RU1782991C

RU1782991C - Способ получени трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики

Info

Publication number: RU1782991C
Application number: SU904908438A
Authority: RU
Inventors: Сергей Петрович Смирнов; Любовь Вениаминовна Крашенинникова; Виталий Анатольевич Пухальский
Original assignee: Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1992-12-23

Abstract

Использование: в сельском хоз йстве при выращивании табака. Сущность изобретени заключаетс в том, что в ген растений табака ввод т ген а -интерферона человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растени N. tabacum с помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков плазми- дой pGv 2260, регенерации на селективной среде растений, экспрессирующих человеческий интерферон, и определ ют устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Description

Изобретение относитс к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хоз йстве при выращивании табака . Известны методы получени устойчивых к вирусу табачной мозаики (ВТМ) растений табака путем скрещивани чувствительных к ВТМ сортов с устойчивыми видами табака .

Однако при этом имеет место случайное наследование различных генов обоих родителей у потомства и тер ютс выгодные сочетани генов, вли ющих на ценность того или иного сорта. Этого недостатка лишен метод введени в растени генов путем генетической трансформации, поскольку в этом случае в растение передаетс лишь небольша последовательность ДНК, включающа один или несколько генов и не нарушающа генетического баланса растени . Другим важным преимуществом этого метода вл етс возможность введени в растение генов из чужеродных организмов, с которыми невозможно осуществить половое скрещивание. И наконец, эти гены можно вводить в растение в составе таких векторов , которые обеспечивают требуемую интенсивность и регул цию экспрессии вво- димого гена. Описан способ получени трансгенных растений табака, устойчивых к ВТМ, основанный на введении в растительный геном гена, кодирующего белок оболочки данного вируса, подставленного под контрол сильного растительного промотора.

Однако, данный способ не обеспечивает полной защиты от вируса, а дает лишь задержку в по влении симптомов вирусного заболевани при заражении ВТМ, и, кроме того, защитный эффект в этом случае наблюдаетс лишь при низкой концентрации вируса , осуществл ющего заражение.

Описано защитное действие на растени человеческого интерферона в отношении р да вирусов, в том числе и ВТМ.

Однако оно было показано лишь дл случа экзогенной обработки интерфероном растений.

(Л

С

ч

00

ю о ю

Цель изобретени - получение транс- генных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики.

Способ предлагает введение гена ре- комбинантного а-интерфероно человека под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты в растени NL tabacum с помощью генетической трансформации растений методом листовых дисков, регенерации на селективной среде растений, зкспрессирующих человеческий интерферон ,-и определение устойчивости трансгенных растений к вирусу табачной мозаики.

Пример. Дл трансформации растений №. tabacum используют штаммы Agrobacterium tumefaclens С158 RifR, содержащие разоруженную Ti-плазмиду pGV2260, интегрированную с рекомбинант- ной плазмидой pST2Q. Плазмида pST20 представл ет собой экспрессионный век тор pST6 со встроенным в экспрессией- ную кассету под контроль промотора 35S вируса мозаики цветной капусты гена ре- комбкнантного «-интерферона человека. Вектор содержит также ген неомицинфос- фотрансферазы 11, обусловливающий устойчивость трансформированных растений к канамицину. Трансформацию растений табака осуществл ют методом листовых дисков следующим образом. Бактерии, вы- ращен ные в минимальной среде А (10,5 г/л К2НРСм, 4,5 г/л КН2РО/|, 10 г/л (NH/feSOu, 0.5 г/л цитрат натри - 2Н20, 0,5% глюкозы ), развод т средой RMIMO до плотности 10 кл/мл и погружают в полученную суспензию кусочки листьео табака сорта Сам- сун, выращенного в асептических услови х, на 3 мин. Кусочки листьев промокают фильтровальной бумагой и перенос т на среду дл органогенеза и инкубируют в светотроне 3 недели. Высшие побеги осторожно вырезают и поме- щают на среду дл укоренени и инкубируют еще 3 недели до укоренени побегой.

Укоренившиес на селективной среде с канамицином растени табака провер ют биохимическими методами на наличие и экспрессию гена интерферона. Присутствие вставки гена интерферона устанавливают методом дот-гибридизации. Тотальную ДИК, выделенную из растений, денатурируют и нанос т на нитроцеллюлозный фильтр, после чего провод т иммобилизацию ДНК на фильтре и гибридизацию с 32Р-меченной ДИК гена интерферона. Растени , дающие

гибридизационный сигнал, содержат вставку гена интерферона.

Транскрипцию гана интерферона в растени х определ ют методом ноузерн-гибри- дизации.г Тотальную РНК выдел ют из трансгенных растений, фракционируют в денатурирующем агарозном геле с фор- мальдегидом, перенос т на нитооиеллюлоз- н ы и фильтр и г и бр и д и з у ю т с ;

0 Р-меченной ДНК гена интерферона. О транскрипции гена интерферона суд т по по влению зоны гибридизации, соответствующей молекулам РНК с размером 0,95 т.о. В случае контрольных растений табака, не

5 подвергавшихс трансформации, гибридизаци с ДНК гена интерферона не наблюдаетс .

Синтез интерферона втрансгенных рас- - тени х устанавливают с помощью метода

0 иммунофлюоресценции. Используют моно- клональные антитела против лейкоцитарного интерферона человека. Препараты готов т из листьеп, растира их в ступке и экстрагируют буфером (25 мМ трис-НС

5 рН8,35; 195 мМ глицин). Препараты центрифугируют , 5 мин при 12000 об/мин, к супер- нанту добавл ют этанол до конечной концентрации 20% и пропускают через нитроцеллюлозный фильтр. Провод т реакцию

0 с моноклоиальными антителами против лейкоцитарного интерферона человека, промывают фильтр и осуществл ют реакцию с меченными антителами против IgG мыши. Фильтры освещают длинноволновым УФ

5 светом и фотографируютчерез зеленый све- тофильтр, При продукции растени ми интерферона наблюдаетс свечение препаратов под УФ-светом. Растени , продуцирующие интерферон, исследуют на

0 устойчивость в ВТМ.

У растений в возрасте 2-3 мес берут листь и инфицируют их ВТМ втира суспензию вируса в концентрации 1 мкг/мл в 100 мкл фосфатного буфера рН7,5 стекл н5 ным шпателем в лист. Через 10 мин поверхность листа промывают дистиллированной водой, промокают фильтровальной бумагой и помещают во влажную камеру в темноте в подвешенном состо нии, где инкубируют 30 е сут при 25°С. В качестве контрольных берут растени N. tabacum сорта Самсун, дающих системную инфекцию при заражении ВТМ, и гибрида Терновского, образующих локальные некрозы при инфекции ВТМ.

5 Через 3-е сут на устойчивых к Bf M листь х табака гибрида Терновского образуютс четкие локальные некрозы, в то врем как на. листь х чувствительного к ВТМ табака сорта Самсун некрозов не наблюдаетс . Листь трансгениых растений табака сорта Самсун,

экспрессирующие лейкоцитарный интерферон человека, при заражении ВТМ образуют локальные некрозы, похожие на некрозы, возникающие на листь х табака гибрида Терновского. Реакци локаль- ной некротизации у трансгенных растений свидетельствуют об усилении активирусной защиты у данных растений . Введение и экспресси гена лейкоцитарного интерферона человека в растени N. tabacum, чувствительных к ВТМ, приводит к индукции устойчивости к данному вирусу.

0

Claims

Формула изобретени Способ получени трансгенных растений табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики , предусматривающий трансформацию растительного материала, регенерацию его на селективной среде, укоренение и выращивание побегов, отличающийс тем, что, с целью повышени устойчивости растений табака, в качестве растительного материала используют листовые диски табака, а трансформацию провод т с помощью аг- робактерий, несущих плазмиду pGV2260 с геном интерферона человека.