RU1807988C - Способ получени производных борсодержащих пептидов - Google Patents
Способ получени производных борсодержащих пептидовInfo
- Publication number
- RU1807988C RU1807988C SU884356026A SU4356026A RU1807988C RU 1807988 C RU1807988 C RU 1807988C SU 884356026 A SU884356026 A SU 884356026A SU 4356026 A SU4356026 A SU 4356026A RU 1807988 C RU1807988 C RU 1807988C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phe
- pro
- product
- found
- calculated
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Rl-Z-NH-CH-BY HW,
t
где Ri - H, As, Bz, Bos, Bos-Leu;
R2 (CH2)nNH-C(NH)NH2, где n 3, 4;
Y - остаток пинаконового или пинанди- олового эфира;
HW-CeHsSOaH.HCl, HBr;
Z D или L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, Ala-Lys, Pro-Phe, Ala-Phe, Gl.u-Phe, Ala-Glu, Glu-Gly, Gly-Leu-Ala, pyro-Glu-Phe, Val-Val, DVal-Leu, Lys-Pro, Leu-Thr, заключающийс в том, что амин формулы (II)
H2N-CHBY HW, .(CH2)nW гдеп 3, 4; W и W1 - CI, Вп;
Y - остаток пинаконового или пинаиди- олового эфира, ввод т во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы (111)
Ri-ZHDH. X значени Ri и Z указаны выше и полученный продукт формулы (IY) . R1-Z-NHCH-BY HW,
(CHa)nW1.. . значени Ri, Z, Y, W, W и п указаны выше, обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединени формулы (Y)
R -Z-NH-CH-BY HW,/
(сн2)п№- - значени Ri, Z, Y, W и n указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты , предпочтительно бензолсульфокислоты, р образованием соединени (Yl) ;
R -Z-NH-CH-BY- HW,; : (CH2)nNH2 ; : .;. С значени R , Z, Y, W и n указаны выше, последнее подвергают взаимодействию с: цианамидом в низшем спирте при 50- 150°С. . г
В описаний изобретени используютс следующие сокращени дл аминокислотных остатков: :.
Ala L-аланин
Arg и-аргинин
Asn L-аспарагин
Asp L-аспарагинова кислота
Cys L-цистеин
Gin L-глутамин.
Glu L-глутаминова кислота
Gly глицин
His L-гистидин
lie L-изолейцин
Leu L-лейцин
Lys L-лизин
Met L-метионин
Phe L-фенилаланин
Pro L-пролин
Ser L-серин
Thr L-треонин
Trp L-триптофан
Tyr L-тирозин Val L-валин
Там, где прибавлен префикс D, упом нутые сокращени обозначают аминокислоту D-конфигурации. Там, где прибавлен префикс D или L, упом нутые сокращени обозначают то, что аминокислота может иметь или конфигурацию D, или конфигурацию L.
Используемый термин М-концева за щитна группа относитс к различным ами- ноконцевым защитным группам, используемым в синтезе пептидов. Примеры пригодных групп включают ацильную защитную группу, например ацетил (Ас), бензоил (Bz), или алифатические уретано- вые защитные группы, например третбуток- сикарбонил (Вое).
Приводимые далее в описании примеры
иллюстрируют конкретные варианты осуществлени изобретени . Все указанные точки плавлени не откорректированы. Все части приведены в весовых част х, а температуры указаны в °С. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного . дерного магнитного резанйнса (ЯМР или ЯМР) указаны в дельта-единицах, част х на млн., исход из внутреннего тетраметилсилано- вого стандарта. Многочисленные сокращёни , используемые в указанных примерах, имеют следующие значени : TFA - трифто- руксусна кислота; ОМР-М,К1-димётилфор- мамид; МС - масс.-спектрометри ; ТСХ - тонкослойна хроматографи ; оф-ТСХ-тонкослойна хроматографи с обращенной
фазой. Сложноэфирные защитные группы борных кислот имеют аббревиатуры:-СбН 12 пинаконова группа и -CioHie пинанди- олова группа.
Все аминокислотные остатки представлены в L-конфигурации, если не оговорено особо.
ТСХ и оф-ТСХ осуществл ют на пластинках из силикагел 60 фирмы E.Merk и
пластинках KCI8F дл оф-ТСХ фирмы Whatman. Нейтральные соединени наблюдали в УФ-области и после экспонировани парами иода, Соединени , содержащие свободные аминогруппы, подкрашивали нингидрином- , а соединени с гуанидиногруппами подкрашивали красителем Sakaguchl. Краситель Sakaguchi про вл ет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например,
которые содержатс в бораргининовых пеп- тидах.
П р и м е р 1,а. 1-амино-4-бром-бутилбо- ронат пинандиол HCI.
NH2-CH(CH2)3Br B02-CioHi6 HCI
4-бром-1-хлорбутилборонат пинандиол получают по методике, описанной Matteson и др. В обычном эксперименте осуществл ют гидроборирование аллилб- ромида (173 мл, 2 моль) бораном пирокате- хина (240 мл, 2 моль) путем, прибавлени борана к аллилбромиду с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 4 ч до 100°С в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилбрро- ната (т.кип. 95-102°С, 0,25 мм), выдел ют перегонкой с выходом 49%. Указанный пи- рокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+)альфа-пинандио- лом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 50 мл тетрагидрофурана (THF), интенсивно перемешива указанную смесь в течение 0,5 ч при 0°С, а затем 0,5 часа при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавл ют 250 мл гексана. Пирокатехин удал ют в виде кристаллического твердого вещества. Количественный выход получают путем последовательного разбавлени гек- саном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении. При упаривании растворител получают про- дукт (147 г) в виде масла.
Вычислено, %: С 51,85; В 7,38; В г 26,54.
С1зН2202ВгВ:
Найдено, %: С 52,85; Н 7,30, Вг 26.58:
4-бром-1-хлорбутилбороната пинандиол получают гомологизацией соответствующего пропилбороната. Хлористый метилен; (34,8 мл, 0,540 моль) раствор ют в 500 мл THF и затем медленно прибавл ют к 1,54М н-бутиллити вгексзне(350мл,0,54рммрль) ;при-10р°С. Пинандиол 3-бромпропилборо- ната (148 г, 0,490 моль) раствор ют в 500 мл THF, охлаждают до точки замерзани указанного раствора и ввод т в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) рас- тврр ют в 250 мл THF, охлаждают до 0°С и прибавл ют несколькими порци ми к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в течение ночи. Затем растворитель упаривают , а полученный осадок раствор ют в гек- сане и промывают водой. После просушивани над безводным сульфатом магни и фильтровани растворитель удал - ют с выходом целевого продукта (140 г),
Пинандиол 1-амино-4-бромбутилборо- ната получают путем растворени гексаме- тилдисилизана (28 г, 80 ммоль) в 30 мл THF, охлаждени полученного раствора до -78°С и прибавлени к нему 1,62N н-бутиллити в гексане (49,4 мл, 80 моль). Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры , повторно1 охлаждают до -78°С и
прибавл ют пинандиол 4-бром-1-хлорбу- тилбороната (28 г, 80 моль) а 20 мл THF. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель удал ют упари- ванием, ввод т сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выдел ют фильтрованием в атмосфере азота. Фильтрат охлаждают до -78°С и добавл ют4н. HCI в диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этой температуре перемешивают ее 2 ч. Полученный продукт (20 г) выдел ют фильтрованием в виде твердого вещества. После просушивани в вакууме неочищенный продукт раствор ют в хлороформе и нерастворившеес вещество выдел ют фильтрованием. Фильтрат упаривают и осадок раствор ют в эти- лацетате.Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г(т.пл. 142-144,5°С, +16,7±0,80, С 1,0 в абсолютном метаноле.
Элементныйанализ дл Ci4H26N02BrC B:
Вычислено, %: С 45,87, Н 7,16, N 3,82, В 2,95. . . ,
Найдено, %: С 45,76, Н 7,21, N 3,79, В 3,04. . : .: ;..: .:;;. ;
П р и мер 1,6. (0,1)1-амино-4-бромбу- тилборонат пинакон-HCI.
(о,дын2-сн(сн2)зВг во2-СбН12 HCI.
Пинакон 4-бром-1-хлорбутилбороната получают по методу, описанному дл получени соответствующего пинандиола (пример 1,а), за исключением того, что вместо пинандиола используют пинакон, пинакон 3-бром-пропилбороната (т.кип. 60-64°С, 0,35 мм) и 4-бром-1-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112°С, 0,20 мм) перегон ют .. . : . . :
Элементныйанализ дл CioHi902BrCIB:
Вычислено, %: С 40,38, Н 6,45
Найдено, %: С 40,70, Н 6,37.
Хлористоводородную соль пинакона 1- амино-4-бромбутилбороната также получают по методике примера 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гаксан с выходом его 52%.
Элементныйанализ дл CioH22N02BrCIB:
Вычислено, %: С38,19, Н 7,05, N4,45, CI 11,27, Вг 25,41.
Найдено, %: С 38,28, Н 7,39, N 4,25, CI 11,68, Вг 26,00.
П р и м е р 1,в. Гидрохлорид 1-амино-4- хлорбутилборонат хлористоводородна соль пинакона.
(0,ЦМН2-СН(СН2}зС В02-СбН12 HCI.
Пирокатехин 3-хлорпропилборонат (т.кип. 80-85°С, 0,30 мм) и пинакон 3-хлорп- ропилового эфира бороновой кислоты (т.кип. 63°С, 0,20 мм) получают по методике примера 1,а за исключением того, что вместо аллилбромида используют а лилхлорид, а вместо пинандиола берут пинакон.
Элементный анализ дл CgHisOaCIB:
Вычислено, %: С 52,85, Н 8,89, C117,33.
Найдено, %: С 53,41, Н8,15, CI 16,81.
Гомологизацию также осуществл ют по методике примера 1,а, а полученный продукт выдел ют перегонкой (т.кип. 95°С, 0.25 мм) с 65% выходом.
Элементный анализ Дл CioHigOaClaB:
Вычислено, %: С 47,47, Н 7,58, CI 28,02.
Найдено. %: С 47,17, Н 7,45, CI 27,75.
Хлористоводородную соль пинакона 1- амино-4-хлорбутилового эфира бороновой (борной) кислоты получают по методике, аналогичной примеру 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с получением 8.8 г продукта (т.пл. 132-135,5°С) и 2,2 г продукта (т.пл. 145-147°С). Продукт с т.пл. 145-147°С используют дл анализа.
Элементный анализ дл CioH22N02CIB: Вычислено, %: С 44,47, Н 8,23, N 5,19., В
4,00. , ; . ..-.--: . .. .: :..,
Найдено, %: С 44,01, Н 8,23. N 4,77, 8 3,80... ...-.-. ; .: . .,:; -v Г;.П р м м е р 1,г. (Ь,Ц1-амиНо-5-бромпён- тилового боронат эфира бороновой кислоты пинакон НС.; : :
(0,1)НН2-СН(СН2)4Вг В02СбН12 HCi.
Пинакон 4-бромбутилового эфира бороновой кислоты получают по методу, описанному дл получени пинандиола 3-бромпропилового эфира борной кислотУ (пример 1,а), за исключением того, что ал- лилбромид замен ют на 4-бром-1-бутен, а пинандиол на пинакон. Продукт выдел ют в виде масла (т.кип, 77°С, 0,3 мм). После го- мологизации получают 5-бром-1-хЛорг)ентй- лового эфира бороновой кислоты пинакоИ, Масс-спектроскопи (С1): CnH2i02BrCIB
Вычислено. %:Н: 310,47.
Найдено. %:Н:310.;
Целевой продукт хлористоводородную соль пинакона 1-амино-5-бромпентипового эфира бороновой кислоты получают по методике примера 1 ,а при выходе 35%.
Элементныйанализ дл CnH24N02BrBCt; %:
Вычислено: С 40,22, Н 7,36, N 4.26, CI 10,79, Вг 24,32, В 3,29.
Найдено: С 39,23. Н 7,18, N 4,04, С1 15.21. Вг25.66, 83,75.
П р и м е р 2. Boc-(D)Phe-Pro-NH- СНКСН2)зВгЗВ02-С1оН1б.
Синтез дипептида ВОС (D) Phe-Pro-OH осуществл ют вначале с получени дипеп- тидного бензилового эфира, а затем удалени указанного сложного эфира каталитическим гидрированием. Вос- (D)Phe-OH (10,0 г, 37,7ммоль) раствор ют в БОмлТНРи к полученному раствору прибавл ют N-метилморфолин (4,14 мл, 37,7 ммоль). Раствор охлаждают до -20°С, а затем к нему прибавл ют изобутиловый эфир хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7 ммоль). Через 5 мин в реакционную смесь ввод т H-Pro-OBZ 1 . HCI(9,11 г, 37,7 ммоль), растворенный в 50 мл хлороформа и охлажденный до -20°С. Прибавл ют триэтиламин (5,25 мл, 37,7 ммоль) и полученную смесь перемешивают 1 ч при -20°С и 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают. Оеадок
раствор ют в.этилацетате с последующим промыванием 0,2н. HCI, 5%-ным водным раствором бикарбоната натри и насыщенным водным раствором хлористого натри . Органический слой сушат над безводным
сульфатом натри , фильтруют и упаривают с получением 15,2 г Boc-(D)Phe-Pro-OBZ1 в
виде масла. Полученный бензиловый эфир
(15,2 г) раствор ют в 100 мл метанола и
затем гидрируют при начальном давлении
40 фунтов/дюйм2 (2,812 кг/см2) в аппарате
Парра в присутствий 6,5 г 10% палладиевой
черни (Pd/C). Реакционный раствор фильтруют через целиттм и упаривают с выходом
твердого вещества. Указанный твердый
. продукт выдел ют и промывают этилацетатом , а затем простым эфиром с получением 10 г требуемого продукта (т.пл. 176,5- 177°д. .;:. . Элементный анализ дл CigH26N205, (%):: - .
Вычислено: С 62,95, Н 7,24, N 7,73. Найдено: С 62,91, Н 7,15, N 7,53. Booj))Phe-Pno-NH-CH i(CH2bBr BO2-CioHi6 получают св зыванием указанного дипеп- тида с соответствующим амином по методике смешанного ангидрида. Смешанный ангидрид Boc-(D)Phe-Pro-OH получают при растворении указанной кислоты (4,94 г, 13,6 ммоль) в 30 мл THF с последующим прибавлением N-мётилморфолина (1,50 мл, 13,6 ммоль). Затем реакционный раствор охлаждают до -20°С и добавл ют изобутиловый эфир хлормуравьинойкислоты (1.77 мл, 13,6 ммоль), После перемешивани в тече- ние 5 мин при -20°С в реакционную смесь ввод т амин, который получен в примере 1,а, МН2-СН(СН2)зВг В02-СюН1б- HCI (5 г, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажденного хлоформа. Охлажденный тетрагид- рофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13,6
ммоль) прибавл ют к реакционной смеси и перемешивают смесь в течение 1 ч при -20°С и примерно 2 ч при комнатной температуре . Смесь фильтруют и оставшуюс жидкость в фильтрате упаривают. Осадок раствор ют в этилацетате и промывают 0,2н. HCI, 5%-ым водным раствором бикарбоната натри и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натри , фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9 г продукта в виде масла. Указанный продукт раствор ют в метаноле и хроматог- рафируют на колонке 2,5 х 50 см с LH-20. Фракции, содержащие целевой продукт, объедин ют и упаривают с получением 5,8 г твердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичное п тно, Rf 0,70.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СззРзэМзОбВВг:
Вычислено: +Н: 674,30
Найдено: 674,30.
ПримерЗ. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3N3 B02-CioHi6.
Продукт примера 2. Boc-(D)Phe-Pro- NH-CH(CH2)3Bf)B02-CioHi6 (4,4 г, .6,54 ммоль) раствор ют в 7 мл диметилформами- да(ДМР) и азид натри (0,919 г, 14.1 ммоль) прибавл ют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100°С в течение 3 ч. Прибавл ют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлористого натри . Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натри , фильтруют и упаривают. Получают 4,1 г твердого продукта. Указанный продукт хро- матографируют на колонке 2,5 х 50 см из LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие целевой продукт, объедин ют, оставшуюс жидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол:хлоро- форм (1:9) показывает единичное п тно, Rf 0,76.
Элементный анализ дл CsaH sNeOeB,
(%):
Вычислено: С 62,35, Н 7,63, N 13,33, В 1,70.
Найдено: С 63,63, Н 8,02, N 11,58, В 1,80.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СззН4вМбОбВ
Вычислено: +Н: 637,39
Найдено: 637,49.
П р и м е р 4. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3NH2 B02-CioHi6 Бёнзолсульфо- кислота.
Азид примера 3 (8,80 г, 13,8 ммоль) раствор ют в 150 мл метанола и гидрируют на установке Парра при давлении 40 фунтов/дюйм2 (2,812 кг/см) в присутствии 0.50 г 10% палладиевой черни и бензолсуль: фокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль). Через час катализатор удал ют и после упаривани
раствора получают 9,9 г требуемого продукта . оф-ТСХ в системе растворителей мета- нол:вода (85:15) показывает п тно в УФ-области, Rf 0,91 и п тно, позитивное к нингидрину, Rf 0.52.
П р и м е р 5. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3-NH-C(NH)NH2 B02-CioHi6X
хбензолсульфокислота.
Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHi6x хбензолсульфокислота. Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHie)f
бензосульфокислоту, полученную в примере 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100°С в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл). Ход реакции регулируют оф- ТСХ в системе растворителей метанол: воды (85:15), где наблюдаетс исчезновение ни- нгидринового п тна из исходного материала амина (Rf 0,54) и по вление красител
Sakaguchi на полученном продукте (Rf 0- 0,13). Указанный продукт можно обнаружить после нагревани с обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышаетс . Через 7
дней, когда амин нельз обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50 об.% пассивным упариванием. Затем реакционный раствор фильтруют, сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см
колонке с LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, объедин ют и после упаривани получают 3,7 г требуемого продукта. Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетзт.тексан с
выходом 0,89 г вещества, а остаток (1,2 г) получают порошкованием простым эфиром в виде твердого продукта,
Mace-спектроскопи (FAB) дл CoiHsaNeOeSB:
Вычислено: +Н: 653,42 Найдено: 653,38. Элементныйанализ дл
C40H59N609SB-H20, %:
Вычислено: С 57,95, Н 7,43, N 10,14, В 1.30
Найдено: С57.20, Н 7,14, N 10,94, В 1,01.
Примерб. H-(D)Phe-Pro-6opoArg- CioHi6 2HCI.
Продукт примера 5, Boc-(D)Phe-Pro- боро Агд-СюН1б,бензолсульфокислота (1,17 г, 1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с 5 мл 4н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный продукт осаждают при добавлении простого эфира, выдел ют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт раствор ют в 10 мл воды и нанос т на анионно-обменную колонку 5 мл с Вио-RADAGI Х8™ (СГ-форма, ВЮ-RADCo., Richmond, CA) с последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 г).
Mace-спектроскопи (FAB) дл
C29H45N604B:
Вычислено: +Н: 553,37
Найдено: 553,40 и 538,40 (не идентифицирован ).
Элементный анализ H-(D)Phe-Pro-6o- poArg-CioHi6-1BSA.TFA:
Найдено; 553,4
Пример ы7и 8. Ac-(D)Phe-Pro-6o- poArg-CioHi6 HCI (пример 7)
Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH.HCI (пример 8).
Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHi6X бензосульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль) подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (TFA) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток TFA удал ют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта, Указанный продукт (0,70 г, 0,91 ммоль) раствор ют в смеси, состо щей из 2 мл диоксана и 1 мл воды. Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5 ммоль) и бикарбонат натри (0,42 г, 5 ммоль) прибавл ют к реак- ционному раствору, Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавл ют этила- цетат (50 мл) и воду (5 мл). Образовавшиес фазы раздел ют и органический слой сушат над безводным сульфатом натри . После фильтровани и удалени растворител упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества .
Полученную пробу раствор ют в 4 мл лед ной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же нанос т на колонку с 15 мл SP-ce- фадекса™ (Н -форма) и уравновешивают 20%-ым раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ой уксусной кислоты до 100 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н.хлористоводородной кислоты. Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0.17н. HCI. содержат N-ацетиловый пептид(0.29 г) в виде смеси из свободной бороновой кислоты и сложного пинандиолового эфира.
Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту раздел ют хроматогра- фией на 2,5 х 100 см колонке, содержащей LH-20 в метаноле. Размер фракций состав- л ет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракци х 41-43, в то врем как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракци х 45-129.
Mace-спектроскопи (FAB) (пример 7): 0 Ас-(0)РЬе-Рго-бороАгд-СюНб дл C3iH47N60sB:
Вычислено+Н: 595,33 . Найдено: 595,33 . Mace-спектроскопи (FAB) (пример 8): 5 Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH.HCI дл С21НззМб05:
Вычислено+Н: 449,60 Найдено: 579,24-581,24. Последние данные нельз объ снить. 0 Тем не менее данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускани дл пинандиоловой группы, например как синг- леты метильных групп при дельта 0,85 (ЗН), 5 1,30 (ЗН) и 1,36 (ЗН), не наблюдались. В качестве дополнительного доказательства этой структуры образец продукта свободной бороновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитиче- 0 скую пробу (20 мг) обрабатывают двухкратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл метанола в течение 5 мин. Растворитель упаривают , а избыток пинандиола удал ют по- рошк ованием простым эфиром указанного 5 образца с выходом требуемого продукта (26 мг). Mace-спектроскопи (FAB) (найдено: 595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой , предполагаемой дл этерифицирован- ного продукта, и почти идентичны 0 пинандиоловому продукту примера 7.
П р и м е р 9. Ac-Phe-6opoArg- CioHi6 HC.
По методике, описанной в примере 2, . получают Ас-Рпе-МН-СН(СН2) 5 СюНтб. Затем получают смешанный ангидрид Ac-Phe-OH (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 мл TFA, который св зывают с NH2- СН(СН2)зВг В02-СюН1б-НС1 (продукт примера 1,а. 1 г, 2,73 ммоль), растворенного в 0 10 мл охлажденного THF с выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т.пл. 106,5-109°С).
5 Элементныйанализ дл C25H36N204BrB, %;
Вычислено: С 57, 81, Н 7.00, N 5.40, Вг 15,40, В 2,08
Найдено: С 58,33, Н 7.33. N 4,76, Вг 14,18, В 1,80.
Масс-спектроскопи (FAB) дл
С25НЗбМ204ВгВ:
Вычислено +Н; 519,20 Найдено.: 519,23.
Ac-Phe-NH-CH(CH2)3N3 B02-CioHie получают при обработке Ac-Phe-NH- СН(СН2)зВг В02-СюН1б (3,22 г, 6,20 ммоль) натрийазидом по методике, описанной в примере 3. Полученный продукт (3,03 г) хро- матографируют на колонке с LH-20, Фракции , содержащие требуемый продукт, объедин ют и упаривают. Осадок порошку- ют гексаном с выходом 2i21 г указанного азида,
. ,. Бензолсульфонат Ac-Phe-6opoOrn- CioHie получают из указанного азида Ас- РЬе-МН-СНг(СН2)з№ В02-СюН1б (2,21 г, 4,59 ммоль) по методике примера 4 за исключением того, что гидрирование осуществл ют при атмосферном давлении. После фильтровани и упаривани растворител путем порошков.ани простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 г).
Ac-Phe-6opoArg-CioHi6X
бензолсульфонат получают путем обработки соединени Ас-РЬе-бороОгд-СюЖе-бен- золсульфокислота (2 г, 3,26 ммоль) 10 мл
раствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле, Реакцию гуанидировани осуществл ют по методике примера 5 за исключением того,
что реакционное врем составл ет 3 дн , а реакционна смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта. Указанна смесь требует дополнительной
очистки, которую по всей веро тности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далее концентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из LH-20 в метаноле.
Фракции, содержащие требуемый продукт, обнаруженные при помощи подкрашивающего агента Sakaguchi, объедин ют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученный продукт (1,2 г) раствор ют в 6 мл уксусной кислоты, разбавл ют 30 мл воды и получают раствор молочного цвета. Этот раствор нанос т на колонку объемом 30 мл с SP-Сефа- дексом™ С-25 fH-форма), доведенную до равновесного состо ни .20%-ым водным раствором уксусной кислоты. Далее колонку промывают240 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ой уксусной кислоты до 250 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н, сол ной кислоты. Фракции , элюированные из колонки в интервале от 0,12 до ОИ6 н. сол ной кислоты, объедин ют с выходом 0,42 г требуемого пептида в виде смеси свободной борной кислоты и сложного эфира пинандиола. Указанную
. смесь раствор ют в метаноле (10 мл) и дл этерификации свободной бороновой кислоты прибавл ют 80 г пинандиола. После перемешивани в течение 30 мин 5 растворитель упаривают, а после порошко- вани осадка простым эфиром получают 0,28 г требуемого продукта.
Элементныйанализ дл C26H40N504B-HCI-2H20, %:
0 Вычислено: С 54,78, Н 8,15, N 12,30. В 1,90.
- Найдено: С 55,34, Н 7,83, N 11,66, В 1,99. Масс-спектроскопи (FAB) дл С2бН4о№04В:
5Вычислено+Н: 498,32 Найдено: 498,31.
Пример 10. Ac-{D,L)Phe-(D,L}-6o- poArg-CieHi2.
Промежуточное соединение Ас- 0 (0,ЦРпе-(О,1Н 1Н-СН-(СН2)зВг В02-СбН12 получают модифицированием методов, описанных в примере 1 и 2. Хлорангидрид Ас- Phe-OH получают при взаимодействии Ac-Phe-OH (30 г, 0,145 моль) с пентахлори5 дом фосфористой кислоты (30 г, 0,144 моль)
в 175 мл THF при-10°С, Реакционную смесь
перемешивают при 0°С приблизительно в
течение 1 ч, затем разбавл ют до объема 350
. мл охлажденным простым эфиром, продукт
0 выдел ют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после вы-, сушивзни в вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилп- роизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) раствор ют
5 в 40 мл THF и прибавл ют к продукту взаимодействи пинакона 4-бром-1-хлорбутил- бороната и гексаметилдисилизана, приготовленных в 20 ммольной концентрации , при -78°С. Затем реакционную смесь
0 нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удал ют путем упаривани . Осадок раствор ют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ым
5 раствором бикарбоната натри и насыщенным водным раствором хлористого натри . Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натри и после концентрированна получают требуемый
0 продукт продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г, т.пл. 146,5- 148°С). При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав.
5 Элементныйанализ дл C2iH32N204BrB, %:
Вычислено: С 53,98, Н 6,92, N 6,00, Вг 17,10, В 2,31.
Найдено: С 54,54, Н 6,78, N 5,89, Вг 16,46,63,40.
151807988 16
Алкилбромид превращают в соответст-5,33 г, 14,5 ммоль) по методике, описанной в
вующий азид по методике примера 3. Про-примере 2, за исключением того, что не выдукт выкристаллизовывают из этилацетатаполн ютхроматографии на колонке с LH-20.
(т.пл. 143-144°С).Полученный продукт выкристаллизовывают
Элементный анализ дл С21Нз2№04В, 5из этилацетата с выходом в первом погоне
%:2,47 г продукта (т.пл. 132-134°С) и 5,05 г
Вычислено: С 58,74, Н 7,53, N 16,31, Впродукта (т.пл. 133-135°С) во втором погоне.
2,53.При оф-ТСХ в системе метанол: вода (85:15)
Найдено: С58,85,Н7,48, N16,53, В 2,93.отмечено единичное п тно. Rf 0,29.
Полученный азид превращают, в соль 1 оЭлементный анализ дл CayHsiNaOeBrB,
бензолсульфокислотыАс-(0,1)Рг1е-(0,1)-бо-%:
ррОгп-СбН 12 по методике примера 4 за иск-Вычислено: С 61,32, Н 7,11, N 5,80, Вг
лючением того, что гидрирование провод т11,03.
при атмосферном давлении.Найдено: С 61,21, Н 7,02, N 5,59, Вг
Ac-(D,L)Phe-(D,L)6opoOrn-C6H 12X1510,22.
Хбензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль)Вос-(0)Рпе-Рпе-ЫН-СН(СН2)зМз В02подвергают взаимодействию с цианамидом-CioHie получают при обработке соответству (0,20 г, 0,476 ммоль) при 100°С в 2 мл абсолют-ющего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) ази .ного этанола в течение ночи. Раствор кон-дом натри по методике, описанной в
центрируют и после порошковани простым 20примере 3, за исключением того, что дл
эфиром получают 0,21 г белого вещества.очистки не нужно проводить хроматографиПри оф-ТСХ отмечено характерное положи-ческого разделени на колонке с LH-20. Третельное окрашивание полосы при использо- буемый продукт элюируют из смеси
вании красител Sakaguchl в случаерастворителей этилацетаттексан в виде ге-.
бороаргининовых пептидов (Rf 0-0,55) и ди- 25л и после выделени и промывани гексаскретное п тно (Rf 0,68), соответствующееном получают 3 г требуемого продукта в
непрореагированному исходному материа- :.первом погоне и 2,9 г во второй порции,
лу. Полученный продукт (81 мг) повторно об- ;Бензолсульфонат B oc-(D)Phe-Phe-6oрабатывают 2 мл раствора цианамида (10ррОгп-СюЖб получают из указанного азида
мг/мл) в течение ночи по указанной методй- 30(5,37 г, 7,82 ммоль) по методике, описанной
ке и после порошковани просты м эфиром ;в примере 4, с выходом 5,33. При оф-ТСХ в получают мг целевого продукта. : . /смеси метанрл:вода (85:15) отмечаетс ин Mace-спектроскопи (FAB) дл тенсивное положительное окрашивание ниG22H37NsO4B: :;.нгидрином, Rf 0,42 .и слабое п тно в
Вычислено Н: 446,30. 35УФ-области, 0,92 (образование п тна в УФНайдено: 446,23 и 404,19 (соответствую-области при Rf.0,92 характерно дл аминов
. щий непрореагированному борорнитиново-или гуанидйновых соединений, которые вму пептиду).л готс сол ми бензолсульфокислоты).
Следует иметь в виду, что методика по: Mace-спектроскопи (FAB) дл примеру 5 представл ет собой наилучший 40Сз7Н5зМ40бВ: V способ получени бороаргининовых пепти-Вычислено+Н: 661,76. дов и отличаетс в том, что используют боль-Найдено: 661,14. ший избыток цианамида и более.Boc-(D)-Phe-Phe-6opoArg-CioHi6 пол- продолжительное врем взаимодействи . :учают по методике, списанной в примере 5.
Пример 11. Boc-(D)Phe-Phe-6o- 45Бороорнитиновый пептид(4.83 г, 5,90ммоль)
роАгд-СюНМш бензолсульфонат.обрабатывают раствором цианамида (50
Boc-(D)Phe-Phe-OH получают по мёто-мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в тече- дике, описанной дл получени дипептида .ние 7 дней. Из реакцйоннрй смеси выдел ют Bpc-(D)Phe-Pro-OH в примере 2. После гид-порцию продукта, соответствующую 1 г ис- рировани сложного бензилового эфира 50ходного материала, и нагревают отдельно полученный продукт выкристаллизовываютбез обратного холодильника в течение ночи из смеси хлороформ:гексан с выходом тре-с полным превращением амина в гуанидино- буемого пептида (т.пл. 133-133,5°С).соединение. После хроматографии на колон- Элементный анализ дл С2зН28№05. %:ке с LH-20 и порошковани продукта
Вычислено: С 66,96, Н 6,86, N 6,79. 55простым эфиром получают 0,52 г требуемого
Найдено: С 66,75, Н 6,79, N 6,56.борнила,
8oc-p)Phe-Phe-NH-CH(i;CH2)3 BrpOj-CioHi6Элементный анализ дл C HeiNeOgSB,
получают путем смешивани Boc-(D)Phe-%;
-Phe-OH (6 г, 14,5 ммоль) с NH2-Вычислено: С 61,38, Н 7.16, N 9,76, В
-СН(СН2)зВг В02-СюН1б НС1 (пример 1,а,1,25.
Найдено: С .59,69, Н 7,41, N 9,82, В 1.26.
Mace-спектроскопи (FAB) дл CaeHssNeOeB:
Вычислено+Н: 703,43
Найдено: 703,49.
П р и м е р 12. H-(D)Phe-Phe-6opoArg- CioHi6 2HCI.
Бензолсульфонат Boc-(D)Phe-Phe-6o- poArg-CioHi6, полученный по примеру 11 (0,59 г, 1,25 ммоль), деблокируют по методике примера 6 за исключением того, что пробу нанос т на ионнообменную колонку в 20% этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ым раствором этанола. Продукт получают (0,424 г) в виде белого твердого вещества.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СззНзтМбСиВ:
Вычислено+Н: 603.38.
Найдено: 603,41,
П р и м е р 13. Бензолсульфат Ac-Ala- Lys(Boc)-6opoArg-CioHi6.
Ac-Ala-Lys(Boc)-OH получают путем сопр женной реакции N-окси нтарной кислоты имидоэфира Ac-Ala-QH. полученного по методу Anderson, с H-Lys(Boc)-OH. N-окси- кукцинимид Ac-Ala-OH (6,25 г, 27,4 ммоль) раствор ют в 30 мл диоксана и прибавл ют к раствору H-Lys(Boc)-OH (7,50 г, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состо щей из 30 мл 1 н. NaOH и триэтиламина (2,12 мл, 15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисл ют сол ной кислотой. Дл получени требуемой насыщаемости раствора добавл ют нужное количество сухого хлорида натри . Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н. HCI, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натри . Растворитель удал ют путем упариванй . После кристаллизации продукта из смеси этилаце- тат:гексан получают 7,3 г требуемого продукта (т.пл. 86-89°С).
Ac-AJa-Lys(Boc -NH-CH(CH2bBr B02-CioHi6 получают по методике примера 2 за исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата. В продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракци х, отмечаетс единичное п тно при оф-ТСХ в смеси растворителей метанол:вода (85:15) при значении Rf 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, на которой после прибавлени нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин.
Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH(CH2)3N3 B02CioHie получают из соответствующего алкилбромида (1,95 г, 2,9 ммоль) по методике,
описанной в примере 3. за исключением того , что очистку продукта осуществл ют кристаллизацией его из этилацетата, а не хро- матографией на LH-20. После кристаллизации неочищенного продукта 5 (1,6 г) получают 0,55 г чистого продукта (т.пл. 79-84°С) и 0,96 г осадка. Ниже представлен химический состав кристаллического продукта .
Элементный анализ дл CaoHsaNyOyB,
0 %:
Вычислено: С 56,86, Н 8,29, N 15,48, В 1,71.
Найдено: С 56,76, Н 8,26, N 15,89, В 1,65. Бензолсульфонат Ac-Ala-l ys(Boc)-6o- 5 poOrn-СюН 16 получают из соответствующего алкилазида (0,433 г, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4. После удалени катализатора и растворител получают названный продукт (0,45 г) при порош- 0 ко.вании простым эфиром.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СзоНмМбОтВ:
Вычислено+Н: 608,42. Найдено: 608,49.
5Бензолсульфонат Ac-Ala-Lys(Boc)-6o- роАгд-СюЖе получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, описанной в примере 5, Хроматографические фрак- 0 ции, содержащие требуемый продукт, порошкуют простым эфиром с выходом 0,83 г продукта в виде белого твердого вещества. Элементный анализ дл CaTHezNyOioBS, %: . 5 Вычислено: С 55,00, Н 7,75. N 12,14, В
1,34:
Найдено: С 54,09, Н 7,53, N 12.22, В 1,34.
Пример14, Ac-A a-Lys-6opoArg-CioHieX x2HCI.
Бензолсульфонат As-Ala-Lys(Boc)-6o- роАгд-СюН1б(0,200 г, 0,248 ммоль) деблокируют по методике примера 6. После ионнообменной хроматографии, упариванй растворител , просушивани в вакууме и порошковани простым эфиром получают 0,14 г требуемого продукта.
Mace-спектроскопи (FAB) дл
C26H48N705B:
Вычислено+Н: 550,39, 0 Найдено: 550,42.
П р и м е р 15. Бензолсульфонат Вос Leu-Gly-Leu-Ala-6opoArg-CioHi6.
Вoc-Leu-Ala-OBzL получают по методике синтеза дипептидов, описанной в приме- 5 ре 2. Boc-Leu-Ala-OBzL (23,7 г, 57,7 ммоль) раствор ют в 40 мл безводной трифторук- сусной кислоты. Через 15 мин удал ют избыток трифтор-уксусной кислоты путем упариванй и после обработки полученного
5
осадка простым эфиром получают трифто- рацетат H-Leu-Ala-OBzL в виде кристаллического продукта (22,8 г).
Элементный анализ дл CieHasNaOsFa,
%:5 Вычислено: С 53,19, Н 6.21, N 6,89. Найдено: С 53,37, Н 5,68, N 6,84. Boc-Gly-Leu-Ala-OBzL получают реакцией сопр жени Boc-Gly-OH (5,70 г, 32,6 ммоль) с H-Leu-Ala-OBzL по методике сме- 10 шанного ангидрида, описанной в примере 2. Продукт (13.8 г) получают в виде аморфного твердого вещества. Boc-Gly-Leu-Ala- OBzL деблокируют трифторуксусной кислотой по методике, описанной дл при- -15 готовлени H-Leu-Ala-OBzL, за исключением того, что трифторацетатна соль может быть растворена в простом эфире. Продукт раствор ют в этилацетате и очищают безводным хлористым водородом. После осаж- 20 дени полученного продукта при добавлении простого эфира получают 7,7 г хлорида H-Gly- Leu-Ala-OBzL в первом сборе .
Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OBzL получают 25 сопр женной реакцией Boc-Leu-OH (2,62 г, 10,5 ммоль) с H-Gly-Leu-Ala-OBzL по методике получени смешанного ангидрида, описанной в примере 2. После кристаллизации полученного продукта из смеси этила- 30 цетат:гексан получают в первом сборе 2,7 г названного продукта (т.пл. 95-96°С).
Элементный анализ дл C29H46N407, %: Вычислено: С 61,89, Н 8,26, N 9,96. Найдено: С 62,00, Н 8.40, N 9,83.35 Boc-Leu-G y- eu-Ala-OH получают каталитическим гидрированием сложного бензилового эфира (2.6 г, 4,62 ммоль) по методике, описанной в примере 2, с выходом 2,1 г требуемого продукта. После кри- 40 сталлизации полученного продукта из гор чего раствора этилацетата получают 1,4 г вещества.
Элементный анализ дл C22H40N407. %: Вычислено: С 55,90. Н 8,55. N 11,86 45 Найдено: С 55,42, Н 8,47, N 11,73. Boc4ЈiH3ly-Leu-Ala-NH-CH(CH2) BO2-CioHie получают реакцией сопр жени Boc-Leu-Gly-Leu-A a-OH (1.40 г, 2,96 ммоль) с амином из примера 1,а по методи- 50 ке, описанной в примере 2, за исключением того, что не провод т хроматографического разделени . После кристаллизации продукта из смеси этилацетаттексан получают 1,17 г требуемого продукта. При ТСХ в системе 55 растворителей метанол:хлороформ (1:9) отмечено единичное п тно при значении Rf 0,68.
Элементныйанализ дл C36H63N5OaBrB, %:
Вычислено: С 55,10, Н 8,11, N 8,93, В 1.38.
Найдено: С 55,96, Н 8,30, N 8,74, В 1,33.
Соответствующий азид получают по методике примера 3 с 97% выходом, который превращают в Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-6o- poOrn-CioHie согласно методу в примере 4. Аналитическую пробу приготавливают путем осаждени указанного продукта простым эфиром и хроматографического разделени его на колонке с LH-20 с последующим элюированием из смеси хлороформа с гексаном.
Mace-спектроскопи (FAB) дл CseHesNeOeB:
Вычислено: : 721,50.
Найдено: 721,55.
Бензолсульфонат Boc-Leu-Gly-Leu- Ala-6opoArg-Cio-Hie получают по методике , описанной в примере 5. Соответствующий бороорнитиновый пеп- тид (0,695 г, 0,791 ммоль) подвергают взаимодействию с 5 мл раствора цианамида (50 мг/мл) в абсолютном этаноле. После хрома- тографировани указанной смеси и порош- ковани простым эфиром получают 0,41 г требуемого продукта.
Mace-спектроскопи (FAB) дл Сз7Рб7Мв08В: ; :у
Вычислено:+Н: 763,53.
Найдено: 763,8.
П р и м ё р 16. Бензолсульфонат H-Leu- G y-Leu-Ala-6opoArg-CioHi6-HCI.
Бензолсульфонат Boc-Leu-Gly-Leu- Aia-6opoArg-CioHie, полученный в примере 15 (0,050 г, 0,0543 ммоль), подвергают взаимодействию с 2 мл 4н.хлороводорода в ди- оксане в течение 5 мин при комнатной температуре. Растворитель и избыток HCI удал ют упариванием. Полученную пробу высушивают над гидроксидом кали в вакууме в течение ночи, а затем после порошковани простым эфиром получают требуемый продукт (46 мг) в виде смешанной соли.
Mace-спектроскопи (FAB) дл Сз2Н5эМ80бВ:
Вычислено Н: 663,47.
Найдено: 663,50.
П р и м е р 17. Бензолсульфонат Bz-Glu- (OBu)-Gly-6opoArg-CioHi6.
(OBu)-Gly-NH-CH-(CH2) СюН 16 получают сопр женной реакцией Bz- Glu-(OBu)-Gly-OH с указанным амином по методике, описанной в примере 2, Соответствующий азид получают в соответствий с методом, описанным в примере 3, а бороорнитиновый пептид получен по методике примера 4.
Mace-спектроскопи (FAB) дл
C32H49N407B:
Вычислено +Н: 613,38.
Найдено: 613.60.
Конечный продукт получают по методике , описанной в примере 5.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СззН51Мб07В:
Вычислено+Н: 655,40. . Найдено: 655,37,
Элементныйанализ дл СзэНзуМбОюЗВ, %:
Вычислено: С 57,62, Н 7,08, N 10,34, В 1 33 Найдено: С57,43, Н 7,25, N9,91,8 1,23.
П р и м е р 18, Бензолсульфонат Bz-Glu- Gly-6opoArg-CioHi6.
Бензолсульфонат Bz-Glu-(OBu)-Gly- 6opoArg-CioHi6 (0,13 г, 0,16 ммоль) раствор ют в 5 мл диоксана. прибавл ют бензолсульфокислоту (0,10 г, 0,66 ммоль) и реакционный раствор перемешивают в те- чение ночи при комнатной температуре. После концентрации раствора до объема примерно 1 мл путем упаривани с последующим порошкованием простым эфиром получают твердое вещество (0,14 г). Пол- ученный продукт хроматографируют на 2,5 х 50 см колонке с Ш-20 в метаноле. Фракции , содержащие требуемый продукт, упаривают , а осадок порошкуют простым эфиром с выходом 53 г названного п роду к- та.. .
Mace-спектроскопи (FAB) дл СгэНззМеОтВ: .
Вычислено Н: 599,34.
Найдено: 599,35, 613,36 (не идентифицирован ).
Пример 18,а. Бензолсульфонат Bz- Glu-бороАгд-СюН 16.
-.. Бензолсульфонат Bz-Glu-(OBu)-Gly- 6opoArg-CioHie (пример 17, Q,20 r, 0,246 ммоль) обрабатывают безводным хлори- стым водородом по методике, описанной в примере 6, в течение 45 мин. После порош- ковани указанного продукта данные ЯМР показывают, что примерно 30% трет-бути- ловой защитной группы все еще находитс в указанном продукте. Затем продукт подвергают взаимодействию с безводной триф- торуксусной кислотой в течение 45 мин при комнатной температуре. TFA удал ют упа- риванием и после порошковани получен- ного осадка простым эфиром получают 143 мг названного продукта.
Масс-спект.роскопи (FAB) дл СаэРчзМеОтВ:
Вычислено+Н: 599,34. Найдено: 599,35.
П р и м е р 19. Бензолсульфонат Bz-Pro- Phe-бороАгд-СюН 16.
Bz-Pro-Phe-OH (т.пл. 200-20ГС) получают по методике, описанной в примере 2, используемой дл синтеза дипептидов.
Элементный анализ дл С21Н22№04, %:
Вычислено: С 68,82, Н 6,06. N 7,65.
Найдено: С 68.91, Н 6,09, N 7,47.
Bz-Pro-Phe-4 H-CH(CH2)3Br B02-CioHi6 получают сопр женной реакцией Bz-Pro- Phe-OH с указанным амином по общему методу, описанному в примере 2, за исключением того, что хроматографическое разделение не осуществл ют. При ТСХ в смеси растворителей метанол:хлороформ (1:9) наблюдаетс обширное п тно при Rf 0,72 и следы при Rf 0,86.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СзбН бМзОбВВг:
Вычислено+Н: 678,27.
Найдено: 677,95.
Полученный алкилгалогенид превращают в азид и бороорнитиновый пептид по методике, описанной в примерах 3 и 4.
Mace-спектроскопи (FAB) дл (Bz-Pro- Phe-6opoOrn-CioHi6)-C35H47N405B:
Вычислено+Н: 615,37,
Найдено: 615,42.
Целевой бензолсульфонат Bz-Pro-Phe- 6opoArg-CioHi6 получают по методике, описанной в примере 5.
Mace-спектроскопи (FAB) дл CseH gNeOsSB:
Вычислено+Н: 657,39.
.Найдено: 657,13.
Элементный анализ дл C42H55N60sSB, %:
Вычислено: С 61,90, Н 6,82, N 10,31, В 1 33
Найдено: С 60,16, Н 7.27, N 9,79. В 1,44.
П р и м е р 20. Хлорид Bz-Pro-Phe-бо- poArg-OH.
Бензолсульфонат Bz-Pro-Phe-бо- poArg-CioHi6 (соединение примера 19, 0,64 г, 0,79 ммоль) раствор ют в 4 мл хлори- стого метилена и охлаждают до -78°С. Реак- ционную смесь сливают в. колбу, содержащую 4 мл 0,50 н. трихлорида бора, полученного путем разбавлени 1 н. трихлорида бора (Aldrlch Chemical Co., Milwankee, Wl) до 50% сухим хлористым метиленом, и помещенную на баню с сухим льдом. Раствор перемешивают при -178°С в течение 5 мин, затем колбу помещают на баню с льдом (0°С), где раствор перемешивают в течение 15 мин. В реакционный раствор медленно прибавл ют (5 мл) холодной воды с последующим разбавлением его до 120 мл 20%-ой уксусной кислотой. Органическую фазу отдел ют и извлекают продукт. Водную фазу нанос т на колонку объемом 20 мл на SP-Ce- фадексе™, уравновешенную 20%-ой уксусной кислотой. Колонку промывают примерно 150 мл раствора 20%-ой уксусной кислоы с последующим установлением инейного градиента концентраций от 200 л 20%-ой уксусной кислоты до 200 мл 20%- й уксусной кислоты, содержащей 0,30 н. НС. Продукт элгаируют при концентрации HCI в интервале 0,08-0,15н. После упарива- ни растворител , высушивани в вакууме и порошковани простым эфиром получают ребуемый продукт (0,19 г).
Масс-спектросколи (FAB) дл СзбНзбМбОзВ:
Вычислено+Н: 523,29.
Найдено: 579,34 (не идентифицирован).
Элементныйанализ дл С2бНзбМб05С1В, %: .
Вычислено: С 53,29, Н 6.55, N 14,34, В 1.84.
Найдено: С 53,27, Н 6,58, N 13,25, В 1,89.
При этерификации названного продукта пинандиолом по методике, описанной в примере 8,а, получают продукт, свойства которого при ЯМР и МС совпадают с исходным сложным эфиром примера 19.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СзбН/шМбОбВ:
Вычислено +Н: 657,40.
Найдено: 657,39.
Приме р 21. Хлористоводородна соль Bz-Pro-Phe-6opoArg-F.
Bz-Pro-Phe-NH-CH(CH2)3NH-C(NH)NH2 BF2 HCI.
Bz-Pro-Phe-6opoArg-F.
Свободную боронЪвую кислоту (соединение примера 20, 0,100 г. 0,179 ммоль) раствор ют в 2 мл воды. К полученному раствору прибавл ют 0,040 мл 48%-ой фтористоводородной кислоты при комнатной температуре. Почти сразу же образуетс смолистообразный преципитат. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, затем замораживают и в вакууме удал ют избыток фтористоводородной кислоты и воду . Остаток раствор ют в метаноле, концентрируют и порошкуют простым эфиром. Выход составл ет 0,093 г требуемого продукта .
Mace-спектроскопи (FAB) дл С2бНззМбОзВР2:
Вычислено+Н: 527,29,
Найдено: 527,31 и дополнительные значени масс, характерных дл свободной бо- роновой кислоты.
Элементныйанализ дл С2бНз4МбОзВР2СГН20, %:
Вычислено: С 53.47. Н 6.25, N 14.47. В 1,86, F6.54.
Найдено: С 54.00. Н 6.40. N 13,48. В 1,95, F 7,06.
.
П р и м е р 22. Boc-Ala-Phe(D,L)6o- polys-CeHtz-HC.
Boc-Ala-Phe-N H-CH( H BCfc-CsH 12 хбензолсульфокислота.
5Продукт Boc-Ala-Phe-NH- CH(CH2)4Br B02-CeHi2 превращают в алки- лазид по методике, описанной в примере 3, за исключением того, что дл очистки пол- .ученного продукта не требуетс хроматог- 10 рафии на колонке с LH-20. Полученный азид гидрируют по методике примера 4 за исключением того, что берут 2 эквивалента бензо- лсульфокислоты, а гидрирование провод т в течение 2 ч. Получают конечный продукт при 15 40% выходе (т.пл. 154-160°С, разложение). Mace-спектроскопи (FAB) дл С2вН4бМ40бВ:
Вычислено: +Н: 547,38. Найдено: 547,43.
20 П р и м е р 23. Трифторацетат-бензо- лсульфонат H-Ala-Phe-(D,L)6opol ysСбН12 .
Бензолсульфонат Boc-Ala-Phe-(D,L)6o- poLys-C6Hi2 подвергают взаимодействию с 25 трифторуксусной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. После упаривани растворител и порошковани осадка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества. 30 Mace-спектроскопи (FAB) дл
С2зНзэМ4СМВ: Вычислено Н: 447,31.
Найдено: 447,31.- Элементный анализ дл 35 C31H46N409SF3B-2H20. %:
Вычислено: С 49,34, Н 6,68, N 7,42, В 1.43.
Найдено: С 49,26, Н 5,94, N 7,12, В 1,34. Пример 24. Бензолсульфонат Вос- 40 (D)Val-Leu-6opoLys-C6Hi2.
Boc-(D)Val-Leu-OH получают по методике , описанной а примере 2. Сложный бен- зиловый эфир получен с 76% выходом.
Mace-спектроскопи (FAB) дл 45 С2зНзбМ2С 5:
Вычислено+Н: 421,27, Найдено: 421,38.
После гидрировани получают свободную борную кислоту с 100% выходом в виде 50 кристаллического твердого вещества белого цвета.
Элементный анализ дл Ci6H29N205, %: Вычислено: С 59,34, Н 8,87, N 8,50, Найдено: С 59,34. Н 8,87, N 8,50. 55 Boc-(D)Val-Leu-OH св зывают с амином , полученным в примере 1,в, используемой дл пептидного св зывани Boc-Ala-Phe-OH с выходом Boc-(D)Val- Leu-NH-CH(CH2)4Br B02-C6Hi2 с выходом 97%.
Масс-спектроскопи (FAB) дл .С27Н51МзОбВВг:
Вычислено+Н: 604.31.
Найдено; 604,31.
Полученный алкилбромид превращают в соответствующий азид при 85% выходе по методике, описанной в примере 3, с последующим его гидрированием.Конечный продукт получают в виде белого твердого вещества с 62% выходом.
бикарбоната натри и насыщенным водным раствором хлористого натри . Органический слой высушивают над безводным сульфатом натри и после фильтровани и
упаривани получают кристаллический продукт . После выделени и промывани этила- цетатом получают 3,26 г соединени , т.пл. 176-177°С.
Элементный анализ дл CiyHasNOaBrB,
%:
Масс-спектроскопи (FAB) дл C27H53N40eB:
Вычислено+Н: 541,41.
Найдено: 541,46.15
Элементныйанализ дл СззН59М4р95В-1,5Н20. %:
Вычислено: С 54,62, Н 8,61, N 7,73, В 1,49.
Найдено: С 54,58, Н 8,59, N 7,92, В 1,98. 20
П р и м е р 25. Бензолсульфонзт Ac-Phe- BopoLys-CeHia.
Продукт примера 25 получают по метоике , описанной в примере 22.
Ac-Phe-NH-CH(CH2)4Br B02-C6Hi2 25 олучен с 72% выходом.
Масс-спектроскопи (FAB) дл С22Нз4№04ВВп :. .
Вычислено+Н: 481,00.
Найдено: 481,21.30
Азид получен с 57% выходом. Конечный продукт получают при 50% его выходе.
Масс-спектроскопи (FAB) дл . С22Нз №04В:
Вычислено+Н: 418.29.35
Найдено: 418,31.
Элементныйанализ дл С29Н42№073В-Н20, %:
Вычислено: С 56,66, Н 7,47, N 7,08, В 40
1,82.
Найдено: С 56,88, Н 7,47, N 7,22, В1.53. Пример 26. Bz-(D.L)borolrg-C6Hi2X
XHBr.
Bz-(D,L)NH-CH(CH2)3Br B02-C6Hi2 получают путем взаимодействи амина, полученного в примере 1,в (5 г, 15,9 ммоль), с эквивалентным количеством бикарбоната натри в смеси, состо щей из 4 мл диоксана и 4 мл воды при 0°С, После первоначального перемешивани реагентов реакционную смесь разбавл ют 6 мл раствора из 50% диоксана с водой и нагревают до комнатной температуры. Реакционную смесь переме- шиаают в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим экстрагированием ее ъ этилацетате и промыванием водой , 0,2 н. HCI, 5%-ым еодным раствором
15
0
5
0
5
0
5
0 5
Вычислено: С 53,44, Н 6,59, N 3,67, В 2,83.
Найдено: С 54,50, Н 6,76, N 3,68, В 2,84.
Полученный алкилгалогенид (1 г, 2,62 ммоль) превращают в соответствующую соль изотиорони . Требуемый продукт 0,84 г получен в виде твердого вещества белого цвета.
Масс-спектроскопи (FAB) дл С1вН28МзОзЗВ: , .
Вычислено+Н: 378,20.
Найдено: 378.21.
Элементныйанализ дл С18Н29МзОзЗВВг, %: .
Вычислено: С 47,18, Н 6,38, N 9,17, В 2,36. .
Найдено: С 46,11, Н 6,71. N8,97, В 2,22.
Пример 27. Ьензолсульфонат Bz(D,L)6opoArg-CeHi2.
Алкилгалогенид (полученный в примере 26, 2 г, 5,25 ммоль) превращают в азид (0,97 г, т.пл. 138-139°С) по методике, описанной в примере 3. Полученный азид превращают бензолсульфонат Bz-6opoOrn-C6Hi2 по методике примера 4 при почти количественном выходе.
Масс-спектроскопи (FAB) дл С1вН27М20зВ: . Вычислено+Н: 319,22.
Найдено: 319,26.
Бензолсульфонат Bz-6opoOrn-C6Hi2. (0,90 г, 1,84 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике, описанной в примере 5, с выходом 0,65 г кристаллического продукта, т.пл. 242- 244°С.
Масс-спектроскопи (FAB) дл CisH29N403B:.
Вычислено+Н: 361,24.
Найдено: 361,24.
Элементный анализ дл С24Нз5М40бЗВ,
Вычислено: С 55,59, Н 6,82, N 10,81, В
2,08.
Найдено: С 54,60, Н 6,70, N 11,24, В
1,87.
П р и м е р 28. Бензолсульфонат Ac-Leu- Thr(OBu)-6opoArg-CioHi6.
Ac-Leu-Thr(OBu)-OH получают путем св зывани Ac-Leu-OSu с H-Thr(OBu)-OH по методике, описанной в примере 12, дл дипептидного синтеза за исключением того, что конечный продукт получают в виде белого аморфного твердого вещества после хроматографии на колонке с LH-20. Ac-Leu-Thr(OBu)-OH (3,29 г, 9,90 ммоль) подвергают сопр женному взаимодействию с амином (пример 1,а) по методике получени смешанного ангидрида, описанной в примере 2, за исключением того, что не нужно проводить хромэтографию на колонке с LH-20.
Ac-Leu-Thr(OBu)-NH-CH(CH2) CioHie получают в виде аморфного твердого вещества белого цвета с выходом 5,39 г. Полученный элкилгалогенид превращают в соответствующий азид с 82% выходом по методике примера 3 за исключением того, что дл последующей очистки нет необходимости в проведении хроматографии. Полученный азид (3,88 г, 6.42 ммоль) гидрируют по методике, описанной в примере 4. Бензолсульфонат Ac-Leu-Thr-(OBu)-6opoOrn- CioHie получают 74% выходом после хроматографии на колонке с LH-20 и порош- ковани простым эфиром.
Mace-спектроскопи (FAB) дл CaoHssN-iOeB:
Вычислено Н: 579, 43.
Найдено: 579,48.
Бороорнитиновый пептид превращают в конечный продукт с выходом его 86% по методике примера 5.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СзтНбтМбОбВ:
Вычислено Н: 621,45.
Найдено: 621,50.
Элементныйанализ дл СзтНюМвЗОэВ. %:
Вычислено: С 57,05. Н 8,17. N 10.79, В 1 39
Найдено: С 56,47. Н 8,01. N 10,93, В 1,34.
П р и м е р 29. Бензолсульфонат Ac-Leu- Thr-бороАгд-СюН ie.
Бензолсульфонэт Ac-Leu-Thr-(0Ви)- 6opoArg-CioHie (пример 28. 0,200 г, 0,257 ммоль) раствор ют в смеси, состо щей из 2 мл хлористого метилена и 2 мл 4 н. оксан, затем полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме, а полученный осадок сушат в высоком вакууме. Требуемый продукт получают в виде белого твердого вещества с 97% выходом после порошкоаани простым эфиром.
Mace-спектроскопи (FAB) дл C27H49Ne06B:
Вычислено+Н: 565,39.
Найдено: 565,48.
Пример 30. Бензолсульфонат Ас- Lys(Boc)-Pro-6opoArg-CioH ie.
Дипептид (Вос)-Рго-ОН получают по методике, описанной в примере 13. После кристаллизации из этилацетата пол- учают указанный продукт в виде белого твердого вещества (т.пл. 160-161.5°С). Указанный дипептид Ac-Lys(Boc)-Pro-OH (3,15 г. 8,18 ммоль) подвергают сопр женной реакции с амином (пример 1,а) по мето- Дике, описанной в примере 2, Полученный продукт (5,8 г) используют без дополнительной очистки. Полученное соединение превращают в азид по методике примера 3 с выходом его 73% после хроматографии на колонке с LH-20. После гидрировани по методике примера 4, хроматографиу) на колонке с LH-20 и порошковани простым эфиром получают бензолсульфонат Ас- Lys(Boc)-Pro-6opoOrn-CioHi6 с выходом 81%.
Mace-спектроскопи (FAB) дл
C32H55N50.7B:
Вычислено +Н: 634,43. Найдено: 634,46.
Бороорнитиновый пептид (2,0 г. 2,53 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике примера 5 с выходом 1,8 г требуемого продукта в виде твердого вещества белого цвета.
Mace-спектроскопи (FAB) дл СззН57М707В: ... у Вычислено Н: 676,46. Найдено: 676,41.
Элементныйанализ дл СзэНбзМтОюВЗ. %: .
Вычислено: С 56,23, Н 7,64, N 11,77, В1,30.
Найдено: С56.06. Н 7,48, N 11,75, В 1.22. Пример 31. Ac-Lys-Prp-6opoArg- CioHi6-2HCI.
Бензолсульфонат Ac-Lys(Boc)-Pro-6o- poArg-CioHi6 (пример 30, 0,30 г. 0,360 ммоль) подвергают взаимодействию со смесью, состо щей из лед ной уксусной кислоты с 4 н, HCI и диоксана в соотношении 50:50 (%), в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают, а остаток сушат в вакууме. Полученный осадок раствор ют в воде и пропускают через 5 мл колонку на (С1-формэ). Полученную пробу упаривают и после порошковани остатка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества белого цвета (230 мг).
Масс-спектроскопи (FAB) дл
C28H49N 03B:
Вычислено+Н: 576,40.
Найдено: 576,45.
П р и м е р 32. Бензолсульфонат Glu(OBu)-6opoArg-CioHi6.
Ac-Ala-Glu(OBu)-OH получают путем св зывани Ас-Ala-OSu с H-Glu(OBu)-OH по методике примера 13. Продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гексан (т.пл. 147,5-148° С).
Элементный анализ дл С-нН24№Об, %:
Вычислено: С 53,14, Н 7,66, N 8,85.
Найдено: С 53,28, Н 7,53. N 9,08.
Ac-Ala-Glu(OBu)-NH-CH(CH2) СюНчб получают по методике примера 2 за исключением того, что вместо этилацетата используют хлороформ дл отделени органического сло на начальной стадии реакции и не провод т хроматографии на колонке с LH-20. После упаривани органического сло получают 87% выхода требуемого продукта в виде частично кристаллического твердого вещества. Ал- килбромид превращают в азид по методике,. описанной в примере 3. Целевой продукт (т.пл. 165-166°С) получен с 50% выходом после кристаллизации неочищенного продукта из хлороформа.
Элементный анализ дл С28Н47МбО В,
%:
Вычислено: С 53,51, Н 7,55, N 6,69, В 1.73.
Найдено: С 55,51. Н 7,50, N 6.50, В 1,66.
Бороорнитиновый пептид получают по методике примера 4 с 79% выходом требуемого продукта,
Масс-спектроскопи (FAB) дл C28H49N407B:
Вычислено +Н: 565,38.
Найдено: 565.51.
Конечный продукт получают в виде твердого аморфного вещества белого цвета с выходом 70% по методике примера 5.
Масс-спектроскопи дл C29H5iN60 B:
Вычислено+Н: 607.40.
Найдено: 607,41.
Элементныйанализ дл Сз5Н57МбСНбВ5, %:
Вычислено: С 54,96; Н 7.53. N 10.99. В 1,41.
Найдено: С 54,36. Н 7,71, N 11.27, В 1.21.
П р и м е р 33. Бензолсульфонат Ac-Ala- Glu-бороАгд-СюН 15.
Бензолсульфонат Ac Ala-Glu(Bu)-6o- poArg-СюН 16 (пример 32. 0.10 г. 0.131 ммоль) раствор ют в 10 мл уксусной кислоты, через полученный раствор в течение 20 мин пропускают хлороводород. Затем раствор перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре и после упаривани растворител получают масло. Требуемый продукт 5 получают в виде твердого белого вещества (82 мг) после просушивани в вакууме и по- рошковани простым эфиром.
Масс-спектроскопи (FAB) дл C25H43N60 B:
0 Вычислено+Н: 551,34. Найдено: 551,41.
Использу аналогичные методы, которые описаны в примерах 22 и 23, получены дополнительно соединени (см. табл. 16).
5 Проведены биологические испытани соединений, полученных описываемым способом .
Показано, что все эти соединени могут быть отнесены к категории малотоксичных
0 веществ.
Ингибици калликреина плазмы человеческой крови
Каллекреин плазмы человека получают из протогена АГ (AG), поставл емого из
5 Швейцарии. Специфическа активность, как описывает поставщик, составл ет 15 единиц на мг. 1 единица определена как количество фермента, необходимого дл гидролиза 1 мкмоль субстрата, H-(D)Pro-Phe-Arg-napa0 нитроанилина, (Kabi S2302), за минуту при концентрации субстрата 0,50 мМ при 25°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8.
Маточный раствор фермента 1 ед/мл приготавливают в 50%-глицерин - 0,1 М на5 трийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлористого натри и 0.1% полиэтиленгликол 6000 (PEG). В стандартных испытани х 10 мкл основного раствора калликреина прибавл ют к 990 мкл раство0 ра, содержащего 0,20 мМ (H-(D)Pro-Phe- Arg-пара-нитроанилида S2302 в 0,10 мМ натрийфосфатного буфера. рН 7,5, в состав которого входит 0,20 М хлорида натри и 0,1 % PEG. при 25°С. Действие ингибиторов
5 оценивают при регистрации ферментативной активности, определ емой при измере-. нииповышени интенсивности поглощени при 405 нм по времени как в присутствии, так и в отсутствии ингибиторов. В табл. 1
0 приведены уровни ингибиторов и активность , замеренные в интервале 10-20 мин после стимул ции активности. Активность контрольных ингибиторов составл ет 0,0092 ±0,0095 .
5В табл. 1 показана биологическа активность ингибиторов калликреина плазмы крови человека.
Из табл. 1 следует, что указанные ингибиторы имеют значени Ki 0.7 мкм. Наиболее эффективным синтетическим
обратимодействующим ингибитором вл етс 6-амидино-2-(4-эмидинофенил)-бен- зо//3/тиофен, имеющий значение Ki 0,7 мкм.
Таким образом, приведенные в табл. 1 соединени вл ютс более активными ин- гибиторами каллекреина, чем известное производное бензо// /тиофена.
Кроме участи в коагул ции крови кал- ликреин высвобождает брадикинин из белковых субстратов. Брадикинин повышает васкул рную проницаемость, оказывает хе- мотактическое действие на лейкоциты и вызывает боль. Первые два вида активности св заны с воспалением. Поэтому предполагаетс , что ингибирование калликреина имеетпротивовоспалительный и обезболивающий эффект.
Соединени по изобретению были испытаны также в отношении ингибировани тромбина.
Ингибици тромбина (эстеразна активность ).
Тромбин человека (специфическа активность 2345 NIH ед/мг) получают из R, Q, P. Laboratories, South Bend, IN (Lot HT 102). Маточный раствор тромбина готов т в 0,01 М PIPES-буфере, рН 6. содержащем 0,75 М хлорида натри . Анализ тромбина провод т в натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М натрийхлорида и 0,1% PEG- 6000. Исходна концентраци субстрата составл ет 0,10 мМ, а концентраци тромбина составл ет 1,0 кМ в расчете на массу.
В табл. 2 приведены уровни ингибиторов и активность, измеренна в интервале 10-20 мин после стимул ции реакции. Активность тромбина дл контрольной группы составл ет 0,0076-0,0005 .
Результаты приведены в табл. 2.
Биологические данные, представленные в табл. 2, подтверждают превосходство соединений в соответствии с описываемым изобретением над известным соединением М-альфа-{2-нафтил-сульфонил-глицил)-4-ам идинофенилаланинпиперидин. Хот и дан- ные втабл, 2 не выражены в виде значений Ki, но все-таки возможно определить значени К на основе данных, представленных в табл. 2. Значение KI определ етс как концентраци ингибитора, требуема дл 50% ингибировани фермента в отсутствии субстрата . Присутствие субстрата, например тромбина, имеет защитный эффект на фермент . Из данных, представленных в табл. 2, следует, что все испытанные соединени имеют значение Ki ниже 6 нМ.
Дл следующих соединений значени Ki были определены методом Лайнуивера и
Брука после установлени равновеси фермента и ингибитора при рН 7,5.
.5
0
5 . 0
0 5 50
5
55
Эти соединени , включающие Ас-А1а- G u-boroArg-CioHi6, которое обладает значением Ki (конечной концентрации) 10 нМ, т.е. значением, которое считаетс примерно равным К| 6, превосход т сравнительное соединение еще по той причине, что их можно вводить без применени органического рас- творител -солюбилизатора.
В случае пептидов - производных боро- новой кислоты, растворимость которых 1- 50мг/мл. органического растворител -солюбилизатора не требуетс .
Ингибици Свертываемости крови, про вл ема при определении АРТТ и РТ.
Эффект ингибиторов протеазы на свертываемость крови in virto определ ют путем измерени их действи по двум разным клиническим параметрам, времени частичного активированного тромбопластина (АРТТ) и времени протромбина (РТ). Реагенты дл каждого из указанных анализов поставл ет General Piagnostics, Jessup MD. Маточные растворы ингибиторов готов т в 25 мМ НЕ- PES-буферё, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натри . Дл АРТТ-анализз, раствор ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычной человеческой плазмой крови (0,100 мл) и спонтанным реагентом АРТТ (0,100 мл). После инкубировани в течение 5 мин при 37°С к указанному раствору прибавл ют хлорид кальци (0,100 мл) и врем .свертываемости, измеренное в секундах, определ ют на фиб- роскопе. В табл. 3 приведены данные вли ни различных концентраций ингибитора на врем свертываемости крови по сравнению с временем свертывани крови контроль- ных групп, установленным при отсутствии ингибитора.
Дл РТ-анализа растворы ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычно плазмой крови человека (0,100 мл) в течение 2 мин при 37°С. Затем к инкубированному раствору прибавл ют симпластиновый реагент (0,200 мл) и определ ют врем свертываемости крови, приведенные в табл. 4.
В табл. 5 приведены суммарные данные результатов, представленных в табл. 3 и 4, показывающие расчетные концентрации ингибитора , необходимого дл увеличени времени частично активированного тром- боплатина (2хАРТТ) и времени протромбина (2хРТ) в два раза.
Соединение, Название ингибитора обозначенное в табл. 3-5,7-10
ABoc-(D)Phe-Pro-boroArg-CioHi6 В H-(D)Phe-Pro-boroArg-CioHi6 С )Phe-Phe-boroArg-CioHi6 D . Ac-Phe-boroArg-CioHi6 Ингибици свертываемости крови, установленна при определении (ТТ) (времени тромбина).
Действие ингибитора протеазы Ac-(D)- Phe-Pro-6opoArg-OH на свертывание кро- ви in virto определ ют путем измерени его вли ни на тромбиновое врем (ТТ). Смесь, состо щую из 0,2 мл обычной кроличьей плазмы и 0,05 мл буфера, содержащего ингибитор в 6-кратном количестве требуемой конечной концентрации, нагревают до 37°С. Свертываемость .крови стимулируют путем введени тромбина (0,05 мл в 6-кратном количестве конечной концентрации). Используемый тромбин закупают от Sigma Chemical Сотр. (NT-6634, активность 1190 NIH ед/на мг белка) и готов т в буфере. Используемый как дл ингибитора, так и тромбина буфер представл ет собой 0,1 М трис-буфер(12,10 г/л), содержащий 0,154 М NaCt (8,84 г/л) и 2,5 мг/мл сывороточного бычьего альбумина. рН 7,4. Тромбиновое врем , измер емое в секундах, определ ют на фиброскопе. В табл. 6 представлены данные вли ни ингибитора на врем свертыва- ни крови по сравнению с временем свертываемости контрольной группы без ис- пдльзовани ингибиторов. Показатели эффекта представл ют усредненное значение как минимум трех замеров. Если реакци свертываемости не происходит в течение 300 с, то ее прекращают.
Стабильность ингибиторов в человеческой плазме, определенна при АРТТ. .
Стабильность ингибиторов в плазме оценивают по их способности ингибировать свертываемость крови. В первую очередь, основные растворы (1 мкМ) ингибиторов, подлежащих испытанию, которые приготов- лены в 25 мл HEPES-буфера, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натри , разбавл ют до 50% обычной плазмой крови человека. Смеси готов т при 0°С, затем аликвоты (0,200 мл) отбирают и инкубируют в течение
2 мин при 37°С. Прибавл ют одинаковый обьем спонтанно-приготовленного реагента АРТТ и замер ют врем свертывани крови, как описано в примерах на с. 49. Конечна концентраци ингибитора в течение анализа свертывани крови составл ет 250 нМ, Инкубационное врем , приведенное в часах , и врем свертывани , замер емое в секундах , дл каждого ингибитора приведены в табл. 7. Показатели стабильности дл соединений Е и F определены одновременно с контрольной группой. Показатели дл соединений А, В получены на другой день.
Стабильность ингибиторов в буферном растворе.
Ингибиторы, каждый при концентрации 1 мкМ, инкубируют при комнатной температуре в 0,20 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлорида натри и 0,10% PEG. Затем отбирают, аликвоты (4 мкл) и анализируют на тромбиновую пробу.
8 табл. 8 приведены данные тромбиновой активности, (в %), сохран ющейс после инкубации , и продолжительность нахождени в натрий-фосфатном буфере испытуемых ингибиторов. В случае использовани ингибитора А имеетс незначительна потер ингибиторной активности. Ингибитор В тер ет свою биологическую активность в течение часа.........
Ингибирование свертывани крови после перорального приема ингибиторов In vivo.. .
Самки крыс (Sprague Dawley CDRats, весом 130-140 г, предоставленные Charles River Labs, Ins, Wilmington MA) анестезируют пентобарбиталом натри (50 мг/кг, внут- рибрюшинно). На вентральной поверхности шеи выполн ют срединный надрез и в одну из каротидных артерий ввод т полиэтиленовый катетер с выведением его у тыльной части шеи. После выведени крысы из состо ни наркоза контрольные пробы крови берут из введенного в каротидную артерию катетера, производ т антикоагул цию цитратом натри и центрифугируют (2000 х об/м, 10 мин.). Плазму перенос т в пластиковые пробирки и выдерживают на льду до их анализа. Тромбиновое врем определ ют в фиброскопе.
Крысы получают протеазный ингибитор Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH в носителе либо только носитель через желудочный зонд в объеме менее 4 мл, В качестве носител используют 5% диметилсульфоксид в физиологическом растворе. Пробы крови берут в разное врем после орального приема, которые анализируют как описано выше. В табл.
9 приведены полученные данные времени
свертывани крови в секундах, В случае, когда врем свертывани крови превышает
300 с, в таблице указано как 300. Остальные данные показывают среднее врем , необходимое дл коагул ции,
, измеренное в секундах, + означает стандартное отклонение от нормы.
Ингибици In vivo коагулировани крови после перорального приема ингибитора .
Дл дополнительной демонстрации способности данного соединени ингиби- ровать свертываемость крови in vivo, крыс анестезируют пентобарбиталом натри (50 мг/кг, внутрибрюшинно), после чего в ремную вену вставл ют катетер и отверстие закрывают . После выведени крыс из наркоза перорально ввод т либо 5 мг/кг ингибитора протеазы. Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH, растворенный в воде, либо равный объем воды. Через 30-60 мин всем крысам влива ют 500 ед/кг тромбина в течение 1 мин. Все 14 крыс, получающие только воду, погибли в течение 10 мин после вливани тромбина. В противоположность этому только 8 из 17 крыс, получившие ингибиторсодержащую воду, погибли в течение 10 мин, а оставшиес жили 1 ч и в это врем их усыпили.
Ингибици in vivo свертываемости крови после перорального местного и ректального приема.
Обща методика: самцы крыс Lewis весом 300-350 г анестезируют пентобарбито- лом натри (50 мг/кг, 1внутрибрюшинно) и в ремную вену вставл ют силастиковую канюлю , прикрепленную к полиэтиленовой .трубке 50. Указанную трубку вывод т наружу у тыльной части шеи и прикрепл ют к шприцу через стопорный вентиль. Пробы крови (0,5 мл) набирают в шприц, который промыт цитратным буфером до каждого забора крови перед и через разные промежутки времени после приема ингибитора протеазы Ac-{D)Phe-Pro-6opoArg-OH. За- тем пробы крови перенос т в герметичные емкости, содержащие цитратный буфер. Кроме того, после каждого забора крови канюлю промывают физиологическим раствором . Затем пробы крови центрифугируют (2500 об/мин в течение 15 мин) и дл измерени времени коагул ции используют 0,2 мл проб плазмы. Измерени времени свертываемости крови провод т на фибро- скопе, как описано ниже. Прежде всего, плазму (0,2 мл) помещают, в фибростакан и прибавл ют трис-буфер (50 мкл), рН 7,4. Буферный раствор, содержащий плазму, инкубируют при 37°С в течение 1 мин, затем
добавл ют 50 мкл 24 мк/мл тромбинового раствора в трис-буфере и замер ют врем коагул ции в секундах. Если врем коагулировани превышает 300 с, далее указывают,
как 300.
Пероральное введение: крыс с введен . ным в ремную вену катетером вывод т из
состо ни наркоза до перорального приема
ингибитора. Водный раствор ингибитора
0 протеазы Ac-(P)Phe-Pro-6opoArg-OH. содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,75 мл воды на кг массы крысы ввод т через зонд. В табл. 10 приведены полученные данные.
5 Местное применение: в брюшной полости крыс с введением в ремную вену катетером выполн ют 3-х см разрез, пока они все еще наход тс в наркотизированном со- сто нии. Наход т толстую кишку и разъеди0 н ют ее восход щую и нисход щую часть. Водный раствор ингибитора протеазы Ас- (D)Prie-Pro-6opoArg OH, содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу) в 1 мл воды на кг массы крысы,
5 инъецируют в восход щую часть полости толстой кишки. Разрез закрывают, использу скобки дл наложени шва. В табл. 11 приведены полученные данные. .
Ректальное применение: в качестве ме0 тодики дл ректального введени ингибитора крысам с вставленным в ремную вену катетером используют методику Kamija. Вкратце говор , изготавливают приспособление , состо щее из 0,89 см и 0,71 см сили5 коновых прокладок, соединенных в длину на 2 см проволочкой. Указанное приспособление вставл ют в ректальное отверстие крысы, причем сначала прокладку большего размера и затем приклеивают к анальному
0 проходу соответствующим клеем. Введение ингибитора осуществл ют путем инекциро- вани через расположенную снаружи прокладку . Доза дл ректального приема составл ет 3 мг ингибитора протеазы Ас- 5 (D)Phe-Pro-6opoArg-OH на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,6 мл воды на кг веса крысы. В табл, 12 приведены полученные данные/
Ингибици in vivo воспалительного про0 цесса, вызванного кротоновым маслом.
Получают два раствора: в первом содержитс в 5%-е кротоновое масло, известное как агент, вызывающий воспаление, в ацетоновом носителе (кротоновый раствор), а
5 второй раствор содержит 5%-е кротоновое масло в ацетоновом носителе, к которому добавлено 10 мг/мл предлагаемого соединени (испытуемый раствор), Кротоновый раствор (10 мкл) или в альтернативном варианте испытуемый раствор нанос т на правое ухо каждого животного (крысы Sprague Dawley CD, весом 130-140 г, представленные Charles River Labs, Inc, Wllmington, MA). Ацетоновый носитель в чистом виде (ацетоновый раствор, 10 мкл) нанос т на левое ухо каждого животного. Через час после обработки животных усыпл ют, их уши отрезают , штампуют на диски размеров 1/4 дюйма в диаметре и взвешивают, Разбухание измер ют как разницу в весе между кретоновым раствором, которым обработано правое ухо и ацетоновым раствором - левое ухо. Полученные данные сравнивают с индометаци- ном, который известен в качестве нестероидного противовоспалительного средства, приготовленного и наносимого аналогичным образом как и испытуемое соединение , В табл. 13 приведены усредненные значени дл соединени F, Ac-Phe-6opoArg-CioHi6. Используемый /термин доза означает количество активного противовоспалительного ингредиента в мкг (соединени А, С, D, E, F или G, или индометацина) в растворе нанесенном на правое ухо, а п означает количество крыс, которое используют в каждом тесте. SE означает стандартную погрешность,
. В табл. 1.4 показана антивоспалительна активность соединений А, С, которые вз ты при одних и тех же услови х (доза
199мкй: .; /- : ..; -.. ., v
Ингибирование плазмина брролизино- выми пепшдами..
Плазмин плазмы человека получают от фирмы American Diagnostics, Greenwich, Ст. концентраци активных центров в препарате , определ ют методом, аналогичным методу; описанному Coleman и др. Анализ ферментов осуществл ют на спектрофото- метре Perkln-Elmer Lambda 4С с использо- .ва нием вычислительной машины типа Perkln-Etmer 7300. В качестве буфера используют 50 ммолей трис-буфера, рН 7,4, содержащего 110 ммоль хлорида натри , 0;1% ПЭГ 6000 и 0,30 ммоль H-(D)Val-Leu- Lys napa-нитроанилида, К этой смеси прибавл ют соответствующие количества ингибитора и затем плазмина. При 25°С измер ют повышение интенсивности погло- щени при 405 нм по времени. Поскольку Ингибиторы св зываютс медленно, скорость реакции определ етс по касательной, проводимой к кривой реакции, по истечении 10 мин от начала реакции, В каждом случае осуществл ют контрольное испытание без применени ингибитора. Во всех случа х концентраци плазмина составл ет менее 10% концентраций ингибитора.
Результаты приведены в табл. 15.
Проведенные испытани показали, что соединени по изобретению малотоксичны, обладают высокой ингибирующей активностью с широким спектром действи , кроме того, все эти соединени могут быть введены в организм без применени растворите- л -солюбилизатора.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ получени производных борсо- держащих пептидов общей формулыR1-Z-NH-CH-BY-HW;:... - -. R2. - : -.RI - Н, Ac, Bz, Вое, Boc-Leu;R2 - (CH)anNHC(NH)NH2, n 3,4;Y - остаток пинаконового или пинанди- олового эфира;HW-CeHsSOaH. HCI, НВгZ D,L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, Ala- Lys, Pro-Phe, Ala-Phe, Glu-Phe, Ala-Glu, Giu-Gly, Gly-Leu-Ala, пиро-Glu-Phe; Val- Val, (D)Val-Leu, Lys-Pro, Leu-Thr. ..i отличающийс тем, что амин формулы : HaN-CHBY HW -(CH2)nWi, ; где n 3. 4, W и Wi Cl, Br;Y - остаток пинаконового или пинанДи- рлового эфира, ввод т во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы.. RI-Z-OH- . : ..... : .... j.:.; /где значени RI и Z указаны выше, и полученный продукт формулы .RI-Z-NHCH-BY-HW г. - ;.....: (CH2)nWl . : .:. . где значени Ri, Z, Y, W, Wi, n указаны выше, . . - : . обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединени формулыR1-Z-NH-CH-BY-HW(СН2)пМзгде значени RI, Z, Y, n и W указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты , предпочтительно бензолсульфокислоты, с образованием соединениRi-Z-NH-C4H-BY HW (CH2)nNH2где значени Ri, Z, Y, W, n указаны выше, и последнее подвергают взаимодействию с цианамидом в низшем спирте при температуре 50-150°С.Ингибирование кзлликреина плазмы человекаИнгибированиё тромбинаТаблицаТ а б л и ц а 2Врем активированного частичного тромбопластина, измеренное в секундахПротромбиновое врем , измеренное в сек.Ингибирование свертывани кровиТаблица 3Таблица 4Таблица 543Тромбиновое времВ качестве ингибитора испытан Ac(D)Phe-Pro-boroArg-OH.Среднее врем , необходимое дл свертывани , измеренное в секундах, ± стандартное отклонение.ТаблицаiУстойчивость ингибиторов в плазме человекаУстойчивость ингибиторов в буфере180798844 Таблица 6Таблица 8451807988 46Таблиц а 9 Ингибирование свертывани крови вслед за пероральным дозированием In vivo.: ND не определено.Ингибирование In vivo свертывани крови вслед за пероральным введением (ингибитор Ac-(D)Phe-Pro-bproArg-OH)Данные представл ют собой среднее дл 2 крыс.Данные представл ют собой среднее дл 3 крыс..... .. ,.-.; -; л.- . :. - ,-;-.. .. . ;. : Та б л и ц а 11 . ..Ингибирование In vivo свертывани крови после введени через ободочную ; v кишку (ингибитор Ac(D)Phe-Pro-boroArg-OH)Таблица 10471807988 48Таблица 12Ингибирование In vivo свертывани крови после ректального введени (ингибитор Ac-{D)Phe-Pro-boroArg-OH)Данные от 1 крысы.Средние данные дл 3 крыс.Ингибирование воспалительного процесса, вызванного кротоновым маслом...- ;. . Таблица 14.. : . .. .. . ., .;. , -..- . . .: ... .. .;...Ингибирование воспалени , вызванного кротоновым масломИнгибирование плазминаТаблица 13Т а б л и ц а 15BSA - Бензолсульфонова кислота TFA - Трифторуксусна кислотаПродолжение табл.15Таблица 16
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5967087A | 1987-06-05 | 1987-06-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1807988C true RU1807988C (ru) | 1993-04-07 |
Family
ID=22024465
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU884356026A RU1807988C (ru) | 1987-06-05 | 1988-06-03 | Способ получени производных борсодержащих пептидов |
SU5010164 RU2017749C1 (ru) | 1987-06-05 | 1991-11-28 | Производные борсодержащих пептидов |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5010164 RU2017749C1 (ru) | 1987-06-05 | 1991-11-28 | Производные борсодержащих пептидов |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (2) | RU1807988C (ru) |
ZA (1) | ZA883953B (ru) |
-
1988
- 1988-06-03 RU SU884356026A patent/RU1807988C/ru active
- 1988-06-03 ZA ZA883953A patent/ZA883953B/xx unknown
-
1991
- 1991-11-28 RU SU5010164 patent/RU2017749C1/ru active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA883953B (en) | 1990-02-28 |
RU2017749C1 (ru) | 1994-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR910003619B1 (ko) | 트립신형 프로테아제의 펩타이드 붕산 억제제 | |
US5242904A (en) | Peptide boronic acid inhibitors of trypsin-like proteases | |
US5250720A (en) | Intermediates for preparing peptide boronic acid inhibitors of trypsin-like proteases | |
US4499082A (en) | α-Aminoboronic acid peptides | |
JP3453357B2 (ja) | トロンビンの阻害剤および基質 | |
RU2075481C1 (ru) | Производные борсодержащих пептидов и фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью к трипсинподобным сериновым протеазам | |
US7230074B2 (en) | Inhibitors of dipeptidyl-aminopeptidase type IV | |
US5444049A (en) | Peptide compounds derived from boronic acid | |
EP0787010A1 (en) | Amidino and guanidino substituted inhibitors of trypsin-like enzymes | |
JPH07504158A (ja) | ジペプチジル−アミノペプチダーゼiv型のインヒビタ | |
US4707490A (en) | Anti-hypertensive agents | |
JPH03386B2 (ru) | ||
JPH09511500A (ja) | N−置換化グリシンを含むブラジキニン拮抗薬ペプチド | |
US5639739A (en) | Imidazole containing aminoboronic acids | |
HU205770B (en) | Process for producing renin inhibiting dipeptide derivatives and pharmaceutical compositions comprising same | |
EP0696199A4 (en) | BORONIC ACID WITH AMIDINO AND GUANIDINO SUBSTITUTION AS AN INHIBITOR OF TRYPSIN-LIKE ENZYMES | |
EP0722449A1 (en) | Boropeptide inhibitors of thrombin which contain a substituted pyrrolidine ring | |
US5462964A (en) | Dipeptide boronic acid inhibitors of trypsin-like enzymes | |
AU707059B2 (en) | Serine protease inhibitors | |
RU1807988C (ru) | Способ получени производных борсодержащих пептидов | |
CA1333208C (en) | Peptide boronic acid inhibitors of trypsin-like proteases | |
JPH0813835B2 (ja) | ピログルタミン酸残基を有するトリペプチド誘導体 | |
US4690940A (en) | Anti-hypertensive agents | |
CA1142868A (en) | Aminopeptidase inhibitor | |
JPH02157294A (ja) | ペプチドおよびプロテアーゼ阻害剤 |