RS66524B1 - Anti-edb antitela i antitelo-lek konjugati - Google Patents

Anti-edb antitela i antitelo-lek konjugati

Info

Publication number
RS66524B1
RS66524B1 RS20250049A RSP20250049A RS66524B1 RS 66524 B1 RS66524 B1 RS 66524B1 RS 20250049 A RS20250049 A RS 20250049A RS P20250049 A RSP20250049 A RS P20250049A RS 66524 B1 RS66524 B1 RS 66524B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
edb
seq
antigen
drug
Prior art date
Application number
RS20250049A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrea Therese Hooper
Kimberly Ann Marquette
Chakrapani Subramanyam
Hans-Peter Gerber
Chad Michael May
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of RS66524B1 publication Critical patent/RS66524B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-EDB antitela i EDB antitelo-lek konjugate (ADC). Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na postupke upotrebe takvih antitela i ADC za lečenje EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja, kao što je kancer.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Fibronektini su adhezivni glikoproteini velike molekulske težine koji su prisutni u solubilnom obliku u plazmi i drugim telesnim tečnostima, i u nesolubilnom obliku u vanćelijskom matriksu (ECM). Splajs varijanta ekstra domena B fibronektina 1 (EDB+ FN ili EDB) je neinternalizujući protein ECM. EDB je homologni domen tipa III od 91 aminokiseline koji se insertuje u molekul fibronektina pomoću mehanizma alternativnog splajsovanja na nivou primarnog transkripta kad god dolazi do remodeliranja tkiva. Pokazano je da se EDB+ FN selektivno akumulira u stromi oko novih krvnih sudova kod tumora i drugih patologija, ali da je uglavnom odsutan u normalnoj vaskulaturi odraslih. Zardi et al., Embo J. 6(8): 2337-42 (1987). EDB+ FN se eksprimira u mnogim agresivnim tumorima i u zavisnosti od tipa tumora pokazuje bilo pretežno vaskularne ili difuzne stromalne obrasce ekspresije. Carnemolla et al., J. Cell Biol.108(3): 1139‑48 (1989).
[0003] Antitelo koje se specifično vezuje za EDB domen fibronektina (FN), L19 antitelo, izolovano je pomoću tehnologije displeja faga. Carnemolla et al., Int. J. Cancer 68(3): 397-405 (1996); Neri et al., Nat. Biotechnol. 15(12): 1271-5. (1997); Pini et al., J. Biol. Chem. 273(34): 21769-76 (1998). L19 antitelo je u stanju da oboji krvne sudove tumora u širokom spektru eksperimentalnih modela tumora i na presecima humanih tumora i drugih angiogenih poremećaja. Carnemolla et al., J. Cell Biol.108(3): 1139-48 (1989); Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 59(1): 11-6 (1994); Berndt et al., Histochem. Cell Biol. 109(3): 249-55 (1998).
[0004] Različite strategije ciljnog delovanja istražene su upotrebom različitih formata L19 antitela u lečenju kancera. Na primer, fragment scFv(L19) monoklonalnog antitela, Birchler et al. Nat Biotechnol. 17: 984-8 (1999), fuzioni proteini koji uključuju interleukin-12 (IL-12) i faktor nekroze tumora (TNF-alfa) fuzionisani sa scFv(L19), Halin C. et al. Cancer Res.
63(12):3202-10 (2003) i L19 mali imunski protein (SIP) sâm i konjugovan za fotosenzibilizator, Fabbrini M. et al. Int J Cancer 118(7):1805‑13 (2006).
[0005] Iako su objavljene različite terapije koje su zasnovane na L19 antitelu, ostaje značajna klinička potreba za razvojem dodatno poboljšanih i optimizovanih EDB+ FN-ciljno delujućih terapija, kao što su antitelo-lek konjugati, za one pacijente sa EDB+ FN-eksprimirajućim poremećajima ili bolestima, kao što su kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri.
SAŽETAK PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za ekstra domen B (EDB) fibronektina (FN), pri čemu antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 3, 5 i 7, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 12, 13 i 14, pri čemu teški lanac sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu, i pri čemu laki lanac sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (,cK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu, (b) linker i (c) lek. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat sadrži antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili 21, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10.
[0007] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10; ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat sadrži antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 ili 25, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31. Ovde su takođe opisani antitelo-lek konjugati, pri čemu antitelo, ili antigenvezujući fragment, sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 8, 17, 23, 27 ili 29, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 15, ali to nisu aspekti pronalaska za koje se zahteva patentna zaštita.
[0008] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31.
[0009] Ovde je takođe opisan, ali nije aspekt pronalaska za koji se zahteva patentna zaštita, antitelo-lek konjugat koji sadrži antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji ima konstantni region teškog lanca i/ili lakog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina za konjugaciju specifičnu za mesto. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat ima konstantni region teškog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat ima konstantni region lakog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (κK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat ima konstantni region teškog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu, i konstantni region lakog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (κK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu.
[0010] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji ima antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži projektovanu oznaku koja sadrži glutamin koja je insertovana u antitelo ili koja zamenjuje jednu ili više endogenih aminokiselina u antitelu. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat ima projektovanu oznaku koja sadrži glutamin koja je insertovana u antitelo na poziciji E294-N297. U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat ima oznaku koja sadrži glutamin koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LLQG (SEQ ID NO: 40). U nekim aspektima, antitelo-lek konjugat koji ima konstantni region teškog lanca dodatno sadrži lizin (K) koji supstituiše arginin (R) na poziciji 222 (K222R), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu.
[0011] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji ima antitelo, ili antigen-vezujući fragment, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži lizin (K) koji supstituiše arginin (R) na poziciji 94 (K94R), u skladu sa numeracijom prema Kabatu.
[0012] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji ima linker koji je isecivi linker. U nekim aspektima, isecivi linker je odabran iz grupe koja se sastoji od vc, diS, diS-C2OCO i AcLys-vc.
[0013] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji ima lek koji je citotoksični agens. U nekim aspektima, citotoksični agens je auristatin. U nekim aspektima, auristatin je odabran iz grupe koja se sastoji od 0101, 1569, 9411 i 4574.
[0014] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 3, 5 i 7, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 12, 13 i 14, (b) vc linker i (c) 0101 lek.
[0015] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10; (b) vc linker i (c) 0101 lek.
[0016] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat koji sadrži (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; (b) vc linker i (c) 0101 lek.
[0017] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo-lek konjugat iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži veći broj antitelo-lek konjugata iz pronalaska, i opciono farmaceutski nosač, pri čemu kompozicija ima prosečni DAR u opsegu od 3 do 5. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži veći broj antitelo-lek konjugata iz bilo kog od patentnih zahteva, i opciono farmaceutski nosač, pri čemu kompozicija ima prosečan DAR u opsegu od 1 do 3.
[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira teški lanac i laki lanac antitela iz pronalaska. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje vektor koji sadrži bilo koju nukleinsku kiselinu iz pronalaska. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži bilo koju nukleinsku kiselinu iz pronalaska.
[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitelo-lek konjugata iz pronalaska koji sadrži: (a) povezivanje linkera sa lekom; (b) konjugovanje linkera i leka za antitelo; i (c) prečišćavanje antitelo-lek konjugata. U nekim aspektima, konjugovanje je specifično za mesto na jednom ili više projektovanih ostataka cisteina i/ili projektovanih ostataka glutamina na antitelu.
[0020] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo-lek konjugat iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja ili bolesti, koji sadrži primenu efikasne količine kompozicije koja sadrži antitelo-lek konjugat iz pronalaska subjektu kome je to potrebno. U nekim aspektima, EDB+ FN-eksprimirajući poremećaj ili bolest je kancer. U nekim aspektima, kancer je čvrsti tumor ili kancer krvi. U nekim aspektima, čvrsti tumor je kancer štitne žlezde, sarkom, kancer dojke, kancer pankreasa, glioblastom, kancer žučne kese, kancer bubrega, kancer kože, kancer materice, mezoteliom, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer jajnika, kancer mokraćne bešike, kancer testisa, kancer prostate, kancer jetre, endokrini kancer, kancer timusa, kancer mozga, kancer nadbubrežne žlezde, kancer oka, kancer grlića materice i kancer pluća. U nekim aspektima, kancer krvi je leukemija, limfom ili mijelom.
[0021] Ovde je takođe opisana, ali nije aspekt pronalaska za koji se zahteva patentna zaštita, upotreba antitelo-lek konjugata iz pronalaska, u proizvodnji medikamenta za lečenje EDB+ FN-eksprimirajućeg poremećaja ili bolesti kod subjekta. U nekim aspektima, EDB+ FN-eksprimirajući poremećaj ili bolest je kancer. U nekim aspektima, kancer je čvrsti tumor ili kancer krvi. U nekim aspektima, čvrsti tumor je kancer štitne žlezde, sarkom, kancer dojke, kancer pankreasa, glioblastom, kancer žučne kese, kancer bubrega, kancer kože, kancer materice, mezoteliom, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer jajnika, kancer mokraćne bešike, kancer testisa, kancer prostate, kancer jetre, endokrini kancer, kancer timusa, kancer mozga, kancer nadbubrežne žlezde, kancer oka, kancer grlića materice i kancer pluća. U nekim aspektima, kancer krvi je leukemija, limfom ili mijelom.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0022]
SL. 1A i 1B pokazuju svojstva vezivanja [A] EDB-L19, EDB-PFE i EDB‑(K94R) antitela; i [B] EDB‑(K94R) i EDB‑(,cK183C-K94R‑K290C) antitela.
SL. 2 pokazuje ekspresiju EDB+ FN upotrebom RNA-Seq analize u modelima ksenografta poreklom od pacijenta (PDX) humanog kancera.
SL. 3A i 3B pokazuju ELISA krive vezivanja za [A] EDB-L19 antitelo i EDB-L19-vc-0101 ADC, i EDB-(,cK183C-K94R-K290C) antitelo i EDB-(,cK183C-K94R-K290C)-vc-0101 ADC; i [B] EDB-(K94R) antitelo i EDB-(K94R)-vc-0101 ADC, i EDB-(,cK183C-K290C) antitelo i EDB-(,cK183C-K290C)-vc-0101 ADC.
SL. 4 pokazuje ekspresiju EDB+ FN pomoću Western blota u WI38-VA13 i HT-29 ćelijama.
SL. 5A-5F pokazuju antitumorsku efikasnost u PDX-NSX-11122, visoko EDB+ FN eksprimirajućem modelu ksenografta poreklom od pacijenta (PDX) humanog kancera NSCLC, [A] EDB-L19-vc-0101 pri 0,3, 0,75, 1,5 i 3 mg/kg; [B] EDB-L19-vc-0101 pri 3 mg/kg i 10 mg/kg disulfidno povezanog EDB-L19-diS-DM1; [C] EDB-L19-vc‑0101 pri 1 i 3 mg/kg i 5 mg/kg disulfidno povezanog EDB-L19-diS-C2OCO‑1569; [D] specifično za mesto konjugovanog EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 i konvencionalno konjugovanog EDB-L19-vc‑0101 (ADC1) pri dozama od 0,3, 1 i 3 mg/kg i 1,5 mg/kg, respektivno; [E] specifično za mesto konjugovanog EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 pri dozama od 0,3, 1 i 3 mg/kg; i [F] EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 grupe dozirane pri 3 mg/kg kao krive inhibicije rasta tumora za svakog pojedinačnog miša koji ima tumor.
SL. 6A-6F pokazuju antitumorsku efikasnost u H-1975, umereno do visoko EDB+ FN eksprimirajućem modelu ksenografta ćelijske linije (CLX) humanog kancera NSCLC, [A] EDB-L19-vc-0101 pri 0,3, 0,75, 1,5 i 3 mg/mg; [B] EDB-L19-vc‑0101 i EDB-L19-vc‑1569 pri 0,3, 1 i 3 mg/kg; [C] EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(H16-K222R)‑AcLys-vc-CPI‑8314 pri 0,5, 1,5 i 3 mg/kg i 0,1, 0,3 i 1 mg/kg, respektivno; [D] specifično za mesto konjugovanog EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 i konvencionalno konjugovanog EDB-L19-vc‑0101 pri 0,5, 1,5 i 3 mg/kg; [E] EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(K94R)‑vc‑0101 pri 1 i 3 mg/kg; i [F] EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 pri 1 i 3 mg/kg.
SL. 7 pokazuje antitumorsku efikasnost u HT29, umereno EDB+ FN eksprimirajućem modelu CLX humanog kancera kolona, EDB-L19-vc‑0101 i EDB-L19-vc‑9411 pri 3 mg/kg.
SL. 8A i 8B pokazuju antitumorsku efikasnost EDB-L19-vc-0101 pri 0,3, 1 i 3 mg/kg u [A] PDX-PAX-13565, umereno do visoko EDB+ FN eksprimirajućem PDX pankreasa; i [B] PDX-PAX‑12534, nisko do umereno EDB+ FN eksprimirajućem PDX pankreasa. SL. 9 pokazuje antitumorsku efikasnost EDB-L19-vc-0101 pri 1 i 3 mg/kg u Ramos, umereno EDB+ FN eksprimirajućem modelu CLX humanog kancera limfoma.
SL. 10A i 10B pokazuju antitumorsku efikasnost u EMT-6, singenom modelu mišjeg karcinoma dojke, [A] EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)-vc-0101 pri 4,5 mg/kg; i [B] EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 grupe dozirane pri 4,5 mg/kg kao krive inhibicije rasta tumora za svakog pojedinačnog miša koji ima tumor.
SL. 11 pokazuje apsolutni broj neutrofila za konvencionalno konjugovani EDB-L19-vc‑0101 pri 5 mg/kg u poređenju sa specifično za mesto konjugovanim EDB‑(κK183C-K94R-K290C)-vc‑0101 (ADC4) pri 6 mg/kg.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0023] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i antitelo-lek konjugate (ADC) koji se vezuju za ekstra-domen B (EDB) fibronektina (FN), koji se označava kao "EDB+ FN" ili "EDB", naizmenično. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke za pripremu ADC upotrebom anti-EDB antitela, linkera, i lekova (korisnog tereta). Pronalazak dodatno obezbeđuje ADC koji su generisani upotrebom konvencionalne i/ili tehnologije konjugacije specifične za mesto. Antitela i ADC iz pronalaska korisni su za pripremu i proizvodnju kompozicija, kao što su medikamenti, koji se mogu upotrebljavati u dijagnozi, profilaksi, i/ili lečenju hiperproliferativnih poremećaja koji se karakterišu ili su povezani sa ekspresijom EDB+ FN, kao što je kancer. Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju anti-EDB antitela koja se upotrebljavaju za pravljenje EDB ADC.
[0024] ADC sadrže komponentu antitela koja je konjugovana za lek, tipično upotrebom linkera. ADC koji su generisani konvencionalnom tehnologijom konjugacije nasumično povezuju lek sa antitelom preko ostataka lizina ili cisteina koji su endogeni na teškom i/ili lakom lancu antitela. U skladu sa tim, takvi ADC su heterogena smeša vrsta koje imaju različite lek:antitelo odnose (DAR). ADC koji su generisani tehnologijom konjugacije specifične za mesto povezuju lek sa antitelom na određenim projektovanim ostacima na teškom i/ili lakom lancu antitela. Kao takvi, specifično za mesto konjugovani ADC su homogena smeša ADC koja sadrži vrste sa definisanim lek:antitelo odnosom (DAR). Stoga, specifično za mesto konjugovani ADC demonstriraju uniformnu stehiometriju što rezultuje poboljšanom farmakokinetikom, biodistribucijom i bezbednosnim profilom.
[0025] ADC iz predmetnog pronalaska uključuju anti-EDB antitela konjugovana za jedan ili više lekova putem linkera (tj. formirajući linker-lek funkcionalne grupe). Predmetni pronalazak obezbeđuje ADC koji imaju (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB; (b) linker i (c) lek. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje ADC formule Ab-(L-D), pri čemu (a) Ab je antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB, i (b) L-D je linker-lek funkcionalna grupa, pri čemu je L linker, i D je lek. U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ADC formule Ab‑(L-D)p, pri čemu (a) Ab je antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB, (b) L-D je linkerlek funkcionalna grupa, pri čemu je L linker, i D je lek i (c) p je broj linker-lek funkcionalnih grupa koje su prikačene za antitelo.
[0026] Broj linker-lek funkcionalnih grupa koje su prikačene za antitelo može biti bilo koji broj poželjan za razvoj ADC. U nekim aspektima, broj linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu je 4. U drugim aspektima, broj linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu je 3. U sledećem aspektu, broj linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu je 2. U sledećem aspektu, broj linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu je 1. U drugim aspektima, broj linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu je veći od 4, kao što je 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili veći od 12 linker-lek funkcionalnih grupa po antitelu.
[0027] Dodatno predmetni pronalazak obezbeđuje ADC, pri čemu su linker-lek funkcionalne grupe prikačene za antitelo putem konvencionalne ili tehnologije konjugacije specifične za mesto. U nekim aspektima, anti-EDB antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, konjugovani su za ili povezani sa lekom kao što je citotoksični, citostatski, i/ili terapijski agens, kao što je ovde dodatno opisano. Na primer, citotoksični agens može biti povezan sa ili konjugovan za anti-EDB antitelo kao što je ovde opisano za ciljanu lokalnu isporuku citotoksičnog agensa. Takođe su obezbeđeni postupci pripreme i proizvodnje takvih ADC, kao i upotreba istih u kliničkim primenama.
[0028] Za razliku od drugih ADC koji se razvijaju da ciljaju internalizirajuće proteine koji se eksprimiraju na ćelijskoj površini, ADC iz predmetnog pronalaska ciljaju EDB, protein koji se eksprimira u vanćelijskom matriksu (ECM). Ciljno delovanje na protein koji se eksprimira u ECM može obezbediti prednosti u odnosu na ciljno delovanje na protein koji se eksprimira na tumorskim ćelijama. ADC može direktno pristupiti cilju bez potrebe da prodre kroz stromalne i barijere ECM koje su uobičajene kod mnogih humanih kancera koji se teško leče. Dodatno, ciljno delovanje na EDB u ECM sa ADC obezbeđuje specifičan mehanizam za pristup mnogim tipovima ćelija koje je teško ciljati u mikrookruženju tumora. Ovo može rezultovati vanćelijskim oslobađanjem citotoksičnog korisnog tereta ili leka, što rezultuje ubijanjem različitih ćelija, putem mehanizama kao što su ćelijska smrt/zaustavljanje ćelijskog ciklusa tumorskih ćelija i/ili ćelija strome pomoću mehanizma slučajnog posmatrača. Pored toga, dodatni mehanizmi uključuju, ali nisu ograničeni na neregulisanu angiogenezu ili citotoksično vaskularno ciljno delovanje/kolaps, vaskularnu normalizaciju, imunomodulaciju i indukciju ćelijske diferencijacije i/ili ometanje epitelno-mezenhimske tranzicije.
[0029] Primeri koji su ovde obezbeđeni demonstriraju poboljšane karakteristike dobijene tokom generisanja anti-EDB antitela i EDB ADC, kao što je optimizacija alotipa kako bi se redukovala imunogenost, uklanjanje COOH-terminusnog lizina kako bi se povećala homogenost proizvoda, i introdukcija mutacija kako bi se ublažila potencijalna odgovornost za glikaciju i smanjila heterogenost (videti Primere 1 i 2). Dodatno, kao što je pokazano u Primerima, EDB ADC koji su generisani upotrebom različitih konvencionalnih i tehnologija konjugacije specifične za mesto (tj. cisteini, lizini i/ili acil donorske oznake koje sadrže glutamin ("Q")) i različitih linker-lek funkcionalnih grupa demonstriraju robusnu in vitro i in vivo efikasnost (videti Primere 6 do 8). Primeri koji su ovde obezbeđeni takođe su pokazali da su EDB ADC koji su generisani upotrebom konjugacije specifične za mesto putem projektovanih ostataka cisteina demonstrirali poboljšane karakteristike u poređenju sa EDB ADC koji su generisani upotrebom konvencionalne konjugacije putem ostataka cisteina, kao što je poboljšani farmakokinetički (PK) profil (tj. povećana izloženost i stabilnost konjugacije što dovodi do manje nespecifičnih (off-target) toksičnih efekata), povoljna termička stabilnost i neklinički bezbednosni profil (tj. ublažavanje mijelosupresije) (videti Primere 9, 10 i 11, respektivno). Dodatno, poboljšana karakteristika EDB ADC koji su generisani tehnologijama konjugacije specifične za mesto može omogućiti veće doze u lečenju ljudi i stoga obezbediti povećanu efikasnost. U nekim aspektima, EDB ADC mogu sadržati supstituciju lizina (K) na poziciji 290 (u skladu sa Kabat EU indeksom) u konstantnom regionu teškog lanca humanog IgG1 sa reaktivnim cisteinom (C) (K290C) i/ili supstituciju lizina (K) na poziciji 183 (u skladu sa Kabatom) u konstantnom regionu humanog kapa lakog lanca sa reaktivnim cisteinom (C) (κK183C) kako bi se omogućila konjugacija specifična za mesto.
Ekstra-domen B fibronektina
[0030] Kao što se ovde upotrebljava, "EDB+ FN" i "EDB" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju fibronektin (FN) koji sadrži ekstra-domen B (EDB). Dodatno, "anti-EDB antitela" i "anti-EDB+ FN antitela" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju antitela koja se vezuju za EDB. "Anti-EDB antitelo-lek konjugati", "EDB antitelo-lek konjugati", "anti-EDB ADC", "EDB ADC" se upotrebljavaju naizmenično i označavaju ADC koji sadrže antitela, ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji se vezuju za EDB i konjugovani su ili vezani za lek. FN je glikoprotein velike molekulske težine koji je prisutan u vanćelijskom matriksu (ECM) i koji je uključen u ćelijsku adheziju i procese migracije koji uključuju embriogenezu, zarastanje rana, koagulaciju krvi, odbranu domaćina, i metastaze. FN tipično postoji kao dimer koji je formiran od dve skoro identične podjedinice od ~250 kDa koje su kovalentno povezane u blizini svog C-terminusa pomoću para disulfidnih veza. Svaki monomer se sastoji od tri tipa ponavljajućih jedinica: tip I, tip II i tip III ponovaka FN. Jedan gen od 75 kb kodira FN, međutim postoji dvadeset varijanti proteina koji su uočeni kod ljudi. Alternativno splajsovanje gena FN javlja se u tri regiona što rezultuje uključivanjem ili isključivanjem bilo kog od dva ponovka tipa III, nazvanih ekstra domen A (EDA) i ekstra domen B (EDB), i segmenta koji povezuje druga dva ponovka tipa III, nazvanog tip III povezujući segment (IIICS). EDB je sekvenca od 91 aminokiseline koja je 100% identična kod miševa, pacova, zečeva, pasa, cinomolgus majmuna i ljudi. Reprezentativna nukleotidna sekvenca EDB+ FN obezbeđena je pod pristupnim brojem NM_001306129.1 i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca obezbeđena je pod pristupnim brojem NP_001293058.1. Aminokiselinske sekvence EDB i rekombinantnog humanog 7-EDB‑8‑9 obezbeđene su u Tabeli 1. Rekombinantni humani 7-EDB‑8‑9 sadrži EDB omeđen domenom 7 na amino-terminusu i domenom 8 i domenom 9 na karboksi-terminusu EDB.
Tabela 1. Sekvence EDB i 7-EDB‑8‑9
Anti-EDB antitela
[0031] Antitela iz predmetnog pronalaska specifično se vezuju za EDB. Za pripremu ADC iz pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti bilo koje antitelo (uključujući antitela koja su ovde opisana), ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za EDB. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može biti izolovano, prečišćeno, ili derivatizovano za upotrebu u pripremi EDB ADC.
[0032] Kao što se ovde upotrebljava, "antitelo" ili "Ab" označava molekul imunoglobulina koji je sposoban da prepozna i veže se za specifičan cilj ili antigen, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd. preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena, koje je locirano u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Termin može da obuhvati bilo koji tip antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, "antigen-vezujuće fragmente" (ili deo), kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, Fc itd. intaktnih antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za dati antigen (npr. EDB), izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), bispecifična antitela, heterokonjugatna antitela, njihove mutante, fuzione proteine koji imaju antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, (npr. domen antitelo), jednolančano (ScFv) i jednodomensko antitelo (npr. antitela ajkula i kamelida), maksitela, minitela, intratela, dijatela, trijatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (videti, npr. Holliger i Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136), humanizovana antitela, himerna antitela i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja uključuje mesto za prepoznavanje antigena potrebne specifičnosti, uključujući varijante glikozilacije antitela, varijante aminokiselinske sekvence antitela, i kovalentno modifikovana antitela. Antitela mogu biti murinskog, pacovskog, humanog, ili bilo kog drugog porekla (uključujući himerna ili humanizovana antitela). U nekim aspektima pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, EDB ADC koji su objavljeni je himerno, humanizovano, ili rekombinantno humano antitelo, ili njegov EDB-vezujući fragment.
[0033] Nativna ili antitela koja se javljaju u prirodi i nativni imunoglobulini su tipično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sačinjeni od dva identična laka lanca (LC) i dva identična teška lanca (HC). Svaki teški lanac ima varijabilni domen (VH) iza kog sledi veći broj konstantnih domena ili regiona (npr. zglob, CH1, CH2 ili CH3), koji se označavaju kao "CH domeni". Svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL) i konstantni domen, koji se označava kao "CL domen". Termin "konstantni region" ili "konstantni domen" antitela označava konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela, bilo sâm ili u kombinaciji. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je vezivanje Fc receptora (FcR), učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), opsonizacija, inicijacija citotoksičnosti zavisne od komplementa, i degranulacija mastocita. Konstantni regioni EDB antitela mogu biti poreklom od konstantnih regiona bilo kog od IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, bilo kog njihovog izotipa (npr. IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 izotipova IgG), kao i njihovih podklasa i mutiranih verzija.
[0034] CH1 domen uključuje prvi (najviše amino-terminusni) domen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr. od oko pozicija 118-215 u skladu sa Kabat EU indeksom. CH1 domen je u blizini VH domena i amino-terminusnog zglobnog regiona molekula teškog lanca imunoglobulina, i ne formira deo Fc regiona teškog lanca imunoglobulina.
[0035] Region zgloba uključuje deo molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. Ovaj region zgloba sadrži približno 25 ostataka i fleksibilan je, omogućavajući stoga da se dva N-terminusna antigen-vezujuća regiona kreću nezavisno. Regioni zgloba se mogu podeliti na tri različita domena: gornji, srednji, i donji domen zgloba.
[0036] CH2 domen uključuje deo teškog lanca molekula imunoglobulina koji se proteže, npr. od oko pozicija 231-340 u skladu sa Kabat EU indeksom. CH2 domen je jedinstven po tome što nije blisko sparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-povezana razgranata ugljenohidratna lanca smeštena su između dva CH2 domena intaktnog nativnog IgG molekula. U nekim aspektima, antitelo (ili njegov fragment) iz pronalaska sadrži CH2 domen koji je poreklom od IgG molekula, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U nekim aspektima, IgG je humani IgG.
[0037] CH3 domen uključuje deo teškog lanca molekula imunoglobulina koji se proteže približno 110 ostataka od N-terminusa CH2 domena, npr. od oko pozicija 341-447 u skladu sa Kabat EU indeksom. CH3 domen tipično formira C-terminusni deo antitela. U nekim imunoglobulinima, međutim, dodatni domeni mogu da se protežu od CH3 domena kako bi formirali C-terminusni deo molekula (npr. CH4 domen u µ lancu IgM i ε lancu IgE). U nekim aspektima, antitelo (ili njegov fragment) iz pronalaska sadrži CH3 domen koji je poreklom od IgG molekula, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U nekim aspektima, IgG je humani IgG.
[0038] CL domen uključuje domen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr. od oko pozicija 108‑214 u skladu sa Kabat EU indeksom. CL domen je susedan VL domenu. U nekim aspektima, antitelo (ili njegov fragment) iz pronalaska sadrži konstantni domen kapa lakog lanca (CLκ). U nekim aspektima, antitelo (ili njegov fragment) sadrži konstantni domen lambda lakog lanca (CLλ). CLκ ima poznate polimorfne lokuse CLκ-V/A45 i CLκ-L/V83 (upotrebom Kabat numeracije) što omogućava polimorfizme Km(1): CLκ-V45/L83; Km(1,2): CLκ-A45/L83; i Km(3): CLκ-A45/V83. Polipeptidi, antitela i ADC iz pronalaska mogu imati komponente antitela sa bilo kojim od ovih konstantnih regiona lakog lanca.
[0039] Fc region generalno sadrži CH2 domen i CH3 domen. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu varirati, Fc region teškog lanca humanog IgG uobičajeno se definiše da se proteže od aminokiselinskog ostatka na poziciji Cys226, ili od Pro230 (u skladu sa Kabat EU indeksom), do njegovog karboksi-terminusa. Fc region može biti Fc region nativne sekvence ili varijantni Fc region. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).
[0040] "Varijabilni region" antitela označava varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo sâm ili u kombinaciji. Kao što je poznato u struci, svaki varijabilni region teškog i lakog lanca sastoji se od četiri regiona okvira (FR) koji su povezani sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) takođe poznata kao hipervarijabilni regioni. CDR u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR i, sa CDR iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela.
[0041] CDR varijabilnog domena može se identifikovati u skladu sa definicijama prema Kabat (Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C), Chothia (Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989)), akumulaciji i prema Kabat i Chothia, AbM definiciji (izvedena upotrebom softvera za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular (sada Accelrys<®>)), definiciji kontakta (zasnovana na uočenim kontaktima antigena, izneta u MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996)), i/ili konformacionoj definiciji (Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008) ili bilo kom postupku određivanja CDR koji je dobro poznat u struci. Kao što se ovde upotrebljava, CDR može označavati CDR koji su definisani pomoću bilo kog pristupa koji je poznat u struci, uključujući kombinacije pristupa. Za predmetni pronalazak, CDR koji su izneti u Tabeli 2 u nastavku izvedeni su upotrebom Kabat i Chothia definicija. Anti-EDB antitela, ili njihov antigen-vezujući fragment, iz predmetnog pronalaska uključuju jedan ili više CDR (kao što su jedan, dva, tri, četiri, pet, ili svih šest CDR).
[0042] Antitelo, ADC ili polipeptid koji se "specifično vezuje" ili "preferencijalno vezuje" (ovde se upotrebljava naizmenično) za cilj ili antigen (npr. EDB protein) je termin koji se dobro razume u struci, i postupci za određivanje takvog specifičnog ili preferencijalnog vezivanja su takođe dobro poznati u struci. Za molekul se kaže da pokazuje "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" ukoliko reaguje ili se povezuje češće, brže, sa dužim trajanjem i/ili sa većim afinitetom za određenu ćeliju ili supstancu nego za alternativne ćelije ili supstance. Antitelo se "specifično vezuje" ili "preferencijalno vezuje" za cilj ili antigen ukoliko se vezuje sa većim afinitetom, aviditetom, lakše, i/ili sa dužim trajenjem nego što se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferencijalno vezuje za EDB epitop je antitelo koje vezuje ovaj epitop sa većim afinitetom, aviditetom, lakše, i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge EDB epitope ili ne-EDB epitope.
[0043] Termin "afinitet vezivanja" ili "KD" kao što se ovde upotrebljava, namenjen je da označi ravnotežnu konstantu disocijacije određene antigen-antitelo interakcije. KDje odnos stope disocijacije, koja se takođe naziva "off-stopa" ili "kd", prema stopi asocijacije, ili "onstopi" ili "ka". Stoga, KDje jednaka kd/kai izražava se kao molska koncentracija (M). Iz toga sledi da što je manja KD, to je jači afinitet vezivanja. Prema tome, KDod 1 µM ukazuje na slab afinitet vezivanja u poređenju sa KDod 1 nM. Vrednosti KDza antitela mogu se odrediti upotrebom postupaka koji su dobro utvrđeni u struci. Jedan postupak za određivanje KDantitela je upotrebom rezonance površinskih plazmona, tipično upotrebom biosenzorskog sistema kao što je BIAcore<®>sistem. Drugi standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja liganada kao što su antitela prema ciljevima poznati su u struci, uključujući, na primer, ELISA, Western blot, RIA, i analizu protočnom citometrijom.
[0044] "Izolovano antitelo", kao što se ovde upotrebljava, označava antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje EDB je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene koji nisu EDB). Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. Takođe se podrazumeva da čitanjem ove definicije, na primer, antitelo (ili funkcionalna grupa ili epitop) koje se specifično ili preferencijalno vezuje za prvi cilj može ili ne mora specifično ili preferencijalno da se vezuje za drugi cilj.
[0045] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC uključuje antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje za humani EDB sa, i/ili vezuje isti epitop kao, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je ovde opisan.
[0046] Termin "u kompeticiji", kao što se ovde upotrebljava u vezi sa antitelom, znači da se prvo antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, vezuje za epitop na način koji je dovoljno sličan vezivanju drugog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, tako da se rezultat vezivanja prvog antitela sa njegovim srodnim epitopom detektabilno smanjuje u prisustvu drugog antitela u poređenju sa vezivanjem prvog antitela u odsustvu drugog antitela. Alternativa, gde se vezivanje drugog antitela za njegov epitop takođe detektabilno smanjuje u prisustvu prvog antitela, može, ali ne mora biti slučaj. To jest, prvo antitelo može inhibirati vezivanje drugog antitela za njegov epitop, a da to drugo antitelo ne inhibira vezivanje prvog antitela za njegov odgovarajući epitop. Međutim, kada svako antitelo detektabilno inhibira vezivanje drugog antitela sa njegovim srodnim epitopom ili ligandom, bilo u istoj, većoj, ili manjoj meri, za antitela se kaže da su u "unakrsnoj kompeticiji" jedno sa drugim za vezivanje svog respektivnog jednog ili više epitopa. I antitela koja su u kompeticiji i antitela koja su u unakrsnoj kompeticiji obuhvaćena su predmetnim pronalaskom. Bez obzira na mehanizam kojim se takva kompeticija ili unakrsna kompeticija dešava (npr. sterično ometanje, konformaciona promena, ili vezivanje za zajednički epitop, ili njegov deo), kvalifikovani stručnjak bi cenio, na osnovu učenja koja su ovde obezbeđena, da takva antitela koja su u kompeticiji i/ili antitela koja su u unakrsnoj kompeticiji obuhvaćena su i mogu biti korisna za postupke koji su ovde objavljeni.
[0047] "L19" antitelo, koje se ovde takođe označava kao "EDB-L19" antitelo, je humano antitelo koje vezuje EDB. L19 antitelo je objavljeno i okarakterisano u PCT međunarodnim publikacijama br. WO1997/045544, WO1999/058570 i WO2001/062800, a sekvence L19-EDB su ovde obezbeđene u Tabeli 2 (SEQ ID NO.1-16).
[0048] U nekim aspektima pronalaska, antitela koja se upotrebljavaju za pripremu EDB ADC mogu biti monoklonalna antitela. Termin "monoklonalno antitelo" ili "mAb" označava antitelo koje je dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su visoko specifična, usmerena su prema jednom antigenskom mestu. Štaviše, za razliku od preparata poliklonalnih antitela, koji tipično uključuju različita antitela usmerena prema različitim determinantima (epitopima), svako monoklonalno antitelo je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Modifikator "monoklonalno" ukazuje na karakter antitela kao onog koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba se tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom.
[0049] U nekim aspektima pronalaska, antitela koja se upotrebljavaju za pripremu ADC iz pronalaska mogu biti monovalentna, tj. koja imaju jedno antigen-vezujuće mesto po molekulu (npr. IgG ili Fab). U nekim slučajevima, monovalentno antitelo može imati više od jednog antigen-vezujućeg mesta, ali vezujuća mesta su od različitih antigena. U nekim aspektima pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ADC iz pronalaska može uključivati "bivalentno antitelo", tj. koje ima dva antigen-vezujuća mesta po molekulu (npr. IgG). U nekim slučajevima, dva vezujuća mesta imaju iste antigenske specifičnosti. Alternativno, bivalentna antitela mogu biti bispecifična. "Bispecifično", "dvostruko specifično" ili "bifunkcionalno" antitelo je hibridno antitelo koje ima dva različita antigenvezujuća mesta. Dva antigen-vezujuća mesta bispecifičnog antitela vezuju se za dva različita epitopa, koji mogu biti na istim ili različitim ciljevima proteinima.
[0050] Termin "himerno antitelo" namenjen je da označi antitela u kojima su deo ili sve sekvence varijabilnog regiona poreklom od jedne vrste, i sekvence konstantnog regiona su poreklom od druge vrste, kao što je antitelo u kom su sekvence varijabilnog regiona poreklom od mišjeg antitela i sekvence konstantnog regiona su poreklom od humanog antitela.
[0051] Kao što se ovde upotrebljava, "humanizovano" ili "CDR graftovano" antitelo označava oblike ne-humanih (npr. murinskih) antitela koja su himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina, ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili druge antigenvezujuće podsekvence antitela) koji sadrže minimalnu sekvencu koja je poreklom od nehumanog imunoglobulina. Poželjno, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz jednog ili više CDR primaoca zamenjeni ostacima iz jednog ili više CDR ne-humane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet.
[0052] Antitela iz pronalaska mogu se proizvesti upotrebom tehnika koje su dobro poznate u struci, npr. rekombinantne tehnologije, tehnologije displeja faga, sintetičke tehnologije ili kombinacije takvih tehnologija ili drugih tehnologija koje su sveopšte poznate u struci (videti, na primer, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) i Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)). Dodatne smernice mogu se pronaći u Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); i Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003).
[0053] Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance antitela koji se upotrebljavaju za pripremu ADC iz pronalaska mogu se klonirati u vektor za ekspresiju ili propagaciju. Sekvenca koja kodira antitelo od interesa može se održavati u vektoru u ćeliji domaćinu i ćelija domaćina se zatim može umnožiti i zamrznuti za buduću upotrebu. Proizvodnja rekombinantnih monoklonalnih antitela u ćelijskoj kulturi može se izvršiti kloniranjem gena antitela iz B ćelija na način koji je poznat u struci. Videti, npr. Tiller et al., J. Immunol. Methods 329:112-124, 2008; S.A.D. patent br.7,314,622.
[0054] Kao što se ovde upotrebljava, termin "vektor" označava konstrukt, koji je sposoban da isporuči, i, poželjno, da eksprimira, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, ekspresione vektore gole DNK ili RNK, vektore plazmida, kosmida ili faga, ekspresione vektore DNK ili RNK povezane sa katjonskim kondenzujućim agensima, ekspresione vektore DNK ili RNK inkapsulirane u lipozomima, i određene eukariotske ćelije, kao što su ćelije proizvođači.
[0055] Kao što se ovde upotrebljava, termin "ćelija domaćin" uključuje pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac jednog ili više vektora za inkorporisanje polinukleotidnih inserata. Ćelije domaćini uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, a potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (po morfologiji ili u genomskom DNK komplementu) originalnoj roditeljskoj ćeliji zbog prirodne, slučajne, ili namerne mutacije. Ćelija domaćin uključuje ćelije koje su transfektovane in vivo sa polinukleotidom(ima) iz ovog pronalaska.
[0056] Kao što je poznato u struci, "polinukleotid", "nukleinska kiselina/nukleotid", i "oligonukleotid" se ovde upotrebljavaju naizmenično, i uključuju polimerne oblike nukleotida bilo koje dužine, bilo dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide, njihove analoge, ili bilo koji supstrat koji može biti inkorporisan u lanac pomoću DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu, i mogu obavljati bilo koju funkciju, poznatu ili nepoznatu. Polinukleotidi mogu biti oni koji se javljaju u prirodi, sintetički, rekombinantni ili bilo koja njihova kombinacija.
[0057] Za sve pozicije aminokiselina konstantnog regiona teškog lanca koje se razmatraju u predmetnom pronalasku, numeracija je u skladu sa Eu indeksom koji je prvi put opisan u Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85, koji opisuje aminokiselinsku sekvencu Eu proteina mijeloma, koji je prvi sekvencionirani humani IgG1. Eu indeks prema Edelman et al. je takođe iznet u Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda. Stoga, "EU indeks kao što je izneto u Kabat" ili "EU indeks prema Kabatu" označava sistem numeracije ostataka koji je zasnovan na humanom IgG1 Eu antitelu prema Edelman et al. kao što je izneto u Kabat 1991.
[0058] Sistem numeracije koji se upotrebljava za aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca je onaj koji je iznet u Kabat 1991.
[0059] EDB ADC iz predmetnog pronalaska mogu biti konjugovani za lek/korisni teret upotrebom konvencionalne tehnologije cisteina ili tehnologije konjugacije specifične za mesto. Kako bi se prilagodila konjugacija specifična za mesto putem projektovanih cisteina, konstantni domen se može modifikovati tako da obezbedi reaktivni ostatak cisteina projektovan na jednom ili više specifičnih mesta (ponekad se označavaju kao "Cys" mutanti). Kako bi se prilagodila konjugacija specifična za mesto putem konjugacije zasnovane na transglutaminazi, acil donorska oznaka koja sadrži glutamin ("Q") ili endogeni glutamin se čini reaktivnim pomoću polipeptidnog projektovanja u prisustvu transglutaminaze i amina.
[0060] Predmetni pronalazak obezbeđuje optimizaciju L19-EDB antitela generisanjem neimunogenog antitela. U nekim aspektima, L19-EDB humani IgG1 konstantni region koji sadrži G1m(a) alotip koji ima asparaginsku kiselinu (D) na poziciji 356 i leucin (L) na poziciji 358, može biti zamenjen sa ne-G1m(a) alotipom koji ima glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 356 i metionin (M) na poziciji 358 (u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu).
[0061] Dodatno, kako bi se redukovale potencijalne hemijske odgovornosti i vezivanje antigena za pretpostavljeno mesto glikacije proteina, anti-EDB antitela iz predmetnog pronalaska mogu imati varijabilni region teškog lanca koji sadrži mutaciju lizina (K) na poziciji 94 (u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu) u arginin (R), npr. (K94R).
[0062] Za konjugaciju specifičnu za mesto putem projektovanih cisteina, konstantni domen teškog lanca anti-EDB antitela može da sadrži reaktivni projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu. Mogu se introdukovati dodatne supstitucije cisteina. U sledećem aspektu, konstantni domen lakog lanca anti-EDB antitela može da sadrži reaktivni projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (κK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu. Mogu se introdukovati dodatne supstitucije cisteina.
[0063] Za konjugaciju specifičnu za mesto putem projektovanih ostataka glutamina, konstantni domen teškog lanca anti-EDB antitela može da sadrži projektovanu oznaku LLQG koja sadrži H16-glutamin (SEQ ID NO: 40). Dodatno, kako bi se optimizovala ova konjugacija specifična za mesto, aminokiselina lizin (K) na poziciji 222 (u skladu sa Kabat EU indeksom) na teškom lancu može biti supstituisana argininom (R), npr. (K222R).
[0064] Modifikacije aminokiselina mogu biti napravljene pomoću bilo kog postupka koji je poznat u struci i mnogi takvi postupci dobro su poznati i rutinski su za osobe sa iskustvom u struci, npr. mutacije, supstitucije, delecije, i/ili adicije. Na primer, ali ne putem ograničenja, supstitucije, delecije i insercije aminokiselina mogu se postići upotrebom bilo koje dobro poznate tehnike zasnovane na PCR. Supstitucije aminokiselina mogu da se naprave pomoću mutageneze usmerene na mesto (videti, na primer, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res.
10:6487-6500; i Kunkel, 1985, PNAS 82:488).
[0065] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC uključuju antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji ima teški lanac i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 98%, ili 99% identična bilo kom od teških ili lakih lanaca koji su ovde objavljeni. Ostaci koji su izmenjeni mogu biti u varijabilnom regionu ili u konstantnom regionu antitela. U nekim aspektima, ne postoji više od 1, 2, 3, 4 ili 5 ostataka koji su izmenjeni u poređenju sa bilo kojim teškim ili lakim lancem koji su ovde objavljeni.
[0066] Termin "procenat identičnosti" u kontekstu aminokiselinskih sekvenci označava broj ostataka u dve sekvence koji su isti kada su poravnati radi maksimalne korespondencije. Postoji veći broj različitih algoritama koji su poznati u struci koji se mogu upotrebljavati za merenje procenta identičnosti aminokiselina (tj. Alat za osnovno lokalno poravnanje ili BLAST<®>). Osim ukoliko nije drugačije specificirano, upotrebljavaju se podrazumevani parametri za određeni program ili algoritam.
[0067] Za upotrebu u pripremi EDB ADC, antitela koja su ovde opisana mogu biti suštinski čista, tj. najmanje 50% čista (tj. bez kontaminanata), poželjnije, najmanje 90% čista, poželjnije, najmanje 95% čista, još poželjnije, najmanje 98% čista, i najpoželjnije, najmanje 99% čista.
[0068] Tabele 2 i 3 obezbeđuju aminokiselinske (proteinske) sekvence i povezane sekvence nukleinske kiseline (DNK) anti-EDB antitela iz predmetnog pronalaska. CDR su kao što su definisali Kabat i Chothia. Osenčeni ostaci identifikuju mutacije, supstitucije i/ili insercije aminokiselina koje se odnose na optimizaciju antitela, a podvučeni ostaci identifikuju mutacije, supstitucije i/ili insercije aminokiselina koje se odnose na tehnologiju konjugacije specifične za mesto.
Tabela 2. Sekvence anti-EDB antitela
[0069] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC uključuje antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji se vezuje za ekstra domen B (EDB) fibronektina (FN).
[0070] U aspektima pronalaska, antitelo iz predmetnog pronalaska, ili njegov antigenvezujući fragment, ima varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu VH ima tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 3, 5 i 7. U aspektima pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu VL ima tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 12, 13 i 14. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima VH koji ima tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 3, 5 i 7; i VL koji ima tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 12, 13 i 14.
[0071] U sledećem aspektu, antitelo iz predmetnog pronalaska, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži VH CDR1 SEQ ID NO: 3, VH CDR2 SEQ ID NO: 5 i VH CDR3 SEQ ID NO: 7 (u skladu sa Kabat). U sledećem aspektu, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ima varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži VL CDR1 SEQ ID NO: 12, VL CDR2 SEQ ID NO: 13 i VL CDR3 SEQ ID NO: 14 (u skladu sa Kabat i Chothia).
[0072] U nekim aspektima pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može imati varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili 21 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da sadrži: varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 10; varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 10; varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10; ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10.
[0073] U sledećem aspektu pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, može imati teški lanac koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 19 ili 25, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31. Ovde su opisani, ali ne u skladu sa pronalaskom, antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 8, 17, 23, 27 i 29, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 15.
[0074] Antitelo iz predmetnog pronalaska, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da sadrži: teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 19 i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 31; teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 31.
[0075] Antitelo iz predmetnog pronalaska, ili njegov antigen-vezujući fragment, može da sadrži: teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31.
Lekovi
[0076] Lekovi korisni u pripremi EDB ADC koji su objavljeni uključuju bilo koju supstancu koja ima biološku ili detektabilnu aktivnost, na primer, terapijske agense, detektabilne obeleživače, vezujuće agense, itd. i prolekove, koji se metabolišu u aktivni agens in vivo. Lek takođe može biti derivat leka, pri čemu je lek funkcionalizovan tako da omogući konjugaciju sa antitelom iz pronalaska.
[0077] Terapijski agens je agens koji ispoljava citotoksični, citostatski, i/ili imunomodulatorni efekat na ćelije kancera ili aktivirane imunske ćelije. Primeri terapijskih agenasa uključuju citotoksične agense, hemioterapijske agense, citostatske agense, i imunomodulatorne agense. Citotoksični efekat označava uklanjanje, eliminaciju i/ili ubijanje ciljne ćelije(a). Citotoksični agens označava agens koji ima citotoksični i/ili citostatski efekat na ćeliju. Citostatski efekat označava inhibiciju proliferacije ćelija. Citostatski agens označava agens koji ima citostatski efekat na ćeliju, čime inhibira rast i/ili umnožavanje specifičnog podskupa ćelija. Hemioterapijski agens označava agens koji je hemijsko jedinjenje koje je korisno u lečenju kancera. Imunomodulatorni agens označava agens koji stimuliše imunski odgovor preko proizvodnje citokina i/ili antitela i/ili moduliranja funkcije T ćelija čime inhibira ili redukuje rast podskupa ćelija (tj. tumorskih ćelija) bilo direktno ili indirektno dozvoljavajući drugom agensu da bude efikasniji.
[0078] U nekim aspektima lek je lek koji prolazi membranu. U takvim aspektima, korisni teret može da izazove efekat slučajnog posmatrača pri čemu se ćelije koje možda ne eksprimiraju EDB+ FN ili nemaju EDB+ FN vezan za svoju površinu, ali okružuju ćeliju koja je vezana od strane ADC, ubijaju korisnim teretom koji ulazi u ćeliju. Ovo se dešava kada se korisni teret oslobodi sa antitela (tj. isecanjem isecivog linkera) i prođe ćelijsku membranu i, nakon difuzije, indukuje ubijanje okolnih ćelija.
[0079] U skladu sa postupcima koji su objavljeni, EDB ADC se mogu proizvesti ili generisati tako da imaju (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB; (b) linker i (c) lek. Lek-antitelo odnos (DAR), ili opterećenje lekom, ukazuje na broj molekula leka konjugovanih po antitelu. Kompozicije, serije, i/ili formulacije većeg broja ADC mogu se okarakterisati pomoću prosečnog DAR. DAR i prosečni DAR mogu se odrediti različitim konvencionalnim načinima kao što su UV spektroskopija, masena spektroskopija, ELISA test, radiometrijski postupci, hromatografija hidrofobne interakcije (HIC), elektroforeza i HPLC.
[0080] U aspektima pronalaska, EDB ADC može imati DAR od 1, DAR od 2, DAR od 3, DAR od 4, DAR od 5, DAR od 6, DAR od 7, DAR od 8, DAR od 9, DAR od 10, DAR od 11, DAR od 12 ili DAR veći od 12. U aspektima pronalaska, EDB ADC može imati jedan molekul leka, ili 2 molekula leka, ili 3 molekula leka, ili 4 molekula leka, ili 5 molekula leka, ili 6 molekula leka, ili 7 molekula leka, ili 8 molekula leka, ili 9 molekula leka, ili 10 molekula leka, ili 11 molekula leka, ili 12 molekula leka, ili više od 12 molekula.
[0081] U aspektima pronalaska, EDB ADC može imati prosečan DAR u opsegu od oko 2 do oko 4, ili prosečan DAR u opsegu od oko 3 do oko 5, ili prosečan DAR u opsegu od oko 4 do oko 6, ili prosečan DAR u opsegu od oko 5 do oko 7, ili prosečan DAR u opsegu od oko 6 do oko 8, ili prosečan DAR u opsegu od oko 7 do oko 9, ili prosečan DAR u opsegu od oko 8 do oko 10, ili prosečan DAR u opsegu od oko 9 do oko 11, ili prosečan DAR u opsegu od oko 10 do oko 12, itd. U nekim aspektima kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu imati prosečan DAR od oko 1, ili prosečan DAR od oko 2, prosečan DAR od oko 3, ili prosečan DAR od oko 4, ili prosečan DAR od oko 5, ili prosečan DAR od oko 6, ili prosečan DAR od oko 7, ili prosečan DAR od oko 8, ili prosečan DAR od oko 9, ili prosečan DAR od oko 10, ili prosečan DAR od oko 11, ili prosečan DAR od oko 12 ili prosečan DAR veći od 12. Kao što se upotrebljava u prethodnim opsezima prosečnog DAR, termin "oko" znači /‑ 0,5%.
[0082] Kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati poželjnim opsegom prosečnog DAR, npr. prosečnim DAR u opsegu od oko 3 do oko 5, prosečnim DAR u opsegu od oko 3 do oko 4, ili prosečnim DAR u opsegu od oko 4 do oko 5. Dodatno, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati poželjnim opsegom prosečnog DAR, npr. prosečnim DAR u opsegu od 3 do 5, prosečnim DAR u opsegu od 3 do 4, ili prosečnim DAR u opsegu od 4 do 5.
[0083] U nekim aspektima pronalaska, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od oko 1,0, ili prosečnim DAR od 1,0, ili prosečnim DAR od 1,1, ili prosečnim DAR od 1,2, ili prosečnim DAR od 1,3, ili prosečnim DAR od 1,4, ili prosečnim DAR od 1,5, ili prosečnim DAR od 1,6, ili prosečnim DAR od 1,7, ili prosečnim DAR od 1,8, ili prosečnim DAR od 1,9. U sledećem aspektu, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od oko 2,0, ili prosečnim DAR od 2,0, ili prosečnim DAR od 2,1, ili prosečnim DAR od 2,2, ili prosečnim DAR od 2,3, ili prosečnim DAR od 2,4, ili prosečnim DAR od 2,5, ili prosečnim DAR od 2,6, ili prosečnim DAR od 2,7, ili prosečnim DAR od 2,8, ili prosečnim DAR od 2,9. U sledećem aspektu, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od oko 3,0, ili prosečnim DAR od 3,0, ili prosečnim DAR od 3,1, ili prosečnim DAR od 3,2, ili prosečnim DAR od 3,3, ili prosečnim DAR od 3,4, ili prosečnim DAR od 3,5, ili prosečnim DAR od 3,6, ili prosečnim DAR od 3,7, ili prosečnim DAR od 3,8, ili prosečnim DAR od 3,9. U sledećem aspektu, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od oko 4,0, ili prosečnim DAR od 4,0, ili prosečnim DAR od 4,1, ili prosečnim DAR od 4,2, ili prosečnim DAR od 4,3, ili prosečnim DAR od 4,4, ili prosečnim DAR od 4,5, ili prosečnim DAR od 4,6, ili prosečnim DAR od 4,7, ili prosečnim DAR od 4,8, ili prosečnim DAR od 4,9, ili prosečnim DAR od 5,0.
[0084] U sledećem aspektu, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od 12 ili manje, prosečnim DAR od 11 ili manje, prosečnim DAR od 10 ili manje, prosečnim DAR od 9 ili manje, prosečnim DAR od 8 ili manje, prosečnim DAR od 7 ili manje, prosečnim DAR od 6 ili manje, prosečnim DAR od 5 ili manje, prosečnim DAR od 4 ili manje, prosečnim DAR od 3 ili manje, prosečnim DAR od 2 ili manje ili prosečnim DAR od 1 ili manje.
[0085] U drugim aspektima, kompozicija, serija, i/ili formulacija EDB ADC mogu se okarakterisati prosečnim DAR od 11,5 ili manje, prosečnim DAR od 10,5 ili manje, prosečnim DAR od 9,5 ili manje, prosečnim DAR od 8,5 ili manje, prosečnim DAR od 7,5 ili manje, prosečnim DAR od 6,5 ili manje, prosečnim DAR od 5,5 ili manje, prosečnim DAR od 4,5 ili manje, prosečnim DAR od 3,5 ili manje, prosečnim DAR od 2,5 ili manje, prosečnim DAR od 1,5 ili manje.
[0086] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, postupci za konvencionalnu konjugaciju putem ostataka cisteina i uslovi prečišćavanja koji su ovde objavljeni obezbeđuju kompoziciju, seriju, i/ili formulaciju EDB ADC sa optimizovanim prosečnim DAR u opsegu od oko 3 do 5, poželjno oko 4.
[0087] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, postupci za konjugaciju specifičnu za mesto putem projektovanih ostataka cisteina i uslovi prečišćavanja koji su ovde objavljeni obezbeđuju kompoziciju, seriju, i/ili formulaciju EDB ADC sa optimizovanim prosečnim DAR u opsegu od oko 3 do 5, poželjno oko 4.
[0088] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, postupci za konjugaciju specifičnu za mesto putem konjugacije zasnovane na transglutaminazi i uslovi prečišćavanja koji su ovde objavljeni obezbeđuju kompoziciju, seriju, i/ili formulaciju EDB ADC sa optimizovanim prosečnim DAR u opsegu od oko 1 do 3, poželjno oko 2.
[0089] Primeri citotoksičnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na antraciklin, auristatin, CC-1065, dolastatin, duokarmicin, enediin, geldanamicin, majtanzin, puromicin, taksan, vinka alkaloid, SN-38, tubulisin, hemiasterlin, i njihove stereoizomere, izostere, analoge ili derivate. Takođe se mogu upotrebljavati biljni toksini, drugi bioaktivni proteini, enzimi (tj. ADEPT), radioizotopi, fotosenzibilizatori (tj. za fotodinamičku terapiju).
[0090] Antraciklini su poreklom od bakterije Strepomyces i upotrebljavaju se za lečenje širokog spektra kancera, kao što su leukemije, limfomi, kanceri dojke, materice, jajnika, i pluća. Primeri antraciklina uključuju, ali nisu ograničeni na, daunorubicin, doksorubicin (tj. adriamicin), epirubicin, idarubicin, valrubicin, i mitoksantron.
[0091] Dolastatini i njihovi peptidni analozi i derivati, auristatini, veoma su potentni antimitotički agensi za koje je pokazano da imaju antikancersku i antifungalnu aktivnost. Videti, npr. S.A.D. patent br. 5,663,149 i Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother.
42:2961-2965, (1998). Primeri dolastatina i auristatina uključuju, ali nisu ograničeni na, dolastatin 10, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), MMAD (monometil auristatin D ili monometil dolastatin 10), MMAF (monometil auristatin F ili N-metilvalinvalin-dolaizoleuin-dolaproin-fenilalanin), MMAE (monometil auristatin E ili N-metilvalinvalin-dolaizoleuin-dolaproin-norefedrin), 5-benzoilvalerinska kiselina-AE estar (AEVB). i druge nove
[0092] U nekim aspektima, lek/korisni teret je auristatin. Auristatini inhibiraju proliferaciju ćelija inhibiranjem formiranja mikrotubula tokom mitoze preko inhibicije polimerizacije tubulina. PCT međunarodna publikacija br. WO2013/072813, objavljuje auristatine koji su korisni u EDB ADC iz predmetnog pronalaska i obezbeđuje postupke za proizvodnju auristatina. Na primer, korisni teret 0101 koji ima strukturu:
korisni teret 1569 koji ima strukturu:
korisni teret 9411 koji ima strukturu:
korisni teret 4574 koji ima strukturu:
korisni teret DM1 koji ima strukturu:
i
korisni teret Cemadotin koji ima strukturu:
[0093] Duokarmicin i CC‑1065 su monomeri zasnovani na CPI koji deluju kao alkilujući agensi DNK sa citotoksičnom potentnošću. Videti Boger i Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995. Primeri dolastatina uključuju, ali nisu ograničeni na, (+)-duokarmicin A i (+)-duokarmicin SA, i (+)-CC-1065.
[0094] U nekim aspektima, lek/korisni teret je CPI ili CBI dimer. CPI dimeri indukuju međulančano umrežavanje DNK i potentnu citotoksičnost. PCT međunarodna publikacija br. WO2015/110935, objavljuje CPI i CBI dimere koji su korisni u EDB ADC iz predmetnog pronalaska i obezbeđuje postupke za proizvodnju CPI i CBI dimera. Na primer, korisni teret CPI‑8314 dimer koji ima strukturu:
i
korisni teret CPI-0326 koji ima strukturu:
[0095] Enediini su klasa antitumorskih bakterijskih proizvoda koje karakterišu bilo deveto- ili desetočlani prstenovi ili prisustvo cikličnog sistema konjugovanih trostruko-dvostrukotrostrukih veza. Primeri enediina uključuju, ali nisu ograničeni na, kaliheamicin, esperamicin, i dinemicin. Kaliheamicin, takođe nazvan LL-E33288 kompleks, na primer, β-kaliheamicin, γ-kaliheamicin ili N-acetil-γ-kaliheamicin (gama-kaliheamicin (γ1)), je enediinski antibiotik koji je prvobitno izolovan kao prirodni proizvod iz organizma iz zemljišta Micromonospora echinospora ssp. calichensis (Zein et al. Science 27;240(4856):1198‑1201, 1988); on generiše prekide dvolančane DNK i potom indukuje apoptozu u ciljnim ćelijama (Zein et al. Science 27,240(4856):1198-1201, 1988; Nicolaou et al. Chem. Biol. Sep;1(1):57-66, 1994. Prokop et al. Oncogene 22:9107-9120, 2003). Disulfidni analog je N-acetil-γ-kaliheamicin dimetil hidrazid.
[0096] Geldanamicini su benzokvinon ansamicinski antibiotici koji se vezuju za Hsp90 (protein toplotnog šoka 90) i upotrebljavaju se kao antitumorski lekovi. Primeri geldanamicina uključuju, ali nisu ograničeni na, 17-AAG (17-N-alilamino-17-demetoksigeldanamicin) i 17-DMAG (17-dimetilaminoetilamino-17-demetoksigeldanamicin).
[0097] Majtanzini ili njihovi derivati majtanzinoidi inhibiraju proliferaciju ćelija inhibiranjem formiranja mikrotubula tokom mitoze preko inhibicije polimerizacije tubulina. Videti Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975. Primeri majtanzina i majtanzinoida uključuju, ali nisu ograničeni na, mertanzin (DM1) i njegove derivate, kao i ansamitocin.
[0098] Taksani su diterpeni koji deluju kao antitubulinski agensi ili mitotički inhibitori. Primeri taksana uključuju, ali nisu ograničeni na, paklitaksel (npr. TAXOL<®>) i docetaksel (TAXOTERE<®>).
[0099] Vinka alkiloidi su takođe antitubulinski agensi. Primeri vinka alkiloida uključuju, ali nisu ograničeni na, vinkristin, vinblastin, vindezin, i vinorelbin.
[0100] U nekim aspektima pronalaska, agens je imunomodulatorni agens. Primeri imunomodulatornog agensa uključuju, ali nisu ograničeni na, ganciklovir, etanercept, takrolimus, sirolimus, voklosporin, ciklosporin, rapamicin, ciklofosfamid, azatioprin, mikofenolgat mofetil, metotrekstrat, glukokortikoid i njegove analoge, citokine, ksantine, faktore rasta matičnih ćelija, limfotoksine, faktor nekroze tumora (TNF), hematopoetske faktore, interleukine (npr. interleukin‑1 (IL‑1), IL‑2, IL‑3, IL‑6, IL‑10, IL‑12, IL‑18, i IL‑21), faktore stimulacije kolonija (npr. faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF) i faktor stimulacije kolonije granulocita i makrofaga (GM-CSF)), interferone (npr. interferoni-α, -β i -γ), faktor rasta matičnih ćelija označen kao "S 1 faktor", eritropoetin i trombopoetin, ili njihovu kombinaciju.
[0101] Imunomodulatorni agensi korisni u pronalasku takođe uključuju antihormone koji blokiraju delovanje hormona na tumore i imunosupresivne agense koji suprimiraju proizvodnju citokina, smanjuju ekspresiju sopstvenih antigena, ili maskiraju MHC antigene. Reprezentativni antihormoni uključuju antiestrogene uključujući, na primer, tamoksifen, raloksifen, aromataza inhibirajuće 4(5)-imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapnston, i toremifen; i antiandrogene kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; i antiadrenalne agense. Reprezentativni imunosupresivni agensi uključuju 2-amino-6-aril-5-supstituisane pirimidine, azatioprin, ciklofosfamid, bromokriptin, danazol, dapson, glutaraldehid, antiidiotipska antitela za MHC antigene i MHC fragmente, ciklosporin A, steroide kao što su glukokortikosteroidi, citokine ili antagoniste receptora citokina (npr. anti-interferon antitela, anti-IL10 antitela, anti-TNFα antitela, anti-IL2 antitela), streptokinazu, TGFβ, rapamicin, T-ćelijski receptor, fragmente T-ćelijskog receptora, i antitela T-ćelijskog receptora.
[0102] U nekim aspektima pronalaska, lek je terapijski protein koji uključuje, ali nije ograničen na, toksin, hormon, enzim, i faktor rasta.
[0103] Primeri proteina (ili polipeptida) toksina uključuju, ali nisu ograničeni na, difteriju (npr. lanac A difterije), Pseudomonas egzotoksin i endotoksin, ricin (npr. lanac A ricina), abrin (npr. lanac A abrina), modecin (npr. lanac A modecina), alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, ribonukleazu (RNaza), Dnazu I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, gelonin, toksin difterin, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, trikotecene, peptide inhibitora čvora cistina (ICK) (npr. ceratotoksini), i konotoksin (npr. KIIIA ili SmIIIa).
[0104] Primeri hormona uključuju, ali nisu ograničeni na, estrogene, androgene, progestine i kortikosteroide.
[0105] U nekim aspektima pronalaska, lek je oligonukleotid, kao što su antisens oligonukleotidi.
[0106] Dodatni lekovi koji su korisni u pronalasku uključuju antiangiogene agense koji inhibiraju formiranje krvnih sudova, na primer, inhibitore farneziltransferaze, inhibitore COX-2, inhibitore VEGF, inhibitore bFGF, inhibitore steroidne sulfataze (npr. 2-metoksiestradiol bis-sulfamat (2-MeOE2bisMATE)), interleukin-24, trombospondin, metalospondin proteine, interferone klase I, interleukin 12, protamin, angiostatin, laminin, endostatin, i fragmente prolaktina.
[0107] Antiproliferativni agensi i proapoptotski agensi uključuju aktivatore PPAR-gama (npr. ciklopentenonski prostaglandini (cyPG)), retinoide, triterpenoide (npr. cikloartan, lupan, ursan, oleanan, fridelan, damaran, kukurbitacin, i limonoid triterpenoidi), inhibitore EGF receptora (npr. HER4), rampamicin, CALCITRIOL<®>(1,25-dihidroksiholekalciferol (vitamin D)), inhibitore aromataze (FEMARA<®>(letrozon)), inhibitore telomeraze, helatore gvožđa (npr. 3-aminopiridin-2-karboksaldehid tiosemikarbazon (triapin)), apoptin (virusni protein 3 -VP3 iz virusa anemije pilića), inhibitore Bcl‑2 i Bcl-X(L), TNF-alfa, FAS ligand, TNF-povezani apoptoza-indukujući ligand (TRAIL/Apo2L), aktivatore signalizovanja TNF-alfa/FAS ligand/TNF-povezanog apoptoza-indukujućeg liganda (TRAIL/Apo2L), i inhibitore signalizovanja PI3K-Akt puta preživljavanja (npr. UCN-01 i geldanamicin).
[0108] Reprezentativni hemioterapijski agensi uključuju alkilujuće agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziidine kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa, i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehioretamin, mehioretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfarnid, uracil iperit; nitrouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kaliheamicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo‑5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kuelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, didezoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-EU; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenale kao što su arninoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za dopunu folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfarnidni glikozid; aminolevulinsku kiselinu; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elfornitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikuon; 2,2’,2’-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (Ara-C); ciklofosfamid; tiotepu; taksoide, npr. paklitaksel (TAXOL<®>, BristolMyers Squibb Oncology of Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE<®>, Rhone-Poulenc Rorer of Antony, France); hiorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platinu; etopozid (VP‑16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aininopterin; kselodu; ibandronat; CPT‑11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoinsku kiselinu; esperamicine; i kapecitabin.
[0109] Dodatni terapijski agensi koji se mogu upotrebljavati u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju fotosenzibilizujuće agense, kao što su oni iz S.A.D. publikacije br.
20020197262 i S.A.D. patenta br. 5,952,329, za fotodinamičku terapiju; magnetne čestice za termoterapiju, kao što su one iz S.A.D. publikacije br.20030032995; vezujuće agense, kao što su peptidi, ligandi, ligandi ćelijske adhezije, itd. i prolekovi kao što su prolekovi koji sadrže fosfate, prolekovi koji sadrže tiofosfate, prolekovi koji sadrže sulfate, prolekovi koji sadrže peptide, prolekovi koji sadrže β-laktam, prolekovi koji sadrže supstituisani fenoksiacetamid ili prolekovi koji sadrže supstituisani fenilacetamid, 5-fluorocitozin i drugi prolekovi 5-fluoruridina koji se mogu konvertovati u aktivniji lek bez citotoksičnosti.
[0110] Za dijagnostičke postupke koji upotrebljavaju anti-EDB antitela, lek može uključivati detektabilni obeleživač koji se upotrebljava za detektovanje prisustva EDB+ FN-eksprimirajućeg ECM ili ćelija in vitro ili in vivo. Radioizotopi koji su detektabilni in vivo, kao što su oni obeleživači koji su detektabilni upotrebom scintigrafije, snimanja magnetnom rezonancom, ili ultrazvuka, mogu se upotrebljavati u kliničkim dijagnostičkim primenama. Korisni scintigrafski obeleživači uključuju pozitronske emitere i γ-emitere. Reprezentativni kontrastni agensi za snimanje magnetnim izvorom su paramagnetni ili superparamagnetni joni (npr. gvožđe, bakar, mangan, hrom, erbijum, evropijum, disprozijum, holmijum i gadolinijum), čestice oksida gvožđa, i kontrastni agensi koji su rastvorljivi u vodi. Za ultrazvučnu detekciju, gasovi ili tečnosti mogu biti zarobljeni u poroznim neorganskim česticama koje se oslobađaju kao kontrastni agensi u obliku mikromehurića. Za in vitro detekciju, korisni detektabilni obeleživači uključuju fluorofore, detektabilne epitope ili vezujuće agense, i radioaktivne obeleživače.
[0111] Stoga, u nekim aspektima pronalaska, lek je agens za snimanje (npr. fluorofora ili PET (pozitronska emisiona tomografija) obeleživač, SPECT (emisiona kompjuterizovana tomografija pojedinačnim fotonom) obeleživač), ili MRI (snimanje magnetnom rezonancom) obeleživač.
[0112] Termin "obeleživač" kada se ovde upotrebljava označava detektabilno jedinjenje ili kompoziciju koja je konjugovana direktno ili indirektno za antitelo tako da generiše "obeleženo" antitelo. Obeleživač može biti detektabilan sam po sebi (npr. radioizotopni obeleživači ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskog obeleživača, može katalizovati hemijsku promenu jedinjenja supstrata ili kompozicije koja je detektabilna. Radionuklidi koji mogu poslužiti kao detektabilni obeleživači uključuju, na primer, I‑131, I‑123, I‑125, Y‑90, Re‑188, Re‑186, At‑211, Cu‑67, Bi‑212, i Pd‑109. Obeleživač takođe može biti nedetektabilni entitet kao što je toksin.
[0113] Primeri fluorofora uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescein izotiocijanat (FITC) (npr. 5-FITC), fluorescein amidit (FAM) (npr. 5-FAM), eozin, karboksifluorescein, eritrozin, Alexa Fluor<®>(npr. Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, ili 750), karboksitetrametilrodamin (TAMRA) (npr. 5,‑TAMRA), tetrametilrodamin (TMR), i sulforodamin (SR) (npr. SR101).
[0114] Terapijski ili dijagnostički radioizotopi ili drugi obeleživači (npr. PET ili SPECT obeleživači) mogu biti inkorporisani u agens za konjugaciju za anti-EDB antitela kao što je ovde opisano. Izotop može biti direktno vezan za antitelo, na primer, na ostatku cisteina koji je prisutan u antitelu, ili se može upotrebljavati helator da posreduje u vezivanju antitela i radioizotopa. Radioizotopi koji su pogodni za radioterapiju uključuju, ali nisu ograničeni na α-emitere, β-emitere, i Ožeove (Auger) elektrone. Za dijagnostičke primene, korisni radioizotopi uključuju pozitronske emitere i γ-emitere. Anti-EDB antitelo iz pronalaska može dodatno biti jodirano, na primer, na ostatku tirozina antitela, kako bi se olakšala detekcija ili terapijski efekat antitela.
[0115] Primeri radioizotopa ili drugih obeleživača uključuju, ali nisu ograničeni na,<3>H,<11>C,<13>N,<14>C,<15>N,<15>O,<35>S,<18>F,<32>P,<33>P,<47>Sc,<51>Cr,<57>Co,<58>Co,<59>Fe,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<67>Ga,<68>Ga,<75>Se,<76>Br,<77>Br,<86>Y,<89>Zr,<90>Y,<94>Tc,<95>Ru,<97>Ru,<99>Tc,<103>Ru,<105>Rh,<105>Ru,<107>Hg,<109>Pd,<111>Ag,<111>In,<113>In,<121>Te,<122>Te,<123>I,<124>I,<125>I,<125>Te,<126>I,<131>I,<131>In,<133>I,<142>Pr,<143>Pr,<153>Pb,<153>Sm,<161>Tb,<165>Tm,<166>Dy,<166>H,<167>Tm,<168>Tm,<169>Yb,<177>Lu,<186>Re,<188>Re,<189>Re,<197>Pt,<198>Au,<199>Au,<201>Tl,<203>Hg,<211>At,<212>Bi,<212>Pb,<213>Bi,<223>Ra,<224>Ac, i<225>Ac.
Linkeri
[0116] EDB ADC iz predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni upotrebom linkera kako bi se direktno ili indirektno povezao ili konjugovao lek za antitelo. Linker je bifunkcionalno jedinjenje koje povezuje lek i antitelo kako bi se formirao ADC. Takvi ADC omogućavaju selektivnu isporuku lekova putem antitela koja se vezuju za specifične antigene ili proteine. Pogodni linkeri uključuju, na primer, isecive i neisecive linkere. Isecivi linker je tipično podložan isecanju i oslobađanju leka pomoću specifičnih unutarćelijskih i vanćelijskih uslova. Glavni mehanizmi pomoću kojih se konjugovani lek može isecati sa antitela unutarćelijski uključuju hidrolizu u kiseloj pH lizozoma (hidrazoni, acetali, i cis-akonitatu slični amidi), isecanje peptida lizozomskim enzimima (katepsini i drugi lizozomski enzimi), i redukciju disulfida. Konjugovani lek može se isecati sa antitela vanćelijski pomoću proteaza u tumorskom mikrookruženju (TME), kao što su katepsini. Kao rezultat ovih različitih mehanizama za isecanje, mehanizmi povezivanja leka za antitelo takođe variraju u velikoj meri i može se upotrebljavati bilo koji pogodan linker.
[0117] Pogodni linkeri mogu uključivati bilo koji isecivi linker. U nekim aspektima, pogodni linkeri uključuju valin-citrulin (val-cit) linker, fenilalanin-lizin (phe-lys) linker, ili maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc) linker, ili sadrže dipeptid koji je prikačen za dodatne imolacione elemente, kao što je N‑2∼-acetil-L-lizil-L-valil-L-citrulinp-aminobenziloksikarbonil-N,N’-dimetilaminoetil-CO‑(AcLys-vc) linker, pogodan za tehnologiju konjugacije zasnovanu na transglutaminazi. U sledećem aspektu, pogodni linkeri uključuju disulfidne linkere, kao što su sulfanil piridin (diS) linker i 2‑(piridin-2-ildisulfanil)etil karbamoil (diS-C2OCO) linker. U sledećem aspektu, linker može biti neisecivi linker, kao što je maleimidokaproil (mc), maleimido-heptanoil (me) i maleimido-Peg6C2 (MalPeg6C2). U drugim aspektima, pogodni linkeri uključuju hidrolizabilne linkere na specifičnoj pH ili pH opsegu, kao što je hidrazonski linker.
[0118] Linker može biti kovalentno vezan za antitelo preko tioestarske veze, na primer reakcijom maleimida ili haloacetamida, koji su prisutni na linkeru sa nativnim ili projektovanim ostatkom cisteina koji je prisutan na antitelu. U sledećem aspektu, linker može biti kovalentno vezan za antitelo preko amidnih veza sa ostacima lizina koji su prisutni na antitelu, na primer reakcijom karboksilne kiseline aktivirane N-hidroksi-sukcinimidom koja je prisutna na linkeru sa slobodnim aminom ostatka lizina. U sledećem aspektu, linker može biti kovalentno vezan za antitelo preko amidnih veza sa bočnim lancima ostataka glutamina koji su prisutni ili projektovani u antitelu, na primer enzimskom reakcijom katalizovanom enzimom transglutaminazom koja stvara novu amidnu vezu iz primarnog amina koji je prisutan na linkeru sa amidnim bočnim lancem ostatka glutamina.
[0119] U nekim aspektima, linkeri iz predmetnog pronalaska uključuju:
"mc-vc-PABC" ili "vc-PABC" ili "vc" linker koji ima strukturu:
"AcLys-vc-PABC-DMAE-CO" ili "AcLys-vc" linker koji ima strukturu:
diS linker koji ima strukturu:
i
diS-C2OCO linker koji ima strukturu:
Postupci pripreme EDB ADC
[0120] Ovde su obezbeđeni postupci za pripremu EDB ADC iz predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupak za proizvodnju ili generisanje konvencionalno i specifično za mesto konjugovanih EDB ADC kao što je ovde objavljeno i može uključivati (a) povezivanje linkera sa lekom; (b) konjugovanje linker-lek funkcionalne grupe za antitelo; i (c) prečišćavanje antitelo lek konjugata. Videti Primere 3 i 4.
[0121] U nekim aspektima, EDB ADC mogu biti generisani upotrebom konvencionalne, nespecifične konjugacije linker-korisni teret funkcionalnih grupa preko jednog ili više ostataka cisteina anti-EDB antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
[0122] U sledećem aspektu, EDB ADC mogu biti generisani upotrebom konjugacije specifične za mesto linker-korisni teret funkcionalnih grupa preko jednog ili više reaktivnih ostataka cisteina koji su projektovani u konstantnom domenu anti-EDB antitela. Postupci pripreme antitela za konjugaciju specifičnu za mesto preko projektovanih ostataka cisteina opisani su u PCT međunarodnoj publikaciji br. WO2013/093809.
[0123] Jedan ili više aminokiselinskih ostataka teškog lanca anti-EDB antitela mogu biti supstituisani drugom aminokiselinom, kao što je ostatak cisteina, u svrhu konjugacije sa lekom ili korisnim teretom. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži konstantni region teškog lanca antitela koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji: 118 (114 u skladu sa Kabatom), 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 290, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 327, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, ili 444, ili bilo koja njihova kombinacija, u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu). Konkretno, mogu se upotrebljavati pozicije 118 (114 u skladu sa Kabatom), 290, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Mogu se introdukovati dodatne supstitucije cisteina.
[0124] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji sadrži konstantni domen teškog lanca koji sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu.
[0125] Jedan ili više aminokiselinskih ostataka konstantnog domena lakog lanca anti-EDB antitela mogu biti supstituisani drugom aminokiselinom, kao što je ostatak cisteina, u svrhu konjugacije sa lekom ili korisnim teretom. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži konstantni region lakog lanca antitela koji sadrži (i) projektovani ostatak cisteina na poziciji 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 183, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 207, 208 ili 210, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, u skladu sa numeracijom prema Kabatu); (ii) projektovani ostatak cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 4, 42, 81, 100, 103, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, SEQ ID NO: 37, kada je konstantni domen poravnat sa SEQ ID NO: 37 (kapa laki lanac); ili (iii) projektovani ostatak cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, SEQ ID NO: 38, kada je konstantni domen poravnat sa SEQ ID NO: 38 (lambda laki lanac). Mogu se introdukovati dodatne supstitucije cisteina.
[0126] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji sadrži konstantni region kapa lakog lanca antitela koji sadrži (i) projektovani ostatak cisteina na poziciji 111, 149, 188, 207, 210, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji (poželjno 111 ili 210), u skladu sa numeracijom prema Kabatu; ili (ii) projektovani ostatak cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 4, 42, 81, 100, 103, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, SEQ ID NO: 37 (poželjno ostatak 4 ili 103), kada je konstantni domen poravnat sa SEQ ID NO: 37.
[0127] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji sadrži konstantni region lambda lakog lanca antitela koji sadrži (i) projektovani ostatak cisteina na poziciji 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji (poželjno 110, 111, 125, 149, ili 155), u skladu sa numeracijom prema Kabatu; ili (ii) projektovani ostatak cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101, ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji, SEQ ID NO: 38 (poželjno ostatak 4, 5, 19, 43, ili 49), kada je konstantni domen poravnat sa SEQ ID NO: 38.
[0128] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-EDB antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji sadrži konstantni domen lakog lanca koji sadrži (i) projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (κK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu; ili (ii) projektovani ostatak cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 76 SEQ ID NO: 37, kada je navedeni konstantni domen poravnat sa SEQ ID NO: 37.
SEQ ID NO: 37 (C,c konstantni domen)
[0129] U sledećem aspektu, EDB ADC se mogu generisati upotrebom tehnologije konjugacije specifične za mesto preko jedne ili više projektovanih acil donorskih oznaka koje sadrže glutamin ili endogenih ostataka glutamina koji su učinjeni reaktivnim u konstantnom regionu anti-EDB antitela. Postupci pripreme antitela za konjugaciju specifičnu za mesto putem acil donorskih oznaka koje sadrže glutamin ili ostataka glutamina opisani su u PCT međunarodnoj publikaciji br. WO2012/059882.
[0130] U nekim aspektima, acil donorska oznaka koja sadrži glutamin sadrži najmanje jedan glutamin (Q) i može biti prikačena za različite pozicije teškog i/ili lakog lanca (tj. na N-terminusu, C-terminusu ili interno). U sledećem aspektu, acil donorska oznaka koja sadrži glutamin može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana od: LLQGG (SEQ ID NO: 39), LLQG (SEQ ID NO: 40), LSLSQG (SEQ ID NO: 41), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 42), GLLQG (SEQ ID NO: 43), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 44), GLLQGGG (SEQ ID NO: 45), GLLQGG (SEQ ID NO: 46), GLLQ (SEQ ID NO: 47), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 48), LLQGA (SEQ ID NO: 49), LLQYQGA (SEQ ID NO: 50), LLQGSG (SEQ ID NO: 51), LLQYQG (SEQ ID NO: 52), LLQLLQG (SEQ ID NO: 53), SLLQG (SEQ ID NO: 54), LLQLQ (SEQ ID NO: 55), LLQLLQ (SEQ ID NO: 56), i LLQGR (SEQ ID NO: 57). U nekim aspektima, acil donorska oznaka koja sadrži glutamin zamenjuje aminokiselinske pozicije divljeg tipa u konstantnom domenu teškog lanca. U nekim aspektima, anti-EDB antitelo može da sadrži acil oznaku koja sadrži glutamin koja ima aminokiselinsku sekvencu LLQG (SEQ ID NO: 40) koja zamenjuje aminokiseline na pozicijama E294-N297 (u skladu sa Kabat EU indeksom) teškog lanca.
[0131] Optimalni reakcioni uslovi za generisanje ADC mogu biti empirijski određeni varijacijom reakcionih varijabli kao što su temperatura, pH, unos linker-korisni teret funkcionalne grupe, i koncentracija aditiva. Uslove pogodne za konjugaciju drugih lekova mogu odrediti oni sa iskustvom u struci bez nepotrebnog eksperimentisanja. Reprezentativni postupci za konjugovanje i karakterizaciju EDB ADC opisani su u Primerima 3 i 4.
[0132] Nakon konjugacije, konjugati se mogu razdvojiti, prečistiti od nekonjugovanih reaktanata i/ili agregiranih oblika konjugata, i okarakterisati pomoću konvencionalnih postupaka. Ovo uključuje postupke kao što su, ali nije ograničeno na, masenu spektrometriju, ekskluzionu hromatografiju (SEC), ultrafiltraciju/dijafiltraciju, jonoizmenjivačku hromatografiju (IEC), hromatofokusiranje (CF), mutagenezu usmerenu na mesto, fluorescentno obeležavanje, kristalografiju rendgenskim zracima, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), brzu proteinsku tečnu hromatografiju (FPLC), Sephacryl S-200 hromatografiju ili hromatografiju hidrofobne interakcije (HIC). Pogodni HIC medijumi uključuju, ali nisu ograničeni na, hromatografski medijum sa brzim protokom fenil sefaroza 6, hromatografski medijum sa brzim protokom butil sefaroza 4, hromatografski medijum sa brzim protokom oktil sefaroza 4, hromatografski medijum Toyopearl Ether-650M, Macro-Prep metil HIC medijum ili Macro-Prep t-Butil HIC medijum.
[0133] Tabela 13 obezbeđuje EDB ADC koji su proizvedeni u skladu sa postupcima konjugacije i prečišćavanja koji su ovde opisani i upotrebljeni za generisanje podataka koji su obezbeđeni u Primerima.
[0134] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC iz predmetnog pronalaska sadrže (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB; (b) linker i (c) lek.
[0135] U sledećem aspektu pronalaska, EDB ADC iz predmetnog pronalaska sadrže (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB; (b) linker i (c) lek, pri čemu je linker isecivi ili neisecivi linker. U nekim aspektima, linker je vc, diS, diS-C2OCO ili AcLys-vc.
[0136] U sledećem aspektu pronalaska, EDB ADC iz predmetnog pronalaska sadrže (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za EDB; (b) linker i (c) lek, pri čemu je lek citotoksični agens. U nekim aspektima, lek je auristatin. U nekim aspektima, lek je CPI ili CBI dimer. U nekim aspektima, auristatin je 0101, 1569, 9411 ili 4574. U nekim aspektima, CPI dimer je CPI‑8314 ili CPI‑0326.
[0137] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC iz predmetnog pronalaska sadrže (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji sadrži: teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; (b) linker i (c) lek. U nekim aspektima, linker je isecivi ili neisecivi linker. U nekim aspektima, linker je vc, diS, diS-C2OCO ili AcLys-vc. U nekim aspektima, lek je citotoksični agens. U nekim aspektima, lek je auristatin. U nekim aspektima, lek je CPI ili CBI dimer. U nekim aspektima, auristatin je 0101, 1569, 9411 ili 4574. U nekim aspektima, CPI dimer je CPI‑8314 ili CPI‑0326.
Upotreba EDB ADC
[0138] Anti-EDB antitela i EDB ADC iz predmetnog pronalaska korisni su u različitim primenama uključujući, ali nisu ograničene na, postupke terapijskog lečenja i postupke dijagnostičkog lečenja.
[0139] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja ili bolesti, kao što su nekanceri ili kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri, kod subjekta. Pronalazak takođe obezbeđuje EDB ADC, ili farmaceutsku kompoziciju, kao što je ovde opisano, za upotrebu u postupku za lečenje EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja, kao što su nekanceri ili kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri, kod subjekta. Pronalazak dodatno obezbeđuje upotrebu EDB ADC, ili farmaceutske kompozicije, kao što je ovde opisano, u proizvodnji medikamenta za lečenje EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja, kao što su nekanceri ili kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri, kod subjekta.
[0140] U nekim aspektima, pronalazak obezbeđuje postupak inhibiranja rasta ili progresije tumora kod subjekta koji ima EDB-eksprimirajući poremećaj, kao što su nekanceri ili kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB-eksprimirajući kanceri, uključujući primenu subjektu kome je to potrebno efikasne količina kompozicije (tj. farmaceutske kompozicije) koja ima jedan ili više EDB ADC koji su ovde opisani. U drugim aspektima pronalaska, obezbeđen je postupak inhibiranja metastaza ćelija kancera koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajućih kancera kod subjekta, uključujući primenu subjektu kome je to potrebno efikasne količina kompozicije (tj. farmaceutske kompozicije) koja ima jedan ili više EDB ADC koji su ovde opisani. U drugim aspektima pronalaska, obezbeđen je postupak indukovanja regresije tumora koji je povezan sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajućih kancera kod subjekta, uključujući primenu subjektu kome je to potrebno efikasne količine kompozicije (tj. farmaceutske kompozicije) koja ima jedan ili više EDB ADC koji su ovde opisani.
[0141] U nekim aspektima, ekspresija EDB+ FN može biti detektovana u vanćelijskom matriksu (ECM) u blizini tumorskih ćelija. EDB+ FN može biti eksprimiran u drugim ćelijama koje nisu fibroblasti u mikrookruženju tumora, uključujući tumorske ćelije. Sekretovani EDB+ FN se zatim može deponovati u matriksu u blizini tumorskih ćelija, ili na ćelijskoj membrani tumorskih ćelija. U drugim aspektima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedan ili više EDB ADC koji su ovde opisani za upotrebu u postupku kao što je prethodno opisano. U drugim aspektima, pronalazak obezbeđuje upotrebu jednog ili više EDB ADC kao što je ovde opisano ili farmaceutske kompozicije koja sadrži EDB ADC kao što je ovde opisano u proizvodnji medikamenta za upotrebu u postupcima koji su prethodno opisani.
[0142] Kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri mogu generalno uključivati bilo koji kancer koji je povezan sa remodeliranjem tkiva. Dodatno, kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, čvrste tumore i kancere krvi. U nekim aspektima, čvrsti tumori uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer štitne žlezde, sarkom, kancer dojke, kancer pankreasa, glioblastom, kancer žučne kese, kancer bubrega, kancer kože, kancer materice, mezoteliom, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer jajnika, kancer mokraćne bešike, kancer testisa, kancer prostate, kancer jetre, endokrini kancer, kancer timusa, kancer mozga, kancer nadbubrežne žlezde, kancer oka, kancer grlića materice i kancer pluća. U sledećem aspektu, kanceri krvi uključuju, ali nisu ograničeni na, leukemiju, limfom i mijelom.
[0143] EDB ADC iz predmetnog pronalaska korisni su u lečenju EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja, kao što su kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri. EDB ADC iz pronalaska mogu se upotrebljavati za lečenje kancera koji eksprimiraju visoke nivoe EDB+ FN, umerene nivoe EDB+ FN ili niske nivoe EDB+ FN.
[0144] Stoga, pacijenti koji se leče sa EDB ADC iz pronalaska mogu biti odabrani na osnovu ekspresije biomarkera, uključujući, ali ne ograničavajući se na iRNK (qPCR) masovnih uzoraka tumora i povećanu ekspresiju EDB+ FN proteina, što rezultuje populacijom pacijenata koja je odabrana zbog obogaćene ekspresije cilja, pre nego zbog porekla ili histologije tumora. Ekspresija cilja može se izmeriti kao funkcija broja obojenih ćelija u kombinaciji sa intenzitetom bojenja ćelija.
[0145] Rast kancera ili abnormalna proliferacija označava bilo koji od većeg broja indeksa koji ukazuju na promenu unutar ćelija u razvijeniji oblik kancera ili stanja poremećaja. Inhibicija rasta ćelija kancera ili ćelija ne-neoplastičnog proliferativnog poremećaja može se testirati pomoću postupaka koji su poznati u struci, kao što su odloženi rast tumora i inhibicija metastaza. Drugi indeksi za merenje inhibicije rasta kancera uključuju smanjenje preživljavanja ćelija kancera, smanjenje zapremine ili morfologije tumora (na primer, kao što je određeno upotrebom kompjuterske tomografije (CT), sonografije, ili drugog postupka snimanja), uništavanje vaskulature tumora, poboljšanje učinka u odloženom testu preosetljivosti kože, povećanje aktivnosti citolitičkih T-limfocita, i smanjenje nivoa tumorspecifičnih antigena.
[0146] Željeni ishodi terapijskih postupaka koji su objavljeni generalno su kvantitativne mere u poređenju sa kontrolnim ili početnim merenjem. Kao što se ovde upotrebljava, relativni termini kao što su "poboljšati", "povećati", ili "redukovati" ukazuju na vrednosti u odnosu na kontrolni ili uporedni molekul, kao što je merenje kod istog pojedinca pre početka lečenja koje je ovde opisano, ili merenje kod kontrolnog pojedinca (ili više kontrolnih pojedinaca) u odsustvu lečenja koje je ovde opisano. Reprezentativni kontrolni pojedinac je pojedinac koji je oboleo od istog oblika kancera kao i pojedinac koji se leči, i koji je otprilike istih godina kao i pojedinac koji se leči (kako bi se osiguralo da su stadijumi poremećaja kod lečenog pojedinca i kontrolnog pojedinca uporedivi).
[0147] Promene ili poboljšanja u odgovoru na terapiju su generalno statistički značajna. Kao što se ovde upotrebljava, termin "značajnost" ili "značajan" odnosi se na statističku analizu verovatnoće da postoji neslučajna povezanost između dva ili više entiteta. Kako bi se odredilo da li je veza "značajna" ili ima "značajnost", statističke manipulacije podacima mogu biti "pvrednost". One p-vrednosti koje padaju ispod korisnički definisane granične tačke smatraju se značajnim. P-vrednost manja od ili jednaka 0,1, manja od 0,05, manja od 0,01, manja od 0,005, ili manja od 0,001 može se smatrati značajnom.
In vivo detekcija i dijagnoza
[0148] U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak detektovanja, dijagnostikovanja, i/ili praćenja EDB+ FN-eksprimirajućeg poremećaja, kao što su kanceri koji su povezani sa ekspresijom EDB+ FN i/ili EDB+ FN-eksprimirajući kanceri. Na primer, anti-EDB antitela kao što je ovde opisano mogu biti obeležena detektabilnom funkcionalnom grupom kao što je agens za snimanje i enzim-supstrat obeleživač. Antitela kao što je ovde opisano takođe mogu da se upotrebljavaju za in vivo dijagnostičke testove, kao što je in vivo snimanje (npr. PET ili SPECT), ili reagens za bojenje.
[0149] Nakon primene EDB ADC subjektu, pri čemu je lek detektabilni obeleživač, i posle vremena dovoljnog za vezivanje, može se vizuelizovati biodistribucija EDB+ FN proteina koji su vezani antitelom. Dijagnostički postupci koji su objavljeni mogu se upotrebljavati u kombinaciji sa postupcima lečenja. Pored toga, EDB ADC iz pronalaska mogu da se primenjuju u dvostruku svrhu detekcije i terapije.
[0150] Reprezentativni neinvazivni postupci detekcije uključuju scintigrafiju (npr. SPECT (emisiona kompjuterizovana tomografija pojedinačnim fotonom), PET (pozitronska emisiona tomografija), snimanje gama kamerom, i pravolinijsko skeniranje), snimanje magnetnom rezonancom (npr. konvencionalno snimanje magnetnom rezonancom, snimanje prenosa magnetizacije (MTI), protonska magnetno-rezonantna spektroskopija (MRS), difuzno ponderisano snimanje (DWI) i funkcionalno MR snimanje (fMRI)), i ultrazvuk.
Formulacije
[0151] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje uključuju bilo koji od EDB ADC koji su ovde objavljeni i farmaceutski prihvatljiv nosač. Dodatno, kompozicije mogu uključivati više od jednog EDB ADC koji je ovde objavljen.
[0152] Kompozicija koja se upotrebljava u predmetnom pronalasku može dodatno da uključuje farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama, i mogu uključivati pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su albumin seruma, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrane; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG). "Farmaceutski prihvatljiva so" kao što se ovde upotrebljava označava farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske soli molekula ili makromolekula. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su ovde dodatno opisani.
[0153] Za primenu mogu se upotrebljavati različite formulacije EDB ADC, koje uključuju, ali nisu ograničene na, formulacije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su poznati u struci, i relativno su inertne supstance koje olakšavaju primenu farmakološki efikasne supstance. Na primer, ekscipijens može dati oblik ili konzistenciju, ili delovati kao razblaživač. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na stabilizacione agense, agense za vlaženje i emulgovanje, soli za variranje osmolarnosti, agense za inkapsuliranje, pufere, i pojačivače penetracije kroz kožu. Ekscipijensi kao i formulacije za parenteralnu i neparenteralnu isporuku lekova izneti su u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000.
[0154] U nekim aspektima pronalaska, ovi agensi se mogu formulisati za primenu injekcijom (npr. intraperitonealno, intravenski, subkutano, intramuskularno, itd.). U skladu sa tim, ovi agensi se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumima kao što su fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i slično. Određeni dozni režim, tj. doza, tajming i ponavljanje, zavisiće od određenog pojedinca i medicinske istorije tog pojedinca.
[0155] Terapijske formulacije EDB ADC koje se upotrebljavaju u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i mogu uključivati pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su albumin seruma, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0156] Terapijske EDB ADC kompozicije se generalno stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermalnu injekciju. Kompozicije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti u jediničnim doznim oblicima kao što su tablete, pilule, kapsule, prahovi, granule, rastvori ili suspenzije, ili supozitorije, za oralnu, parenteralnu ili rektalnu primenu, ili primenu inhalacijom ili insuflacijom.
[0157] Pogodni površinski aktivni agensi uključuju, posebno, nejonske agense, kao što su polioksietilensorbitani (npr. Tween<™>20, 40, 60, 80 ili 85) i drugi sorbitani (npr. Span<™>20, 40, 60, 80 ili 85). Kompozicije sa površinski aktivnim agensom pogodno će uključivati između 0,05 i 5% površinski aktivnog agensa, i može biti između 0,1 i 2,5%. Biće cenjeno da se drugi sastojci mogu dodati, na primer manitol ili drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ukoliko je potrebno.
[0158] Pogodne emulzije se mogu pripremiti upotrebom komercijalno dostupnih emulzija masti, kao što su INTRALIPID<™>, LIPOSYN<™>, INFONUTROL<™>, LIPOFUNDIN<™>i LIPIPHYSAN<™>. Aktivni sastojak može biti rastvoren bilo u prethodno pomešanoj kompoziciji emulzije ili alternativno može biti rastvoren u ulju (npr. sojino ulje, ulje šafranike, ulje semena pamuka, ulje susama, kukuruzno ulje ili bademovo ulje) i emulziji koja se formira nakon mešanja sa fosfolipidima (npr. fosfolipidi jaja, fosfolipidi semena soje ili sojin lecitin) i vodom. Biće cenjeno da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer glicerol ili glukoza, kako bi se podesila toničnost emulzije. Pogodne emulzije će tipično sadržati do 20% ulja, na primer, između 5 i 20%. Emulzija masti može uključivati kapljice masti između 0,1 i 1,0 µm, naročito 0,1 i 0,5 µm, i imati pH u opsegu od 5,5 do 8,0. Kompozicije emulzije mogu biti one koje su pripremljene mešanjem EDB ADC sa INTRALIPID<™>ili njegovim komponentama (sojino ulje, fosfolipidi jaja, glicerol i voda).
[0159] Pronalazak takođe obezbeđuje komplete za upotrebu u trenutnim postupcima. Kompleti iz pronalaska uključuju jedan ili više kontejnera koji uključuju EDB antitelo ili EDB ADC kao što je ovde opisano i uputstva za upotrebu u skladu sa bilo kojim od postupaka iz pronalaska koji su ovde opisani. Generalno, ova uputstva uključuju opis primene EDB antitela ili EDB ADC za prethodno opisana dijagnostička ili terapijska lečenja.
[0160] Uputstva koja se odnose na upotrebu EBD antitela ili EDB ADC kao što je ovde opisano, generalno uključuju informacije o dozi, rasporedu doziranja, i putu primene za namenjeno lečenje. Kontejneri mogu biti jedinične doze, rasuta pakovanja (npr. pakovanja sa više doza) ili podjedinične doze. Uputstva koja se nalaze u kompletima iz pronalaska su tipično pisana uputstva na etiketi ili insertu u pakovanju (npr. list papira koji je uključen u komplet), ali i mašinski čitljiva uputstva (npr. uputstva koja se nalaze na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje) su takođe prihvatljiva.
[0161] Kompleti iz ovog pronalaska su u pogodnom pakovanju. Pogodno pakovanje uključuje, ali nije ograničeno na, bočice, boce, tegle, fleksibilno pakovanje (npr. zapečaćene milar (Mylar) ili plastične kese), i slično. Takođe se razmatraju pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa određenim uređajem, kao što je inhalator, uređaj za nazalnu primenu (npr. atomizer) ili uređaj za infuziju kao što je minipumpa. Komplet može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermalnu injekciju). Kontejner takođe može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermalnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je EDB antitelo ili EDB ADC. Kontejner može dodatno da uključuje drugi farmaceutski aktivni agens.
[0162] Kompleti mogu opciono da obezbede dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Uobičajeno, komplet uključuje kontejner i etiketu ili insert(e) u pakovanju na ili povezane sa kontejnerom.
Doza i primena
[0163] Predmetni pronalazak obezbeđuje EDB ADC koji se primenjuju u efikasnoj dozi. Fraza "efikasna doza" ili "efikasna količina" kao što se ovde upotrebljava označava količinu ADC, leka, korisnog tereta, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije koja je neophodna za postizanje bilo kog jednog ili više korisnih ili željenih terapijskih rezultata. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju eliminisanje ili redukovanje rizika, smanjenje ozbiljnosti, ili odlaganje početka poremećaja, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome poremećaja, njegove komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove koji se pojavljuju tokom razvoja poremećaja. Za terapijsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što su redukovanje incidence ili poboljšanje jednog ili više simptoma različitih EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja, kao što je kancer, smanjenje doze drugih medikamenata koji su potrebni za lečenje poremećaja, poboljšanje efekta drugog medikamenta, i/ili odlaganje napredovanja EDB+ FN-eksprimirajućih poremećaja kod pacijenata.
[0164] Efikasna doza se može primeniti u jednoj ili više primena. Efikasna doza ADC, leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije može, ali ne mora biti postignuta u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem, ili farmaceutskom kompozicijom. Stoga, "efikasna doza" se može razmatrati u kontekstu primene jednog ili više terapijskih agenasa, i može se smatrati da se jedan agens daje u efikasnoj količini ukoliko, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa, može da se postigne ili je postignut željeni rezultat.
[0165] Na primer, kada se primenjuje subjektu koji ima kancer, efikasna količina uključuje količinu dovoljnu da izazove antikancersku aktivnost, uključujući citolizu ćelija kancera, inhibiciju proliferacije ćelija kancera, indukciju apoptoze ćelija kancera, redukciju antigena ćelija kancera, odloženi rast tumora, i/ili inhibiciju metastaza. Skupljanje tumora je dobro prihvaćeno kao klinički surogat marker za efikasnost. Sledeći dobro prihvaćen marker za efikasnost je preživljavanje bez progresije.
[0166] EDB ADC iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati pojedincu bilo kojim pogodnim putem. Osobe sa iskustvom u struci treba da razumeju da ovde opisani primeri nisu namenjeni da ograničavaju, već da ilustruju dostupne tehnike. U skladu sa tim, u nekim aspektima pronalaska, EDB ADC se primenjuje pojedincu u skladu sa postupcima koji su poznati, kao što je intravenska primena, npr. kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, intrakranijalnim, transdermalnim, subkutanim, intraartikularnim, sublingvalnim, intrasinovijalnim, putem insuflatacije, intratekalnim, oralnim, inhalacionim ili topikalnim putem. Primena može biti sistemska, npr. intravenska primena, ili lokalizovana. Komercijalno dostupni nebulizatori za tečne formulacije, uključujući mlazne nebulizatore i ultrazvučne nebulizatore, korisni su za primenu. Tečne formulacije se mogu direktno raspršiti, i liofilizovani prah se može raspršiti posle rekonstitucije. Alternativno, EDB ADC može da se aerosolizuje upotrebom formulacije fluorougljenika i inhalatora sa odmerenom dozom, ili da se inhalira kao liofilizovani i samleveni prah.
[0167] U nekim aspektima pronalaska, EDB ADC se primenjuju putem specifičnih za mesto ili ciljano lokalnih tehnika isporuke. Primeri specifičnih za mesto ili ciljanih lokalnih tehnika isporuke uključuju različite implantabilne depo izvore EDC ADC ili katetere za lokalnu isporuku, kao što su infuzioni kateteri, stalni kateteri, ili igla kateteri, sintetički transplantati, adventicijski omotači, šantovi i stentovi ili drugi implantabilni uređaji, nosači specifični za mesto, direktnu injekciju, ili direktnu primenu.
[0168] Za potrebe predmetnog pronalaska, odgovarajuća doza EDB ADC može zavisiti od određenog EDB ADC (ili njegovih kompozicija) koji se koristi, tipa i ozbiljnosti simptoma koji se leče, toga da li se agens primenjuje u terapijske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na agens, stope klirensa pacijenta za primenjeni agens, i diskrecionog prava ordinirajućeg lekara. Kliničar može da primenjuje EDB ADC dok se ne postigne doza koja postiže željeni rezultat i nadalje. Doza i/ili učestalost mogu da variraju tokom trajanja lečenja, ali takođe mogu ostati konstantne. Empirijska razmatranja, kao što je poluživot, generalno će doprineti određivanju doze. Na primer, antitela koja su kompatibilna sa humanim imunskim sistemom, kao što su humanizovana antitela ili potpuno humana antitela, mogu se upotrebljavati za produženje poluživota antitela i za sprečavanje napada na antitela od strane imunskog sistema domaćina. Učestalost primene se može odrediti i prilagoditi tokom trajanja terapije, i generalno je, ali ne nužno, zasnovana na lečenju i/ili supresiji i/ili ublažavanju i/ili odlaganju simptoma, npr. inhibiciji ili odlaganju rasta tumora, itd. Alternativno, formulacije EDB ADC sa produženim kontinuiranim oslobađanjem mogu biti prikladne. Različite formulacije i uređaji za postizanje produženog oslobađanja su poznati u struci.
[0169] Za potrebe predmetnog pronalaska, tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko bilo koje od 3 µg/kg do 30 µg/kg do 300 µg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg, do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. Na primer, može se upotrebljavati doza od oko 1 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, i oko 25 mg/kg. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od poremećaja, lečenje se održava sve dok se ne pojavi željena supresija simptoma ili dok se ne postignu dovoljni terapijski nivoi, na primer, tako da se inhibira ili odloži rast/progresija tumora ili metastaze ćelija kancera. Primeri doznih režima mogu uključivati primenu rastućih doza (npr. inicijalna doza od 1 mg/kg i postepeno povećanje do jedne ili više većih doza svake nedelje ili tokom dužeg vremenskog perioda). Drugi dozni režimi takođe mogu biti korisni, u zavisnosti od obrasca farmakokinetičkog propadanja koji lekar želi da postigne. Na primer, u nekim aspektima pronalaska, razmatra se doziranje od jednom do četiri puta nedeljno. U drugim aspektima, razmatra se doziranje jednom mesečno ili jednom svaki drugi mesec ili svaka tri meseca, kao i nedeljno, dvonedeljno i svake tri nedelje. Napredak ove terapije može se lako pratiti pomoću konvencionalnih tehnika i testova. Dozni režim (uključujući EDB ADC koji se upotrebljava) može da varira tokom vremena.
[0170] U nekim aspektima pronalaska, doze za EDB ADC mogu se odrediti empirijski kod pojedinaca kojima je data jedna ili više primena EDB ADC. Pojedincima mogu biti date inkrementalne doze EDB ADC. Kako bi se procenila efikasnost, može se pratiti indikator poremećaja.
[0171] Primena EDB ADC u skladu sa postupkom iz predmetnog pronalaska može biti kontinuirana ili intermitentna, u zavisnosti, na primer, od fiziološkog poremećaja primaoca, da li je svrha primene terapijska ili profilaktička, i drugih faktora koji su poznati lekarima sa iskustvom. Primena EDB ADC može biti suštinski kontinuirana tokom unapred odabranog vremenskog perioda ili može biti u seriji razmaknutih doza.
Kombinovane terapije
[0172] U nekim aspektima pronalaska, postupci koji su ovde opisani dodatno uključuju korak lečenja subjekta dodatnim oblikom terapije. U nekim aspektima, dodatni oblik terapije je dodatna antikancerska terapija uključujući, ali nije ograničena na to, da bude upotrebljena u hemioterapiji, zračenju, hirurgiji, hormonskoj terapiji, i/ili dodatnoj imunoterapiji.
[0173] EDB ADC koji su objavljeni mogu se primeniti kao inicijalno lečenje, ili za lečenje kancera koji ne odgovaraju na konvencionalne terapije. Pored toga, EDB ADC se mogu kombinovati sa drugim terapijama (npr. hirurška ekscizija, zračenje, dodatni antikancerski lekovi, itd.) kako bi na taj način izazvali dodatne ili potencirane terapijske efekte i/ili redukovali citotoksičnost nekih antikancerskih agenasa. EDB ADC iz pronalaska se mogu primenjivati zajedno ili koformulisati sa dodatnim agensima, ili formulisati za uzastopnu primenu sa dodatnim agensima u bilo kom redosledu.
[0174] EDB ADC iz pronalaska mogu da se upotrebljavaju u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima uključujući, ali ne ograničavajući se na, terapijska antitela, ADC, imunomodulatorne agense, citotoksične agense, i citostatske agense. Reprezentativni agensi koji su korisni za kombinovanu terapiju takođe uključuju bilo koji od lekova koji su ovde prethodno opisani kao korisni za pripremu EDB ADC pod podnaslovom "Lekovi".
[0175] Terapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, primenu hemioterapijskog agensa, vakcine, terapije zasnovane na CAR-T ćelijama, radioterapije, terapije citokinima, vakcine, bispecifičnog antitela, ADC, inhibitora drugih imunosupresivnih puteva, inhibitora angiogeneze, aktivatora T ćelija, inhibitora metaboličkog puta, inhibitora mTOR, inhibitora puta adenozina, inhibitora tirozin kinaze uključujući ali ne ograničavajući se na inlita, inhibitora ALK i sunitinib, inhibitora BRAF, epigenetskog modifikatora, inhibitora ili depletora Treg ćelija i/ili supresorskih ćelija poreklom od mijeloida, inhibitora JAK, inhibitora STAT, inhibitora ciklin-zavisne kinaze, bioterapijskog agensa (uključujući ali ne ograničavajući se na antitela na VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, druge receptore faktora rasta, CD20, CD40, CD‑40L, CTLA‑4, OX‑40, 4‑1BB, i ICOS), imunogenog agensa (na primer, oslabljene kancerske ćelije, tumorski antigeni, antigen-prezentujuće ćelije kao što su dendritske ćelije pulsirane sa antigenom ili nukleinskim kiselinama poreklom od tumora, imunostimulatorni citokini (na primer, IL-2, IFNa2, GM-CSF), i ćelije transfektovane sa genima koji kodiraju imunostimulatorne citokine kao što su, ali ne ograničavajući se na GM-CSF).
[0176] Dodatna reprezentativna antitela, koja se mogu upotrebljavati sama ili kao ADC, uključuju, ali nisu ograničena na, anti-5T4 antitela (npr. A1, A2, i A3), anti-CD19 antitela, anti-CD20 antitela (npr. RITUXAN<®>, ZEVALIN<®>, BEXXAR<®>), anti-CD22 antitela, antiantitela (npr. MYLOTARG<®>), anti-CD33 antitelo-lek konjugate, anti-Lewis Y antitela (npr. Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), anti-HER-2 antitela (npr. HERCEPTIN<®>(trastuzumab), MDX‑210, OMNITARG.RTM. (pertuzumab, rhuMAb 2C4)), anti-CD52 antitela (npr. CAMPATH<®>), anti-EGFR antitela (npr. ERBITUX<®>(cetuksimab), ABX-EGF (panitumumab)), anti-VEGF antitela (npr. AVASTIN<®>(bevacizumab), anti-DNK/histon kompleks antitela (npr. ch-TNT‑1/b), anti-CEA antitela (npr. CEA-Cide, YMB‑1003) hLM609, anti-CD47 antitela (npr. 6H9), anti-VEGFR2 (ili receptor koji sadrži insert domen kinaze, KDR) antitela (npr. IMC‑1C11), anti-Ep-CAM antitela (npr. ING-1), anti-FAP antitela (npr. sibrotuzumab), anti-DR4 antitela (npr. TRAIL-R), anti-progesteronski receptor antitela (npr.2C5), anti-CA19.9 antitela (npr. GIVAREX<®>) i anti-fibrin antitela (npr. MH‑1).
[0177] Primeri hemioterapijskih agenasa uključuju alkilujuće agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa, i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC‑1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW‑2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrosuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin gamal I i kaliheamicin phiM, videti, npr. Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonate, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoproteine enediine antibiotske hromofore), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo‑5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin, i dezoksidoksorubicin), pegilovani lipozomalni doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kuelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, didezoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenale kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstvo za dopunu folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidamin; majtanzinoide kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikuon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("AraC"); ciklofosfamid; tiotepu; taksoide, npr. paklitaksel i doksetaksel; hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platinu; etopozid (VP‑16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kselodu; ibandronat; CPT‑11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od prethodno navedenih.
[0178] Takođe su uključeni i antihormonski agensi koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore kao što su antiestrogeni i selektivni modulatori estrogenskih receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen, raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY1 17018, onapriston, i toremifen (Fareston); inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat, eksemestan, formestan, fadrozol, vorozol, letrozol, i anastrozol; i antiandrogeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od prethodno navedenih.
[0179] U nekim aspektima, EDB ADC se mogu upotrebljavati u kombinaciji krizotiniba, palbocikliba, gemcitabina, ciklofosfamida, fluorouracila, FOLFOX, folinske kiseline, oksaliplatina, aksitiniba, sunitinib malata, tofacitiniba, bevacizumaba, rituksimaba, i traztuzumaba.
[0180] U jednom aspektu, posle lečenja sa EDB ADC može doći do povećanja broja tumorinfiltrirajućih limfocita, povećanja CD8/CD4 odnosa, povećanja broja F4/80+ makrofaga, i/ili povećanja imunomodulatornih proteina kao što su PDL1 i 41BB, ili bilo koje njihove kombinacije. Stoga, kombinacija EDB ADC i inhibitora imunske kontrolne tačke ili IO agensa, kao što je anti-41BB agonist i/ili anti-PDL1 antagonist monoklonalno antitelo može biti efikasna. (Videti Primer 12). Dodatno, EDB ADC iz pronalaska sâmi mogu imati imunodulatorne, i mehanizme koji aktiviraju imuno-onkološke (IO) agense, koji se mogu povećati kombinovanom terapijom.
[0181] U nekim aspektima, EDB ADC može da se upotrebljava u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih agenasa koji ciljno deluju na modulator imunske kontrolne tačke, uključujući, ali ne ograničavajući se na, agens (kao što je antitelo) koji ciljno deluje na PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PDH1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1 (CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1 -3AS CEACAM3C2, CEACAM1 -15, PSG1 -11, CEACAM1 -4C1, CEACAM1 -4S, CEACAM1 - 4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-put adenozina (A2AR), BTK, TIK, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, VEGF put, CSF-1, ili modulator urođenog imunskog odgovora.
[0182] Za kombinovane terapije, EDB ADC i/ili jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa se primenjuju unutar bilo kog vremenskog okvira koji je pogodan za izvođenje predviđene terapije. Stoga, pojedinačni agensi se mogu primenjivati suštinski istovremeno (tj. kao jedna formulacija ili unutar nekoliko minuta ili sati) ili uzastopno bilo kojim redosledom. Na primer, lečenja sa jednim agensom mogu se primeniti unutar oko 1 godine jedan od drugog, kao što je unutar oko 10, 8, 6, 4, ili 2 meseca, ili unutar 4, 3, 2 ili 1 nedelje, ili unutar oko 5, 4, 3, 2 ili 1 dana.
[0183] Kombinovane terapije koje su objavljene mogu izazvati sinergistički terapijski efekat, tj. efekat veći od zbira njihovih pojedinačnih efekata ili terapijskih ishoda. Na primer, sinergistički terapijski efekat može biti efekat koji je najmanje oko dvostruko veći od terapijskog efekta koji izaziva jedan agens, ili zbira terapijskih efekata koje izazivaju pojedinačni agensi date kombinacije, ili najmanje oko petostruko veći, ili najmanje oko desetostruko veći, ili najmanje oko dvadesetostruko veći, ili najmanje oko pedesetostruko veći, ili najmanje oko stostruko veći. Sinergistički terapijski efekat se takođe može uočiti kao povećanje terapijskog efekta od najmanje 10% u poređenju sa terapijskim efektom koji izaziva jedan agens, ili zbirom terapijskih efekata koje izazivaju pojedinačni agensi date kombinacije, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100%, ili više. Sinergistički efekat je takođe efekat koji dozvoljava redukovano doziranje terapijskih agenasa kada se upotrebljavaju u kombinaciji.
PRIMERI
[0184] Sledeći primeri specifičnih aspekata za sprovođenje predmetnog pronalaska ponuđeni su samo u ilustrativne svrhe.
PRIMER 1
Generisanje anti-EDB antitela i priprema za konjugaciju
Generisanje anti-EDB antitela
[0185] cDNA koja kodira različita potpuno humana antitela koja se vezuju za EDB konstruisana je upotrebom standardne metodologije molekularne biologije i poreklom je iz L19 humanog monoklonalnog antitela koje se specifično vezuje za EDB (ovde u nastavku "anti-EDB-L19" ili "EDB-L19" antitelo). EDB-L19 antitelo sadrži konstantni region humanog IgG1 sa G1m(a) alotipom koji ima asparaginsku kiselinu (D) na poziciji 356 i leucin (L) na poziciji 358 (u skladu sa Kabat EU indeksom) i konstantni region humanog kapa lakog lanca. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca EDB-L19 antitela izneti su u SEQ ID NO: 1 i 10, respektivno, i teški i laki lanci izneti su u SEQ ID NO: 8 i 15, respektivno.
[0186] Kako bi se proizvelo neimunogeno antitelo, alotip koji nije G1m(a) koji ima glutaminsku kiselinu (E) na poziciji 356 i metionin (M) na poziciji 358 (u skladu sa Kabat EU indeksom) introdukovan je u teški lanac EDB-L19. Kako bi se generisao teški lanac, nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca EDB-L19 fuzionisana je sa cDNA konstantnog regiona humanog IgG1 sa Glm<z>, non-(a), non-(x) alotipom. U nekim aspektima, antitela su dodatno izmenjena kako bi se smanjila varijanta naelektrisanja antitela i povećala homogenost eliminisanjem C-terminusnog lizina (K) konstantnog regiona EDB-L19 antitela IgG1 koji generiše EDB-PFE HC (SEQ ID NO: 17). Teški i laki lanci EDB-PFE antitela izneti su u SEQ ID NO: 17 i 15, respektivno.
[0187] Kao što je pokazano u Tabeli 4, snimljena kapilarna elektroforeza (iCE) je izvedena upotrebom iCE3 sa Prince autosamplerom kako bi se odredio procenat varijanti naelektrisanja za preparate antitela. EDB-L19 antitelo imalo je značajno povećanje baznih vrsta i smanjenje glavnog pika antitela kao rezultat nepotpune obrade C-terminusnog lizina tokom ćelijske kulture u poređenju sa EDB-PFE antitelom.
Tabela 4: Procenat (%) varijanti naelektrisanja za EDB antitela.
Antitela za konjugaciju specifičnu za mesto putem projektovanih ostataka cisteina
[0188] Postupci za pripremu anti-EDB antitela za konjugaciju specifičnu za mesto za različite linker-korisne terete preko reaktivnih projektovanih ostataka cisteina generalno su izvedeni kao što je opisano u PCT međunarodnoj publikaciji br. WO2013/093809. Jedan ili više ostataka bilo na teškom lancu, kao što je pozicija K290 (u skladu sa Kabat EU indeksom, ili na lakom lancu, kao što je K183 (u skladu sa Kabatom) izmenjeni su u ostatak cisteina (C) pomoću mutageneze usmerene na mesto.
[0189] U nekim aspektima, pozicija K290 (u skladu sa Kabat EU indeksom) u konstantnom regionu teškog lanca humanog IgG1 EDB-PFE antitela supstituisana je reaktivnim cisteinom (C) kako bi se omogućila konjugacija specifična za mesto što generiše EDB‑(K290C) HC (SEQ ID NO: 19). U drugim aspektima, ostatak K183 (u skladu sa Kabatom) u konstantnom regionu humanog kapa lakog lanca supstituisan je reaktivnim cisteinom (C) kako bi se omogućila konjugacija specifična za mesto što generiše EDB‑(,cK183C) LC (SEQ ID NO: 31).
Antitela za konjugaciju specifičnu za mesto putem projektovanih ostataka glutamina
[0190] Anti-EDB antitela su eksprimirana tako da imaju podtipove humanog IgG1 projektovane sa reaktivnim ostacima glutamina, kao što su oznake koje sadrže glutamin ("Q"), na različitim aminokiselinskim pozicijama za konjugaciju za različite linker-korisne terete. Postupci za pripremu anti-EDB antitela za konjugaciju specifičnu za mesto preko reaktivnih ostataka glutamina generalno su izvedeni kao što je opisano u PCT međunarodnoj publikaciji WO2012/059882.
[0191] U nekim aspektima, H16-glutaminska oznaka LLQG (SEQ ID NO: 40) projektovana je unutar humanog IgG1-Fc regiona EDB-PFE antitela kako bi se omogućila konjugacija specifična za mesto koja je posredovana DAR 2 transglutaminazom. Na primer, u teškom lancu EDB-PFE antitela aminokiseline na pozicijama E294-N297 (u skladu sa Kabat EU indeksom) zamenjene su oznakom koja sadrži H16-glutamin LLQG (SEQ ID NO: 40). U drugim aspektima, antitela su dodatno izmenjena kako bi se povećala specifičnost konjugacije za projektovanu oznaku koja sadrži H16-glutamin. Aminokiselina lizin (K) na poziciji 222 (u skladu sa Kabat EU indeksom) na teškom lancu supstituisana je argininom (R) što generiše EDB‑(H16-K222R) HC (SEQ ID NO: 27). K222R supstitucija je obezbedila povećanje homogenih ADC, poboljšano unutarmolekulsko umrežavanje između antitela i linkerkorisnog tereta, i/ili značajno smanjenje međulančanog umrežavanja sa oznakom koja sadrži H16-glutamin na C-terminusu lakog lanca antitela.
Potencijalne hemijske odgovornosti
[0192] Potencijalne hemijske odgovornosti, naročito unutar CDR, mogu uticati na molekulsku heterogenost i rezultovati vezivanjem antigena za pretpostavljena mesta glikacije proteina. Glikacija proteina je neenzimska glikozilacija koja se može desiti u rekombinantnim antitelima tokom ćelijske kulture i glikovani proteini mogu biti podvrgnuti dodatnim reakcijama da generišu loše okarakterisane heterogene proizvode, koji se zajednički nazivaju krajnji proizvodi uznapredovale glikacije. Kako bi se ublažila potencijalna odgovornost za glikaciju, pozicija K94 (numeracija prema Kabatu) u blizini CDR3 u varijabilnom regionu teškog lanca EDB-L19 mutirana je u arginin (R) kako bi se generisao EDB‑(K94R) VH (SEQ ID NO: 21) i zatim je fuzionisan sa konstantnim regionom humanog IgG1 kako bi se generisao EDB‑(K94R) HC (SEQ ID NO: 23). K94R glikaciona mutacija je takođe introdukovana unutar EDB‑(K290C) i EDB‑(H16-K222R) teških lanaca koji su projektovani za konjugaciju specifičnu za mesto kako bi se generisali EDB‑(K94R-K290C) HC (SEQ ID NO: 25) i EDB‑ (K94R-H16-K222R) HC (SEQ ID NO: 29), respektivno.
PRIMER 2
Karakterizacija svojstava vezivanja varijante EDB antitela
Analiza afiniteta vezivanja
[0193] Rezonanca površinskih plazmona (SPR) upotrebljena je za karakterizaciju kinetike vezivanja varijanti anti-EDB antitela za rekombinantni humani, cinomolgus majmuna i pacovski 7-EDB-89 (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 36, respektivno) i da potvrdi da su svojstva vezivanja anti-EDB antitela koja imaju K94R glikacionu mutaciju u potpunosti zadržana. Vezivanje se detektuje pomoću površinskog SPR laserskog svetla koje se prelama od površine. Analiza kinetike signala on-stope (ka) i off-stope (kd), omogućava diskriminaciju između nespecifičnih i specifičnih interakcija.
[0194] Anti-humano IgG antitelo (GE Healthcare) je kovalentno kuplovano aminom na sve 4 protočne ćelije CM5 karboksimetilovanim dekstranom obloženog senzorskog čipa do gustine od oko 10.000 rezonantnih jedinica (RU) prema protokolu proizvođača i zatim je svaka varijanta anti-EDB antitela uhvaćena na nivou od približno 60-90 RU. Upotrebljeni radni pufer i pufer za uzorkovanje bio je HBS-EP+ pufer (0,01M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, i 0,05% zapr./zapr. surfaktant P20 pH 7,4). Serija trostrukih serijskih razblaženja 7-EDB-89 u opsegu koncentracija od 600 nM do 11,1 nM injektirana je preko površine pri stopi protoka od 50 µl/min tokom 60 sekundi asocijacije i 120 sekundi disocijacije. Površina je zatim regenerisana sa pulsom 3 M MgCl2od 30 sekundi, pulsom pufera za jonsku regeneraciju (0,46 M KSCN, 1,83 M MgCl2, 0,92 M uree, i 1,83 M guanidin-HCl pH 7,4) od 30 sekundi i zatim je ekvilibrisana sa pulsom HBS-EP+ radnog pufera od 30 sekundi. Svi SPR testovi izvedeni su na 25 °C sa stopom prikupljanja podataka od 1Hz upotrebom BIAcore<®>T200 instrumenta (GE Healthcare). Rezultujući senzorgrami su dvostruko referencirani (Myszka, D. G., J. Mol. Recognit., 12:279-284,1999) upotrebom i kontrolne površine i pufer injekcija. Konstante stopa su određene fitovanjem podataka po 1:1 Langmuir modelu sa BIAcore<®>T200 softverom za evaluaciju v2.0 i jednačinom KD=kd/ka. Svaki eksperiment je izveden u duplikatu i određena je prosečna KD. Kao što je pokazano u Tabeli 5, EDB-L19 i EDB‑(K94R) antitela pokazuju uporedivo vezivanje za humani 7-EDB‑89. t1/2= poluživot, Rmax=maksimalni odgovor, RU=rezonantne jedinice.
[0195] Dodatno, određeni su afiniteti vezivanja EDB-L19 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela za humani, cinomolgus majmuna i pacovski 7-EDB‑89. Kao što je pokazano u Tabeli 6, afiniteti vezivanja EDB-L19 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela bili su slični. Kao što je pokazano u Tabeli 7, afiniteti vezivanja EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela za humani, cinomolgus majmuna i pacovski 7-EDB‑89 bili su uporedivi, što potvrđuje da je reaktivnost među vrstama zadržana posle projektovanja EDB-L19 antitela da omogući konjugaciju specifičnu za mesto i uklanjanja pretpostavljenog mesta glikacije.
Tabela 6. Svojstva vezivanja anti-EDB antitela 7-EDB‑89.
Tabela 7. Svojstva vezivanja EDB‑(,cK183C-K94R-K290C) antitela za 7-EDB‑89.
Kompetitivno vezivanje pomoću ELISA
[0196] Svojstva vezivanja EDB‑(K94R) i EDB‑(,cK183C-K94R-K290C) antitela dodatno su procenjena upotrebom kompetitivnog ELISA testa sa biotinilisanim EDB-L19 kako bi se potvrdilo da je vezivanje za EDB u potpunosti zadržano. Humani 7-EDB-89 (SEQ ID NO: 34) je imobilisan (100 ng/bunariću) na ELISA ploči sa 96 bunarića i dodato je 20 ng/ml biotinilisanog EDB-L19 antitela kako bi bilo u kompeticiji sa različitim koncentracijama uzoraka modifikovanih anti-EDB antitela i vezivanje je detektovano upotrebom anti-Streptavidin-HRP antitela (Southern Biotech, Birmingham, AL).
[0197] Kao što je pokazano na SL. 1A i Tabeli 8, EDB-L19 i EDB-(K94R) antitela imala su slične vrednosti polovine maksimalne inhibitorne koncentracije. SL. 1B i Tabela 9 pokazuju da su EDB‑(K94R) i EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela takođe imala slične vrednosti polovine maksimalne inhibitorne koncentracije. Ovo ukazuje da su EDB‑(K94R) i EDB‑()cK183C-K94R-K290C modifikovana antitela zadržala svojstva vezivanja EDB i da (K94R) modifikacija teškog lanca i/ili introdukcija reaktivnih projektovanih cisteina za konjugaciju specifičnu za mesto nije izmenila vezivanje za EDB.
Tabela 8. Kompeticija sa bioEDB-L19 za vezivanje za humani 7-EDB-89.
Tabela 9. Kompeticija sa bioEDB-L19 za vezivanje za humani 7-EDB-89.
Analiza aviditeta
[0198] Afinitet vezivanjs EDB-L19 antitela za EDB određen je kao interakcija niskog vezivanja na ~230 nM. Prema tome, SPR je upotrebljena da se istraži da li aviditet utiče na vezivanje za različite nivoe cilja unutar tumorskog mikrookruženja. Promenljive gustine humanog 7-EDB-89 (SEQ ID NO: 34) kovalentno su kuplovane aminom na pojedinačne protočne ćelije CM5 karboksimetilovanim dekstranom obloženog senzorskog čipa. Radni pufer i pufer za uzorkovanje je kao što je prethodno opisano za analizu afiniteta vezivanja. Serija trostrukih serijskih razblaženja EDB-L19 antitela u opsegu koncentracija od 6 nM do 0,074 nM injektirana je pri stopi protoka od 50 µl/min tokom 110 sekundi asocijacije i 900 sekundi disocijacije. Površina je zatim regenerisana sa dva pulsa pufera za jonsku regeneraciju (0,46 M KSCN, 1,83 M MgCl2, 0,92 M uree, i 1,83 M guanidin-HCl pH 7,4) od 30 sekundi i zatim je ekvilibrisana sa pulsom HBS-EP+ radnog pufera od 30 sekundi. Svaki eksperiment je izveden u duplikatu i određene su prosečne ka, kd i KD.
[0199] Kao što je pokazano u Tabeli 10, rezultati su pokazali da kako se nivo imobilizovanog humanog 7-EDB-89 povećavao, off-stope (kd) su se usporavale i posledično afiniteti su se povećavali. Očigledne vrednosti KDbile su proporcionalne nivoima imobilizacije humanog 7-EDB-89 i potvrdile su da EDB-L19 antitelo vezuje EDB sa velikom komponentom aviditeta.
Polireaktivnost anti-EDB antitela
[0200] Polireaktivnost je povezana sa brzim klirensom in vivo (Hotzel et al. mAbs 4(6):753‑760, 2012) i neželjenim protein-protein interakcijama (Xu et al. Protein Eng Des Sel 26(10): 663‑670 (2013). Pokazano je da je ELISA direktnog vezivanja DNK i insulina u korelaciji sa poznatim farmakokinetikama (PK) klinički potvrđenih antitela. Serijska razblaženja antitela počevši od 10 µg/ml u kvadriplikatu procenjena su u testu niske strogosti za vezivanje bilo za DNK ili za insulin koji je bio direktno obložen na ELISA ploči.
[0201] Kao što je pokazano u Tabeli 11, i EDB‑(K94R) i EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela imaju veoma niske rezultate polireaktivnosti koji su uporedivi ili bolji od negativne kontrole koja ima optimalna PK svojstva. Dodatno, rezultati polireaktivnosti su bili značajno niži od antitela pozitivne kontrole koje ima lošu PK i rezultuje brzim klirensom.
Tabela 11. Rezultati polireaktivnosti anti-EDB antitela.
FcRn hromatografija
[0202] FcRn hromatografija je korišćena kako bi se istražio potencijalni uticaj posredovan naelektrisanjem introdukcije reaktivnih projektovanih cisteina u konstantni region IgG1 divljeg tipa na farmakokinetiku zavisnu od FcRn. Procena antitela upotrebom metodologije u FcRn koloni demonstrirala je da vreme elucije pokazuje pozitivnu korelaciju sa klirensom kod ljudi i ne-humanih primata (Schoch A. et al. PNAS, 2015, Vol. 112). FcRn afinitetne kolone su pripremljene u skladu sa Schlothauer et al., MAbs 5(4): 576‑586, 2013. Zatim, 50 µg EDB‑(κK183C-K94R-K290C) antitela ili EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ADC je injektirano i zatim eluirano pomoću linearnog pH gradijenta (30 CV) od pH 5,5-8,8 unutar 60 minuta upotrebom 20 mM MES, 150 mM NaCl, pH 5,5 i 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,8 kao eluenata.
[0203] Kao što je pokazano u Tabeli 12, relativno vreme elucije u FcRn koloni EDB‑(,cK183C-K94R-K290C) antitela i EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ADC bilo je u skladu sa prihvatljivim PK parametrima. Ovi podaci demonstriraju da inkorporisanje reaktivnog projektovanog ostatka cisteina K290 u konstantni region IgG1 ne utiče na vezivanje FcRn.
Tabela 12. Relativno vreme elucije u FcRn koloni.
PRIMER 3
Biokonjugacija EDB ADC
[0204] Anti-EDB antitela iz predmetnog pronalaska konjugovana su za lekove/korisne terete putem linkera kako bi se generisali EDB ADC. Upotrebljeni postupak konjugacije je bio bilo konvencionalna konjugacija (tj. putem nasumičnih ostataka cisteina) ili konjugacija specifična za mesto (tj. putem projektovanih ostataka cisteina ili projektovanih ostataka glutamina). Tabela 13 pokazuje postupke konjugacije koji su upotrebljeni za različite EDB ADC.
Postupak A: Konvencionalna konjugacija putem ostataka cisteina
[0205] Anti-EDB antitelo pri 27 mg/ml u PBS, pH 7,2 redukovano je sa 2,3 do 2,6 puta (m/m) TCEP na 37 °C tokom 2 sata i zatim konjugovano. Molski odnos je generalno bio 2,5 puta, ali je optimizovan u zavisnosti od količine konjugata antitela kako bi se postigao optimalni krajnji prosečni DAR od oko 4,0. Delimično redukovano antitelo konjugovano je sa 6 do 7 puta (m/m) linker/korisnim teretom u PBS sa 10% DMA na 25 °C tokom 1 sata. Višak linker/korisnog tereta ugašen je sa L-cisteinom na 25 °C tokom 15 minuta. Sirovi ADC je dijalizovan preko noći u PBS na 4-6 °C.
[0206] Sirovi ADC je prečišćen pomoću ekskluzione hromatografije (SEC) na Superdex 200 u PBS i sakupljeni monomerni pik je bilo skladišten na 4-6 °C ili dijalizovan u 20 mM histidinu, 8,5% saharozi, pH 5,8; sterilno filtriran i zamrznut na -70 °C. Antitelo negativne kontrole huNeg‑8.8 konjugovano je pomoću istog postupka.
Postupak B: Konjugacija specifična za mesto putem projektovanih ostataka cisteina
[0207] Dva grama anti-EDB antitela, generisana sa reaktivnim projektovanim ostacima cisteina, pri 27,2 mg/ml u PBS, pH 7,2 redukovano je sa 15 puta (m/m) TCEP na 37 °C tokom 7 sati i odsoljeno na Sephadex<®>G-25 u PBS kako bi se uklonio višak TCEP. Međulančani cisteini su oksidovani sa 30 puta DHA (m/m) na 4-6 °C preko noći. DHA je uklonjen odsoljavanjem na Sephadex<®>G-25 u PBS. Za ADC koji imaju veći stepen dodavanja kape glutationa, umesto poželjnog dodavanja kape cisteina cisteina specifičnog za mesto, upotrebljen je 100 puta TCEP (m/m) za redukciju.
[0208] Redukovano i oksidovano antitelo je konjugovano sa 9 puta (m/m) linker-korisnim teretom u PBS sa 10% DMA na 25 °C tokom 2 sata. Višak linker-korisnog tereta ugašen je sa 9 puta (m/m) L-cisteina na 25 °C tokom 15 minuta. Sirovi ADC je dijalizovan preko noći u PBS na 4-6 °C.
[0209] Sirovi ADC je prečišćen pomoću SEC na Superdex 200 u PBS i sakupljeni monomerni pik je dijalizovan u 20 mM histidinu, 8,5% saharozi, pH 5,8; sterilno filtriran i zamrznut na -70 °C. Antitelo negativne kontrole huNeg‑8.8 konjugovano je pomoću istog postupka.
Postupak C: Konjugacija specifična za mesto putem projektovanih ostataka glutamina
[0210] Anti-EDB antitelo, generisano sa reaktivnim projektovanim ostacima glutamina, dijalizovano je u reakcionom puferu; 100 mM fosfata, 200 mM NaCl, pH 7,0. 20 mg/ml antitela konjugovano je sa linker-korisnim teretom (10 puta m/m) na sobnoj temperaturi tokom 15 sati, upotrebom 1 jedinice komercijalno prečišćene transglutaminaze (TG) po mg antitela, uz mešanje, u 100 mM kalijum fosfata, 200 mM NaCl, 10% DMSO. Sirovi ADC je centrifugiran i supernatant je prečišćen pomoću SEC.
[0211] Sirovi ADC je prečišćen pomoću SEC na Superdex 200 u PBS, sakupljeni monomerni pik je i dijalizovan u 20 mM histidinu, 8,5% saharozi, pH 5,8; sterilno filtriran i zamrznut na -70 °C. Antitelo negativne kontrole huNeg‑8.8 konjugovano je pomoću istog postupka.
Postupak D: Konvencionalna konjugacija putem ostataka cisteina upotrebom disulfidnih linkera
[0212] Anti-EDB antitelo pri 27 mg/ml u PBS, pH 7,2 delimično je redukovano upotrebom 5 puta (m/m) TCEP na 37 °C tokom 2 sata i odsoljeno upotrebom Sephadex<®>G‑25 SEC.
[0213] Delimično redukovano antitelo je konjugovano sa 12-15 puta (m/m) redukovanog linker-korisnog tereta u 67 mM HEPES, pH 7,0 sa 0,7 mM DTPA i 7% DMA na 25 °C tokom 15 minuta. Višak linker-korisnog tereta ugašen je sa 20 puta NEM (m/m) na 25 °C tokom 15 minuta.
[0214] Sirovi ADC je prečišćen pomoću SEC na Superdex 200 u PBS sa 50 mM DHA i 50 mM DTPA, i sakupljen je monomerni pik koji je čuvan na 4-6 °C. Negativna kontrola je konjugovana pomoću istog postupka.
Tabela 13. Strukture različitih EDB ADC (X predstavlja antitelo).
PRIMER 4 Karakterizacija EDB ADC
[0215] EDB ADC iz predmetnog pronalaska okarakterisani su upotrebom kombinacije ekskluzione hromatografije (SEC), LC-MS i hromatografije hidrofobne interakcije (HIC). Prosečan lek:antitelo odnos (DAR) određen je pomoću masene spektrometrije (MS). Tabela 14 obezbeđuje analitičke karakteristike različitih EDB ADC.
[0216] LC-MS: Kolona = Waters BEH300-C4, 2,1 × 100 mm (P/N = 186004496); Instrument = Acquiti UPLC sa SQD2 detektorom masene spek; Stopa protoka = 0,7 ml/min; Temperatura = 80 °C; Pufer A = voda 0,1% mravlja kiselina; Pufer B = acetonitril 0,1% mravlja kiselina. Gradijent se kreće od 3% B do 95% B tokom 2 minuta, drži na 95% B tokom 0,75 minuta, i zatim reekvilibrira na 3% B. Uzorak je redukovan sa TCEP ili DTT neposredno pre injekcije. Eluat je praćen pomoću LCMS (400-2000 daltona) i proteinski pik je dekonvolucionisan upotrebom MaxEnt1. DAR je saopšten kao prosečno težinsko opterećenje kao što je prethodno opisano.
[0217] SEC: Kolona: Superdex200 (5/150 GL); Mobilna faza: fosfatom puferisan fiziološki rastvor koji sadrži 2% acetonitril, pH 7,4; Stopa protoka = 0,25 ml/min; Temperatura = ambijentalna; Instrument: Agilent 1100 HPLC.
[0218] HIC: Kolona: TSKGel Butyl NPR, 4,6 mm × 3,5 cm (P/N = S0557‑835); Pufer A = 1,5 M amonijum sulfat koji sadrži 10 mM fosfat, pH 7; Pufer B = 10 mM fosfat, pH 7 20% izopropil alkohol; Stopa protoka = 0,8 ml/min; Temperatura = ambijentalna; Gradijent = 0% B do 100% B tokom 12 minuta, drži na 100% B tokom 2 minuta, i zatim reekvilibrira na 100% A; Instrument: Agilent 1100 HPLC.
PRIMER 5
Ekspresija EDB+ FN
[0219] Kako bi se sprovela široka istraga indikacija kancera za terapiju koja je zasnovana na EDB ADC, analizirana je ekspresija EDB+ FN na nivou proteina i iRNK u humanim tumorima i modelima PDX.
RNA-Seq analiza ekspresije EDB+ FN
[0220] RNA-Seq podaci su analizirani iz 10660 pojedinačnih uzoraka tumora koji su prikupljeni u okviru projekta Atlasa genoma kancera (The Cancer Genome Atlas - TCGA) (Nacionalni institut za kancer pri NIH, Bethesda, MD) umnožavajući 31 tip tumora. Podaci o ekspresiji nivoa izoforme dobijeni su od OmicSoft softvera (Cary, NC). Ekspresija EDB+ FN izračunata je kao zbir nivoa ekspresije izoformi fibronektina (FN1) koje sadrže EDB. Nivoi ekspresije izmereni su pomoću fragmenta po kilobazi transkripta na milion čitanja (FPKM) i zbirna statistika nivoa ekspresije EDB+ FN za svaki tip tumora pokazana je u Tabeli 15. Generalno, gen se smatra eksprimiranim ukoliko je FPKM oko 1 ili više.
[0221] Tabela 15 pokazuje RNA-Seq analizu EDB+ FN u humanim tumorima. Ekspresija EDB+ FN demonstrirana je u širokom spektru indikacija humanih tumora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinom štitne žlezde, sarkom, karcinom dojke, adenokarcinom pankreasa, glioblastom, holangiokarcinom, adenokarcinom pluća, karcinom bubrega, melanom, karcinosarkom materice, mezoteliom, karcinom skvamoznih ćelija pluća, adenokarcinom rektuma i kolona, hepatoćelijski karcinom jetre, karcinom kolona, serozni cistadenokarcinom jajnika, i karcinom mokraćne bešike.
Tabela 15. RNA-Seq analiza EDB+ FN u TCGA uzorcima.
[0222] Kvantifikacija ekspresije gena izvedena je na RNA-Seq podacima 160 internih Pfizer modela ksenografta poreklom od pacijenta (PDX) iz kancera dojke, kancera jajnika, kancera glave i vrata, kolorektalnog kancera, melanoma, kancera pankreasa, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) i sitnoćelijskog kancera pluća upotrebom RSEM programa. Videti Li et al., BMC Bioinformatics, 12:323, 2011. Ekspresija EDB+ FN izračunata je kao zbir nivoa ekspresije izoformi fibronektina (FN1) koje sadrže EDB. Kao što je pokazano na SL. 2, EDB+ FN se eksprimira na različitim nivoima (svi uzorci su imali nivoe >1) u svim analiziranim tipovima tumora. Podaci su predstavljeni kao fragment po kilobazi transkripta na milion čitanja (FPKM).
Imunohistohemijska (IHC) detekcija ekspresije EDB+ FN
[0223] Ekspresija EDB+ FN proteina u humanom kanceru potvrđena je pomoću IHC upotrebom EDB-L19 antitela na zamrznutim presecima. Preseci sveže zamrznutog tkiva od osam mikrona koji su ukalupljeni u Tissue-Tek O.C.T. jedinjenje (Sakura Finetek) fiksirani su tokom 4 minuta u 3:1 smeši acetona i 100% etanola i zatim potopljeni u 10% neutralni puferisani formalin na 20 sekundi. Pločice su isprane u TBS. Aktivnost endogene peroksidaze je inaktivirana sa Peroxidazed 1 (Biocare Medical) tokom 10 minuta. Nespecifične interakcije proteina blokirane su tokom 10 minuta sa Background Punisher (Biocare Medical). EDB-L19 antitelo ili izotipska negativna kontrola huNeg-8.8 antitelo je prethodno kompleksirano sa zečjim anti-humanim IgG (Jackson ImmunoResearch) u krajnjoj koncentraciji od 3 µg/ml i 0,5 µg/ml, respektivno, tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Prethodno kompleksirana smeša je inkubirana sa viškom potpuno humanog IgG (Jackson ImmunoResearch) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi i dodata je pločicama tokom 1 sata. Preseci su isprani u TBS i inkubirani sa SignalStain Boost Rabbit HRP (CellSignaling Technologies) tokom 30 minuta. Hromogeni signal je razvijen sa DAB+ (Dako) tokom 5 minuta, i zatim je ugašen sa destilovanom H2O. Pločice su nakratko kontra-obojene sa CAT hematoksilinom (Biocare Medical), isprane u vodi, dehidatisane u rastućim koncentracijama alkohola, prosvetljene u ksilenu, i pokrovna stakla su montirana sa Permount medijumom za montiranje (FisherChemicals). Izvedena je i potvrđena analiza ekspresije.
[0224] Kao što je pokazano u Tabeli 16, EDB+ FN protein je eksprimiran na umerenim do visokih nivoa na svim profilisanim indikacijama humanog kancera, uključujući karcinom glave i vrata (podaci nisu pokazani), karcinom pankreasa, nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), karcinom jajnika i karcinom dojke. Ekspresija u svim tumorima bila je dominantno stromalna (uključujući fibroblastnu i onu koja je povezana sa vaskulaturom), mada je takođe uočeno određeno bojenje tumorskih ćelija.
Tabela 16. Ekspresija EDB+ FN proteina kod humanog kancera procenjena pomoću IHC testa.
PRIMER 6
In vitro vezivanje EDB ADC
[0225] Kako bi se procenilo relativno vezivanje anti-EDB antitela i EDB ADC za EDB, MaxiSorp ploče sa 96 bunarića su obložene sa 0,5 ili 1 µg/ml humanog 7-EDB-89 (SEQ ID NO: 34) u PBS i inkubirane preko noći na 4 °C uz lagano mućkanje. Ploče su zatim ispražnjene, isprane sa 200 μl PBS i blokirane sa 100 μl blokirajućeg pufera (ThermoScientific) tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Blokirajući pufer je uklonjen, bunarići su isprani sa PBS i inkubirani sa 100 µl anti-EDB antitela ili EDB ADC koji su serijski razblaženi (4-struko) u ELISA test puferu (EAB; 0,5% BSA / 0,02% Tween-20/PBS). Prva kolona ploče je ostavljena prazna a poslednja kolona ploče je napunjena sa EAB kao prazna kontrola. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reagensi su uklonjeni i ploča je isprana sa 200 µl 0,03% Tween-20 u PBS (PBST). Anti-humani IgG-Fc-HRP (Thermo/Pierce) razblažen 1:5000 u EAB dodat je kao 100 µl u bunariće i inkubirano je tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana sa 200 µl PBST, zatim je dodato 100 µl BioFX TMB (Fisher) i boji je omogućeno da se razvije tokom 4 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena sa 100 µl 0,2 N sumporne kiseline i očitana je apsorbanca na 450 nm na Victor čitaču ploča (Perkin Elmer, Waltham, MA).
[0226] Tabela 17 obezbeđuje relativno vezivanje anti-EDB antitela i EDB ADC za humani 7-EDB-89 fragment proteina koji je vezan za ploču sa 96 bunarića u ELISA formatu. Sva antitela i ADC koji ciljno deluju na EDB vezali su se za ciljni protein sa sličnim afinitetom u opsegu od 19 pM do 58 pM. Nasuprot tome, antitela i ADC koji ne deluju ciljno na EDB imaju visoke vrednosti EC50>10.000 pM. Reprezentativne ELISA krive vezivanja ilustrovane su na SL.3A i 3B.
Tabela 17. Vezivanje anti-EDB antitela i ADC za humani EDB.
PRIMER 7
In vitro citotoksičnost EDB ADC
Ćelijska kultura
[0227] WI38-VA13 su SV40-transformisani humani fibroblasti pluća koji su dobijeni od ATCC i održavani u MEM Eagles medijumu (Cell-Gro), koji je suplementovan sa 10% FBS, 1% MEM neesencijalnih aminokiselina, 1% natrijum piruvatom, 100 jedinica/ml penicilinstreptomicina i 2 mM GlutaMax. HT29 su poreklom od humanog kolorektalnog karcinoma (ATCC) i održavane su u DMEM medijumu koji je suplementovan sa 10% FBS i 1% glutaminom.
Detekcija EDB+ FN transkripta
[0228] Za ekspresiju gena i analizu transkripta EDB+ FN, adherentne proliferišuće WI38-VA13 i HT29 ćelije disocirane su od flaskova za ćelijsku kulturu pomoću TrypLE Express (Gibco). RNeasy Mini Kit (Qiagen) je upotrebljen za prečišćavanje ukupne RNK iz sakupljenih ćelijskih peleta. Preostala DNK je uklonjena pomoću RNase-Free DNase kompleta (Qiagen) tokom prečišćavanja RNK. RNA-to-cDNA komplet visokog kapaciteta (Applied Biosistems) upotrebljen je za reverznu transkripciju ukupne RNK u cDNA. cDNA je analizirana pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu upotrebom TaqMan Universal Master Mix II, sa UNG (Applied Biosistems). EDB+ FN signal je detektovan pomoću TaqMan prajmera Hs01565271_m1 i normalizovan sa prosekom oba signala iz ACTB (TaqMan prajmer Hs99999903_m1) i GAPDH (TaqMan prajmer Hs99999905_m1). Svi prajmeri su od ThermoFisher Scientific. Pokazani su podaci iz reprezentativnog eksperimenta.
Detekcija EDB+ FN proteina pomoću Western blota
[0229] Za detekciju EDB+ FN pomoću Western blota, adherentne proliferišuće WI38-VA13 i HT29 ćelije su sakupljene struganjem ćelija. Ćelijski lizati su pripremljeni u puferu za ćelijsku lizu (Cell Signaling Technology) sa inhibitorima proteaze i inhibitorima fosfataze. Tumorski lizat je pripremljen bilo u RIPA puferu za lizu ili u 2X puferu za ćelijsku lizu (Cell Signaling Technology) sa inhibitorima proteaze i inhibitorima fosfataze. Proteinski lizati su analizirani pomoću SDS-PAGE i zatim pomoću Western blota. Proteini su prebačeni na nitroceluloznu membranu i zatim blokirani sa 5% mleko/TBS, nakon čega je usledila inkubacija sa EDB-L19 antitelom i anti-GAPDH antitelom (Cell Signaling Technology) preko noći na 4 °C. Posle ispiranja, anti-EDB blot je inkubiran sa ECL HRP-vezanim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom (GE Healthcare) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, EDB+ FN signal je razvijen pomoću Pierce ECL 2 supstrata za Western blot (Thermo Scientific) i detektovan pomoću rendgenskih filmova. Anti-GAPDH blot je inkubiran sa Alexa Fluor 680 konjugovanim anti-zečjim IgG sekundarnim antitelom (Invitrogen) u blokirajućem puferu tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, GAPDH signal je detektovan pomoću LI-COR Odyssey Imaging sistema. Denzitometrijska analiza EDB+ FN Western blotova sprovedena je upotrebom Bio-Rad GS‑800 kalibrisanog denzitometra za snimanje i kvantifikovana upotrebom Quantity One softvera verzija 4.6.9. Pokazani su podaci iz reprezentativnog eksperimenta.
[0230] SL. 4 pokazuje ekspresiju EDB+ FN pomoću Western blota u WI38-VA13 i HT29 ćelijama. EDB+ FN je eksprimiran u WI38-VA13 ćelijskoj liniji a HT29 ćelijska linija karcinoma kolona je negativna kada se uzgaja in vitro.
Detekcija EDB+ FN proteina pomoću protočne citometrije
[0231] EDB-L19 antitelo je upotrebljeno za merenje ekspresije EDB+ FN na površini ćelije WI38-VA13 ili HT29 ćelija pomoću protočne citometrije. Ćelije su disocirane neenzimskim puferom za disocijaciju ćelija (Gibco) i inkubirane sa hladnim puferom protoka (FB, 3% BSA/PBS+Ca+Mg) na ledu radi blokiranja. Ćelije su zatim inkubirane sa primarnim antitelima na ledu u FB. Posle inkubacije, ćelije su isprane hladnim PBS-Ca-Mg i zatim inkubirane sa bojom za vijabilnost (Biosciences) kako bi se razlikovale žive i mrtve ćelije, u skladu sa procedurom proizvođača. Signali su analizirani na BD Fortessa protočnom citometru i podaci su analizirani upotrebom BD FACS DIVA softvera. Pokazani su podaci iz reprezentativnog eksperimenta.
[0232] Tabela 18 sumira rezultate Western blota, qRT-PCR i protočne citometrije. Podaci demonstriraju da su WI38-VA13 EDB+ FN pozitivne a HT29 EDB+ FN negativne.
Tabela 18. Karakterizacija ekspresije EDB+ FN u WI38 VA13 i HT29 ćelijama
In vitro testovi citotoksičnosti
[0233] Proliferišuće WI38-VA13 ili HT29 ćelije sakupljene su iz flaskova za kulturu sa puferom za neenzimsku ćelijsku disocijaciju i kultivisane su preko noći u pločama sa 96 bunarića (Corning) pri 1000 ćelija/bunariću u vlažnoj komori (37 °C, 5% CO2). Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa EDB ADC ili izotipskim kontrolnim ne-EDB-vezujućim ADC dodavanjem 50 µl 3x štokova u duplikatu pri 10 koncentracija. U nekim eksperimentima, ćelije su zasejane pri 1500 ćelija/bunariću i tretirane istog dana. Ćelije su zatim četiri dana inkubirane sa EDB ADC ili izotipskim kontrolnim ne-EDB-vezujućim ADC. Na dan sakupljanja, ćelijama je dodato 50 µl Cell Titer Glo (Promega) i inkubirano 0,5 sati na sobnoj temperaturi. Luminescenca je izmerena na Victor čitaču ploča (Perkin Elmer, Waltham, MA). Relativna vijabilnost ćelija je određena kao procenat netretiranih kontrolnih bunarića. Vrednosti IC50su izračunate upotrebom logističkog modela sa četiri parametra #203 sa XLfit v4.2 (IDBS).
[0234] Tabela 19 pokazuje IC50(ng/ml antitela) EDB ADC lečenja u testovima citotoksičnosti koji su izvedeni na WI38-VA13 (EDB+ FN pozitivna tumorska ćelijska linija) i HT29 ćelijama karcinoma kolona (EDB+ FN negativna tumorska ćelijska linija). EDB ADC su indukovali ćelijsku smrt u ćelijskoj liniji koja eksprimira EDB+ FN. Vrednosti IC50su bile slične za sve EDB ADC koji imaju vc-0101 linker-korisni teret, u opsegu od približno 184 ng/ml do 216 ng/ml (EDB-L19-vc-0101, EDB-(,cK183C-K290C)-vc-0101, EDB-(K94R)-vc-0101, EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101). Negativne kontrole ADC sa vc-0101 bile su znatno manje potentne, sa vrednostima IC50približno 70- do 200-struko višim od EDB-vc-0101 ADC. Svi vc-0101 ADC imali su 46- do 83-struko više vrednosti IC50u EDB+ FN negativnoj ćelijskoj liniji tumora, HT29. Prema tome, EDB ADC su zavisni od ekspresije EDB+ FN za njihovu in vitro citotoksičnost.
[0235] Drugi EDB ADC zasnovani na auristatinu sa "vc" proteazom isecivim linkerima, EDB-L19-vc‑9411 i EDB-L19-vc‑1569, takođe su pokazali potentnu citotoksičnost u WA38-VA13 ćelijama sa visokom selektivnošću od oko 50‑ do 180-struko u poređenju sa odgovarajućim ADC negativnim kontrolama i selektivnošću od oko 25- do 140-struko u poređenju sa neeksprimirajućom ćelijskom linijom. EDB-L19-diS-DM1 ADC je imao sličnu potentnost kao vc-0101 ADC, međutim mnogo manju selektivnost u poređenju sa ADC negativnom kontrolom (oko 3-struko) i sa HT29 ćelijama (oko 0,9-struko).
Tabela 19. In vitro citotoksičnost EDB ADC i kontrolnih ne-EDB-vezujućih ADC.
[0236] Kao što je pokazano u Tabeli 20, nekonjugovani korisni tereti su bili veoma potentni u obe ćelijske linije, nezavisno od ekspresije EDB+ FN, što ukazuje na to da su ove ćelije osetljive na citotoksične agense koji se upotrebljavaju kao korisni tereti ADC.
Tabela 20. In vitro potentnost citotoksičnosti različitih nekonjugovanih jedinjenja.
PRIMER 8
In vivo efikasnost EDB ADC
[0237] EDB ADC su procenjeni na modelima ksenografta ćelijske linije (CLX), ksenografta poreklom od pacijenta (PDX) i singenog tumora. Ekspresija EDB+ FN je detektovana upotrebom imunohistohemijskog (IHC) testa kao što je ovde prethodno opisano.
[0238] Kako bi se generisali modeli CLX, 8 × 10<6>do 10 × 10<6>ćelija H-1975, HT29, ili Ramos tumorskih linija implantirane su subkutano u ženke atimičkih golih miševa. Ramos i H-1975 ćelije za inokulaciju su suspendovane u 50% i 100% Matrigel (BD Biosciences), respektivno. Za Ramos model, životinje su primile zračenje celog tela (4 Gy) pre inokulacije ćelija kako bi se olakšalo uspostavljanje tumora. Kada je prosečna zapremina tumora dostigla približno 160 do 320 mm<3>, životinje su nasumično podeljene u grupe tretmana, sa 8-10 miševa u svakoj grupi. ADC ili vehikulum (PBS) su primenjeni intravenski na dan 0 i zatim su životinje dozirane jednom svaka 4 dana za 4 do 8 doza. Tumori su mereni jednom ili dva puta nedeljno i zapremina tumora je izračunata kao zapremina (mm<3>) = (širina × širina × dužina)/2. Telesna težina životinja je praćena tokom 4 do 9 nedelja i nije uočen gubitak težine životinja ni u jednoj grupi tretmana.
[0239] Kako bi se generisali modeli PDX, tumori su sakupljeni od životinja donora i fragmenti tumora veličine približno 3x3 mm implantirani su subkutano u bok ženki atimičkih golih miševa (za PDX-NSX‑11122 model) ili NOD SCID miševa (za PDX-PAX‑13565 i PDX-PAX‑12534 modele) upotrebom trokara veličine 10. Kada je prosečna zapremina tumora dostigla približno 160 do 260 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u grupe tretmana, sa 7-10 miševa u svakoj grupi. Dozni režim ADC ili vehikuluma (PBS) i put primene kao i procedure merenja tumora su isti kao što je prethodno opisano za modele CLX. Telesna težina životinja je praćena tokom 5 do 14 nedelja i nije uočen gubitak težine životinja ni u jednoj grupi tretmana. Inhibicija rasta tumora je prikazana u grafičkom formatu kao prosek veličine tumora ± SEM.
Ekspresija EDB+ FN
[0240] Kao što je pokazano u Tabeli 21, ekspresija EDB+ FN u H‑1975, HT29 i Ramos modelima CLX, PDX-NSX‑11122, PDX-PAX‑13565 i PDX-PAX‑12534 modelima PDX i EMT-6 modelu singenog tumora merena je vezivanjem EDB-L19 antitela i zatim detekcijom u IHC testu. CLX HT-29 je bio CLX sa umerenom ekspresijom, međutim bio je negativan kada je ispitivan in vitro usled preovlađivanja ekspresije proteina u CLX koji potiče od strome tumora.
Tabela 21. Ekspresija EDB+ FN
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX
[0241] Efekti različitih ADC procenjeni su u PDX-NSX‑11122, NSCLC PDX modelu humanog kancera koji eksprimira visoke nivoe EDB+ FN. SL. 5A pokazuje antitumorsku aktivnost za EDB-L19-vc-0101 pri 0,3, 0,75, 1,5 i 3 mg/kg. Podaci demonstriraju da je EDB-L19-vc-0101 pokazao regresiju tumora na dozno-zavisan način pri 3 mg/kg i 1,5 mg/kg.
[0242] Antitumorska efikasnost vc-povezanih ADC upoređena je sa disulfidno-povezanim ADC. SL. 5B i 5C pokazuju antitumorsku aktivnost EDB-L19-vc-0101 pri 3 mg/kg u poređenju sa 10 mg/kg disulfidno-povezanog EDB-L19-diS-DM1 i EDB-L19-vc-0101 pri 1 i 3 mg/kg u poređenju sa 5 mg/kg disulfidno-povezanog EDB-L19-diS-C2OCO‑1569, respektivno. Kao što je pokazano na SL. 5B i 5C, EDB-L19-vc‑0101 demonstrirao je veću efikasnost u poređenju sa izotipskom negativnom kontrolom ADC i ADC koji su generisani upotrebom disulfidnog linkera, EDB-L19-diS-DM1 i EDB-L19-dis-C2OCO‑1569. Dodatno, životinje koje imaju tumore koje su tretirane sa EDB-L19-vc-0101 imale su odložen rast tumora pri 1 mg/kg i potpunu regresiju pri 3 mg/kg. Podaci demonstriraju da EDB-L19-vc-0101 (ADC1) inhibira rast PDX-NSX‑11122 NSCLC ksenografta na dozno-zavisan način.
[0243] Procenjena je aktivnost specifično za mesto i konvencionalno konjugovanih ADC. SL.
5D pokazuje antitumorsku efikasnost specifično za mesto konjugovanog EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 u poređenju sa konvencionalno konjugovanim EDB-L19-vc‑0101 u dozama od 0,3, 1 i 3 mg/kg i 1,5 mg/kg, respektivno. Efikasnost zasnovana na nivou doze bila je uporediva i EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 je doveo do regresije tumora na dozno-zavisan način.
[0244] Procenjena je aktivnost vc‑0101 EDB ADC koji imaju različite mutacije. SL. 5E pokazuje antitumorsku efikasnost specifično za mesto konjugovanog EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 u dozama od 0,3, 1 i 3 mg/kg. EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 je indukovao regresiju tumora pri 1 i 3 mg/kg. SL. 5F pokazuje krive inhibicije rasta tumora za 10 pojedinačnih miševa koji imaju tumor u EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 grupi koja je dozirana pri 3 mg/kg sa SL. 5E. Regresije tumora u grupi od 3 mg/kg bile su potpune i trajne kod 8 od 10 miševa (80%) na kraju studije (95 dana).
H‑1975 NSCLC CLX
[0245] Efekti različitih vc-povezanih auristatin i CPI ADC procenjeni su u H-1975, umereno do visoko EDB+ FN eksprimirajućem NSCLC CLX modelu humanog kancera. SL. 6A pokazuje EDB-L19-vc-0101 procenjen za antitumorsku aktivnost pri 0,3, 0,75, 1,5 i 3 mg/mg. Podaci demonstriraju da je EDB-L19-vc-0101 pokazao regresiju tumora na dozno-zavisan način pri 3 mg/kg, i pri tako niskoj dozi kao što je 1,5 mg/kg. SL. 6B pokazuje da su EDB-L19-vc-0101 i EDB-L19-vc-1569 procenjeni za antitumorsku aktivnost pri 0,3, 1 i 3 mg/kg. Podaci demonstriraju da su EDB-L19-vc‑0101 i EDB-L19-vc‑1569 pokazali regresiju tumora na dozno-zavisan način.
[0246] Antitumorska aktivnost vc-povezanih auristatin ADC upoređena je sa CPI ADC. Kao što je pokazano na SL. 6C, EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(H16-K222R)‑AcLys-vc-CPI‑8314 procenjeni su pri 0,5, 1,5 i 3 mg/kg i 0,1, 0,3 i 1 mg/kg, respektivno. I EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(H16-K222R)‑AcLys-vc-CPI‑8314 pokazali su regresiju tumora pri najvišim procenjenim dozama.
[0247] Procenjena je aktivnost specifično za mesto i konvencionalno konjugovanih EDB ADC. SL. 6D pokazuje antitumorsku efikasnost specifično za mesto konjugovanog EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 u poređenju sa konvencionalno konjugovanim EDB-L19-vc-0101 pri dozama od 0,5, 1,5 mg/kg. Efikasnost zasnovana na nivou doze bila je uporediva i EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 je doveo do regresije tumora na dozno-zavisan način.
[0248] Procenjena je aktivnost vc‑0101 EDB ADC koji imaju različite mutacije. SL. 6E pokazuje antitumorsku efikasnost EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(K94R)‑vc‑0101 pri 1 i 3 mg/kg. SL. 6F pokazuje antitumorsku efikasnost specifično za mesto EDB‑(κK183C+K290C)‑vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 pri 1 i 3 mg/kg. Četiri ADC su demonstrirala sličnu efikasnost u modelu H-1975, bez obzira da li su sadržali mutacije κK183C-K290C i/ili K94R. Pored toga, svi testirani ADC su rezultirali snažnom antitumorskom efikasnošću uključujući regresiju tumora pri 3 mg/kg. Ovi podaci demonstriraju da introdukcija κK183C-K290C i/ili K94R mutacija nije negativno uticala na efikasnost ADC.
HT29 CLX kolona
[0249] Efekti različitih vc-povezanih auristatin ADC procenjeni su u HT29, umereno EDB+ FN eksprimirajućem CLX modelu humanog kancera kolona. Kao što je pokazano na SL. 7, EDB-L19-vc‑0101 i EDB-L19-vc‑9411 su testirani na antitumorsku aktivnost pri 3 mg/kg. I EDB-L19-vc‑0101 i EDB-L19-vc‑9411 pokazali su regresiju tumora pri dozi od 3 mg/kg tokom vremena.
PDX-PAX‑13565 i PDX-PAX‑12534 PDX pankreasa
[0250] Antitumorska efikasnost EDB-L19-vc-0101 procenjena je na PDX modelima pankreasa kod ljudi. Kao što je pokazano na SL.8A, EDB-L19-vc‑0101 je procenjeno pri 0,3, 1 i 3 mg/kg u PDX-PAX‑13565, umereno do visoko EDB+ FN eksprimirajućem PDX pankreasa. Kao što je pokazano na SL. 8B, EDB-L19-vc‑0101 je procenjen pri 0,3, 1 i 3 mg/kg u PDX-PAX‑12534, nisko do umereno EDB+ FN eksprimirajućem PDX pankreasa. EDB-L19-vc-0101 je demonstrirao regresiju tumora na dozno-zavisan način u oba procenjena PDX modela pankreasa.
Ramos CLX limfoma
[0251] Antitumorska efikasnost EDB-L19-vc-0101 procenjena je u Ramos, umereno EDB+ FN eksprimirajućem CLX modelu limfoma. EDB-L19-vc-0101 je procenjen za antitumorsku aktivnost pri 1 i 3 mg/kg. Kao što je pokazano na SL. 9, EDB-L19-vc-0101 pokazao je regresiju tumora pri dozi od 3 mg/kg na dozno-zavisan način.
EMT‑6 singeni model dojke
[0252] Antitumorska efikasnost EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 procenjena je u EMT‑6, mišjem singenom modelu karcinoma dojke u imunokompetentnoj pozadini. Kao što je pokazano na SL. 10A, EDB‑(,cK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 pokazao je inhibiciju rasta tumora pri 4,5 mg/kg. Inhibicija rasta tumora je prikazana u grafičkom formatu kao prosek veličine tumora kod jedanaest životinja koje imaju tumor ± SEM. SL. 10B pokazuje krive inhibicije rasta tumora za 11 pojedinačnih miševa koji imaju tumor u EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 grupi koja je dozirana pri 4,5 mg/kg. Regresije tumora u grupi od 4,5 mg/kg bile su potpune i trajne kod 9 od 11 miševa (82%) na kraju studije (34 dana).
Jajnika
[0253] Aktivnost EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ispitana je na humanim modelima PDX karcinoma jajnika i dojke koji eksprimiraju EDB+ FN. Aktivnost je uočena pri nivoima doze od 3 mg/kg i 10 mg/kg (podaci nisu pokazani).
PRIMER 9
Farmakokinetika (PK)
[0254] Izloženost konvencionalno konjugovanih EDB-L19-vc‑0101 i specifično za mesto konjugovanih EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 konjugovanih antitelo lek konjugata, određivana je posle primene intravenske (IV) bolus doze bilo od 5 ili 6 mg/kg kod cinomolgus majmuna, respektivno. Koncentracije ukupnog antitela (ukupno Ab; merenje i konjugovanih mAb i nekonjugovanih mAb), ADC (mAb koje je konjugovano sa najmanje jednim molekulom leka) izmerene su upotrebom testova vezivanja liganda (LBA) i koncentracije oslobođenog korisnog tereta 0101 izmerene su upotrebom masene spektrometrije. Kvantifikacija koncentracija ukupnih Ab i ADC postignuta je testom vezivanja liganda (LBA) upotrebom Gyrolab<®>radne stanice sa detekcijom fluorescencije. Upotrebljeni biotinilisani hvatajući protein bio je ovčiji anti-hIgG i detekciono antitelo bilo je Alexa Fluor 647 kozji anti-hIgG za ukupna antitela ili Alexa Fluor 647 anti-0101 mAb za ADC (podaci su obrađeni u Watson v 7.4 LIMS sistemu). In vivo uzorci su pripremljeni za analizu nekonjugovanog korisnog tereta upotrebom precipitacije proteina i injektirani su u AB Sciex API5500 (QTRAP) maseni spektrometar upotrebom pozitivne Turbo IonSpray elektrosprej jonizacije (ESI) i režima praćenja višestrukih reakcija (MRM). Prelazi 743,6→188,0 i 751,6→188,0 upotrebljeni su za analit i deuterisani unutrašnji standard, respektivno. Prikupljanje i obrada podataka obavljeni su pomoću Analyst softvera verzija 1.5.2 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Kanada).
[0255] Farmakokinetika ukupnog Ab, ADC i oslobođenog korisnog tereta iz EDB-L19-vc‑0101 ADC (pri 5 mg/kg) i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ADC (6 mg/kg) koji su dozirani cinomolgus majmunima pokazana je u Tabeli 22. Izloženost specifično za mesto konjugovanih EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ADC pokazala je i povećanu izloženost (~2,3X povećanje kao što je izmereno pomoću dozno normalizovane AUC) i povećanu stabilnost konjugacije u poređenju sa konvencionalnim konjugatom. Stabilnost konjugacije procenjena je i na osnovu većeg ADC/Ab odnosa (84% naspram 75%) i niže izloženosti oslobođenog korisnog tereta (dozno normalizovana AUC; 0,0058 naspram 0,0082 µg*h/ml) za specifično za mesto konjugovani EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 ADC u poređenju sa konvencionalnim EDB-L19-vc‑0101 ADC, respektivno. NA= nije primenljivo.
PRIMER 10
Procena termičke stabilnosti za EDB ADC
[0256] Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DCS) upotrebljena je za određivanje termičke stabilnosti varijanti anti-EDB antitela i odgovarajućih konvencionalno i specifično za mesto konjugovanih EDB ADC. Uzorci formulisani u PBS-CMF pH 7,2 raspoređeni su u posudu za uzorke MicroCal VP-Capillary DSC sa autosamplerom (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), ekvilibrisani tokom 5 minuta na 10 °C i zatim skenirani do 110 °C pri stopi od 100 °C na sat. Odabran je period filtriranja od 16 sekundi. Sirovi podaci su korigovani za početne vrednosti i koncentracija proteina je normalizovana. Origin Software 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) upotrebljen je za fitovanje podataka u MN2-State Model sa odgovarajućim brojem tranzicija.
[0257] Kao što je pokazano u Tabeli 23, različita anti-EDB antitela i EDB ADC, upotrebom i specifične za mesto i konvencionalne tehnologije konjugacije, procenjeni su i pokazali su povoljnu termičku stabilnost kao što je određeno prvom tranzicijom topljenja (Tm1) >65 °C. Ovi rezultati demonstriraju da su EDB-(κK183C-K94R-K290C antitelo i κK183C‑K94R-K290C-vc‑0101 ADC koji inkorporišu projektovane ostatke cisteina bili termički stabilni.
Tabela 23. Termička stabilnost varijanti EDB antitela i EDB ADC
PRIMER 11
Studije toksičnosti
[0258] Neklinički bezbednosni profil konvencionalno konjugovanog EDB-L19-vc‑0101 i specifično za mesto konjugovanog EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 okarakterisan je u istražnim studijama ponovljenih doza (Q3Wx3) na Wistar-Han pacovima i cinomolgus majmunima. Pacov i cinomolgus majmun smatrani su farmakološki relevantnim nekliničkim vrstama za procenu toksičnosti usled 100% homologije proteinske sekvence sa humanim EDB, kao i sličnog afiniteta vezivanja antitela EDB-L19 i EDB‑(,cK183C-K94R-K290C) za pacovske, ljudi i majmuna pomoću Biacore testa, kao što je demonstrirano u Primeru 2.
[0259] EDB-L19-vc‑0101 je procenjen kod Wistar Han pacova i cinomolgus majmuna do 10 i 5 mg/kg/dozi, respektivno, i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 je procenjen kod cinomolgus majmuna do 12 mg/kg/dozi. Pacovi ili majmuni su dozirani intravenski jednom svake 3 nedelje (na Dane 1, 22 i 43) i eutanazirani su na Dan 46 (3 dana nakon 3. doze). Životinje su procenjene na kliničke znake, promene u telesnoj težini, potrošnju hrane, parametre kliničke patologije, težinu organa, i makroskopske i mikroskopske opservacije. U ovim studijama nije zabeležen mortalitet ni značajne promene u kliničkom stanju životinja.
[0260] Nije bilo indikacija ciljno-zavisne toksičnosti u EDB+ FN eksprimirajućim tkivima/organima kod pacova i majmuna. Kod obe vrste, glavna toksičnost bila je reverzibilna mijelosupresija sa povezanim hematološkim promenama. Kod majmuna je uočena izražena prolazna neutropenija sa konvencionalno konjugovanim EDB-L19-vc‑0101 pri dozi od 5 mg/kg/dozi, dok su samo minimalni efekti na broj neutrofila uočeni sa specifično za mesto konjugovanim EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 pri 6 mg/kg/dozi, kao što je pokazano u Tabeli 24 i SL. 11. Tačke predstavljaju srednju vrednost i barovi greške predstavljaju ±1 standardnu devijaciju (SD) od srednje vrednosti.
[0261] Podaci demonstriraju značajno ublažavanje mijelosupresije konjugacijom specifičnom za mesto. Profil toksičnosti EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 bio je u skladu sa ciljno-nezavisnim efektima ovih konjugata i najviše ne-ozbiljno toksične doze (HNSTD) za EDB-L19-vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 određene su da iznose ≥ 5 mg/kg/dozi i ≥ 12 mg/kg/dozi, respektivno.
PRIMER 12
IO kombinacije
[0262] Kako ćelije kancera umiru, one oslobađaju antigene koje preuzimaju i prezentuju dendritske ćelije (DC). Zbog mutacija u ovim tumorskim ćelijama neki od ovih antigena uključuju neoepitope kancera koji imaju potencijal da ih zrele DC prezentuju T ćelijama, čime ih aktiviraju i indukuju antitumorsko ciljanje. Međutim, negativni regulatorni mehanizmi pojačani su kod pacijenata sa kancerom. Na primer, signalizacija preko kontrolnih tačaka kao što su PD-1/PD-L1 putevi može ograničiti prepoznavanje neoepitopa i aktivaciju T ćelija.
[0263] Korisni tereti konjugovani za antitela u ADC formatu mogu da učestvuju u uključivanju puteva maturacije dendritskih ćelija što rezultuje povećanom unakrsnom prezentacijom tumorskih antigena, što omogućava prajmovanje T ćelija i povećano ciljno delovanje T ćelija na tumor. EDB ADC iz predmetnog pronalaska, koji sadrže različite korisne terete, kao što je Korisni teret-0101, korišćeni su za poboljšanje imunskog prepoznavanja tumorskih neoantigena kreiranjem imunogenog okruženja tumora. Ova okruženja postaju osetljiva na imunoonkološke agense koji blokiraju negativne regulatorne puteve, kada se EDB ADC i imunoonkološki agens daju u kombinaciji.
[0264] Podaci iz studija efikasnosti EMT6 singenih tumora koji su tretirani sa EDB-L19-vc‑0101 sugerišu da je indukovan efektorski odgovor na Korisni teret‑0101. Povećana infiltracija CD3+ T ćelija uočena je kod tumora koji su tretirani sa EDB-L19-vc-0101 naspram vehikulum kontrole. Pored toga, uočena je povećana ekspresija PDL1 u tretiranim tumorima, što sugeriše oslobađanje IFNy usled povećanog odgovora efektorskih T ćelija.
[0265] Kombinovanje EDB ADC sa agensima koji ciljaju imunomodulatorne puteve, kao što su anti-PDL1 antagonist antitela ili anti-41BB agonist antitela, verovatno će poboljšati antitumorsku efikasnost i obezbediti trajnije odgovore.
PRIMER 13
Biomarker/Mehanizam delovanja
[0266] NSCLC PDX model PDX-NSX‑11122 razvijen je na golim miševima kao što je prethodno opisano. EDB‑(K94R)‑vc‑0101, EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101, i Negvc‑0101 ADC, primenjivani su injekcijom u repnu venu pri 3 mg/kg (4 životinje po vremenskoj tački po grupi). Na 96 sati posle jedne primene, životinje su anestezirane i izvršena je perfuzija fiziološkim rastvorom. Nakon perfuzije fiziološkim rastvorom, tumori su uklonjeni i pripremljeni za merenje antitela i ADC putem testa vezivanja liganda (LBA), ili su pripremljeni za imunohistohemiju (IHC).
Test vezivanja liganda (LBA)
[0267] Za testove LBA, 5x pufer je dodat uzorcima tumora. Reagens za ekstrakciju iz tkiva (Invitrogen) sadržao je 1% inhibitor proteaze (Sigma), (zapr./tež.) sa krajnjim razblaženjem od 6x (µg/ml homogenata→µg/g tkiva). Dodate su perle od nerđajućeg čelika i tkivo je homogenizovano upotrebom Mini-Beadbeater-96 (BioSpec). Homogenat (‑100‑ 300 µl u zavisnosti od veličine uzorka) prebačen je u odgovarajuću bočicu (Marsh tuba) i centrifugiran na 14000 rpm tokom 10 minuta (4 °C). Centrifugirani homogenat je razblažen (MRD) sa Super Block<™>za analizu u skladu sa analitičkim protokolom.
[0268] Kao što je pokazano u Tabeli 25, testovi vezivanja liganda upotrebljeni su za određivanje srednjih vrednosti koncentracija ukupnih antitela i ADC u plazmi (µg/ml), koncentracija u tumoru (µg/g) nakon primene jedne doze EDB ADC. Podaci demonstriraju da su EDB‑(K94R)‑vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 detektovani na mestu tumora u povećanim nivoima kao što je izmereno pomoću ukupnog antitela i ADC u poređenju sa Neg-vc‑0101. Štaviše, postojao je smanjeni odnos plazme prema tumoru i za ADC i za ukupno antitelo što je uočeno za EDB‑(K94R)‑vc‑0101 i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 u poređenju sa Neg-vc-0101 što ukazuje na povećanu efikasnost tumor specifičnog ciljnog delovanja ADC koji ciljno deluju na EDB.
Tabela X. Srednje vrednosti koncentracija ukupnih Ab i ADC u plazmi i tumoru u NSCLC
PDX.
Imunohistohemija (IHC)
[0269] Za imunohistohemijsku detekciju distribucije ADC i nizvodnih biomarkera odgovora, uzorci su fiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu tokom 48 sati. Posle fiksacije, uzorci su ukalupljeni u parafin i isečeni na preseke od 5 µm. Isečeni parafinski preseci su deparafinisani u zameni za ksilen i rehidratisani u opadajućim koncentracijama alkohola do destilovane vode. Antigeni su otkriveni u: 10 mM citratnom puferu pH 6,0 (Invitrogen) za detekciju fosfo-histon H3 i isečene kaspaze 3 ili Borg Decloaker puferu pH 9,5 (Biocare Medical) za detekciju anti-humanih IgG i za detekciju anti-0101 u loncu pod pritiskom (Electron Microscopy Sciences) i ohlađeni na sobnu temperaturu. Endogena peroksidaza je blokirana sa 3% vodonik peroksidom tokom 10 minuta. Nespecifične interakcije proteina blokirane su proteinskim blokom (DAKO) tokom 20 minuta. Preseci tkiva su inkubirani sa primarnim antitelom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Primarna antitela su: 0,3 µg/ml antihumano Pan IgG antitelo (Epitomics); 10 µg/ml anti-0101 Ab; 0,13 µg/ml anti-fosfo histon H3 (pHH3, Cell Signaling Technologies); 1,3 µg/ml anti-isečena kaspaza 3 (Cell Signaling Technologies). Kako bi se izbeglo miš na mišu detekcija, anti-0101 izotipska antitela su obeležena sa AlexaFluor 488 upotrebom Alexa Fluor 488 kompleta za obeležavanje proteina (Life Technologies). Neobeležena primarna antitela su detektovana sa Signalstain Boost reagensom (Cell Signaling Technologies) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. AlexaFluor 488 obeležena primarna antitela detektovana su sa 1 µg/ml zečjeg anti-AlexaFluor488 (Life Technologies) tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila inkubacija sa Signalstain Boost reagensom (Cell Signaling Technologies) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. DAB+ (3ꞌ,3ꞌ-diaminobenzidin; Dako) upotrebljen je za razvijanje boje tokom 5 minuta. Preseci su nakratko kontra-obojeni u hematoksilinu, isprani u vodi, dehidratisani u rastućim koncentracijama alkohola, prosvetljeni u zameni za ksilen, i pokrovna stakla su montirana sa Permount medijumom za montiranje.
[0270] Na 96 sati posle jedne doze, i konvencionalni EDB‑(K94R)‑vc‑0101 i specifično za mesto konjugovani EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 slično su detektovani pomoću anti-humanog IgG IHC u PDX-NSX‑11122 modelu PDX. Povećanje pHH3 pozitivnih ćelija, markera zaustavljanja mitoze, uočeno je kod tumora koji su tretirani i sa EDB‑(K94R)‑vc‑0101 i sa EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 u poređenju sa onima koji su tretirani sa ADC negativnom kontrolom (Neg-vc‑0101). Većina ćelija koje imaju pHH3 marker zaustavljanja mitoze bile su neoplastične ćelije, što ukazuje na efekat slučajnog posmatrača. Bojenje na isečenu kaspazu 3 ukazuje na povećanu apoptozu kod onih tumora koji su tretirani sa EDB‑(K94R)‑vc‑0101 (i EDB‑(κK183C-K94R-K290C)‑vc‑0101 u poređenju sa tumorima koji su tretirani sa ADC negativnom kontrolom (Neg-vc-0101).

Claims (23)

  1. Patentni zahtevi 1. Antitelo-lek konjugat naznačen time što sadrži: (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za ekstra domen B fibronektina, pri čemu antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 3, 5 i 7, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDR koji sadrže SEQ ID NO: 12, 13 i 14, pri čemu teški lanac sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 290 (K290C), u skladu sa numeracijom prema Kabat EU indeksu, i pri čemu laki lanac sadrži projektovani ostatak cisteina na poziciji 183 (κK183C), u skladu sa numeracijom prema Kabatu, (b) linker, i (c) lek.
  2. 2. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili 21, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10.
  3. 3. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 ili 25, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31.
  4. 4. Antitelo-lek konjugat u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži lizin u arginin mutaciju na poziciji 94 (K94R), u skladu sa numeracijom prema Kabatu.
  5. 5. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je linker isecivi linker.
  6. 6. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što je linker odabran iz grupe koja se sastoji od
  7. 7. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time što linker kada je konjugovan za antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, i lek sadrži sledeću strukturu:
  8. 8. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time što je lek citotoksični agens.
  9. 9. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time što je lek auristatin.
  10. 10. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je auristatin odabran iz grupe koja se sastoji od
  11. 11. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je auristatin 0101 i pri čemu auristatin konjugovan za linker sadrži sledeću strukturu:
  12. 12. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 10, vc linker i auristatin 0101.
  13. 13. Antitelo-lek konjugat u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što teški lanac sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac sadrži SEQ ID NO: 31, vc linker i auristatin 0101.
  14. 14. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili 5-11, naznačen time što sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 19 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31, vc linker i auristatin 0101.
  15. 15. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, naznačen time što su citotoksični agens, linker, i antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, povezani tako da generišu strukturu:
    pri čemu: X-S predstavlja antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je S atom sumpora najmanje jednog ostatka cisteina u antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu.
  16. 16. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, naznačen time što sadrži (a) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za ekstra domen B fibronektina, pri čemu antitelo, ili antigen-vezujući fragment, sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 31; (b) isecivi linker i (c) citotoksični lek, pri čemu su isecivi linker, citotoksični lek, i antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, povezani tako da generišu strukturu:
    pri čemu: X-S predstavlja antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, i S je atom sumpora najmanje jednog ostatka cisteina u antitelu, ili njegovom antigenvezujućem fragmentu.
  17. 17. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  18. 18. Kompozicija naznačena time što sadrži veći broj antitelo-lek konjugata prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16, i opciono farmaceutski nosač, pri čemu kompozicija ima prosečni DAR u opsegu od 3 do 5 ili od 1 do 3.
  19. 19. Nukleinska kiselina koja kodira teški lanac i laki lanac antitela, ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu ili ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor.
  20. 20. Postupak za proizvodnju antitelo-lek konjugata prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 naznačen time što sadrži: (a) povezivanje linkera sa lekom; (b) konjugovanje linkera i leka za antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, i (c) prečišćavanje antitelo-lek konjugata, opciono pri čemu je konjugovanje specifično za mesto na jednom ili više projektovanih ostataka cisteina na antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu.
  21. 21. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16 za upotrebu u lečenju EDB+ FN-eksprimirajućeg poremećaja ili bolesti kod subjekta.
  22. 22. Antitelo-lek konjugat za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 21, naznačeno time što je EDB+ FN-eksprimirajući poremećaj ili bolest kancer.
  23. 23. Antitelo-lek konjugat za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 22, naznačeno time što je kancer nesitnoćelijski kancer pluća, kancer kolona, kancer pankreasa, limfom, i kancer dojke.
RS20250049A 2016-10-17 2017-10-03 Anti-edb antitela i antitelo-lek konjugati RS66524B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662409081P 2016-10-17 2016-10-17
PCT/IB2017/056093 WO2018073680A1 (en) 2016-10-17 2017-10-03 Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates
EP17784700.1A EP3525828B1 (en) 2016-10-17 2017-10-03 Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66524B1 true RS66524B1 (sr) 2025-03-31

Family

ID=60117722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250049A RS66524B1 (sr) 2016-10-17 2017-10-03 Anti-edb antitela i antitelo-lek konjugati

Country Status (22)

Country Link
US (5) US20190269791A1 (sr)
EP (3) EP4617283A2 (sr)
JP (4) JP7039577B2 (sr)
KR (1) KR102338660B1 (sr)
CN (2) CN116251196A (sr)
AU (3) AU2017344440B2 (sr)
CA (1) CA3040423A1 (sr)
DK (1) DK3525828T3 (sr)
ES (1) ES3007557T3 (sr)
FI (1) FI3525828T3 (sr)
HR (1) HRP20250056T1 (sr)
HU (1) HUE070615T2 (sr)
IL (2) IL266112B2 (sr)
LT (1) LT3525828T (sr)
MX (2) MX2019004434A (sr)
PL (1) PL3525828T3 (sr)
PT (1) PT3525828T (sr)
RS (1) RS66524B1 (sr)
RU (1) RU2758632C2 (sr)
SG (1) SG11201903400WA (sr)
SI (1) SI3525828T1 (sr)
WO (1) WO2018073680A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3824906A1 (en) 2016-12-21 2021-05-26 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
WO2020123425A2 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
KR102614063B1 (ko) 2020-12-24 2023-12-19 대화제약 주식회사 엑스트라도메인 b 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체
CN112816453B (zh) * 2021-02-09 2022-07-08 黑龙江大学 蛋白在预测药物性能上的应用
KR20240034234A (ko) 2021-07-14 2024-03-13 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 항체로부터의 결합 도메인에 융합된 조작된 t 세포 수용체
CN119546327A (zh) 2022-04-08 2025-02-28 再生元制药公司 多部分受体和信号传导复合物
WO2025011561A1 (en) * 2023-07-10 2025-01-16 Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd. Antibody-drug conjugates and production thereof
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025208105A1 (en) * 2024-03-29 2025-10-02 Pyxis Oncology, Inc. Constructs, compositions, and methods for treating extra domain b splice variant of fibronectin-expressing diseases and disorders

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
WO1997026885A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The General Hospital Corporation Doing Business As Massachusetts General Hospital Benzophenothiazine and benzoporphyrin dye combination photodynamic therapy of tumors
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
TWI259837B (en) 1998-05-11 2006-08-11 Eidgenossische Tech Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
ATE526039T1 (de) * 2000-02-24 2011-10-15 Philogen Spa Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von angiogenese in pathologischen schädigungen
CA2400622A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US7498029B2 (en) 2001-05-01 2009-03-03 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using combination therapies
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
RU2352582C2 (ru) * 2002-01-03 2009-04-20 Шеринг Акциенгезельшафт Конъюгаты, содержащие антитело, специфическое для ed-в-домена фибронектина, и их применение для обнаружения и лечения опухолей
AU2003219370B2 (en) 2002-03-11 2009-01-15 Philogen S.P.A Antibodies derived rom anti ED-B L19 and targeting tumor vasculature
WO2004012735A2 (en) * 2002-07-31 2004-02-12 Schering Ag New effector conjugates, process for their production and their pharmaceutical use
CA2604238C (en) 2005-04-15 2015-07-07 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
ES2341126T3 (es) * 2005-05-11 2010-06-15 Philogen S.P.A. Proteina de fusion del anticuerpo l19 contra fibronectina ed-b e interleucina 12.
NZ567202A (en) 2005-10-05 2012-02-24 Commw Scient Ind Res Org Silk proteins from Hyhemonptera species containing heptad repeats that form coiled coil tertiary structures
EP1842553A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Combination of an anti-EDb fibronectin domain antibody/IL2 fusion protein and a further small molecule
JP2009535372A (ja) * 2006-05-03 2009-10-01 バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 抗ｅｄｂフィブロネクチンドメイン抗体ｌ１９−ｓｉｐ及び抗−ｅｇｆｒ−抗体の組合せ
TWI412367B (zh) * 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
EP2653478B1 (en) 2007-04-02 2016-10-05 Philogen S.p.A. A novel antigen associated with the neovasculature of tumour metastases
KR101781638B1 (ko) 2007-07-25 2017-09-25 필로겐 에스.피.에이. 종양 전이의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ｅｄ-ａ 항원
ES2382058T3 (es) * 2008-01-17 2012-06-04 Philogen S.P.A. Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos
ES2738700T3 (es) * 2009-02-13 2020-01-24 Immunomedics Inc Inmunoconjugados con un enlace escindible intracelularmente
US8679488B2 (en) 2009-08-05 2014-03-25 Philogen S.P.A. Targeting of bone marrow neovasculature
MX2012002014A (es) 2009-08-17 2012-06-13 Roche Glycart Ag Inmunoconjugados dirigidos.
EP2621535A1 (en) 2010-09-29 2013-08-07 Philogen S.p.A. Thiazolidine linker for the conjugation of drugs to antibodies
CA2813411C (en) 2010-11-05 2016-08-02 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CN104185477B (zh) 2011-11-17 2017-05-24 辉瑞公司 细胞毒性肽及其抗体‑药物缀合物
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
BR112015018899B1 (pt) * 2013-02-08 2023-09-26 Novartis Ag Imunoconjugados, composição farmacêutica, anticorpos igg modificados ou fragmentos de anticorpo modificados dos mesmos e seu método de produção, e célula hospedeira
WO2014174105A1 (en) * 2013-04-25 2014-10-30 Philochem Ag Antibody-drug conjugates
KR101871088B1 (ko) * 2014-01-27 2018-06-25 화이자 인코포레이티드 이관능성 세포독성제
GB2538023A (en) * 2014-02-03 2016-11-02 Philochem Ag Targeted drug conjugates
US11602525B2 (en) * 2014-04-25 2023-03-14 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading
TWI703160B (zh) 2015-11-30 2020-09-01 美商輝瑞股份有限公司 用於部位專一性接合之抗體和抗體片段
TWI726942B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體

Also Published As

Publication number Publication date
US20230241235A1 (en) 2023-08-03
IL266112B2 (en) 2024-07-01
US11833216B2 (en) 2023-12-05
HUE070615T2 (hu) 2025-06-28
JP2025175010A (ja) 2025-11-28
MX2024003463A (es) 2024-04-03
JP2022016581A (ja) 2022-01-21
SG11201903400WA (en) 2019-05-30
JP7383682B2 (ja) 2023-11-20
IL266112B1 (en) 2024-03-01
SI3525828T1 (sl) 2025-04-30
IL310865A (en) 2024-04-01
RU2758632C2 (ru) 2021-11-01
FI3525828T3 (fi) 2025-01-27
US20240156977A1 (en) 2024-05-16
CA3040423A1 (en) 2018-04-26
CN110087691A (zh) 2019-08-02
EP4617283A2 (en) 2025-09-17
AU2017344440A1 (en) 2019-05-02
US20240261423A1 (en) 2024-08-08
PT3525828T (pt) 2025-01-29
CN116251196A (zh) 2023-06-13
ES3007557T3 (en) 2025-03-20
EP3525828A1 (en) 2019-08-21
AU2017344440B2 (en) 2020-07-30
US20190269791A1 (en) 2019-09-05
KR102338660B1 (ko) 2021-12-10
AU2020260375B2 (en) 2023-11-30
LT3525828T (lt) 2025-02-25
EP3525828B1 (en) 2024-12-25
MX2019004434A (es) 2019-09-26
DK3525828T3 (da) 2025-02-17
RU2019111303A (ru) 2020-11-17
KR20190069493A (ko) 2019-06-19
CN110087691B (zh) 2023-02-03
WO2018073680A1 (en) 2018-04-26
US20240181071A1 (en) 2024-06-06
AU2020260375A1 (en) 2020-11-19
JP2023184697A (ja) 2023-12-28
JP2019534706A (ja) 2019-12-05
JP7039577B2 (ja) 2022-03-22
EP4635516A2 (en) 2025-10-22
PL3525828T3 (pl) 2025-03-31
BR112019007760A2 (pt) 2019-09-03
RU2019111303A3 (sr) 2020-11-17
IL266112A (en) 2019-06-30
HRP20250056T1 (hr) 2025-04-11
AU2024201216A1 (en) 2024-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7383682B2 (ja) 抗ｅｄｂ抗体および抗体－薬物コンジュゲート
JP6629837B2 (ja) 抗ｐｔｋ７抗体−薬物コンジュゲート
US12371507B2 (en) CDCP1 antibodies and antibody drug conjugates
HK40092426A (zh) 抗-edb抗体和抗体-药物缀合物
HK40012788B (en) Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates
HK40012788A (en) Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates
WO2025208105A1 (en) Constructs, compositions, and methods for treating extra domain b splice variant of fibronectin-expressing diseases and disorders
BR112019007760B1 (pt) Conjugados de anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor, processo para a produção do conjugado de anticorpofármaco e uso do conjugado de anticorpo-fármaco
BR122024006481A2 (pt) Conjugados de anticorpo-fármaco, composição farmacêutica e seus usos, processo para a produção de um conjugado de anticorpo-fármaco, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo e método para detectar domínio b extra de fibronectina