、コバルト、ケイ化コバルト、ニッケル、ケイ化ニッケル、アルミニウム、タングステン、銅、チタン、モリブデン、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、インジウム亜鉛（indium zin）酸化物、金、プラチナ、炭素などが含まれる。

導電性チャネル１６は、ナノスケール（１ｎｍ～１μｍ未満の範囲）の少なくとも１つの寸法を有するナノ構造体であってもよい。１例において、少なくとも１つの寸法は最大の寸法をいう。

また、導電性チャネル１６は、いずれかの適当な幾何学、例えば、管状構造、ワイヤー構造、平面構造などを有してもよく、いずれかの適当な半導電性または導電性材料であってもよい。例として、導電性チャネル１６は、半導体ナノ構造体、グラフェン・ナノ構造体、金属ナノ構造体、導電性高分子ナノ構造体または分子ワイヤーよりなる群から選択してもよい。いくつかの例において、ナノ構造体は、多層または単層ナノチューブ、ナノワイヤー、ナノリボンなどであってもよい。特定の例として、ナノ構造体は、カーボンナノチューブ、単層カーボンナノチューブ、シリコン・ナノワイヤー、シリコン・ナノチューブ、ポリマー・ナノワイヤー、グラフェン・ナノリボン、ＭｏＳ_２ナノリボン、シリコン・ナノリボンなどであってもよい。

システム１０、１０’において、荷電分子１８、１８’が、荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６に共有結合または非共有結合で結合される。荷電分子１８、１８’は、導電性チャネル１６へ直接結合してよく、または繋留（またはテザー、tether）を介して導電性チャネル１６へ間接的に結合してもよい。荷電分子１８、１８’の結合は、導電性チャネル１６の付近（vicinity）内の、例えば、少数のデバイ長内に荷電分子１８、１８’を維持する。標識されたヌクレオチド２６の標的標識２４との可逆的結合を受けることができるいずれの適当な荷電分子１８、１８’も用いてもよい。より詳しくは、荷電分子１８、１８’は、標識２４に可逆的に結合することができる認識部位２８を含み、非結合荷電配置と会合した非結合優先構造Ａを有し（図１Ａおよび図１Ｂの各々における頂部部分（（ｉ）で標識）を参照）、認識部位２８が標識２４に結合する場合に荷電配置と会合した優先構造Ｂを有する（図１Ａおよび図１Ｂの各々における底部部分（（ｉｉ）で標識）を参照）。

用語「非結合優先構造」とは、標識２４がそれに結合されない場合に荷電分子１８、１８’によって優先的に示される１つの空間的配置をいう。標識２４が結合されない場合に、荷電分子１８、１８’は、ダイナミックにいくつかの異なる構造間で移動することができる。しかしながら、荷電分子１８、１８’は、標的標識２４が結合されない場合に他の空間的配置よりしばしば示される好ましい空間的配置を有する。本例において、この好ましい空間的配置（または優先的に示された空間的配置）は、例えば、分子安定性および／またはその最低のエネルギー状態であることにより最も好ましい配置であり、かくして、非結合優先構造Ａである。非結合優先構造Ａは、いくつかの例において、最も安定な構造および／または最低のエネルギー構造であってもよい。

非結合優先構造Ａは非結合荷電配置と会合する。非結合優先構造Ａ内にある場合に、非結合荷電配置は、荷電分子１８、１８’の荷電分布である。

用語「優先構造」は、標識２４がそれに可逆的に結合される場合に、荷電分子１８、１８’によって優先的に示される１つの空間的配置をいう。荷電分子１８、１８’の優先構造Ｂは、非結合優先構造Ａとは異なる。標的分子が荷電分子１８、１８’に結合する場合、荷電分子１８、１８’は、標的標識が結合する場合に他の空間的配置よりしばしば示される好ましい空間的配置に移動する。本例において、この好ましい空間的配置は、標的標識が結合する場合に、例えば、分子安定性により最も好ましい配置であり、かくして優先構造である。１例において、荷電分子１８、１８’は、平衡において多数の構造を有し、標識２４は、構造の１つを安定化させることができる。

優先構造Ｂは荷電配置と会合する。荷電配置は、その優先構造Ｂ中にある場合に、荷電分子１８、１８’の荷電分布である。優先構造Ｂと会合した荷電配置は、非結合荷電配置とは検知可能に異なる。荷電配置は、増減した大きさ、または頻度の変化などとして、（荷電センサーによって）検知可能である。

記載のごとく、標識されたヌクレオチド２６の標識２４は、認識部位２８に可逆的に結合することができる。かくして、認識部位２８は、標識２４についての一時的な受容体である。

図１Ａおよび図１Ｂの頂部部分（（ｉ）と標識された）は、非結合優先構造Ａ中の荷電分子１８、１８’を示す。本明細書に言及のごとく、非結合優先構造Ａは、認識部位２８がそれに結合した標識２４を有する場合に、荷電分子１８、１８’の好ましい配向または空間的配置をいう。非結合構造Ａ（図１Ａおよび図１Ｂの（ｉ）に示される）は、非結合荷電配置と会合する。非結合荷電配置は、その非結合優先構造Ａにある場合に、荷電分子１８、１８’の荷電分布である。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、荷電分布の重心（centroid）は「・」として示され、荷電重心および導電性チャネル１６の表面の間の距離は、「δ_１８Ａ」（図１Ａ）および「δ_１８’Ａ」（図１Ｂ）として示される。これらの図に示すごとく、荷電分布、重心および距離δ_１８Ａ、δ_１８’Ａは、各荷電分子１８、１８’について異なり、荷電分子１８、１８’が標的標識２４に結合する場合に変更することができる。

図１Ａおよび図１Ｂの底部部分（（ｉｉ）と標識された）は、優先構造Ｂにおいて、すなわち、標的標識２４が、認識部位２８に結合する場合に荷電分子１８、１８’を示す。本明細書に言及のごとく、優先構造Ｂ（図１Ａおよび図１Ｂにおいて（ｉｉ）で示される）は、標識２４が認識部位２８に結合する場合に、荷電分子１８、１８’の好ましい配向または空間的配置をいう。優先構造Ｂは荷電配置と会合する。荷電配置は、その優先構造Ｂにある場合に、荷電分子１８、１８’の荷電分布である。図１Ａ（ｉｉ）において、荷電分子１８の優先構造Ｂは、非結合優先構造Ａと比較される場合に、導電性チャネル１６の表面により近接して荷電分子１８を移動させる。優先構造Ｂの本例において、δ_１８Ｂはδ_１８Ａより小さく、荷電分子１８の負または正の荷電は、導電性チャネル１６への接近において接近している。図１Ｂ（ｉｉ）において、荷電分子１８’の優先構造Ｂは、非結合優先構造Ａと比較される場合に、導電性チャネル１６の表面から離れて荷電分子１８’を移動させる。優先構造Ｂの本例において、δ_１８’Ｂはδ_１８’Ａより大きく、荷電分子１８の負または正の荷電は導電性チャネル１６からさらに離れている。荷電分子１８、１８’の荷電の運動に応じて、導電性チャネル１６の導電性は変化する。本明細書に開示された例において、移動の２つの方向の変化のサインは、相互に反対であり；実際のサインは、感知システム１０、１０’の性質に依存する。例として、応答および反発または退縮（retraction）のサインは、荷電センサー１１、１１’がＦＥＴであるかどうか、またはそれがＦＥＴであるならば、消耗または転換モードにあるかどうか、そのチャネル・キャリアーが電子およびホールであるならば、に依存する。

荷電分子１８、１８’は、荷電したアプタマー、荷電したタンパク質または荷電したペプチドであってもよい。本明細書に用いた用語「荷電したアプタマー」は、
１）標識に可逆的に結合でき、２）その優先構造を変更させることができ、それにより、標識に可逆的に結合する際に、荷電分布を改変することができる構造化して荷電した核酸をいい：用語「荷電したタンパク質」は、１）標識に可逆的に結合でき、２）その優先構造を変更させることができ、それにより、標識に可逆的に結合する際に、荷電分布を改変することができる構造化して荷電した高分子をいい；また、用語「荷電したペプチド」は、１）標識に可逆的に結合でき、２）その優先構造を変更させることができ、それにより、標識に可逆的に結合する際に、荷電分布を改変することができるペプチド（アミド）結合によって連結したアミノ酸モノマーの構造化して荷電した短鎖をいう。

いくつかの例において、荷電分子１８、１８’は負に荷電している。適当な負の荷電分子１８、１８’の例は、負に荷電したアプタマー、負に荷電したタンパク質、負に荷電したペプチドおよび他の負の荷電分子を含む。負に荷電したアプタマーのいくつかの特定の例は、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーまたはそのアナログを含む。負に荷電したタンパク質のいくつかの特定の例は、ＨＳＦ１（－１７）、ＳＨＦＭ１（－２１）、ＮＦＫＢＩＡ（－２５）、ＲＢＢＰ４（－２６）、ＡＰＰ（－５５）、ＰＪＡ２（－８７）および多数の他のものを含む。負に荷電したペプチドの例は、ポリグルタマートおよびポリアスパルタート、ならびにより構造化したペプチド、例えば、負に荷電した表面を持つコイルドコイルを含む。

いくつかの例において、荷電分子は正に荷電している。適当な正の荷電分子１８、１８’の例は、正に荷電したアプタマー、正に荷電したタンパク質、正に荷電したペプチドおよび他の正の荷電分子を含む。正に荷電したタンパク質のいくつかの特定例には、Ｈ２ＡＦＸ（＋１７）、ＰＡＲＰ１（＋２１）、ＥＬＮ（＋４０）、ＴＥＲＴ（＋９８）および多数の他のものを含む。正に荷電したペプチドの例は、ポリリシンおよびポリアルギニンならびにより構造化したペプチド、例えば、正に荷電した表面を持つコイルドコイルを含む。

一例において、荷電分子１８、１８’はポリメラーゼではない。

荷電分子１８、１８’は、荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６へ直接的もしくは間接的におよび／または共有結合または非共有結合を介して結合されてもよい。荷電分子１８、１８’および導電性チャネル１６間で形成された結合のタイプは、用いられる分子１８、１８’およびチャネル１６に依存するであろう。アプタマーが荷電分子１８、１８’として用いられる場合には、導電性チャネル１６はシラン化されて（silanized）アミン末端シランを生成してもよく、これはチオール化されたアプタマーと結合することができる。荷電分子１８、１８’を結合するために用い得る適当な界面化学の他の例には、（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、銅触媒クリック反応を受けることができるアジ化物を含み得る。他の例において、テザーを用いて、導電性チャネル１６に荷電分子１８、１８’を結合させてもよい。このテザーはテザー２２について本明細書に記載された例のいずれかであってもよい。

図１Ａに示される例において、ポリメラーゼ２０は、荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６上で固定化される。図１Ｂに示される例において、ポリメラーゼ２０は荷電分子１８’上で固定化される。他の例において、ポリメラーゼ２０は電極１２または１４の１つの上で固定化される（図７Ｂを参照）。依然として他の例において、ポリメラーゼ２０は、例えば、荷電センサー１１、１１’を支持する基板上で固定化される（図７Ｂを参照）。いずれの例においても、ポリメラーゼ２０はテザー２２を介して固定化してもよい。テザー２２はポリメラーゼ２０についてのアンカーとして用いられる。適当なテザー２２の一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの例において、テザー２２はポリメラーゼ２０を導電性チャネル１６から、または荷電分子１８から少なくとも１０ｎｍ離れて保持する。これは望ましいかもしれず、その結果、例えば、ポリメラーゼ２０へのコンフォーマル（conformal）変更、ポリメラーゼ２０の荷電、および／またはポリメラーゼ２０により保持された標的／鋳型ポリヌクレオチド鎖の荷電は、荷電センサー１１、１１’の感知オペレーションを妨げない。

いずれの適当なポリメラーゼ２０も用いられてもよい。例には、ファミリーＡからのポリメラーゼ、例えば、Ｂｓｕポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼおよび多数の他のものを含み；ファミリーＢからのポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼおよび多数の他のもの；ファミリーＣからのポリメラーゼ、例えば、大腸菌ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩおよび多数の他のもの、ファミリーＤからのポリメラーゼ、例えば、ピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩおよび多数の他のもの；ファミリーＸからのポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ Ｐｏｌμ、ＤＮＡ Ｐｏｌβ、ＤＮＡ Ｐｏｌσおよび多数の他のものが含まれる。

ポリメラーゼ２０が、荷電分子１８、１８’と結合する標的標識２４の結果として遊離されないと理解されるべきである。むしろ、ポリメラーゼ２０は、結合事象が行なわれたとき、および結合事象が行なわれた後に、例えば、チャネル１６、または荷電分子１８、１８’へ、または他のあるフローセル成分につながれたままである。

本明細書に開示されたいくつかの例において、荷電分子１８、１８’およびポリメラーゼ２０は、異なる役割／機能を有する異なる（個別および別々の）存在物（entities）であり、それは単一分子感知を一緒に可能にする。単一分子感知の例において、ヌクレオチドが鋳型鎖に沿って形成される新生鎖に組み込まれるので、シグナルは荷電センサー１１、１１’にて検知される。１つの例のヌクレオチド組込みの事象中に、ポリメラーゼ２０は鋳型ポリヌクレオチド鎖を保持し、鋳型に沿ったヌクレオチドに相補的な新生鎖に１つのヌクレオチドを組み込み、一方、荷電分子１８、１８’は、標識（組み込またヌクレオチドに結合される）を可逆的に結合し、荷電センサー１１、１１’にて識別可能なシグナルを生じさせる構造変化を受ける。本明細書に言及のごとく、いくつかの例において、ポリメラーゼ２０のいずれの構造変化も荷電分子１８、１８’の構造変化によって生成されたシグナルを妨げないように、ポリメラーゼ２０（例えば、テザー２２の長さの調整による）を構成することは望ましいかもしれない。

図１Ａ（ｉｉ）および１Ｂ（ｉｉ）に示されるごとく、標識されたヌクレオチド２６は、感知システム１０、１０’に導入される。標識されたヌクレオチド２６は、ヌクレオチド３０、ヌクレオチド３０のリン酸基に結合した連結分子３２、および連結分子３２に結合した認識部位特異的標識２４（標識２４または標的標識２４とも呼ばれる）を含む。標識されたヌクレオチド２６は、それが天然のヌクレオチドとは構造上または化学上異なるため、非天然または合成ヌクレオチドと考えられてもよい。

標識されたヌクレオチド２６のヌクレオチド３０は、天然のヌクレオチドであってもよい。天然のヌクレオチドは、窒素含有複素環塩基、糖および１以上のリン酸基を含む。天然のヌクレオチドの例は、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。リボヌクレオチドにおいて、糖はリボースであり、デオキシリボヌクレオチドにおいて、糖はデオキシリボース（すなわち、リボース中の２’位に存在する水酸基を欠く糖）である。一例において、ヌクレオチド３０は、いくつかのリン酸基（例えば、三リン酸（すなわち、ガンマ・リン酸塩）、四リン酸、五リン酸、六リン酸など（図５に示されるごとく））を含むため、ポリリン酸形態である。複素環塩基（すなわち、核酸塩基）はプリン塩基またはピリミジン塩基または他の核酸塩基アナログであってもよい。プリン塩基は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにその修飾された誘導体またはアナログを含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）およびその修飾された誘導体またはアナログを含む。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。

また、標識されたヌクレオチド２６は連結分子３２を含む。連結分子３２は、一つの末端（end）にて、ヌクレオチド３０のリン酸基に化学結合でき、かつ、他方の末端にて、標識２４に化学結合できるいずれかの長鎖分子であってもよい。また、連結分子３２は、それがポリメラーゼ２０と相互作用しないように、選択されてもよい。連結分子３２は、標識２４が荷電分子１８、１８’の認識部位２８と会合することを可能にするのに十分に長く、例えば、ヌクレオチド３０がポリメラーゼ２０によって保持されているように、選択されてもよい。

例として、連結分子３２は、アルキル鎖、ポリ（エチレングリコール）鎖、アミド基、リン酸基、トリアゾールのごとき複素環、ヌクレオチドまたはその組合せを含んでもよい。アルキル鎖の例は、少なくとも６つの炭素原子を含んでもよく、ポリ（エチレングリコール）鎖の例は、少なくとも３つのエチレングリコール単位を含んでもよい。

以下の例は、連結分子３２がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖およびトリアゾールを含む場合の標識されたヌクレオチド２６の例を示す：

以下の例は、連結分子３２がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾールおよびリン酸基を含む場合の標識されたヌクレオチド２６のもう一つの例を示す：

以下の例は、連結分子３２がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾールおよびリン酸基を含む場合の標識されたヌクレオチド２６のさらにもう一つの例を示す：

以下の例は、依然として、連結分子３２がアルキル鎖、アミド基、ポリ（エチレングリコール）鎖、トリアゾール、リン酸基およびポリヌクレオチド鎖含む場合の標識されたヌクレオチド２６のさらなる例を示す：

いくつかの例の連結分子３２が記載されているが、他の連結分子３２が用いられてもよいと理解されるべきである。

認識部位特異的標識２４は、荷電分子１８、１８’によって認識することができ、認識部位２８にて荷電分子１８および１８と可逆的に結合することができる分子である。適当な認識部位特異的標識２４の例は、抗生物質、例えば、カナマイシン、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、バイオマイシン、ストレプトマイシンなど；酵素共同因子、例えば、ＦＭＮ、ＮＡＤ、ビタミンＢ１２、キサンテンなど；アミノ酸、例えば、アルギニン、シトルリン（citrulin）、アルギニンアミド、バリン、イソロイシン、トリプトファンなど；および多数の様々な低分子（テオフィリン、ドーパミン、スルホローダミン、セロビオースなどを含む。

図１Ａおよび図１Ｂは、１つの標識されたヌクレオチド２６の１つの標的標識２４に結合することができる荷電分子１８、１８’の例を示す。他の例において、１つの標識されたヌクレオチド２６は、単一荷電分子１８、１８’と結合することができる複数の標識２４を含んでもよく（図２）、または、１つの荷電分子１８、１８’は、その各々がそれぞれのヌクレオチドのそれぞれの標識２４に結合することができる複数の認識部位２８を含んでもよい（図３Ｅによる図３Ａ～図３Ｅ）。

図２において、荷電分子１８’は、標識されたヌクレオチド２６’の第１の標識を可逆的に結合するための第１の認識部位２８Ａを含み、さらに、標識されたヌクレオチド２６’の第２の標識２４’に可逆的に結合するための第２の認識部位２８Ｂを含む。本例は、３つの異なる構造変化－第１の標識単独が結合する場合のもの、第２の標識２４’単独が結合する場合のもの、および標記２４、２４’の双方が同時に結合する場合のものを含む。図２において、荷電分子１８’の特定の構造変化は、２つの異なる認識部位２８Ａ、２８Ｂに２つの異なる標識２４、２４’を結合させることにより達成される。示されるように、その１つの標識されたヌクレオチド２６’は、標識２４、２４’双方を含み、これらの標識２４、２４は、それぞれの連結分子３２、３２’によって１つのヌクレオチド３０に結合される。標識２４および連結分子３２のいずれかの例は、標識２４、２４’が相互に異なり、かつ荷電分子１８’の認識部位２８Ａおよび２８Ｂによって別々にまたは同時に認識することができる限りは、標識されたヌクレオチド２６’の本例に用いてもよい。示された例において、標識２４、２４’が双方が結合する場合に、荷電分子１８’は、その改変された構造Ｂおよび検知可能なシグナル結果のものである。

結合したポリメラーゼ２０を持つ荷電分子１８’が、図２に示されているが、荷電分子１８および別々に結合したポリメラーゼ２０が図２に示される例に用いられてもよいと理解されるべきである。

図面において示されない依然としてもう一つの例において、荷電分子１８、１８’は、２つの認識部位（例えば、２８Ａ、２８Ｂ）を含み、そのいずれかは、ヌクレオチド３０に結合される単一の標識２４に結合することができる。本例は、２つの異なる優先構造変化－標識２４が第１の認識部位２８Ａに結合するもの、および標識２４が第２の認識部位２８Ｂに結合する場合の他方を含む。

図３Ａ～図３Ｅにおいて、荷電分子１８’は４つの異なる認識部位２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ、２８Ｄを含み、その各々は、異なる標識されたヌクレオチド２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｄの異なる標的標識２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、２４Ｄに可逆的に結合することができる。それに結合したポリメラーゼ２０を持つ荷電分子が図３Ａ～３Ｅに示されるが、荷電分子１８および別々に結合したポリメラーゼ２０は、図３Ａ～図３Ｅに示される例に用いてもよいと理解されるべきである。

本例において、図３Ａに示されるごとく、荷電分子１８’は、第１の標識されたヌクレオチド２６Ａの第１の標識２４Ａを可逆的に結合するための第１の認識部位２８Ａを含み、第１の認識部位２８Ａが第１の標識２４Ａに結合する場合に、第１の荷電配置と会合する第１の優先構造Ｂ_１を有する。図３Ｂに示されるごとく、荷電分子１８’は、さらに、第２の標識されたヌクレオチド２６Ｂの第２の標識２４Ｂを可逆的に結合するための第２の認識部位２８Ｂを含み、第２の認識部位２８Ｂが第２の標識２４Ｂに結合する場合に、第２の荷電配置と会合する第２の優先構造Ｂ_２を有する。図３Ｃに示されるごとく、荷電分子１８’は、第３の標識されたヌクレオチド２６Ｃの第３の標識２４Ｃに可逆的に結合するための第３の認識部位２８Ｃをさらに含み、第３の認識部位２８Ｃが第３の標識２４Ｃに結合する場合に、第３の荷電配置と会合する第３の優先構造Ｂ_３を有する。図３Ｄに示されるごとく、荷電分子１８’は、第４の標識されたヌクレオチド２６Ｄの第４の標識２４Ｄを可逆的に結合するための第４の認識部位２８Ｄをさらに含み、第４の認識部位２８Ｄが第４の標識２４Ｄに結合する場合に、第４の荷電配置と会合する第４の優先構造Ｂ_４を有する。

荷電分子１８’の非結合優先構造Ａは、図３Ｅに示される。示されるごとく、第１の認識部位２８Ａ、第２の認識部位２８Ｂ、第３の認識部位２８Ｃおよび第４の認識部位２８Ｃの各々が未結合である場合に（すなわち、部位２８Ａ～２８Ｄに結合する標識されたヌクレオチド２６Ａ～２６Ｄはない）、本例（非結合荷電配置と会合する）の非結合優先構造Ａが生じる。非結合優先構造Ａについての荷電分布の重心は、導電性チャネル１６の表面からのセット距離δ_０を有する。この距離δ_０は、荷電分子１８’に可逆的に結合する標識されたヌクレオチド２６Ａ～２６Ｄに依存して変更される。

図３Ａに示される例において、標識されたヌクレオチド２６Ａは、ヌクレオチド３０Ａ、リンカー３２Ａおよびユニークな標識２４Ａとしてグアニン・ポリホスファートを含む。ポリメラーゼ２０がヌクレオチド３０Ａを組み込む場合に、標識２４Ａの有効濃度は、荷電分子１８’（これは標識２４Ａのための認識部位２４Ａを有する）の接近内で有効に増加され、荷電分子１８’が標識２４Ａを結合させる。図３Ａに示される例において、結合は、「δ_＋＋」によって表示されるごとく、荷電重心およびチャネル表面の間の距離δ_０を増加させる。

図３Ｂに示される例において、標識されたヌクレオチド２６Ｂは、ヌクレオチド３０Ｂ、リンカー３２Ｂおよびユニークな標識２４Ｂとしてアデニン・ポリホスファートを含む。ポリメラーゼ２０がヌクレオチド３０Ｂを組み込む場合に、標識２４Ｂの有効濃度は、荷電分子１８’（標識２４Ａのための認識部位２４Ｂを有する）の接近内で有効に増加され、荷電分子１８’に標識２４Ｂを結合させる。図３Ｂに示される例において、結合は、「δ_＋」によって表示されるごとく、荷電重心およびチャネル表面の間の距離δ_０を増加させる。図３Ａおよび図３Ｂに示された優先構造変化の結果、距離δ_＋＋およびδ_＋が増加し、距離δ_＋＋およびδ_＋は異なり、かくして、別々の測定可能なシグナルを生じるであろう。

図３Ｃに示される例において、標識されたヌクレオチド２６Ｃは、ヌクレオチド３０Ｃ、リンカー３２Ｃおよびユニークな標識２４Ｃとしてシトシン・ポリホスファートを含む。ポリメラーゼ２０がヌクレオチド３０Ｃを組み込む場合に、標識２４Ｃの有効濃度は、荷電分子１８’（標識２４Ｃのための認識部位２４Ｃを有する）の接近内で有効に増加され、荷電分子１８’に２４Ｃ標識を結合させる。図３Ｃに示される例において、結合は、「δ_－」によって表示されるごとく、荷電重心およびチャネル表面の間の距離δ_０を減少させる。

図３Ｄに示される例において、標識されたヌクレオチド２６Ｄは、ヌクレオチド３０Ｄ、リンカー３２Ｄおよびユニークな標識２４Ｄとしてチミン・ポリホスファートを含む。ポリメラーゼ２０がヌクレオチド３０Ｄを組み込む場合に、標識２４Ｄの有効濃度は、荷電分子１８’（標識２４Ｄのための認識部位２４Ｄを有する）の接近内で有効に増加され、荷電分子１８’に標識２４Ｄを結合させる。図３Ｄに示される例において、結合は、「δ_－－」によって表示されるごとく、荷電重心およびチャネル表面の間の距離δ_０を減少させる。図３Ｃおよび図３Ｄに示される優先構造変化の双方の結果、減少した距離δ_－およびδ_－－を生じ、距離δ_－およびδ_－－は異なり、かくして、別々の測定可能なシグナルを生じるであろう。

図３Ａ～図３Ｅに示される例において、１つの荷電分子１８’は４つの異なる認識部位２８Ａ～２８Ｄを有し、かくして、４つの異なり別々の測定可能なシグナルを生じる４つの異なる改変された配置を有する。これらの異なり別々のシグナルは、４つの異なるヌクレオチド３０Ａ～３０Ｄが、それらが鋳型鎖にそれぞれ組み込まれると識別されるのを可能にする。

多重認識部位荷電分子の他の変化も考えられる。例えば、各々が２つの異なる認識部位２８を有する２つの荷電分子１８、１８’を荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６に結合できる。これらの荷電分子１８、１８’の各々については、２つの異なる認識部位が未結合のままである場合に、非結合優先構造Ａは示されるであろう。本例において、第１の２つの荷電分子１８、１８’は、第１の標識されたヌクレオチド（例えば、図３Ａの２６Ａ）の第１の標識（例えば、図３Ａ中の２４Ａ）を可逆的に結合するための第１の認識部位（例えば、図３Ａ中の２８Ａ）を含み、第１の認識部位が第１の標識に結合される場合に第１の荷電配置と会合する第１の優先構造（例えば、図３ＡのＢ_１）を有し、さらに、第２の標識されたヌクレオチド（例えば、図３Ａ～３Ｅの２６Ｂ）の第２の標識（例えば、図３Ａ～図３Ｅ中の２８Ｂ）を可逆的に結合するための第２の認識部位（例えば、図３Ｂ中の２８Ｂ）を含み、第２の認識部位が第２の標識に結合される場合に第２の荷電配置と会合する第２の優先構造（例えば、図３ＢのＢ_２）を有する。本例において、第２の２つの荷電分子１８、１８’は、第３の標識されたヌクレオチド（例えば、図３Ｃ中の２６Ｃ）の第３の標識（例えば、図３Ｃ中の２４Ｃ）を可逆的に結合する第３の認識部位（例えば、図３Ｃ中の２８Ｃ）および第４の標識されたヌクレオチド（例えば、図３Ｄ中の２６Ｄ）の第４の標識（例えば、図３Ｄ中の２４Ｄ）を可逆的に結合する第４の認識部位（例えば、図３Ｄ中の２８Ｄ）を含み、また、第３の認識部位が第３の標識に結合される場合に第３の荷電配置と会合する第３の優先構造を有し、第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電配置と会合する第４の優先構造を有する。本例において、２つの異なる荷電分子１８、１８’を用いて、４つの異なる標識されたヌクレオチド２６Ａ～２６Ｄを識別してもよい。

依然として他の例において、感知システム１０、１０’は、荷電センサー１１、１１’の導電性チャネル１６に結合したいくつかの荷電分子１８、１８’を含んでもよい。一例において、荷電分子１８、１８’の各々が、異なる標識されたヌクレオチド２６に可逆的に結合することができる。本感知システム１０’’の一例が図４に示される。

本例において、４つの異なる荷電分子１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄは、荷電センサー１１’’の導電性チャネル１６に結合されている。本例において、荷電分子１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄの各々はそれ自身の認識部位、非結合優先構造、他の荷電分子１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄの各々に依存しない優先構造（標識結合中に）を有する。より詳細には、導電性チャネル１６に結合した第１の荷電分子１８Ａは、第１の標識されたヌクレオチドの第１の標識を可逆的に結合するための第１の認識部位、第１の認識部位が未結合である場合の非結合優先構造、および第１の認識部位が第１の標識に結合する場合の荷電配置を持つ優先構造を含む。本例において、導電性チャネル１６に結合した第２の荷電分子１８Ｂは、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位、第２の荷電分子非結合優先構造、および第２の認識部位が第２の標識に結合する場合の第２の荷電分子荷電配置を含む第２の荷電分子優先構造を含む。また、本例において、導電性チャネル１６に結合した第３の荷電分子１８Ｃは、第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位、第３の荷電分子非結合優先構造、および第３の認識部位が第３の標識に結合する場合の第３の荷電分子荷電配置を持つ第３の荷電分子優先構造を含む。また、本例において、導電性チャネル１６に結合した第４の荷電分子１８Ｄは、第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位、第４の荷電分子優先構造および第４の認識部位が第４の標識に結合する場合の第４の荷電分子荷電配置を持つ第４の荷電分子優先構造を含む。

図４に示されるごとく、単一ポリメラーゼ２０は導電性チャネル１６に結合してもよい。本例において、それぞれのヌクレオチド３０がポリメラーゼ２０によって保持される場合に、それぞれの標識２４は、その対応する荷電分子１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄと結合することができ、隣接した荷電分子１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄと結合できないように、それぞれの標識されたヌクレオチド２６の各連結分子３２の長さを選択してもよい。

また、図４は、感知装置４０の例を示す。図４に示される、感知装置４０の例は、フローセル４１およびフローセル４１に統合された感知システム１０’’を含む。感知システム１０、１０’、１０’’のいずれの例も、感知装置４０に用いられてもよいと理解されるべきである。

フローセル４１は感知システム１０’’を含む容器である。他の容器、例えば、ウェル、チューブ、チャネル、キュベット、シャーレ（Petri plate）、ボトルなどが、感知システム１０’’を代替的に含んでもよいと理解されるべきである。循環プロセス、例えば、核酸配列決定反応は、フローセル４１に特によく適している。

例のフローセル４１は、基板／支持体１３、およびそれに直接的または間接的に結合した、またはそれと統合して形成されたふた（lid）４３を含む。フローセル４１は、フローセル４１内に含まれる１つの感知システム１０’’または感知システム１０’’のアレイにバルク試薬を送達できる流動体入口４５および流動体出口４７を含んでもよい。いずれかの個々のフローセル４１は、何十、何百、何千、何百万または何十億でさえの個々にアドレス可能で判読可能な感知システム１０、１０’、１０’’を含んでもよい。

図７Ａおよび７Ｂに示される例は、感知システム１０、１０’、１０’’のアレイを含むフローセル４１’の１つの例である。そのアレイはいくつかの感知システム１０、１０’、１０’’を含んでもよく、その各々は、基板上に配置され、それが個々にアドレス可能で判読可能なように、電子回路で構成される。一例において、アレイの各感知システム１０、１０’、１０’’は、個々のくぼみにおいて基板上に位置してもよい。そのくぼみは、感知システム１０、１０’、１０’’の各々を物理的に分離する。

図７Ａの例において、フローセル４１’はフロー・チャネル５２を含む。いくつかのフロー・チャネル５２が示されるが、いずれかの数のチャネル５２がフローセル４１’に含まれてもよい（例えば、単一のチャネル５２、４つのチャネル５２など）と理解されるべきである。各フロー・チャネル５２は、２つの結合した成分（例えば、基板およびふたまたは２つの基板）間で規定された領域であり、これは流体（例えば、本明細書に記載されるもの）をそれに導入し、除去することができる。フロー・チャネル５２は、それぞれ互いから分離されてもよい、いずれかの特定のフロー・チャネル５２に導入された流体がいずれかの隣接するフロー・チャネル５２に流れ込まないように、相互にフロー・チャネル５２を分離してもよい。フロー・チャネル５２に導入された流体のいくつかの例は、反応成分（例えば、標識されたヌクレオチド２６など）、洗浄溶液などを導入してもよい。

フローセル４１’のフロー・チャネル５２内の構造の一例は、図７Ｂを示される。図７Ｂに示される例において、フローセル４１’は、支持５４、および支持体５４上に位置したパターン化材料（patterned material）５６を含む基板１３を含む。パターン化材料５６は、隙間領域６０によって分離されたくぼみ５８を規定する。本例において、支持体５４の表面は、くぼみ５８の各々に露出され、感知システム’１０、１０、１０’’は、各くぼみ５８内に位置する。

図７Ｂ中の支持体５４は、フローセル４１’の他の成分の支持を提供する。支持体５４は、一般的に剛直であり、水性液体において不溶性である。適当な支持体５４の例は、エポキシシロキサン、ガラス、改質ガラス、プラスチック、ナイロン、セラミックス／セラミック酸化物、ケイ酸（シリコン酸化物（ＳｉＯ_２））、溶融シリカ、シリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン、改質シリコン（例えば、ホウ素ドープしたｐ＋シリコン）、窒化ケイ素（Ｓｉ_３Ｎ_４）、五酸化タンタル（ＴａＯ_５）または他のタンタル酸化物（ＴａＯｘ）、ハフニウム酸化物（ＨａＯ_２）、無機ガラスなどを含む。支持体５４に適当なプラスチックのいくつかの例は、アクリル、ポリスチレン、スチレンおよび他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓからのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）のごとき）、環状オレフィン／環状オレフィン・ポリマー（ＣＯＰ）（ＺｅｏｎからのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）のごとき）、ポリイミドなどを含む。支持体５４は、表面でのタンタル酸化物またはもう一つのセラミック酸化物のコーティング層を持つガラスまたはシリコンであってもよい。

支持体５４の形態は、ウエハー、パネル、矩形シート、ダイまたはいずれかの他の適当な形状であってもよい。一例において、支持体５４は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有する円形ウエハーまたはパネルであってもよい。より特定の例として、支持体５４は、約２００ｍｍから約３００ｍｍの範囲の直径を有する円形ウエハーである。もう一つの例において、支持体５４は、約１０フィート（約３メートル）以下のその最大の寸法を有する矩形のシートまたはパネルであってもよい。特定の例として、支持体５４は、約０．１ｍｍから約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例の寸法は提供されているが、いずれかの適当な寸法を持つ支持体５４が用いられてもよいと理解されるべきである。

図７Ｂに示される例において、パターン化材料５６は、支持体５４に位置する。いずれの材料も選択的に沈着し、または沈着およびパターン化して、くぼみ５８を形成でき、隙間領域６０をパターン化材料５６のために用いてもよいと理解されるべきである。

一例として、無機酸化物は、蒸着、エアゾール印刷またはインクジェット印刷によって支持体６６に選択的に適用されてもよい。適当な無機の酸化物の例は、タンタル酸化物（例えば、Ｔａ_２Ｏ_５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ_２Ｏ_３）、シリコン酸化物（例えば、ＳｉＯ_２）、ハフニウム酸化物など（例えば、ＨｆＯ_２）を含む。

もう一つの例として、樹脂は支持体５４に適用して、次いで、パターン化されてもよい。適当な沈着技術は、化学蒸着、ディップコーティング、浸漬コーティング、スピンコーティング、スプレー・コーティング、パドル分配（puddle dispensing）、超音波スプレー・コーティング、ドクターブレードコーティング、エアゾール印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などを含む。適当なパターン化技術は、フォトリソグラフィ、ナノインプリント・リソグラフィ（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などを含む。適当な樹脂のいくつかの例は、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（ＰＯＳＳ）ベースの樹脂、非ＰＯＳＳエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、無定形フッ素重合体樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））およびその組合せを含む。

本明細書に用いた用語「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（ＰＯＳＳ）は、シリカのもの（ＳｉＯ_２）およびシリコーン（Ｒ_２ＳｉＯ）間でのハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ_１．５）である化学組成物をいう。ＰＯＳＳの一例は、ＫｅｈａｇｉａｓらMicroelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778（ここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす）に記載されたものであってもよい。一例において、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ_３／２］_ｎ（Ｒ基が同一または異なることができる）を持つ有機ケイ素化合物である。ＰＯＳＳのための例のＲ基は、エポキシ、アジ化物／アジド、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、および／またはメタクリレート、または例えば、さらに、アルキル基、アリル基、アルコキシル基、またはハロアルキル基を含む。本明細書に開示した樹脂組成物は、単量体単位として１以上の異なるケージまたはコア構造を含んでもよい。多面体構造は、

のごときＴ８構造であっても、

により表されてもよい。この単量体単位は、典型的には官能基Ｒ１～Ｒ８の８つのアームを有する。

単量体単位は、

のごときＴ１０という、１０個のシリコン原子および１０個のＲ基を持つケージ構造を有しても：または

のごときＴ１２という、１２個のシリコン原子および１2個のＲ基を持つケージ構造を有してもよい。ＰＯＳＳベースの材料は、代替的にＴ_６、Ｔ_１４またはＴ_１６ケージ構造を含んでもよい。平均ケージ含量は合成中に調整するおよび／または精製方法によってコントロールすることができ、単量体単位のケージサイズの分布は本明細書に開示した例に用いられてもよい。

図７Ｂに示されるごとく、パターン化材料５６は本明細書に規定されたくぼみ５８、および隣接するくぼみ５８を分離する隙間領域６０を含む。くぼみ５８の多数の異なるレイアウトが規則的パターン、反復パターンおよび非規則的パターンを含めて考えられてもよい。ある例において、くぼみ５８は、最密充填および密度の改善のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線（矩形）レイアウト、三角形レイアウトなどを含んでもよい。いくつかの例において、レイアウトまたはパターンは、列および行で存在するくぼみ５８のｘ－ｙフォーマットであることができる。他のいくつかの例において、レイアウトまたはパターンは、くぼみ５８および／または隙間領域６０の繰り返し配置であってもよい。依然として他の例において、レイアウトまたはパターンは、くぼみ５８および／または隙間領域６０のランダム配置であってもよい。パターンは、スポット、パッド、ウェル、ポスト、ストリップ、渦巻き、線、三角形、矩形、円、弧、チェック、格子じま、対角線、矢印、正方形、またはクロスハッチを含んでもよい。

くぼみ５８のレイアウトまたはパターンは、規定された領域におけるくぼみ５８の密度（くぼみ５８の数）に関して特徴付けられてもよい。例えば、くぼみ５８は、１ｍｍ^２当たりおよそ２００万の密度で存在してもよい。密度は、例えば、１ｍｍ^２当たり約１００、１ｍｍ^２当たり約１，０００、１ｍｍ^２当たり約１０万、１ｍｍ^２当たり約１００万、１ｍｍ^２当たり約２００万、１ｍｍ^２当たり約５００万、１ｍｍ^２当たり約１０００万、１ｍｍ^２当たり約５０００万またはより多いかまたは少ない密度を含めた種々の密度に合わせてもよい。パターン化材料５６中のくぼみ５８の密度は、上記の範囲から選択されたより低値のものおよびより高値のものの間であることができる。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満によりくぼみ５８を分離する、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍにより分離する、低密度アレイは約１μｍ以上によりくぼみ５８を分離することであると特徴付けてもよい。例の密度が提供されているが、いずれの適当な密度も用いられてもよいと理解されるべきである。

くぼみ５８のレイアウトまたはパターンは、平均ピッチ、またはくぼみ５８の中心から隣接するくぼみ５８の中心（中心－中心間隔）、または一つのくぼみ５８の端から隣接するくぼみ５８の端までの間隔（端－端間隔）の点でさらにまたは別法として特徴付けられてもよい。パターンは、平均ピッチ周囲の変動係数が小さいように規則的であってもよいか、または、パターンは非規則的にあってもよく、この場合には、変動係数は比較的大きくなることができる。いずれの場合にも、平均ピッチは、例えば、約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍまたはより大きいかもしくは少なくてもよい。特定のパターンのくぼみ５８についての平均ピッチは、上記の範囲から選択されたより低値のものおよびより高値のものの間にあることができる。ある例において、くぼみ５８は、約１．５μｍのピッチ（中心－中心間隔）を有する。例の平均ピッチ値が提供されているが、他の平均ピッチ値が用いられてもよいと理解されるべきである。

各くぼみ５８のサイズはその体積、深さおよび／または直径により特徴付けてもよい。

各くぼみ５８は、流体を閉じ込めることができるいずれかの体積を有することができる。最小または最大の体積は、例えば、処理能力（例えば、多重度）、分解能、標識されたヌクレオチド２６、またはフローセル４１’の下流の使用のために期待された分析物反応性を提供するために選択することができる。例えば、体積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^３、少なくとも約１×１０^－２μｍ^３、少なくとも約０．１μｍ^３、少なくとも約１μｍ^３、少なくとも約１０μｍ^３、少なくとも約１００μｍ^３、またはそれを超えてもよい。別法としてまたは加えて、体積は、多くとも約１×１０^４μｍ^３、多くとも約１×１０^３μｍ^３、多くとも約１００μｍ^３、多くとも約１０μｍ^３、多くとも約１μｍ^３、多くとも約０.１μｍ^３、またはそれより少なくてもよい。

各くぼみ５８の深さは、１つの感知システム１０、１０’、１０’’を収容するために十分に大きくできる。ある例において、深さは、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれを超えてもよい。別法としてまたは加えて、深さは、多くとも約１×１０^３μｍ、多くとも約１００μｍ、多くとも約１０μｍ、多くとも１００μｍ、またはそれより小さくてもよい。各くぼみ５８の深さは、前記に特定された値より大きい、より小さいまたはその間であることができる。

いくつかの例において、各くぼみ５８の直径または長さおよび幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、またはそれを超えることができる。別法としてまたは加えて、直径または長さおよび幅は、多くとも約１×１０^３μｍ、多くとも約１００μｍ、多くとも約１０μｍ、多くとも約１μｍ、多くとも約０．５μｍ、多くとも約０．１μｍ、またはそれより小さく（例えば、約５０ｎｍ）てもよい。各くぼみ５８の直径または長さおよび幅は、前記に特定された値より大きくても、小さくても、またはその間であることができる。

図７Ｂに示されるごとく、アレイ中のくぼみ５８の各々は、それぞれの荷電センサー１１、１１’、１１’’を含む。各くぼみ５８中の各荷電センサー１１、１１’、１１’’が、それに結合した一つの荷電分子１８、１８’を有し、およびその接近内に結合した１つのポリメラーゼ２０を有することが望ましい。いくつかの例において、くぼみ５８は各々、１つの荷電センサー１１、１１’、１１’’、１つの荷電分子１８、１８’およびその中の１つのポリメラーゼ２０を有する。他の例において、いくつかのくぼみ５８は、１つの荷電センサー１１、１１’、１１’’、１つの荷電分子１８、１８’および１つのそのポリメラーゼ２０を有するが；他のくぼみ５８は、１つの荷電センサー１１、１１’、１１’’、１つの荷電分子１８、１８’、および１を超えるその中のポリメラーゼ２０を有し；依然として他のくぼみ５８は、１つの荷電センサー１１、１１’、１１’’、１つの荷電分子１８、１８’を有し、その中のポリメラーゼ２０を有しない。これらの例において、いずれかの所与のくぼみ５８内に結合するポリメラーゼ２０の数は、ランダムであっても、ポアソン分布によって決定されてもよい。

いくつかの例において、それに結合した荷電分子１８、１８’を含む荷電センサー１１、１１’、１１’’は、くぼみ５８に予め組み立てられてもよい。それぞれのくぼみ５８内でポリメラーゼ２０を結合するために、ポリメラーゼ２０を含む流体は、フローセル４１’の各レーン５２に導入されてもよい。ポリメラーゼ２０は、くぼみ５８内に結語するテザー２２を含んでいてもよく、またはリンカー２２は、くぼみ５８内に予め結合していてもよく、また、ポリメラーゼ２０はリンカー２２に結合できる。望ましい時間および望ましい温度が、ポリメラーゼ２０が結合することを可能にするようにインキュベートさせてもよい。

図７Ｂに示されるごとく、ポリメラーゼ２０は、フローセル４１’内のいずれかの成分および／またはいずれかの表面に結合してもよい。いくつかの例において、ポリメラーゼ２０は、電極１２または１４、基板１３の表面（例えば、くぼみ５８の底部、くぼみ５８の側壁など）、導電性チャネル１６上、荷電分子１８、１８’上などに結合する。

荷電センサー１１、１１’、１１’’の各々は、個々に電気的にアドレス可能で判読可能である。かくして、各くぼみ５８内で起こる荷電分子構造変化に起因するシグナルは、個々に検知し分析してもよい。

また、感知装置４０のいずれの例も、感知システム１０、１０’、１０’’に関して、フローセル４１またはフローセル４１’のレーン５２の流入口（例えば、流体入口４５）に、次いで、流体出口４７に試薬を選択的に導入するための試薬送達システム４９を含んでもよい。試薬送達システム４９は、流体入口４５に永続的にまたは移動可能に結合することができる管材料（tubing）または他の流体物（fluidic）を含んでもよい。試薬送達システム４９はサンプル容器５１を含んでもよい。試薬（感知システムに１０’’導入される、標識されたヌクレオチド２６のいずれの例も含む）は、サンプル容器に格納されるか、または調製されてもよく、使用の直前にサンプル容器に導入されてもよい。また、試薬送達システム４９は、サンプル容器５１から試薬を回収し、流体入口４５にそれを送達するためのポンプまたは他の適当な機器を含んでもよい。他の例において、試薬が流体入口４５に、感知システム１０’’を越えて、流体出口４７外に重力によって流れることができるように、サンプル容器５１は配置される。

また、フローセル４１、４１’中の荷電センサー１１、１１’、１１’’は、感知システム１０、１０、１０’’および感知装置４０が用いられる場合に、荷電センサー１１、１１’、１１’’のコンダクタンス変化を検知するための検知器１５に作動可能に接続されてもよい。

本明細書に開示された感知システム１０、１０’、１０’’が、感知方法に用いられてもよい。方法の一例は、図５に模式的に示されている。その方法は、２つの電極１２、１４および２つの電極１２、１４を連結する導電性チャネル１６；導電性チャネル１６に結合した荷電分子１８、１８’、ここに、荷電分子１８、１８’は認識部位２８を含み；および導電性チャネル１６または荷電分子１８、１８’に結合したポリメラーゼ２０を含む感知システム１０、１０’、１０’’に鋳型ポリヌクレオチド鎖４８を導入すること、
標識されたヌクレオチド２６を含む試薬を感知システム１０、１０’、１０’’に導入し、それにより標識されたヌクレオチド２６の１つのヌクレオチド３０は、ポリメラーゼ２０と会合し、標識されたヌクレオチド２６の１つの認識部位特異的標識２４は、荷電分子１８、１８’の構造変化を誘導するために認識部位２８と会合し、および
荷電分子１８、１８’の構造変化に応じて、荷電センサー１１、１１’、１１’’の応答を検知することを含む。

鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、配列決定されるいずれかのサンプルであっても、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログ（例えば、ペプチド核酸）を含んでいてもよい。鋳型（または標的）ポリヌクレオチド鎖４８のソースは、ネイティブソースからのゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは他の核酸であることができる。いくらかの場合には、かかるソースに由来する鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、本明細書の方法またはシステム４０の使用に先立ち増幅することができる。限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）またはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含めた、様々な公知の増幅技術のいずれかを用いることができる。本明細書に記載の方法またはシステム４０の使用に先立つ鋳型ポリヌクレオチド鎖４８の増幅は、オプションであると理解されるべきである。かくして、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、いくつかの例での使用に先立ち増幅されないであろう。鋳型／標的ポリヌクレオチド鎖４８は、所望により合成ライブラリーに由来することができる。合成核酸はネイティブＤＮＡまたはＲＮＡの構成を有することができるか、またはそのアナログであることができる。

鋳型ポリヌクレオチド鎖４８が由来することができる生物学的サンプルは、例えば、げっ歯動物、マウス、ネズミ、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、雌ウシ、ネコ、イヌ、霊長動物、ヒトまたは非ヒト霊長動物のごとき哺乳動物；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、トウモロコシ、モロコシ、オート麦、小麦、米、キャノーラまたは大豆のごとき植物；クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）のごとき藻類；カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）のごとき線虫；キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、蚊、ミバエ、ミツバチまたはクモのごとき昆虫；ゼブラフィッシュのごとき魚；爬虫類；カエルまたはツメガエル（Xenopus laevis）のごとき両生動物；細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）；ニューモシスチス・カリニ（pneumocystis carinii）、トラフグ（Takifugu rubripes）、酵母、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharamoyces cerevisiae）または分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のごとき菌類；または熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）からのものを含む。また、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、バクテリア、大腸菌、ブドウ球菌またはマイコプラズマ・ニューモニエ（mycoplasma pneumoniae）のごとき原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス、エボラウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスのごときウイルス；またはウイロイドから由来することができる。鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、前記の有機体の均一培養物または集団から、または別法として、例えば、コミュニティーまたは生態系におけるいくつかの異なる有機体の収集物から由来することができる。

さらに、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、天然ソースに由来しなくてもよいが、公知の技術を用いて、むしろ合成することができる。例えば、遺伝子発現プローブまたは遺伝子型決定プローブを合成し、本明細書に記載された例において用いることができる。

いくつかの例において、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、１以上のより大きな核酸の断片として得ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的切断、酵素的切断または物理的剪断（shearing）を含めた、当該技術分野において知られた様々な技術のいずれかを用いて実行することができる。また、断片化は、より大きな核酸鎖の一部だけのコピーにより、アンプリコンを生成する特定の増幅技術の使用に起因してもよい。例えば、ＰＣＲ増幅は、フランキングプライマーが増幅中にハイブリダイズする位置の間にあるオリジナルの鋳型上の核酸配列の長さにより規定されるサイズを有する断片を生成する。鋳型ポリヌクレオチド鎖４８の長さは、ヌクレオチド数、またはメートルの長さ（例えば、ナノメートル）の点からあってもよい。

鋳型／標的ポリヌクレオチド鎖４８の集団、またはそのアンプリコンは、本明細書に記載の方法またはシステム４０の特定の適用のために望ましくいかまたは適当である平均鎖長を有することができる。例えば、平均鎖長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約５０，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満であることができる。別法としてまたは加えて、平均鎖長は、約１０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約５０，０００ヌクレオチド、または約１００，０００ヌクレオチドを超えることができる。標的ポリヌクレオチド鎖４８の集団またはそのアンプリコンについての平均鎖長は、前記の最大および最小値の間の範囲にあることができる。

いくつかの場合には、鋳型／標的ポリヌクレオチド鎖４８の集団は、そのメンバーについて最大長を有するような条件下で生成または構成することができる。例えば、メンバーについての最大長は、約１００，０００ヌクレオチド未満、約５０，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約５，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満であることができる。別法としてまたは加えて、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８の集団またはそのアンプリコンは、そのメンバーについて最小の長さを有するような条件下で生成または構成することができる。例えば、メンバーについての最小の長さは、約１０ヌクレオチドを超える、約５０ヌクレオチドを超える、約１００ヌクレオチドを超える、約５００ヌクレオチドを超える、約１，０００ヌクレオチドを超える、約５，０００ヌクレオチドを超える、約１０，０００ヌクレオチドを超える、約５０，０００ヌクレオチドを超える、または約１００，０００ヌクレオチドを超えることができる。集団中の鋳型ポリヌクレオチド鎖４８についての最大および最小の鎖長は、前記の最大値および最小値の間の範囲にあることができる。

図５に示されるごとく、感知システム１０（または１０’、１０’’）に導入される鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、ポリメラーゼ２０によって適所に保持されてもよく、それは、本例において、導電性チャネル１６に繋留される（tethered）。図５に示される鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、ＤＮＡの鋳型鎖である。鋳型ポリヌクレオチド鎖４８は、標識されたヌクレオチド２６のごとき試薬と共に、生物学的に安定な溶液に導入されてもよい。生物学的に安定な溶液は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または線形増幅のごときポリメラーゼベースの組込み反応に適するいずれの緩衝液であってもよい。ある例として、生物学的に安定な溶液は、７付近のｐＨ、いくらかのミリモルを超える塩濃度、およびＭｇ^２＋イオンを有する緩衝液を含んでもよい。

また、図５に示されるごとく、標識されたヌクレオチド２６は鋳型ポリヌクレオチド鎖４８の標的核酸に相補的な塩基を含んでもよい。標識されたヌクレオチド２６は、部分的に、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８に結合されるポリメラーゼ２０によって、適所に保持されるであろう。ある例として、ポリメラーゼ２０は、特定のヌクレオチド３０を組込んでもよく、ヌクレオチド３０は、数（例えば、２）ミリ秒から数百ミリ秒の範囲の期間保持されてもよい。

標識されたヌクレオチド２６およびポリメラーゼ２０間の相互作用および連結分子３２の長さは、標的標識２４が荷電分子１８の接近内で会合するのを可能にする。感知システム１０、１０’、１０’’がアレイ中に存在し、個々にアドレス可能で、個々に判読可能な荷電センサー１１、１１’、１１’’を含む場合に、連結分子３２の長さも、一旦標識されたヌクレオチド２６が特定の感知システム１０、１０’、１０’’のポリメラーゼ２０と相互作用すれば、隣接する感知システム１０、１０’、１０’’との会合からいずれの個々の標的標識２４も妨げる。

いくつかの例において、標的標識２４の会合は、標識２４の有効濃度を増加させ、標的標識２４に荷電分子１８を結合させる。荷電分子１８は、平衡でのその構造をダイナミックに変更し、標的標識２４の不存在下で、１つの特定の構造（すなわち、非結合優先構造）中の大部分の時間を消費してもよい。標的標識２４の結合は、（非結合優先構造から）異なる優先構造に荷電分子１８を移動させるであろう。結合の間の優先構造は、非結合優先構造（例えば、結合した標識２４の不存在下、荷電分子１８によって最も示された構造）とは異なる。非結合優先構造中の荷電分布は、優先構造中の荷電分布とは異なる（例えば、荷電分子１８が標識２４に結合する場合）。荷電分子１８の荷電分布の変化は、今度は、チャネル１６のコンダクタンスを変更する。

荷電センサー１１、１１’、１１’’の応答は、標的標識２４がヌクレオチド特異的である（すなわち、特異的標識２４が特定の塩基のために選択される）ため、および荷電分子１８の認識部位２８が標識に特異的であるため、標識されたヌクレオチド２６の組み込まれた塩基を示し得る。かくして、また、方法は、会合した認識部位特異的標識２４（すなわち、荷電分子１８の構造を変更した標識２４）と荷電センサー１１、１１’、１１’’の応答を関連させること、および会合した認識部位特異的標識２４に基づいて、会合した標識されたヌクレオチド２６（すなわち、ポリメラーゼ２０および認識部位２８と会合した標識されたヌクレオチド２６）のヌクレオチド（例えば、塩基）を識別することを含み得る。

ユニークな指紋シグナルが生成されるように、荷電分子１８、１８’および標識２４の間のオン速度およびオフ速度を調整することができると理解されるべきである。

遅いオフ速度を持つ標識２４については、標識２４は、例えば、全ヌクレオチド組込みサイクル中に、かなりの持続時間で結合されたままであろう。この伸長された結合は、荷電センサー１１、１１’のチャネル１６を介して電流のＤＣレベルにおける変化を生成するであろう。これは、遅いオフ速度を持つ異なる標識２４が４つの異なるヌクレオチドに用いられ、４つの異なり別々の検知可能なシグナルを生じる場合の図６Ａにおいて模式的に示される。これらのシグナルは、４つの異なる認識部位２８を持つ単一荷電分子１８、１８’を介して、または各々が標識特異的認識部位２８を持つ４以下の異なる荷電分子１８、１８’を介して、または別々の遅いオフ速度で４以下の異なるヌクレオチドを結合することができる単一認識部位２８を持つ単一荷電分子１８を介して検知できる。

速いオン速度およびオフ速度を持つ標識２４については、標識２４は全ヌクレオチド組込みサイクル中に荷電分子１８、１８’から多数回に会合／分離することができる。この迅速なオンおよびオフ結合は、荷電センサー１１、１１’からチャッター（chatter）様のシグナル（例えば、ＤＣレベル、振幅、周波数、百分位数レベル、特徴的分布など）を生成するであろう。これは、速いオン速度およびオフ速度を持つ異なる標識２４が、４つの異なるヌクレオチドに用いられ、４つの異なり別々の検知可能なシグナルを生じる図６Ｂにおいて模式的に示される。これらのシグナルは、４つの異なる認識部位２８を持つ単一荷電分子１８、１８’を介して、または各々標識特異的認識部位２８を持つ４以下の異なる荷電分子１８、１８’を介して、または別々のオン速度およびオフ速度にて１～４以下の異なるヌクレオチドを結合することができる単一荷電分子１８、１８’を介して検知することができる。

また、荷電分子１８、１８’の構造状態が変更される頻度は、モニターされてもよい。

また、荷電センサー応答の大きさは別々であってもよい。いくつかの例において、認識部位２８は４以下の異なる標識されたヌクレオチド２６を可逆的に結合するためのものである。４つの異なる標識されたヌクレオチド２６の１つがポリメラーゼ２０および認識部位２８と会合する場合、荷電センサー１１、１１’、１１’’の応答は、４つの異なる標識されたヌクレオチド２６の１つを識別するために用いることができる別々の大きさ（または振幅、magnitude）を有する。また、４つの異なる標識されたヌクレオチド２６の各々は、別々の大きさ（例えば、他の４つの異なる標識されたヌクレオチド２６の各々と会合した大きさとは異なる大きさ）を有してもよい。

他の例において、図６Ａおよび６Ｂからのモダリティ（modalities）は、いくつかの形態で組み合わせてもよい。例えば、感知システム１０、１０’、１０’’に曝される複数の標識されたヌクレオチド２６において、遅いオン速度およびオフ速度を有するいくつかの標識２４が用いられてもよく、速いオン速度およびオフ速度を有する他の標識２４が用いられてもよい。

本明細書に記載された組込みサイクルの結果として、会合した標識されたヌクレオチド２６の塩基は、鋳型ポリヌクレオチド鎖４８にハイブリダイズされる新生鎖５０に組み込まれるであろう。塩基が十分に組込まれ、新生鎖５０の糖骨格が伸長される場合、ヌクレオチド３０および標識２４間のリンカー３２は、自然に分割される。この結果、背景レベルへの標識２４の有効濃度の低下が生じる。標的標識２４は分離し、荷電分子１８、１８’は、それは優先非結合構造を優先的に示すその非結合（時々「野生型」という）構造に戻る。

本明細書に開示した方法は、配列決定サイクルの所望の数のために繰り返されてもよい。

本明細書に開示された標識されたヌクレオチド２６および感知システム１０、１０’、１０’’は、様々な適用のいずれに用いられてもよい。図５への参照で記載されるごとく、特に有用な適用は、シーケンシング・バイ・シンセシス（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）のごとき核酸配列である。ＳＢＳにおいて、鋳型核酸４８に沿った核酸配列決定プライマーの伸長は、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定するためにモニターされる。基礎をなす化学プロセスは、重合（例えば、本明細書に記載されるごときポリメラーゼ酵素２０によって触媒される）であってもよい。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳの例において、新生鎖を形成するためにプライマーに加えられたヌクレオチドの順序およびタイプの検知を用いて、鋳型の配列を決定できるように、ヌクレオチド（例えば、塩基）は、配列決定プライマーに加えられる（それにより、配列決定プライマーを伸長する）。アレイの異なる感知システム１０、１０’、１０’’での複数の異なる鋳型４８は、ＳＢＳ技術に付してもよい。異なる鋳型４８で生じる事象は、アレイにおける特定の感知システム１０、１０’、１０’’の位置のために、部分的に識別することができる。アレイ中の各感知システム１０、１０’、１０’’の荷電センサー１１、１１’は、個々にアドレス可能で判読可能であってもよく、かくして、各センサー１１、１１’のシグナルを検知することができる。

本明細書に開示された標識されたヌクレオチド２６および感知システム１０、１０’、１０’’についての他の適当な適用は、シーケーシング・バイ・ライゲーション（sequencing-by-ligation）およびシーケーシング・バイ・ハイブリダイゼーション（sequencing-by-hybridization）を含む。

後記により大きく詳細に言及される先の概念およびさらなる概念（但し、かかる概念が相互に矛盾しなくはない）のすべての組合せが、本明細書に開示した発明の主題の一部であるとして考えられると認識されるべきである。特に、本開示の終わりに現われる、特許請求された主題のすべての組合せは、本明細書に開示した発明の主題の一部であると考えられる。また、参照によって組み込まれるいずれかの開示にさらに現われ得る本明細書に明示的に使用された用語が、本明細書に開示された特定の概念と最も一致する意味を与えられるべきであると認識されるであろう。

「一例（one example）」、「もう一つの例」、「ある例（an example）」などへの明細書の全体にわたる参照は、例に関して記載された特定の要素（例えば、特徴、構造および／または特性）が、本明細書に記載された少なくとも１つの例に含まれ、他の例において存在してもしなくてもよいことを意味する。加えて、文脈が明らかに他の方法で指示しない限りは、いずれかの例について記載された要素を様々な例においていずれかの適当な方法で組み合わせてもよいと理解されるべきである。

本開示の全体にわたって用いた用語「実質的に」および「約」を用いて、例えば、処理（processing）における変化のための小さな変動を記載または説明する。例えば、それらは、±５％以下、例えば、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．２％以下、±０．１％以下、±０．０５％以下をいうことができる。

さらに、本明細書に提供された範囲は、それらが明示的に記載されたように、記載された範囲、および記載された範囲内のいずれかの値または副範囲を含むと理解されるべきである。例えば、１ｎｍ～１μｍ未満により表わされる範囲は、１ｎｍ～１μｍ未満の明示された範囲だけではなく、約１５ｎｍ、２２．５ｎｍ、４５ｎｍなどのごとき個々の値、および約２０ｎｍ～約４８ｎｍなどのごとき副範囲も含むと解釈されるべきである。

いくつかの例が詳細に記載されているが、開示した例が変更されてもよいと理解されるべきである。したがって、先の記載は、非限定的であると考えられるべきである。

Claims (23)

1. ２つの電極、および
   前記２つの電極を連結する１つの導電性チャネル
   を含む荷電センサー；
   前記導電性チャネルに結合した荷電分子、前記荷電分子は、
   標識されたヌクレオチドの標識を可逆的に結合するための認識部位を含み、
   非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し、かつ
   前記認識部位が標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、前記荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；ならびに
   前記導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼ
   を含む、感知システム
2. 前記荷電分子が荷電したアプタマーである、請求項１記載の感知システム。
3. 前記荷電したアプタマーが、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーおよびそのアナログよりなる群から選択される、請求項２記載の感知システム。
4. 前記荷電分子が、荷電したタンパク質および荷電したペプチドよりなる群から選択される、請求項１記載の感知システム。
5. 前記荷電分子が、
   さらに、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み、前記第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電配置と会合する第２の優先構造を有し；
   さらに、第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位を含み、前記第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電配置と会合する第３の優先構造を有し；
   さらに、第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み、前記第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電配置と会合する第４の優先構造を有し；および、
   前記認識部位、第２の認識部位、第３の認識部位および第４の認識部位の各々が未結合である場合に非結合荷電配置と会合した非結合優先構造が生じる、請求項１記載の感知システム。
6. さらに、前記導電性チャネルに結合した第２の荷電分子を含み、
   前記第２の荷電分子は、
   第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み；
   第２の荷電分子非結合荷電配置と会合する第２の荷電分子非結合優先構造を有し；かつ
   前記第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電分子荷電配置と会合した第２の荷電分子優先構造を有する、請求項１記載の感知システム。
7. さらに、前記導電性チャネルに結合した第３の荷電分子、
   前記第３の荷電分子は、
   第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位を含み、第３の荷電分子非結合荷電配置と会合する第３の荷電分子非結合優先構造を有し；および
   前記第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電分子荷電配置と会合する第３の荷電分子優先構造を有し；および
   前記導電性チャネルに結合した第４の荷電分子、
   前記第４の荷電分子は、
   第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み、
   第４の荷電分子非結合荷電配置と会合する第４の荷電分子非結合優先構造を有し；および、
   前記第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電分子荷電配置と会合する第４の荷電分子優先構造を有する
   を含む、請求項６記載の感知システム。
8. 前記荷電分子が、さらに、第２の標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含み、前記第２の認識部位が第２の標識に結合する場合に第２の荷電配置と会合する第２の優先構造を有し；および
   前記感知システムが、さらに、導電性チャネルに結合した第２の荷電分子を含み、
   前記第２の荷電分子は、
   第３の標識されたヌクレオチドの第３の標識を可逆的に結合する第３の認識部位；および
   第４の標識されたヌクレオチドの第４の標識を可逆的に結合する第４の認識部位を含み；
   第２の荷電分子非結合荷電配置と会合した第２の荷電分子非結合優先構造を有し；
   第３の認識部位が第３の標識に結合する場合に第３の荷電配置と会合する第３の優先構造を有し；および
   第４の認識部位が第４の標識に結合する場合に第４の荷電配置と会合する第４の優先構造を有する、請求項１記載の感知システム。
9. 前記荷電分子が、さらに、標識されたヌクレオチドの第２の標識を可逆的に結合する第２の認識部位を含む、請求項１記載の感知システム。
10. ２つの電極、および
    前記２つの電極を連結する１つの導電性チャネル
    を含む荷電センサー；
    前記導電性チャネルに結合した荷電分子、前記荷電分子は、
    標識されたヌクレオチドの標識を可逆的に結合する認識部位を含み、
    非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し、かつ前記認識部位が標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；および
    ２つの電極の少なくとも１つ、または荷電センサーが位置される基板に結合したポリメラーゼ
    を含む、感知システム。
11. 前記基板が、パターン化基板であり、前記荷電センサーがパターン化基板のくぼみに位置し、前記ポリメラーゼがくぼみの表面に結合している、請求項１０記載の感知システム。
12. フローセルおよび
    前記フローセルに統合された感知システムを含む感知装置であって、前記感知システムは、
    導電性チャネルを含む荷電センサー；
    前記導電性チャネルに結合した荷電分子を含み、前記荷電分子は、
    非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し；および
    前記荷電分子の認識部位が標識されたヌクレオチドの標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、前記荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；ならびに
    前記導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼを含む、前記装置。
13. さらに、フローセルの流入口に試薬を選択的に導入するための試薬送達システムを含む、請求項１２記載の感知装置。
14. 試薬が、サンプル容器内にあり、前記試薬が、
    ヌクレオチド；
    ヌクレオチドのリン酸基に結合した連結分子；および
    連結分子に結合した認識部位特異的標識
    を含む標識されたヌクレオチドを含む、請求項１２記載の感知装置。
15. さらに、前記荷電センサーからの応答を検知するための検知器を含む、請求項１２記載の感知装置。
16. フローセル；および
    フローセルに統合された感知システムを含む感知装置であって、前記感知システムは、
    導電性チャネルを含む荷電センサー；
    前記導電性チャネルに結合した荷電分子を含み、前記荷電分子は、
    非結合荷電配置と会合する非結合優先構造を有し、かつ
    前記荷電分子の認識部位が標識されたヌクレオチドの標識に結合する場合に荷電配置と会合する優先構造を有し、前記荷電配置は非結合荷電配置とは異なり；かつ２つの電極の少なくとも１つまたはフローセルの基板に結合したポリメラーゼを含む、前記感知装置。
17. 前記基板がパターン化基板であり、前記荷電センサーがパターン化基板のくぼみに位置し、前記ポリメラーゼがくぼみの表面に結合している、請求項１６記載の感知装置。
18. ２つの電極および
    前記２つの電極を連結する導電性チャネル
    を含む荷電センサー；
    導電性チャネルに結合した荷電分子、前記荷電分子は認識部位を含み；および
    前記導電性チャネルまたは荷電分子に結合したポリメラーゼ
    を含む感知システムに鋳型ポリヌクレオチド鎖を導入すること、
    前記感知システムに標識されたヌクレオチドを含む試薬を導入し、それにより、標識されたヌクレオチドの１つのヌクレオチドはポリメラーゼと会合し、標識されたヌクレオチドの１つの認識部位特異的標識が、認識部位と会合して、荷電分子の構造変化を誘導すること；および
    前記荷電分子の構造変化に応じて、荷電センサーの応答を検知すること
    を含む、方法。
19. さらに、前記荷電センサーの応答を会合した認識部位特異的標識に関連させること；および
    前記会合した認識部位特異的標識に基づいて、標識されたヌクレオチドの１つのヌクレオチドを識別することを含む、請求項１８記載の方法。
20. 前記荷電分子が複数の異なる認識部位を含み、その各々が、別々の速度で異なる標識されたヌクレオチドの異なる標識を可逆的に結合するためのものである、請求項１８記載の方法。
21. ．
    さらに、異なる標識されたヌクレオチドがそれぞれポリメラーゼと会合し、異なる標識されたヌクレオチドの異なる認識部位特異的標識がそれぞれ複数の異なる認識部位の一つに結合する場合に、前記荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの複数の応答を検知すること；および
    別々の速度によってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別することを含む、請求項２０記載の方法。
22. 前記認識部位が、複数の別々の速度にて複数の異なる標識されたヌクレオチドの複数の異なる標識を可逆的に結合するためのものである請求項１８記載の方法であって、
    さらに、
    異なる標識されたヌクレオチドの少なくともいくつかがそれぞれポリメラーゼと会合し、かつ、異なる標識の少なくともいくつかがそれぞれ認識部位に結合する場合に、荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの複数の応答を検知すること：および
    別々の速度によってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別することを含む、前記方法。
23. 前記認識部位が４以下の異なる標識されたヌクレオチドを可逆的に結合するためのものである、請求項１８記載の方法であって、さらに、
    ４以下の異なる標識されたヌクレオチドがそれぞれ、ポリメラーゼおよび認識部位と会合する場合に、荷電分子の異なる構造変化に応じて、荷電センサーの４以下の異なる応答を検知すること、前記４以下の異なる応答の各々が、別々の大きさを有し；および
    別々の大きさによってそれぞれ会合した異なる標識されたヌクレオチドを識別すること
    を含む、前記方法。

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