RS66083B1 - Kvasac sa niskom produkcijom diacetila - Google Patents

Kvasac sa niskom produkcijom diacetila

Info

Publication number
RS66083B1
RS66083B1 RS20241167A RSP20241167A RS66083B1 RS 66083 B1 RS66083 B1 RS 66083B1 RS 20241167 A RS20241167 A RS 20241167A RS P20241167 A RSP20241167 A RS P20241167A RS 66083 B1 RS66083 B1 RS 66083B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
yeast strain
yeast
test solution
diacetyl
ilv2
Prior art date
Application number
RS20241167A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Lengeler
Michael Katz
Jochen Förster
Ross Fennessy
Claes Gjermansen
Anna Chailyan
Original Assignee
Carlsberg As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=71409176&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66083(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Carlsberg As filed Critical Carlsberg As
Publication of RS66083B1 publication Critical patent/RS66083B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C12C12/006—Yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/86—Saccharomyces carlsbergensis ; Saccharomyces pastorianus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast proizvodnje piva i, konkretno, na oblast proizvodnje lager piva. Konkretnije, pronalazak obezbeđuje kvasac sa niskim sadržajem diacetila, što je posebno korisno za brzu i efikasnu fermentaciju tokom proizvodnje piva, naročito u proizvodnji lager piva.
Osnov pronalaska
[0002] Lager piva se često odlikuju svežim i čistim profilima ukusa. Diacetil doprinosi profilu ukusa brojnih fermentisanih proizvoda. Međutim, njegov tipičan ukus maslaca se smatra nepoželjnim ukusom u pivima lager stila i uklanjanje ovog jedinjenja ima veliki uticaj na utrošak vremena i energije u pivarama.
[0003] Lager pivo se obično priprema fermentacijom sladovine - tečnosti bogate ugljenim hidratima - pomoću lager kvasca. Lager kvasac se generalno razlikuje od ejl kvasca na nekoliko načina.Lager kvasac generalno pripada vrsti Saccharomyces pastorianus. Često se lager kvasac naziva i "kvasac za fermentaciju na dnu" jer se taloži na dnu tokom fermentacije.Taloženje ili flokulacija kvasca takođe može da utiče na vreme obrade, jer kvasac mora da se istaloži u dovoljnoj meri kako bi se sakupio za sledeću rundu vrenja.Za lager kvasce koji nisu jako flokulentni (polako se talože) ovo će zahtevati hlađenje zbog čega dovodi do dodatnog vremena obrade.Osim toga, u principu je najbolje da se sojevi lager kvasca koriste na temperaturama koje se kreću od 7 ° C do 18 ° C. Za razliku od ejl kvasca, koji generalno pripada vrsti Saccharomyces cerevisiae, lager kvasac je u stanju da koristi melibiozu kao jedini izvor ugljenika i obično ne može da raste na 37ºC.
[0004] Tokom fermentacije, diacetil se formira neenzimskom oksidacijom acetolaktata izlučenog iz ćelije kvasca, međutim tokom perioda sazrevanja, diacetil se ponovo preuzima u ćelije kvasca i metaboliše. Deo upravljanja fermentacijom se preduzima kako bi se osiguralo da gotovo pivo sadrži diacetil ispod predefinisanog praga. Problem smanjenja sadržaja diacetila u gotovom pivu posebno je izražen kod lager piva jer se fermentacija odvija na nižoj temperaturi, a to dovodi do sporijeg ponovnog preuzimanja i metabolizma diacetila od strane lagera kvasca.
[0005] Generalno se smatra da donja granica za percepciju ukusa diacetila u pivu iznosi 50 ppb diacetila, a potreba da se koncentracije diacetila u gotovom pivu smanji na ovaj nivo konvencionalno dodaje značajnu količinu dodatnog vremena potrebnog za sazrevanje lager piva, pre nego što se proces proizvodnje piva završi. JP2012217430 opisuje sojeve kvasca sa specifičnom ILV2 varijantom i nekoliko kopija ILV5 gena. Sojevi su snizili produkciju diacetila tokom fermentacije. WO2007/097089 otkriva kvasac sa poremećenim ILV2 genom, pri čemu takođe prikazuje nižu produkciju diacetila. Zhao-Yue Wang, Int. J. Food Science Technology, 2008 vol 43, (6), 989-994 prikazuje smanjenu produkciju diacetila od strane kvasca sa poremećenim ILV2 genom.
Kratak opis pronalaska
[0006] Kao što je prethodno navedeno, fermentacija sladovine konvencionalnim sojevima lager kvasca Saccharomyces pastorianus na temperaturama između 7°C i 18 °C dovodi do nivoa diacetila u sladovini, koji su znatno iznad granice percepcije ukusa od 50 ppb. Posledično, ranije je bilo potrebno nekoliko dodatnih dana sazrevanja kvasca da bi se smanjili ovi nivoi, kako bi se osiguralo da sadržaj diacetila u gotovom pivu bude ispod predefinisanog praga.
[0007] Zanimljivo je da predmetni pronalazak obezbeđuje nove hibridne varijante sojeva kvasca Saccharomyces pastorianus koji proizvode niske nivoe diacetila i/ili brzo konzumiraju pomenuti diacetil tokom fermentacije na 18 °C ili na nižim temperaturama, tako da, posledično, pivo proizvedeno pomoću ovih sojeva zahteva vrlo malo vremena za sazrevanje.Konkretno, kada se sladovina fermentiše sa sojevima kvasca prema pronalasku, ukupni nivo diacetila je ≤60ppb, poželjno ≤50ppb, u trenutku kada je fermentacija šećera završena, tj. u trenutku tokom fermentacije kada je nivo šećera više ili manje stabilan.Generalno, sa aktuelnim lager sojevima je uočeno smanjenje vremena fermentacije za najmanje 1 dan ili najmanje 2 dana.
[0008] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju napitaka koji zahtevaju vrlo malo vremena za sazrevanje piva nakon fermentacije na 18 °C ili nižim temperaturama, pomoću sojeva kvasca S. pastorianus, a koji imaju prijatan ukus.
[0009] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju fermentisanog vodenog ekstrakta, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:
i) obezbeđivanja vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog fermentisanog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od 18 °C, ili nižoj, poželjeno između 12 i 16 °C; i
iii) fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca iz koraka ii), čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt.
[0010] Kako se ovde koristi, termin "vodeni ekstrakt" se koristi za označavanje vodenog ekstrakta slada i/ili zrna žitarica, kao što je sladovina, koji se koristi za pravljenje napitka, npr. piva, dok se termin "test rastvor" koristi za označavanje rastvora sa strože definisanim sastavom koji se koristi za procenu svojstava mikroorganizma koji se koristi za fermentaciju.
[0011] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju napitka, koji obuhvata korake:
i. obezbeđivanja vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii. obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii. fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca, čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt.
iv. prerade navedenog fermentisanog vodenog ekstrakta u napitak.
[0012] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju napitka, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:
i. obezbeđivanja vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii. obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii. fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca, čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt; i
iv. prerade pomenutog fermentisanog vodenog ekstrakta u napitak, pri čemu koraci prerade obuhvataju jedno ili više od sledećeg:
1. Filtracija,
2. Karbonacija,
3. Sazrevanje, ili
4. Flaširanje
[0013] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje soj kvasca, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato i pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije navedenog soja kvasca u navedenom ekstraktu. Opis crteža
[0014]
SL. 1 prikazuje nivoe diacetila i °Plato u sladovini inkubiranoj sa hibridnim sojem kvasca ZDA1 i kontrolnim sojem kvasca Hibridni kvasac 7 iz ispitivanja na 50 L pri (A) 16 °C i (B) 18 °C. Slika 1 C je isti grafikon kao na slici 1B, ali samo sa sojem ZDA1 i različitom osom za ukupan diacetil18 °C. Rezultati su opisani u primeru 1.
SL. 2 prikazuje nivoe diacetila u sladovini inkubiranoj sa hibridnim sojevima kvasca ZDA1 i kontrolnim sojem kvasca Hibridni kvasac 7 iz ispitivanja na 10 HL pri 16 ° (slika 2A). °Plato je dodatno prikazan za hibridni soj kvasca ZDA1 (slika 2B). Rezultati su opisani u primeru 4. SL. 3 prikazuje odnos između propanola po izobutanolu u devet različitih komercijalnih piva u poređenju sa pivom koje je pripremljeno sa sojem kvasca ZDA2 (89-84393 ZDA F1) prema predmetnom pronalasku. Sva piva su blizu 5% ABV.
SL. 4 A-F: prikazuju poravnanje ILV2 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub (Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2. SL. 5 A-C: prikazuju poravnanje ILV6 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub(Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2.
SL. 6 A-E: prikazuju poravnanje ILV3 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub (Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2. SL. 7 A-D: prikazuju poravnanje ILV5 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub (Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2. SL. 8 A-E: prikazuju poravnanje BAT1 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub (Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2. SL. 9 A-D: prikazuju poravnanje BAT2 proteinskih sekvenci WS34-78, cer (Saccharomyces cerevisiae), eub (Saccharomyces eubayanus), Hybrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2. Sl. 10: prikazuje °Plato i nivoe diacetila sladovine inkubirane sa sojem kvasca ZDA2 i kontrolnim sojem kvasca Hibridni kvasac 7 iz ispitivanja na komercijalnoj količini pri 16 ° C. Rezultati su opisani u primeru 8.
Detaljan opis
Definicije
[0015] Kako se ovde koriste, imenice u jednini mogu da se odnose na jedno ili više, u zavisnosti od konteksta u kome se koriste.
[0016] Kako se ovde koristi, termin "približno", kako se ovde koristi, označava ±10%, poželjno ±5%, poželjnije ±2%.
[0017] Termin "pivo", kako se ovde koristi, odnosi se na napitak pripremljen fermentacijom sladovine. Poželjno, navedena fermentacija se obavlja pomoću kvasca.
[0018] Termin "zeleno pivo", kako se ovde koristi, odnosi se na rastvor koji se direktno dobija nakon fermentacije sladovine, poželjno pomoću kvasca. Tako se "zeleno pivo" dobija pre lagerovanja. Drugim rečima, zeleno pivo je rastvor koji se dobija odmah nakon što je fermentacija šećera završena. Uopšteno govoreći, pivo se više ne smatra "zelenim" kada dostigne punu zrelost ukusa i arome.
[0019] Termin "diacetil", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje formule:
[0020] Koncentracija diacetila u uzorku može da se meri gasnom hromatografijom prema metodi EBC 9.24.2 Evropske konvencije o pivarstvu, koja uključuje period inkubacije uzoraka na 60 °C tokom 90 minuta kako bi se odredio ukupni diacetil, koji će odražavati ukupan zbir prekursora acetolaktata i slobodnog diacetila.U celoj predmetnoj prijavi, kada se opisuje diacetil produkovan pomoću predmetnih sojeva kvasca, termin "diacetil" se odnosi na "ukupni diacetil", osim ako nije drugačije naznačeno.Koncentracija diacetila u uzorku se stoga odnosi na ukupnu koncentraciju diacetila, tj. na ukupni zbir prekursora acetolaktata i slobodnog diacetila.
[0021] Termin "žitarice" ,kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju biljku iz porodice trave koja daje jestivo zrno, kao što su pšenica, proso, pirinač, ječam, ovas, raž, tritikale, sirak i kukuruz.
[0022] Termin "zrno", kako se ovde koristi, odnosi se na seme žitarica koje sadrži kariopsis žitarica, a takođe se označava i kao unutrašnje seme. Pored toga, zrno može da sadrži lemu i plevicu. Kod većine sorti ječma, lema i plevica su priljubljene uz kariopsis i deo su zrna nakon vršidbe. Međutim, javljaju se i gole sorte ječma. Kod njih kariopsis nema lemu i plevice i vršidbom se dobija slobodno zrno, kao kod pšenice. Termini "zrno" i "jezgro" se ovde naizmenično koriste.
[0023] Pod terminom "sladovina" podrazumeva se tečni ekstrakt slada i/ili zrna žitarica i opciono još neki dodaci. Sladovina se u principu dobija gnječenjem, koje je opciono praćeno "ukomljavanjem", u procesu ekstrakcije zaostalih šećera i drugih jedinjenja iz otpadnih zrna, nakon gnječenja sa toplom vodom. Ukomljavanje se obično izvodi u komovnjaku, bistreniku ili nekom drugom aparatu koji omogućava odvajanje ekstrahovane vode od otpadnih zrna. Sladovina dobijena nakon gnječenja se generalno naziva "prva sladovina", dok se sladovina dobijena nakon ukomljavanja generalno naziva "druga sladovina". Ako nije naveden, izraz sladovina može da bude prva sladovina, druga sladovina ili kombinacija obe. Tokom konvencionalne proizvodnje piva, sladovina se kuva zajedno sa hmeljem. Sladovina bez hmelja takođe može da se označava kao "slatka sladovina", dok sladovina kuvana sa hmeljem može da se označava kao "kuvana sladovina" ili jednostavno kao sladovina.
[0024] Termin "vodeni ekstrakt", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji vodeni ekstrakt slada i/ili zrna žitarica. Stoga njegov neograničavajući primer može da bude sladovina sa određenom količinom šećera koji mogu da se fermentišu.
[0025] Termin "fermentisani vodeni ekstrakt", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji vodeni ekstrakt inkubiran sa mikroorganizmom, kao što je soj kvasca, gde je fermentacija šećera završena. Smatra se da je fermentacija šećera završena u vremnskoj tački tokom fermentacije, kada nivo šećera, meren °Plato, više nije značajno smanjen. Poželjno, fermentacija šećera može da se smatra završenom, kada se nivo šećera nije promenio za više od 0,5 °Plato tokom perioda od 24 sata, ili kada se nivo šećera nije promenio za više od 0,25 °Plato tokom perioda od 12 sati. Fermentisani vodeni ekstrakt može, na primer, da bude ekstrakt na bazi fermentisanog slada i/ili žitarica.
[0026] Termin "test rastvor", kako se ovde koristi, odnosi se na sve vodene tečnosti ili rastvore. Test rastvor može da sadrži predefinisane nivoe specifičnih jedinjenja. Tako njegovi neograničavajući primeri mogu da budu sladovina sa specifičnim sadržajem šećera.
[0027] Termin "fermentisani test rastvor", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji test rastvor inkubiran sa mikroorganizmom, kao što je soj kvasca, gde je fermentacija šećera završena.
[0028] Termin "°Plato" , kako se ovde koristi, odnosi se na gustinu izmerenu na Plato skali. Plato skala je empirijski izvedena hidrometarska skala za merenje gustine piva ili sladovine u smislu procenta ekstrakta po težini. Skala izražava gustinu kao u gramima ekstrakta na 100 g sladovine. Plato, na primer, može da se meri pomoću instrumenta Alkolyzer ili ručnog uređaja kompanije Anton Paar.
[0029] "Prividni ekstrakt" , kako se ovde koristi, odnosi se na gustinu datog piva ili sladovine izmerenu u °Plato. Kako je gustina primarno određena sadržajem šećera, prividni ekstrakt je pokazatelj sadržaja šećera u rastvoru ili ekstraktu. Prividni ekstrakt rastvora može da se meri npr. ručnim Anton-PAAR serijskim brojem DM.
[0030] Termin "alkohol po zapremini (ABV)", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu alkohola (etanola) u datoj zapremini alkoholnog napitka (izraženo kao procenat zapremine). Definiše se kao broj mililitara čistog etanola koji je prisutan u 100 mL rastvora na 20 °C. ABV može da se meri pomoću instrumenta Alcolyzer.
[0031] Termin "RDF" ili "stvarni stepen fermentacije", kako se ovde koristi, odnosi se na stepen do kojeg je šećer u sladovini fermentisan u alkohol u pivu, što je označeno i kao atenuacija. RDF izražava procenat ekstrakta koji je fermentisan. RDF između 50 i 60% predstavljaju piva sa preko 40% originalnog ekstrakta koji je ostao nefermentisan, dok RDF iznad 80% predstavljaju visoko atenuirana piva kod kojih je manje od 20% originalnog ekstrakta nefermentisano. Osećaj u ustima je u velikoj meri određen procentom RDF; što je veći procenat RDF, pivo je lakše i suvlje.
[0032] Termin "flokulacija", kako se ovde koristi, odnosi se na proces koji dovodi do toga da se fine čestice, kao što su ćelije kvasca, međusobno slepljuju u flok.Flok zatim može da pluta na vrhu tečnosti (krem), da se taloži na dnu tečnosti (sedimentacija) ili da se lako filtrira iz tečnosti.Stručnjaci za kvasac i pivari često kategorišu ponašanje kvasca pri flokulaciji kao "visoko", "srednje" ili "nisko" prema stepenu flokulacije koji uočen za soj kvasca tokom procesa fermentacije.Visoko flokulentni sojevi mogu da proizvedu svetlije pivo sa manje suspendovanog kvasca, što olakšava filtraciju.Flokulacija može da se poveća na nižim temperaturama, tako da za niske flokulentne kvasce može da bude potreban dodatni korak hlađenja nakon završetka fermentacije.Visokoflokulentni kvasci stoga imaju mogućnost skraćenog vremena obrade u odnosu na niskoflokulentne kvasce, jer nije potrebno hlađenje da bi se postiglo svetlije pivo i pivo koje se lako filtrira.Flokulacija se, na primer, može odrediti brojanjem ćelija kvasca u rastvoru nakon fermentacije, npr. brojanjem ćelija kvasca u uzorku uzetom iz gornje 3⁄4 posude koji sadrži fermentisani vodeni ekstrakt ili test rastvor.
[0033] Termin "fermentacija", kako se ovde koristi, odnosi se na inkubaciju vodenog ekstrakta ili test rastvora sa mikroorganizmom, kao što je soj kvasca.
[0034] Termin "slad" , kako se ovde koristi, odnosi se na zrna žitarica, koja su bila slađena. Termin "zeleni slad" odnosi se na proklijala zrna žitarica, koja nisu bila podvrgnuta koraku sušenja u peći. U nekim primerima izvođenja zeleni slad je mleveni zeleni slad. Termin "sušeni slad", kako se ovde koristi, odnosi se na proklijala zrna žitarica, koja su osušena sušenjem u peći. U nekim primerima izvođenja, slad sušen u peći je mleveni slad sušen u peći. Generalno, navedena zrna žitarica je izloženo klijanju pod kontrolisanim uslovima okoline.
[0035] Termin "izvor ugljenika", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji organski molekul, koji može da obezbedi energiju za kvasac i obezbedi ugljenik za ćelijsku biosintezu. Konkretno, navedeni izvor ugljenika mogu da budu ugljeni hidrati, i poželjnije, izvor ugljenika mogu da budu monosaharidi, disaharidi, trisaharidi, tetrasaharidi i/ili kratki oligosaharidi. Izvori ugljenika koji mogu biti fermentisani kvascem se često nazivaju fermentisanim šećerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na glukozu, fruktozu, maltozu, maltotriozu i saharozu.
[0036] Amino kiseline se ovde mogu imenovati koristeći IUPAC kodove od jednog i tri slova. Ako nije drugačije naznačeno, termin "amino kiselina" odnosi se na standardne amino kiseline.
[0037] Termin "funkcionalni gen", kako se ovde koristi, odnosi se na gen koji, kada se transkribuje i translatira, eksprimira protein sa najmanje 80%, recimo, najmanje 85%, recimo, najmanje 90%, recimo, najmanje 95%, recimo, najmanje 99%, recimo, 100% identičnost sekvence proteina kodiranog odgovarajućim genom soja divljeg tipa u kojem je gen endogen. Protein eksprimiran funkcionalnim genom mora biti funkcionalni homolog proteina kodiranog odgovarajućim genom soja divljeg tipa gde je gen endogen, tj. mora imati isti tip enzimske aktivnosti i navedena aktivnost mora biti na sličnom nivou sa proteinom kodiranim odgovarajućim genom soja divljeg tipa gde je gen endogen. Konkretno, termin "funkcionalni gen" ne obuhvata gene koji kodiraju skraćene proteinske proizvode sa malo ili nimalo enzimske aktivnosti. Poželjno je da se termin "gen", kako se ovde koristi, odnosi na funkcionalan gen.
[0038] Termin "broj funkcionalnih kopija" , kako se ovde koristi, odnosi se na ukupan broj funkcionalnih gena unutar soja kvasca. U ovom tekstu se "broj funkcionalnih kopija" naizmenično koristi sa "aktivnim brojem kopije".
[0039] Termin "funkcionalni homolog" , kako se ovde koristi, označava polipeptid koji deli najmanje jednu biološku funkciju sa referentnim polipeptidom.Generalno, pomenuti funkcionalni homolog takođe deli značajan identičnost sekvence sa referentnim polipeptidom.Poželjno je da je funkcionalni homolog referentnog polipeptida polipeptid, koji ima istu biološku funkciju kao referentni protein i koji deli visok nivo identičnosti sekvence sa referentnim polipeptidom.
[0040] Termin "nativni promoter" , kako se ovde koristi, odnosi se na promotora čija nukleotidna sekvenca ima najmanje 80%, recimo, najmanje 85%, recimo, najmanje 90% recimo, najmanje 95", recimo, najmanje 99%, recimo, 100% identičnost sekvence promotora soja divljeg tipa u kojem je gen endogen. Gen eksprimiran pod svojim nativnim promotorom se stoga obično eksprimira na endogenim nivoima.
[0041] Termin "identičnost sekvence" , kako se ovde koristi, opisuje povezanost između dve sekvence aminokiselina ili između dve nukleotidne sekvence, tj. sekvence kandidata (npr. sekvenca mutanata) i referentne sekvence (kao što je sekvenca divljeg tipa) na osnovu njihovog poravnanja po parovima.Za potrebe ovog pronalaska, identičnost sekvence između dve sekvence aminokiselina je određen korišćenjem Nidlman-Vunš algoritma (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mo/.Biol.48: 443-453), onako kako je implementiran u Nidl programu paketa EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), poželjno verzija 5.0.0 ili novija (dostupno na https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).Korišćeni parametri su kazna za otvoreni razmak od 10, kazna za proširenje razmaka od 0,5 i EBLOSUM62 (EMBOSS verzija programa 30 BLOSUM62) supstituciona matrica.Izlaz Nidle programa sa oznakom "najduža identičnost" (dobijen korišćenjem opcije -nobrief) se koristi kao procenat identičnosti i izračunava se na sledeći način: (Identični ostaci x 100)/(dužina poravnanja - ukupan broj praznina u poravnanju). Nidlman-Vunš algoritam se takođe koristi za određivanje da li data aminokiselina u nizu koja nije referentna odgovara datoj poziciji referentne sekvence.Za potrebe ovog pronalaska, identičnost sekvence između dve nukleotidne sekvence određuje se pomoću Nidlman-Vunš algoritma (Needleman and Wunsch, 1970, supra), kako je implementiran u programu Nidle paketa EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular BiologyOpen Softvare Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 ), poželjno verzija 5.0.0 ili novija. Korišćeni parametri su otvorena kazna od 10, kazna za proširenje razmaka od 0,5 i DNAFULL (EMBOSS verzija NCBI NUC4.4) supstituciona matrica. Izlaz Nidle programa sa oznakom "najduža identičnost" (dobijen korišćenjem opcije -nobrief) se koristi kao procenat identičnosti i izračunava se na sledeći način: (identični deoksiribonukleotidi x 100)/(dužina poravnanja - ukupan broj praznina u poravnanju).identičnost sekvence se uvek meri u poređenju sa referentnom sekvencom pune dužine, tj. skraćeni proteini bez praznina ili neusklađenosti se ne smatraju 100% sekvencom identičnom referentnoj sekvenci.
[0042] Termin "mutacije" , kako se ovde koristi, uključuje insercije, delecije, supstitucije, transverzije i tačkaste mutacija u kodirajućim i nekodirajućim regionima gena.Tačkaste mutacije se mogu odnositi na promene jednog baznog para, i mogu rezultirati preuranjenim stop kodonima, mutacijama promene okvira, mutacijama mesta splajsovanja ili aminokiselinskim supstitucijama.Gen koji sadrži mutaciju se može nazvati "mutantnim genom".Ako pomenuti mutantni gen kodira polipeptid sa sekvencom različitom od divljeg tipa, pomenuti polipeptid se može nazvati "mutantnim polipeptidom" i/ili "mutantnim proteinom".Mutantni polipeptid se može opisati kao nosilac mutacije, kada sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od sekvence divljeg tipa.
1
[0043] Termin "delecije", kako se ovde koristi, može da bude delecija celog gena, ili samo dela gena, ili dela hromozoma.
[0044] Termin "stop kodon" , kako se ovde koristi, odnosi se na nukleotidnu trojku u genetskom kodu, koja u okviru iRNK rezultira prekidom translacije. Termin "stop kodon", kako se ovde koristi, se takođe odnosi na nukleotidni triplet unutar gena koji kodira stop kodon u iRNK. Stop kodon u DNK obično ima jednu od sledećih sekvenci: TAG, TAA ili TGA.
[0045] Termin "rast" , kako se ovde koristi, u odnosu na kvasac, odnosi se na proces kojim se ćelije kvasca množe. Tako, kada ćelije kvasca rastu, broj ćelija kvasca se povećava. Broj ćelija kvasca može se odrediti bilo kojom korisnom metodom.
[0046] Termin "u stanju da koristi", kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost kvasca da koristi specifično jedinjenje kao izvor ugljenika i/ili azota za ćelijsku biosintezu.
Soj kvasca
[0047] Sadašnja obelodanjivanja se odnose na soj kvasca, kao što je soj kvasca Saccharomyces pastorianus, koji iznenađujuće proizvodi niske nivoe ukupnog diacetila i/ili brzo konzumira diacetil tokom fermentacije na 18 °C ili nižoj, kada se inkubira u ekstrakt slada i/ili žitarica koji imaju prividan ekstrakt od najmanje 10 ° Plato.
[0048] Različite vrste kvasca se koriste za proizvodnju piva, od kojih su najznačajnije Saccharomyces pastorianus i Saccharomyces cerevisiae. Lager pivo se tipično fermentiše korišćenjem kvasca vrste Saccharomyces pastorianus. Tako, Saccharomyces pastorianus prema pronalasku može, na primer, biti bilo koji kvasac koristan za proizvodnju lager piva.Konkretno, Saccharomyces pastorianus može da bude donji fermentišući soj kvasca. Poželjno je da je Saccharomyces pastorianus hibrid između S . cerevisiae i S . eubayanus. Takođe je poželjno da je navedeni Saccharomyces pastorianus u stanju da koristi maltozu i melibiozu.Tako, poželjno Saccharomyces pastorianus je soj kvasca, koji je hibrid između S . cerevisiae i S. eubayanus. Takođe je poželjno da je navedeni Saccharomyces pastorianus u stanju da koristi maltozu i melibiozu.
[0049] U jednom aspektu, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri čemu je navedeni test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividni ekstrakt od najmanje 10° Plato, i pri čemu navedeni fermentisani test rastvor or sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije navedenog soja kvasca u navedenom ekstraktu, pri lemu se navedena fermentacije odvija na temperaturi od najviše 18 °C
[0050] Dakle, soj kvasca Saccharomyces pastorianus prema pronalasku je poželjno u stanju da proizvede fermentisani test rastvor, kada se testira u postupku koji obuhvata korake:
a) obezbeđivanja test rastvora, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato,
b) inkubiranja navedenog soja kvasca Saccharomyces pastorianus sa navedenim test rastvorom na temperaturi od 18°C ili manje, poželjno između 12 i 18°C, poželjno na 16 ° C,
c) određivanja najranije vremenske tačke u kojoj se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata tokom navedene inkubacije, i
d) određivanja nivoa diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački,
pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
[0051] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, gde test rastvor može da bude bilo koji od test rastvora opisanih prethodno u tekstu, poželjno, test rastvor je ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10 ° Plato", i gde fermentisani test rastvor sadrži maksimalni nivo diacetila kao što je opisano u nastavku teksta, u najranijem vremenskom trenutku u kome prividni ekstrakt pomenutog test rastvora nije smanjen za više od 0,50 ° Plato, recimo, nije smanjen za više od 0.30° Plato, recimo, nije smanjen za više od 0,20° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u pomenutom test rastvoru gde se navedena fermentacija odvija na temperaturi kako je navedeno u nastavku. Konkretno, prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata.
[0052] Navedeni maksimalni nivo diacetila je poželjno na najviše 60 ppb, kao što je na najviše 55 ppb diacetil, kao što je na najviše 50 ppb diacetil, na primer na najviše 45 ppb diacetil u najranijoj vremenskoj tački gde prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od pomenutog ° Plato. Konkretno, pomenuti nivo diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački može da bude najviše 45 ppb.
[0053] Kada se identifikuju svojstva kvasca, kao što je gore opisano, inkubacija se poželjno izvodi na temperaturi od najviše 18 °C, na primer na temperaturi od 12°C do 18 °C ili u opsegu od 14 do 16°C. Konkretno, navedena inkubacija se može izvesti na temperaturi od oko 16 ° C.
[0054] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato i pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,25° Plato u prethodnih 12 sati nakon inkubacije navedenog soja kvasca u navedenom ekstraktu, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C.
[0055] Dakle, soj kvasca Saccharomyces pastorianus prema pronalasku je poželjno u stanju da proizvede fermentisani test rastvor, kada se testira u postupku koji obuhvata korake:
a) obezbeđivanje test rastvora, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koje imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato,
b) inkubiranje pomenutog Saccharomyces pastorianus soja kvasca sa pomenutim test rastvorom na temperaturi od najviše 18°,
c) određivanje najranije vremenske tačke u kojoj se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,25° Plato u prethodnih 12 sati tokom navedene inkubacije, i
d) određivanje nivoa diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački,
pri čemu pomenuti test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
[0056] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, gde test rastvor može da bude bilo koji od test rastvora opisanih u nastavku teksta, i pri čemu fermentisani test rastvor sadrži maksimalni nivo diacetila kao što je opisano u nastavku teksta, u najranijem vremenskom trenutku u kome prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,25 ° Plato, recimo nije smanjen za više od 0,20° Plato, recimo nije smanjen za više od 0,15° Plato, recimo nije smanjen za više od 0,10° Plato, u prethodna 24 sata nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u pomenutom test rastvoru gde se navedena fermentacija odvija na temperaturi koja je navedena u nastavku teksta. Konkretno, prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,25 ° Plato u prethodnih 12 sati.
[0057] Navedeni maksimalni nivo diacetila je poželjno na najviše 60 ppb, kao što je na najviše 55 ppb diacetil, kao što je na najviše 50 ppb diacetil, na primer na najviše 45 ppb diacetil u najranijoj vremenskoj tački gde prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od pomenutog ° Plato. Konkretno, pomenuti maksimalni nivo diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački može da bude 50 ppb.
[0058] Gore navedena inkubacija se poželjno izvodi na temperaturi od najviše 18 °C, na primer na temperaturi od 12°C do 18 °C. Konkretno, navedena inkubacija se može izvesti na
1
temperaturi od oko 16 ° C.
[0059] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvodi fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, na primer najviše 60 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u naredna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C.
[0060] Dakle, soj kvasca Saccharomyces pastorianus prema pronalasku je poželjno u stanju da proizvede fermentisani test rastvor, kada se testira metodom koja se sastoji od koraka:
a) obezbeđivanje test rastvora, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koje imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato,
b) inkubiranje pomenutog Saccharomyces pastorianus soja kvasca sa pomenutim test rastvorom na temperaturi od najviše 18 °,
c) određivanje najranije vremenske tačke u kojoj se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,50° Platona u prethodna 24 sata tokom navedene inkubacije, i
d) određivanje nivoa diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački,
pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, na primer, najviše 60 ppb diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački.
[0061] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u test rastvoru, gde test rastvor može da bude bilo koji od dole opisanih test rastvora, poželjno je da je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10 ° Plato", i gde fermentisani test rastvor sadrži maksimalni nivo diacetila kao što je opisano u najranijem vremenskom trenutku gde prividni ekstrakt pomenutog test rastvora nije smanjen za više od 0,50 ° Plato, kao što nije smanjeno za više od 0.30° Plato, kao što se nije smanjilo za više od 0.20° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u pomenutom test rastvoru gde se navedena fermentacija odvija na temperaturi kako je navedeno u nastavku.Konkretno, prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata.
[0062] Navedeni maksimalni nivo diacetila je poželjno najviše 120 ppb diacetila, recimo, najviše 115 ppb diacetila, na primer, najviše 110 ppb diacetila, recimo najviše 60 ppb diacetila u najranijoj vremenskoj tački gde prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od pomenutog ° Plato. Konkretno, pomenuti maksimalni nivo diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački može da bude 110 ppb.Konkretno, pomenuti maksimalni nivo diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački može da bude 55 ppb.
[0063] Gore navedena inkubacija se poželjno izvodi na temperaturi od najviše 18 °C, na primer na temperaturi od 12°C do 18 °C. Konkretno, navedena inkubacija se može izvesti na temperaturi od oko 16 ° C.
[0064] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomices pastorianus je sposoban da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, poželjno najviše 65 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,25° Plato u narednih 12 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C.
[0065] Stoga, Saccharomyces pastorianus soj kvasca prema pronalasku je poželjno u stanju da proizvede fermentisani test rastvor, kada se testira metodom koja se sastoji od koraka:
a) obezbeđivanje test rastvora, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koje imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Platona,
b) inkubiranje pomenutog Saccharomyces pastorianus soja kvasca sa pomenutim test rastvorom na temperaturi od najviše 18 °,
c) određivanje najranije vremenske tačke u kojoj se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,50° Platona u prethodna 24 sata tokom navedene inkubacije, i
d) određivanje nivoa diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački,
Pri čemu pomenuti test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački.
[0066] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u test rastvoru, gde test rastvor može da bude bilo koji od dole opisanih test rastvora, poželjno je da je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10 ° Plato", i gde fermentisani test rastvor sadrži maksimalni nivo diacetila kao što je opisano u najranijem vremenskom trenutku gde prividni ekstrakt pomenutog test rastvora nije smanjen za više od 0,50 ° Plato, kao što nije smanjeno za više od 0 .30° Plato, kao što se nije smanjilo za više od 0.20° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca u pomenutom test rastvoru gde se navedena fermentacija odvija na temperaturi kako je navedeno u
1
nastavku.Konkretno, prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50 ° Plato u prethodna 24 sata.
[0067] Navedeni maksimalni nivo diacetila je poželjno na najviše 60 ppb, kao što je na najviše 55 ppb diacetil, kao što je na najviše 50 ppb diacetil, na primer na najviše 45 ppb diacetil u najranijoj vremenskoj tački gde prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od pomenutog ° Plato.Konkretno, pomenuti maksimalni nivo diacetila u pomenutoj najranijoj vremenskoj tački može da bude 110 ppb, kao što je najviše 55 ppb diacetil.
[0068] Gore navedena inkubacija se poželjno izvodi na temperaturi od najviše 18 °C, na primer na temperaturi od 12°C do 18 °C. Konkretno, navedena inkubacija se može izvesti na temperaturi od oko 16 ° C.
[0069] U nekim primerima izvođenja soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10 ° Plato, i gde pomenuti test rastvor sadrži najviše 265 ppb diacetil u bilo kom trenutku u roku od 5 dana nakon početka inkubacije kvascem, pri čemu se inkubacija vrši na temperaturi od najviše 18 ° C i gde se u opsegu od 7 do 15 miliona vijabilnih ćelija kvasca / ml dodaju pomenutom test rastvoru.
[0070] U nekim primerima izvođenja soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, i gde navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije navedenim sojem kvasca najviše 6 dana.Konkretno, navedeni fermentisani test rastvor može sadržati najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca najviše 5 dana.Konkretno, navedeni fermentisani test rastvor može sadržati najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca najviše 4 dana.
[0071] U nekim primerima izvođenja soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, i gde navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca najviše 5 dana na temperaturi od najviše 16 °C. Konkretno, navedeni fermentisani test rastvor može sadržati najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije sa navedenim sojem kvasca najviše 4 dana na temperaturi od najviše 16 °C.
[0072] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri
1
čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, i gde je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede najmanje 4,0 mL/L etanola po °Plato, kada se navedeni soj kvasca inkubira u navedenom test rastvoru.
[0073] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10 ° Plato, i gde je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede najmanje 4,0 mL / L etanola po °Plato, kada se navedeni soj kvasca inkubira u pomenutom test rastvoru tokom opsega od 4 do 6 dana. Konkretno, navedeni soj kvasca može da se inkubira u navedenom test rastvoru tokom približno 4 dana.
[0074] U veoma poželjnom primeru izvođenja, soj kvasca je soj kvasca koji je u stanju da:
- proizvodnju fermentisanog test rastvora nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila u najranijem trenutku kada se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata;
- proizvodnju fermentisanog test rastvora nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijem trenutku kada se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,25° Plato u prethodnih 12 sati;
- proizvodnju fermentisanog test rastvora nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, recimo najviše 60 ppb diacetila, u najranijem trenutku kada se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,50° Plato u naredna 24 sata; i
- proizvodnju fermentisanog test rastvora nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, recimo najviše 60 ppb diacetila, u najranijem trenutku kada se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,25° Plato u narednih 12 sati;
pri čemu se fermentacija odvija kao što je opisano ovde u primeru 6.
[0075] U nekim primerima izvođenja soj kvasca ima visoku flokulaciju. Flokulacija se, na primer, može odrediti kao ćelije u suspenziji nakon fermentacije. "Ćelije u suspenziji" se
1
generalno određuje brojanjem ćelija kvasca u uzorku uzetom iz gornje 3⁄4, na primer iz gornje 2/3, recimo, iz gornje polovine posude koja sadrži fermentisani test rastvor. Ako se fermentacija vrši u konusnom cilindričnom rezervoaru, navedeni uzorak se poželjno uzima iznad konusa. Mali broj ćelija u rastvoru nakon fermentacije ukazuje na visoku flokulaciju.
[0076] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru, gde je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica koji ima prividan ekstrakt od najmanje 10 ° Plato, i gde pomenuti test rastvor sadrži najviše 10 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,5 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,0 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 8,0 miliona ćelija po mililitru rastvora vremenska tačka u kojoj se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,50 ° Plato u prethodna 24 sata.
[0077] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus je u stanju da raste na medijima sa melibiozom kao jedinim izvorom ugljenika.
[0078] U poželjnim oblicima, soj kvasca kao što je ovde navedeno je ne-GMO organizam. Tako, u poželjnim primerima izvođenja, navedeni soj kvasca nije prošao korak genetskog inženjeringa.
Test rastvor
[0079] U nekim primerima izvođenja, test rastvor je sladovina koji ima prividan ekstrakt od približno 16° Plato. U nekim primerima izvođenja, test rastvor sadrži najmanje 40 g/kg maltoze.
[0080] Test rastvor je generalno ekstrakt slada i/ili žitarica koje imaju prividan ekstrakt od najmanje 10° Plato. Stoga test rastvor može naročito da bude sladovina. Test rastvor može da ima očigledan ekstrakt u opsegu od 12 do 18 °Plato i, poželjnije, prividan ekstrakt od pribl.16 ° Plato. test rastvor može dalje da sadrži u opsegu od 0,20 mg/L do 0,40 mg/L cinka i pH se može prilagoditi u opsegu od 4,0 do 6,0.
[0081] Jedan primer testnog rastvora čine glukoza u opsegu od 12-25 g/L, maltoza u opsegu od 60-80 g/L, maltotrioza u opsegu od 15-20 g/L, cink u opsegu od
0,20 mg/L do 0,40 mg/L, slobodni alfa amino azot (FAN) u opsegu od 110-250 mg/L i odnos Valin/FAN od 0,6 do 0,8.
[0082] U nekim primerima izvođenja test rastvor je napravljen od pilsner slada, potencijalno sa dodatkom ječma.
Genotip
[0083] Sojevi kvasca Saccharomyces pastorianus prema pronalasku imaju fenotip da su sposobni da proizvedu fermentisani test rastvor sa smanjenim nivoom diacetila kako je opisano u odeljku sa naslovom "soj kvasca" gore.
1
[0084] Pored navedenih fenotipskih karakteristika, sojevi kvasca prema pronalasku mogu po mogućnosti imati jedan ili više genotipova opisanih u nastavku.
[0085] ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 su uključeni u sintezu L-valina iz piruvata. U ovom procesu može da dođe do spontane produkcije diacetila.
[0086] Mala subjedinica acetolaktat sintaze (ILV6) i katalitička subjedinica acetolaktat sintaze (ILV2) konvertuju piruvat u alfa-acetolaktat.
[0087] Ketol-kiselina reduktoizomeraza (ILV5) katalizuje konverziju alfa-acetolaktata u 2,3 hidroksi-izovalerat.
[0088] Dihidroksi-kiselinska dehidrataza (ILV3) katalizuje konverziju 2,3 hidroksi-izovalerata u 2-keto izolaterat.
[0089] Aminotransferaza razgranatog lanca-aminokiselina (BAT1) katalizuje konverziju 2-keto izolaterata u L-valin u mitohondrijima i aminotransferaza razgranatog lanca-aminokiselina (BAT2) katalizuje pomenutu reakciju u citosolu.
Hromozomska lokacija:
[0090]
Sličnost proteina S . Cerevisiae i S. eubayanus (proteinske sekvence)
[0091]
1
[0092] Podrazumeva se da kada ćelija kvasca "ima" tačan broj gena, navedena ćelija ne sadrži više gena od naznačenog broja. Slično tome, ako ćelija kvasca "ima" u opsegu XX do YY gena, navedena ćelija kvasca ne sadrži više od YY gena.
[0093] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše pet gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, na primer u najviše 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 5 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 SEQ ID NO: 32 ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%% sekvence identiteta sa, ili kodira SelLV2 SEQ ID NO: 38 ili homolog dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% sekvence identiteta sa njima.Poželjno je da soj kvasca pronalaska ima najviše dva funkcionalna gena koji kodiraju ILV2, na primer soj kvasca može imati u opsegu od 1 do 2, kao što su tačno 2 funkcionalna gena koji kodiraju ILV2.Poželjno je da navedeni funkcionalni geni kodiraju SclLV2 SEQ ID NO: 32 ili SelLV2 SEQ ID NO: 38 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa tim.U jednom izvođenju navedeni funkcionalni geni kodiraju SclLV2, poželjno ScILV SEQ ID NO:32.U jednom izvođenju navedeni funkcionalni geni kodiraju ILV2 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3, pri čemu su sekvence ILV2 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3 date na slici 4.
[0094] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca ima najviše dva funkcionalna gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira SclLV2 iz SEQ ID NO: 32 ili
2
SelLV2 iz SEQ ID NO: 38, ili funkcionalni homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence; najmanje četiri funkcionalna gena koji kodiraju ILV3, kao što je najmanje pet funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, kao što je najmanje šest funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, pri čemu svaki gen koji kodira ILV3 kodira ScILV3 iz SEQ ID NO: 35 ili SelLV3 iz SEQ ID NO: 41, ili funkcionalni homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence; i najmanje tri funkcionalna gena koji kodiraju ILV5, kao što su najmanje četiri funkcionalna gena koji kodiraju ILV5, kao što je najmanje pet funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 iz SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 iz SEQ ID NO: 40, ili funkcionalni homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
[0095] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca ima najviše dva funkcionalna gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID-a NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je identičnost sekvence najmanje 98%; i u opsegu od 5 do 9 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, kao što su u opsegu od 5 do 7, kao što su 6 funkcionalnih gena ing ILV3, pri čemu svaki gen koji kodira ILV3 kodira ScILV3 SEQ ID NO: 35 ili SelLV3 SEQ ID NO: 41 ili funkcionalni homolog bilo kog od gore pomenutih deljenja najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnost sekvence sa tim; i u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 SelLV5 SEQ ID NO: 40 ili funkcionalni homolog bilo kog od gore pomenutog deljenja najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa njima.
[0096] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše četiri gena koji kodiraju funkcionalni ILV6, na primer u opsegu od dva do četiri gena koji kodiraju funkcionalni ILV6, pri čemu svaki gen koji kodira ILV6 kodira SclLV6 SEQ ID NO: 33 ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence sa tim, ili kodira SelLV6 SEQ ID NO: 39 ili deljenje funkcionalnog homologa 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% sekvencijalni identitet sa tim.
[0097] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše dva gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, na primer, najviše četiri gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, na primer, najviše pet gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 iz SEQ ID NO: 34 ili funkcionalni homolog koji sa njim deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% do 99% identičnosti sekvence, ili kodira SelLV5 iz SEQ ID NO: 40 ili funkcionalni homolog koji sa njim ima najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnosti sekvence. U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je najviše 15 gena, kao što je najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih. U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima u opsegu od 5 do 20 alelnih gena, kao što je 5 do 15 gena, kao što je 5 do 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.
[0098] U jednom izvođenju, soj kvasca ima u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 ID NO: 34 ili SeILV5 SEQ ID NO: 40 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnost sekvence sa tim. U jednom izvođenju, soj kvasca ima u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što su u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen kodira ILV5 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3, pri čemu su sekvence ILV5 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3 date na slici 7.
[0099] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše pet gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, na primer u najviše 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 5 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 SEQ ID NO: 32 ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95% sekvence identiteta sa, ili kodira SelLV2 SEQ ID NO: 38 ili homolog dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% sekvence identiteta sa njima.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.
[0100] U jednom izvođenju, soj kvasca ima u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 ID NO: 34 ili SeILV5 SEQ ID NO: 40 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% identičnost sekvence sa tim. U jednom izvođenju, soj kvasca ima u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što su u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen kodira ILV5 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3, pri čemu su sekvence ILV5 ZDA1, ZDA2 i/ili ZDA3 date na slici 7.
[0101] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše pet gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, na primer u najviše 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 5 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 SEQ ID NO: 32 ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 95%% sekvence identiteta sa, ili kodira SelLV2 SEQ ID NO: 38 ili homolog dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% sekvence identiteta sa njima.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.
[0102] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše pet gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, na primer u najviše 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 5 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, kao što je u opsegu od 1 do 4 gena koji kodiraju funkcionalni ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 SEQ ID NO: 32 ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 95%% sekvence identiteta sa, ili kodira SelLV2 SEQ ID NO: 38 ili homolog dele najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 98% sekvence identiteta sa
2
njima.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus ima najviše 20 gena, kao što je na najviše 15 gena, kao što je na najviše 10 alelnih gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, pri čemu gen koji kodira funkcionalni ILV5 može da bude bilo koji od gore navedenih.
[0103] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena.
[0104] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena.
[0105] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju koja rezultira manjom ili nikakvom ekspresijom jednog ili više ILV2 gena.
[0106] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena.
[0107] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena.
[0108] U nekim primerima izvođenja, soj kvasca Saccharomyces pastorianus nosi mutaciju koja rezultira manjom ili nikakvom ekspresijom jednog ili više ILV2 gena.
[0109] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, suma gena koji kodiraju funkcionalni ILV2 i funkcionalni ILV6 je niža od sume gena koji kodiraju funkcionalni ILV5 i funkcionalni ILV3, pri čemu pomenuti funkcionalni ILV2, ILV6, ILV3 i ILV5 mogu biti bilo koji od gore navedenih. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, suma gena koji kodiraju funkcionalni ILV2 i funkcionalni ILV6 je niža od sume gena koji kodiraju funkcionalni ILV5 i funkcionalni ILV3, pri čemu pomenuti funkcionalni ILV2, ILV6, ILV3 i ILV5 mogu biti bilo koji od gore navedenih. U jednom primeru izvođenju, suma gena koji kodiraju funkcionalni ILV2 i funkcionalni ILV6 je manja od sume gena koji kodiraju funkcionalni ILV5, funkcionalni ILV3, funkcionalni BAT1 i funkcionalni BAT2, pri čemu pomenuti funkcionalni ILV2, ILV6, ILV3, ILV5; BAT1 i BAT2 mogu biti bilo koji od gore navedenih. Drugim rečima, u nekim primerima izvođenja suma gena koji kodiraju ILV5 i ILV3 je veća od sume gena koji kodiraju ILV2 i ILV6. Dakle, u nekim primerima izvođenja, suma gena koji kodiraju ILV5 i ILV3 je veća od sume gena koji kodiraju ILV2, ILV6, BAT1 i BAT2.
[0110] U nekim primerima izvođenja, odnos gena ILV5 i ILV3 gena prema ILV2 genima iznosi najmanje 1, kao što je najmanje 1.5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2.5, kao što je najmanje 3, gde je rečeno ILV2, ILV5 i ILV3 geni kodiraju bilo koji od gore navedenih funkcionalnih ILV2, ILV5 i ILV3, respektivno.
[0111] U nekim primerima izvođenja, odnos gena ILV5 i ILV3 gena vs. ILV2 geni su najmanje 1, kao što je najmanje 1.5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2.5, kao što je najmanje 3, gde navedeni ILV2 , ILV5 i ILV3 geni kodiraju bilo koji od gore navedenih funkcionalnih ILV2, ILV5 i ILV3, respektivno.
[0112] U nekim primerima izvođenja, odnos gena ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 prema ILV2 je najmanje 1, kao što je najmanje 1,5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2,5, kao što je najmanje 3, kao što je najmanje 4, kao što je najmanje 5, kao što je najmanje 6, pri čemu su navedeni ILV2, ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 geni kodiraju bilo koji od gore pomenutih funkcionalnih ILV2, ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 respektivno.
[0113] U nekim primerima izvođenja, odnos gena ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 prema ILV2 i ILV6 iznosi najmanje 1, kao što je najmanje 1,5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2,5, kao što je najmanje 3, kao što je najmanje 4, gde navedeni ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2 geni kodiraju bilo koji od prethodno navedenih funkcionalnih ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 i BAT2, respektivno.
Fermentisani vodeni ekstrakt na bazi slada i/ili žitarica i postupci za njegovu proizvodnju [0114] Pronalazak obezbeđuje Saccharomyces pastorianus sojeve kvasca opisane u odeljku sa naslovom "soj kvasca" iznad, kao i metode pripreme fermentisanog vodenog ekstrakta na bazi slada i/ili žitarica, koristeći navedene sojeve kvasca.
[0115] Aspekt pronalaska predstavlja obezbeđivanje postupaka za proizvodnju fermentisanog vodenog ekstrakta, pri čemu se navedeni postupak sastoji od koraka:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanje soja kvasca, pri čemu navedeni soj kvasca može da bude bilo koji od gorenavedenih sojeva kvasca opisanih u odeljku "Soj kvasca"; i
iii) fermentaciju vodenog ekstrakta datog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca iz koraka ii),
čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt.
[0116] Vodeni ekstrakt može da bude bilo koji vodeni ekstrakt slada i/ili zrna žitarica. Dakle, neograničavajući primer ovoga je sladovina. Vodeni ekstrakt se, na primer, može pripremiti pripremom ekstrakta slada gnječenjem i opciono aeracijom, kako je opisano u nastavku ovog odeljka.
[0117] Slad su zrna žitarica, kao što je ječma, koja su prerađene u slad.Pod pojmom "slad" podrazumeva se proces koji uključuje narastanje i klijanje zrna u procesu koji se odvija u
2
kontrolisanim uslovima okoline, opciono praćen korakom sušenja.Pomenuti korak sušenja može poželjno biti sušenje proklijalih zrna na povišenim temperaturama.Zeleni slad, koji nije bio predmet pečenja, takođe se može koristiti, posebno slad dobijen procesom opisanim u WO 2018/001882 .
[0118] Malting je važan za sintezu brojnih enzima koji uzrokuju modifikaciju jezgra, procese koji uglavnom depolimerizuju skrob i ćelijske zidove mrtvog endosperma da bi mobilisali hranljive materije jezgra i aktivirali druge depolimeraze. U kasnijem procesu sušenja, ukus i boja se generišu barem delimično zbog hemijskih reakcija smeđivanja.
[0119] Steeping se može izvesti bilo kojom konvencionalnom metodom poznatom kvalifikovanoj osobi. Jedan neograničavajući primer podrazumeva kopanje na temperaturi u opsegu od 10°C do 25°C sa naizmeničnim suvim i vlažnim uslovima. Klijanje se može izvesti bilo kojom konvencionalnom metodom poznatom kvalifikovanoj osobi. Jedan neograničavajući primer podrazumeva klijanje na temperaturi u opsegu od 10 do 25°C, opciono sa promenom temperature u opsegu od 1 do 4 h. Klijanje se takođe može izvesti kombinovanom metodom, npr. kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2018/001882.
[0120] Sušenje u peći može se vršiti na konvencionalnim temperaturama, kao što je najmanje 75°C, na primer u opsegu od 80 do 90°C, kao što je opseg od 80 do 85°C. Stoga, slad može, na primer, biti proizveden bilo kojom od metoda opisanih od strane Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982). Međutim, bilo koji drugi pogodan metod za proizvodnju slada može se takođe koristiti sa ovim pronalaskom, kao što su metode za proizvodnju specijalnih sladova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metode prženja slada.
[0121] Slad se može dalje prerađivati, na primer mlevenjem. Mlevenje se može obaviti u suvom stanju, tj. slad se melje dok je suv ili u vlažnom stanju ako se koristi zeleni slad.
[0122] Slad, npr. mleveni slad može da se gnječi da bi se pripremio vodeni ekstrakt pomenutog slada. Početna tečnost za pripremu napitka može da bude vodeni ekstrakt slada, npr. vodeni ekstrakt slada pripremljen gnječenjem.
[0123] Prema tome, metod za pripremu fermentisanog vodenog ekstrakta na bazi slada i/ili žitarica prema pronalasku može da obuhvati korak proizvodnje vodenog ekstrakta, kao što je slad, gnječenjem slada i opciono dodatnih dodataka. Pomenuti korak pasiranja može takođe opciono obuhvatati sparing, i shodno tome, pomenuti korak pasiranja može da bude korak pasiranja, uključujući korak sparinga ili korak pasiranja, isključujući korak sparinga.
[0124] Generalno, proizvodnja vodenog ekstrakta se inicira mlevenjem slada i/ili zrna. Ako se dodaju još neki dodaci, oni takođe mogu da se samelju, u zavisnosti od svoje prirode. Ako je dodatak žitarica, ona, na primer, može da se melje, dok se sirupi, šećeri i slično, generalno ne
2
melju. Mlevenje će olakšati pristup vode česticama jezgra u fazi gnječenja. Prilikom gnječenja može se nastaviti enzimska depolimerizacija supstrata započeta tokom produkcije slada.
[0125] Uopšteno govoreći, vodeni ekstrakt se priprema kombinovanjem i inkubacijom mlevenog slada i vode, tj. u procesu gnječenja. Tokom gnječenja, slad/tečna kompozicija može da bude dopunjen dodatnim kompozicijama bogatim ugljenim hidratima, na primer mlevenim ječmom, kukuruzom ili dodacima pirinča. Neslađeni dodaci žitarica obično sadrže malo ili nimalo aktivnih enzima, što je važno dopuniti sa sladom ili egzogenim enzimima kako bi se obezbedili enzimi neophodni za depolimerizaciju polisaharida itd. Tokom gnječenja, mleveni slad i/ili mleveni zrna - i opciono dodatni dodaci se inkubiraju sa tečnom frakcijom, kao što je voda. Temperatura inkubacije se generalno ili održava konstantnom (izotermno pasiranje), ili postepeno povećava, na primer povećava se sekvencijalno. U oba slučaja, rastvorljive supstance u sladu/jezgru/dodacima oslobađaju se u pomenutu tečnu frakciju. Kasnija filtracija podrazumeva odvajanje vodenog ekstrakta i zaostalih čvrstih čestica, koje se takođe označavaju kao "potrošeno jezgro". Ovako dobijeni vodeni ekstrakt se takođe može označiti kao "prvi slad". Dodatna tečnost, kao što je voda, može se dodati u potrošena zrna tokom procesa koji se takođe označava kao raspršivanje. Nakon prskanja i filtracije, može se dobiti "drugi slad". Dodatna sladovina može da se pripremi ponavljanjem postupka. Neograničavajuće primere pogodnih postupaka za pripremu sladovine opisuju Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982).
[0126] Kao što je gore pomenuto, vodeni ekstrakt se takođe može pripremiti gnječenjem samo neslađenih zrna.Jezgra koja nisu obrađena u slad ne sadrže ili sadrže samo ograničenu količinu enzima koji su korisni za proizvodnju sladovine, kao što su enzimi sposobni za razgradnju ćelijskih zidova ili enzimi sposobni za depolimerizaciju skroba u šećere.Tako, u izvođenjima pronalaska gde se do 80%, kao što je 90% ili kao što je 100% neslađenih zrna, kao što je ječma, koristi za gnječenje, poželjno je da se jedan ili više pogodnih, spoljnih pivarskih enzima doda u kašu Pogodni enzimi mogu biti lipaze, skrob degradirajući enzimi (npr. amilaze), glukanaze [poželjno (1-4)- i/ili (1-3,1-4)-β-glukanaza], i/ili ksilanaze (kao što je arabinoksilanaza), i/ili proteaze, ili enzimske mešavine koje sadrže jedan ili više gore pomenutih enzima, npr. Cereflo, Ultraflo ili Ondea Pro (Novozymes).
[0127] Vodeni ekstrakt se takođe može pripremiti korišćenjem mešavine sladnih i nesladnih zrna, u kom slučaju se tokom pripreme može dodati jedan ili više pogodnih enzima. Čak i u primerima izvođenja gde se koristi slad, enzimi se takođe mogu dodati. Preciznije, jezgra se mogu koristiti zajedno sa sladom u bilo kojoj kombinaciji za gnječenje - sa ili bez spoljnih enzima za kuvanje - kao što su, ali ne ograničavajući se na, proporcije jezgra: slad = približno 100 : 0, ili približno 75 : 25, ili približno 50 : 50, ili približno 25 : 75.
2
[0128] Vodeni ekstrakt dobijen nakon gnječenja se takođe može nazvati "slatka sladovina". U konvencionalnim metodama, slatka sladovina se kuva sa ili bez hmelja, gde se nakon toga može nazvati kuvana sladovina.
[0129] Vodeni ekstrakt se može zagrejati ili prokuvati pre nego što se podvrgne fermentaciji kvascem pronalaska. U jednom aspektu pronalaska, druga i sledeće sladovine mogu da se kombinuju, a nakon toga da se podvrgnu zagrevanju ili ključanju. Vodeni ekstrakt se može zagrejati ili kuvati u bilo kom odgovarajućem vremenskom periodu, npr. u opsegu od 60 min do 120 min.
[0130] Ishod fermentisanog vodenog ekstrakta na bazi slada i/ili žitarica u velikoj meri zavisi od količine i vrste fermentisanih šećera prisutnih u vodenom ekstraktu slada i/ili zrna žitarica, kao i od karakteristika soja kvasca koji se koristi tokom fermentacije.
[0131] U nekim primerima izvođenja sadašnjeg pronalaska, pomenuti vodeni ekstrakt ima prividni ekstrakt od najmanje 12° Platona, kao što je najmanje 15° Platona, kao što je u opsegu od 5-15° Plato, kao što je u opsegu od 10-20° Platona, kao što je u opsegu od 15-25° Platona.
[0132] U nekim primerima izvođenja, navedeni vodeni ekstrakt fermentiše se sa navedenim sojem kvasca najviše 6 dana, na primer tokom većine 5 dana, na primer tokom većine 4 dana, na primer tokom većine 3 dana.
[0133] Dodatna prednost sojeva kvasca ovog pronalaska može da bude u tome što su korisni za fermentaciju sladovine sa niskim nivoom aminokiselina. Tako, u nekim primerima izvođenja, pomenuti vodeni ekstrakt sadrži najviše 3500 mg/L, kao što je najviše 3000 mg/L, na primer na najviše 2500 mg/L aminokiselina.
[0134] Stoga se vodeni ekstrakt, npr. slad, može pripremiti kao što je gore opisano.Fermentisani vodeni ekstrakt na bazi slada i/ili žitarica može se pripremiti fermentacijom pomenutog vodenog ekstrakta sa navedenim sojem kvasca prema pronalasku.
[0135] U nekim preferiranim oblicima, rečeno je da je fermentisani vodeni ekstrakt zeleno pivo.
[0136] U opštem smislu, alkoholni fermentisani vodeni ekstrakti - kao što je pivo - mogu se proizvoditi od slada i/ili neslađenog zrna. Slad, pored hmelja i kvasca, doprinosi aromi i boji napitka, poput piva. Osim toga, slad funkcioniše kao izvor fermentisanog šećera i enzima. Neograničeni opisi primera pogodnih metoda za slađenje i kuvanje mogu se naći, na primer, u publikacijama Briggs et al. (1981) i Hough et al. (1982). Brojne, redovno ažurirane metode za analizu proizvoda od jezgra, slada i piva dostupne su, na primer, ali ne ograničavajući se na, Američko udruženje hemičara koji se bave žitaricama (1995), Američko društvo hemičara koji se bave proizvodnjom piva (1992), Evropska konvencija o pivarama (1998) i Institut za pivarstvo (1997). Priznato je da se za datu pivaru primenjuju mnoge specifične procedure, pri
2
čemu se najznačajnije varijacije odnose na lokalne potrošačke preferencije. Svaki takav način proizvodnje piva može se koristiti sa predmetnim pronalaskom.
[0137] Prvi korak proizvodnje piva od sladovine poželjno uključuje zagrevanje pomenute sladine kao što je opisano gore, nakon čega sledi kasnija faza hlađenja sladovine i opciono odmor u vrtlogu.
[0138] Postupci prema pronalasku obuhvataju korak fermentacije vodenog ekstrakta slada i/ili zrna žitarica sa sojem kvasca prema pronalasku. Navedena fermentacija može da bude fermentacija nefermentisanog vodenog ekstrakta ili fermentisanog vodenog ekstrakta koji još uvek sadrži fermentisane šećere za kvasac. Tako, u nekim primerima izvođenja, navedena fermentacija se može izvesti u suštini odmah nakon završetka gnječenja ili nakon zagrevanja sladovine.
[0139] Fermentacija se može vršiti u rezervoarima za fermentaciju koji sadrže kvasac prema pronalasku, odnosno kvasac koji ima jednu ili više karakteristika opisanih u prethodnom tekstu.
[0140] Tokom višednevnog procesa fermentacije razvijaju se aromatične supstance. Ako soj kvasca nije u stanju da konvertuje specifična jedinjenja, ona će i dalje biti prisutna nakon koraka fermentacije iii).
[0141] U nekim primerima izvođenja, fermentacioni korak iii) se javlja na bilo kojoj od temperatura navedenih u nastavku, gde je vodeni ekstrakt inkubiran sa bilo kojim od brojeva ćelija kvasca kao što je opisano u nastavku, gde fermentisani vodeni ekstrakt sadrži maksimalni nivo diacetila kao što je opisano u nastavku, i gde je fermentacija završena nakon najviše 5 dana, kao što je maksimalno 4 dana, kao što je maksimalno 3 dana. Konkretno, fermentacija je završena nakon najviše 4 dana.
[0142] U specifičnom izvođenju, fermentacija pomoću kvasnog soja pronalaska je završena i diacetil je ispod 60 ppb, kao što je 50 ppb najmanje 12 sati, kao što je najmanje 24 sata ranije od fermentacije koja je sprovedena sa -W34/78 sojem kvasca pod istim uslovima.
[0143] Gore navedena inkubacija se poželjno izvodi na temperaturi od najviše 18 °C, na primer na temperaturi od 12°C do 18 °C. Konkretno, navedena inkubacija se može izvesti na temperaturi od pribl.16 ° C.
[0144] Navedeni maksimalni nivo diacetila je poželjno najviše 60 ppb diacetila, kao što je najviše 55 ppb diacetila, kao što je na najviše 50 ppb diacetil, na primer na najviše 45 ppb diacetil kada je fermentacija završena. Konkretno, pomenuti nivo diacetila pri završetku fermentacije je najviše 60 ppb.
[0145] Navedena fermentacija se poželjno izvodi inkubacijom vodenog ekstrakta sa najmanje 6 miliona vijabilnih ćelija kvasca po mililitru, recimo, najmanje 10 miliona vijabilnih ćelija
2
kvasca po mililitru, recimo, najmanje 14 miliona vijabilnih ćelija kvasca po mililitru, na primer u opsegu od 7-8 miliona vijabilnih ćelija kvasca po mililitru, na primer u opsegu od 14-16 miliona vijabilnih ćelija kvasca po mililitru. Konkretno, navedena fermentacija može da se izvodi inkubacijom vodenog ekstrakta sa pribl.15 miliona ćelija kvasca po mililitru.
[0146] U nekim primerima izvođenja, navedeni fermentisani vodeni ekstrakt ima sadržaj alkohola od najmanje 4% ABV, kao što je najmanje 5% ABV, kao što je najmanje 6% ABV, kao što je najmanje 7% ABV.
[0147] U nekim primerima izvođenja, navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najmanje 25 mg/L propanola, recimo, najmanje 30 mg/L propanola.
[0148] U nekim primerima izvođenja, navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najviše 8 mg/L izobutanola, kao što je najviše 7 mg/L izobutanola, kao što je najviše 6 mg/L izobutanola.
[0149] U nekim primerima izvođenja, navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži koristan odnos propanol:izobutanol. Konkretno, odnos propanol:izobutanol može da bude najmanje 1,5, recimo, najmanje 2,0, recimo, najmanje 2,5, recimo, najmanje 3,0, recimo, najmanje 3,5, recimo, najmanje 4,0, recimo, najmanje 4,5, recimo, najmanje 5,0, recimo, najmanje 5,5, recimo, najmanje 6,0, recimo, najmanje 6,5.
[0150] U nekim primerima izvođenja, fermentisani vodeni ekstrakt dobijen pomoću kvasca prema pronalasku ima stvarni stepen fermentacije (RDF) koji je najmanje 1,5%, recimo, 2% niži pri istom % ABV nego fermentacija sprovedena sa sojem kvasca W-34/78 ili sojem kvasca Hibridni kvasac 7 pod istim uslovima.
Napitak na bazi slada i/ili žitarica i postupci za njegovu proizvodnju
[0151] Prethodno opisani fermentisani vodeni ekstrakt na bazi slada i/ili žitarica može se dalje preraditi u napitak.
[0152] Obezbeđivanje postupaka za proizvodnju napitka na bazi slada i/ili žitarica, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:
i.Priprema fermentisanog vodenog ekstrakta kako je gore opisano u odeljku "Fermentisani vodeni ekstrakt na bazi slada i/ili žitarica i metode njihove proizvodnje", i ii. dalje obrade navedenog fermentisanog vodenog ekstrakta u napitak.
[0153] U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, napitak na bazi slada i/ili žitarica se razblažuje sa tečnošću, kao što je voda.
[0154] Po želji, voda se može koristiti za razblaživanje napitka na bazi slada i/ili žitarica i na taj način prilagoditi npr. sadržaj etanola. U jednom izvođenju ovog pronalaska proporcije vode: slada i/ili napitka na bazi žitarica mogu biti u opsegu od 0,1 do 5 delova vode do 1 dela slada i/ili napitka na bazi žitarica.
[0155] Dalji proces može, na primer, da obuhvati hlađenje i/ili filtriranje napitka na bazi slada i/ili žitarica.Takođe mogu da se dodajuu aditivi.Osim toga, može da se doda CO2.Na kraju, napitak na bazi slada i/ili žitarica, kao što je pivo, može da se pasterizuje i/ili filtrira pre pakovanja (npr. flaširanja ili konzerviranja).
[0156] U poželjnim primerima izvođenja, napitak je pivo.
[0157] U aspektu ovog pronalaska, napitak na bazi slada i/ili žitarica, proizveden fermentacijom vodenog ekstrakta sa navedenim sojem kvasca prema ovom pronalasku, ima prijatan ukus.
[0158] Ukus napitka na bazi slada i/ili žitarica proizvedenog fermentacijom sa kvascima prema pronalasku može da se analizira, na primer, pomoću specijalizovanog panela za ukus piva. Poželjno je da se pomenuti panel obuči za degustaciju i opisivanje ukusa piva, sa posebnim fokusom na aldehide, ukus papira, stari ukus, estre, više alkohole, masne kiseline i komponente sumpora.
[0159] Uopšteno govoreći, panel ukusa će se sastojati u opsegu od 3 do 30 članova, na primer u opsegu od 5 do 15 članova, poželjno u opsegu od 8 do 12 članova. Panel ukusa može da proceni prisustvo različitih ukusa, kao što su papirni, oksidovani, stari i hlebni ukusi, kao i ukusi estara, viših alkohola, komponenti sumpora i tela piva. Ukupan ukus piva će generalno ocenjivati panel za ukus na nekoliko različitih karakteristika na skali od 1 do 9, gde prosečna ocena preko 5 označava da pivo ima prihvatljiv ukus.
[0160] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje pića na bazi slada i/ili žitarica, pripremljena metodama opisanim gore.
[0161] U nekim primerima izvođenja, napitak sadrži najmanje 25 mg/L propanola, kao što je
1
najmanje 30 mg/L propanola.
[0162] U nekim primerima izvođenja, ovaj napitak sadrži najviše 8 mg/L izobutanola, kao što je najviše 6 mg/L izobutanola.
[0163]. Generalno, fermentisani vodeni ekstrakt ili piće pripremljeno korišćenjem sojeva kvasca pronalaska će imati specifičan odnos propanola: izobutanola, na primer odnos sličan odnosima prikazanim na slici 2. Stoga, ako fermentisani vodeni ekstrakt ili piće ima ovaj specifičan odnos propanola: izobutanola, to je indikacija da je fermentisani vodeni ekstrakt ili piće proizveden fermentacijom sa sojem kvasca pronalaska. Konkretno, odnos propanol: izobutanol može da bude najmanje 1,5, recimo, najmanje 2,0, recimo, najmanje 2,5, recimo, najmanje 3,0, recimo, najmanje 3,5, recimo, najmanje 4,0, recimo, najmanje 4,5, recimo, najmanje 5,0, recimo, najmanje 5,5, recimo, najmanje 6,0, recimo, najmanje 6,5.
Stavke
[0164] Pronalazak se može dalje definisati sledećim stavkama:
1. Postupak proizvodnje fermentisanog vodenog ekstrakta, navedena metoda koja obuhvata korake:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii) fermentaciju vodenog ekstrakta datog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca koraka ii), čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt.
2. Soj kvasca koji kodira u svom genomu
a. najviše dva funkcionalna gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira SclLV2 SEQ ID NO: 32 ili SelLV2 SEQ ID NO: 38, ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence ovde; i
2
b. najmanje pet funkcionalnih gena, kao što je najmanje šest funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, pri čemu svaki gen koji kodira ILV3 kodira ScILV3 SEQ ID NO: 35 ili SeILV3 SEQ ID NO: 41, ili funkcionalni homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence ovde.
3. Soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani vodeni ekstrakt nakon inkubacije u vodenom ekstraktu slada i/ili žitarica, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži odnos propanol: izobutanol od najmanje 2,0.
4. obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
5. Postupak ili soj kvasca prema tački 1 ili 4, pri čemu je navedena vremenska tačka najranija vremenska tačka kada se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,40 ° Plato, kao što je 0,30 ° Plato, kao što je 0,20 ° Plato u prethodna 24 sata.
6. Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 1 i 4-5, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 55 ppb diacetil, kao što je najviše 50 ppb diacetil, kao što je najviše 45 ppb diacetil u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
7. Postupak proizvodnje fermentisanog vodenog ekstrakta, navedena metoda koja obuhvata korake:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii) fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca, čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt; i
8. obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
9. Postupak ili soj kvasca prema tački 1 ili 4, pri čemu je navedena vremenska tačka najranija vremenska tačka kada se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,40 ° Plato, kao što je 0,30 ° Plato, kao što je 0,20 ° Plato u prethodna 24 sata.
10.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 7 i 8, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 55 ppb diacetil, kao što je najviše 50 ppb diacetil, kao što je najviše 45 ppb diacetil u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
11.Postupak proizvodnje fermentisanog vodenog ekstrakta, navedena metoda koja obuhvata korake:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, poželjno najviše 60 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii) fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca, čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt; i
12.Soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 2 do 6 i 8 do 10, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb ukupnog diacetila, poželjno najviše 60 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u sledeća 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C.
4
13.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 11 do 12, pri čemu je navedena vremenska tačka najranija vremenska tačka kada se prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjio za više od 0,40 ° Plato, kao što je 0,30 ° Plato, kao što je 0,20° Plato u sledeća24 sata.
14.Postupak proizvodnje fermentisanog vodenog ekstrakta, pri čemu navedeni postuak obuhvata korake:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanja soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
iii) fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca, čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt; i
15.Soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 2 do 6, 8 do 10 i 12 do 13, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 120 ppb diacetila, na primer najviše 65 ppb ukupnog diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,25° Plato u sledećih 12 sati, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C;
16.Postupak ili soj kvasca prema tački 14 ili 15, pri čemu je navedena vremenska tačka najranija vremenska tačka kada se prividni ekstrakt navedenog testnog rastvora nije smanjio za više od 0,40 ° Plato, kao što je 0,30 ° Plato, kao što je 0,20 ° Plato u prethodna 24 sata.
17.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki od 11 do 15, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 115 ppb diacetila u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
18.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 1 i 4 do 17,
pri čemu pomenuti test rastvor sadrži najviše 10 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,5 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,0 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 8,5 miliona ćelija po mililitru u rastvoru, u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
19.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je test rastvor iz koraka ii) ili test rastvor, sladovina sa prividnim ekstraktom od pribl.16 ° Plato.
20.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu test rastvor iz koraka ii) ili test rastvor, sadrži najmanje 40 g/kg maltoze.
21.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se navedena fermentacija u koraku ii) ili navedena fermentacija, odvija na temperaturi u opsegu od 12 °C do 18 °C.
22.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se navedena fermentacija u koraku ii) ili navedena fermentacija, odvija na temperaturi od najviše 16 °C.
23.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se navedena fermentacija u koraku ii) ili navedena fermentacija, odvija nakon inokulacije u opsegu od 7.000.000 do 20.000.000 vijabilnih ćelija kvasca po mL test rastvora.
24.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se navedeni vodeni ekstrakt fermentiše pomoću navedenog soja kvasca najduže 6 dana, na primer najviše 5 dana, na primer najviše 4 dana.
25.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni vodeni ekstrakt ima prividan ekstrakt od najmanje 12° Plato, kao što je najmanje 15° Plato.
26.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni vodeni ekstrakt sladovina.
27.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni vodeni ekstrakt sadrži najviše 3500 mg/L, recimo, najviše 3000 mg/L, recimo, najviše 2500 mg/L amino kiselina.
28.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni fermentirani vodeni ekstrakt sadrži najviše 60 ppb diacetila, kao što je najviše 55 ppb diacetila, kao što je najviše 50 ppb diacetila, kao što je najviše 45 ppb diacetil, kao što je najviše 40 ppb diacetil.
29.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od stavki 1 i 4 do 17, pri čemu pomenuti test rastvor sadrži najviše 10 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,5 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 9,0 miliona ćelija po mililitru, kao što je najviše 8,5 miliona ćelija po mililitru u rastvoru, u navedenoj najranijoj vremenskoj tački.
30.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt ima sadržaj alkohola od najmanje 4% ABV, kao što je najmanje 5% ABV.
31.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najmanje 25 mg/L propanola, kao što je najmanje 30 mg/L propanola.
32.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najviše 8 mg/L izobutanola, recimo, najviše 6 mg/L izobutanola.
33.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži odnos propanol:izobutanol od najmanje 2,0, recimo, najmanje 2,5, recimo, najmanje 3,0, recimo, najmanje 4,0, recimo, najmanje 5,0, recimo, najmanje 5,5.
34.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 265 ppb diacetila u bilo kom trenutku u roku od 5 dana nakon početka inkubacije, i pri čemu se u opsegu od 7 do 8 miliona ćelija kvasca dodaje navedenom test rastvoru.
35.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor koji sadrži najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije u pomenutom test rastvoru najviše 6 dana, recimo, najviše 5 dana, recimo, najviše 4 dana.
36.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor koji sadrži najviše 50 ppb diacetila nakon inkubacije u pomenutom test rastvoru na temperaturi od najviše 16 °C, tokom najviše 5 dana, recimo, najviše 4 dana.
37.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede prvi fermentisani test rastvor koji sadrži najviše 60 ppb diacetila nakon inkubacije u pomenutom test rastvoru za određeno vreme, pri čemu je navedeno vreme najmanje 12 sati, na primer najmanje 24 sata manje od vremena potrebnog za soj kvasca W-34/78 inkubiran pod istim uslovima da proizvede drugi fermentisani test rastvor koji sadrži najviše 60 ppb diacetila nakon inkubacije u pomenutom test rastvoru.
38.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede najmanje 4,0, recimo, najmanje 4,7 ml/l etanola po °Plato, kada se navedeni soj kvasca inkubira u pomenutom ispitnom rastvoru.
39.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede najmanje 4,0, kao što je najmanje 4,7 ml/l etanola po °Plato, kada se navedeni soj kvasca inkubira u pomenutom ispitnom rastvoru.
40.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da raste na medijima sa melibiozom kao jedinim izvorom ugljenika.
41.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
42.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
43.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
44.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
45.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
46.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
47.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše pet alelnih gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 ID SEK NO: 32 ili SelLV2 ID-a NO: 38, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
48.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri gena koji kodiraju ILV5, kao što je najmanje pet gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 SEQ ID NO: 40, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
49.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri gena koji kodiraju ILV5, kao što je najmanje pet gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 SEQ ID NO: 40, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence ovde.
50.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše funkcionalnih 15 gena koji kodiraju ILV5, kao što je između 4 i 10 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je između 4 i 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5.
51.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima u opsegu i u opsegu od 4 do 8 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je u opsegu od 4 do 6, kao što je 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 SEQ ID NO: 40 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80% identičnosti sekvence.
52.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri gena koji kodiraju ILV5, kao što je najmanje pet gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 SEQ ID NO: 40, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
53.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najviše funkcionalnih 15 gena koji kodiraju ILV5, kao što je između 4 i 10 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, kao što je između 4 i 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5.
54.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima u opsegu i u opsegu od 5 do 9 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, kao što je u opsegu od 5 do 7, kao što je 6 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, pri čemu svaki gen koji kodira ILV3 kodira ScILV3 SEQ ID NO: 35 ili SeILV3 SEQ ID NO: 41 ili funkcionalni homolog bilo kojeg od gore pomenutih koji dele najmanje 80% identičnosti sekvence.
55.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje tri gena, recimo, najmanje četiri gena koji kodiraju BAT1, pri čemu svaki gen koji kodira BAT1 kodira ScBAT1 SEQ ID NO: 36 ili SeBAT1 SEQ ID NO: 42 ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
56.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje tri funkcionalna gena, recimo, najmanje četiri funkcionalna gena koji kodiraju BAT1, pri čemu svaki gen koji kodira BAT1 kodira ScBAT1 SEQ ID NO: 36 ili SeBAT1 SEQ ID NO: 42 ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
57Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri gena, recimo najmanje pet gena koji kodiraju BAT2, pri čemu svaki gen koji kodira BAT2 kodira ScBAT2 SEQ ID NO: 37 ili SeBAT2 SEQ ID NO: 43, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
58.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri gena koji kodiraju ILV5, kao što je najmanje pet gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 SEQ ID NO: 34 ili SelLV5 SEQ ID NO: 40, ili homolog koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence sa njima.
59.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je suma gena u pomenutom soju kvasca koji kodira ILV2 i ILV6 niža od sume gena koji kodiraju ILV5 i ILV3.
60.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je suma gena u pomenutom soju kvasca koji kodira ILV2 i ILV6 niža od sume gena koji kodiraju ILV5 i ILV3.
61.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je odnos gena u pomenutom soju kvasca ILV5 i ILV3 vs. ILV2 je najmanje 1, kao što je najmanje 1,5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2,5 ili kao što je najmanje 3.
62.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je odnos gena u pomenutom soju kvasca ILV5 i ILV3 prema ILV2 je najmanje 1, kao što je najmanje 1,5, kao što je najmanje 2, kao što je najmanje 2,5 ili kao što je najmanje 3.
63.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je odnos gena u pomenutom soju kvasca ILV5 i ILV3 vs. ILV2 i ILV6 je najmanje 1, kao što je najmanje 1.2, kao što je najmanje 1.4, kao što je najmanje 1.6, kao što je najmanje 1.8 ili
4
najmanje 2.
64.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je odnos gena u pomenutom soju kvasca ILV5 i ILV3 vs. ILV2 i ILV6 je najmanje 1, kao što je najmanje 1.2, kao što je najmanje 1.4, kao što je najmanje 1.6, kao što je najmanje 1.8 ili najmanje 2.
65.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se geni koji kodiraju ILV2, ILV3 i/ili ILV5 izražavaju od njihovih izvornih promotora.
66.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se geni koji kodiraju ILV2, ILV3 i/ili ILV5 izražavaju od njihovih izvornih promotora.
67.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena.
68.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi frejmšift mutaciju u jednom ili više ILV2 gena.
69.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi mutaciju koja dovodi do niže ekspresije ili odsustva ekspresije jednog ili više ILV2 gena.
70.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV6 gena.
71.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi frejmšift mutaciju u jednom ili više ILV6 gena.
72.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nosi mutaciju koja dovodi do niže ekspresije ili odsustva ekspresije jednog ili više ILV6 gena.
73.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca ne sadrži heterologu DNK.
74.Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu navedeni soj kvasca nije podvrgnut koraku genetskog inženjeringa.
75.Fermentisani vodeni ekstrakt pripremljen postupokom prema bilo kojoj od prethodnih stavki.
76.Postupak za proizvodnju napitka, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:
i. pripremanja fermentisanog vodenog ekstrakta u skladu sa bilo kojom od prethodnih stavki, i
ii. preradu navedenog fermentisanog vodenog ekstrakta u napitak.
77.Postupak prema stavki 76, pri čemu koraci obrade obuhvataju jedno ili više od sledećeg:
i.Filtraciju,
ii.Karbonaciju,
iii.Sazrevanje, ili
iv.Flaširanje
78.Napitak pripremljen postupkom prema bilo kojoj od stavki od 76. do 77.
79.Napitak prema stavki 78, pri čemu navedeni napitak sadrži najmanje 25 mg/L propanola, recimo, najmanje 30 mg/L propanola.
80.Napitak prema bilo kojoj od stavki od 78 do 79, pri čemu navedeni napitak sadrži najviše 8 mg/L izobutanola, recimo, najviše 6 mg/L izobutanola.
81.Napitak prema bilo kojoj od stavki 78 do 80, pri čemu je pomenuti napitak pivo. 82.Fermentisani vodeni ekstrakt prema tački 75 ili napitak prema bilo kojoj od tačaka 78-81, pri čemu navedeni ekstrakt ili navedeno piće ima odnos propanol:izobutanol najmanje 3,0, kao što je najmanje 4,0, kao što je najmanje 5,0, kao što je najmanje 5,5.
83.Soj kvasca, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije navedenog soja kvasca u test rastvoru sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato i pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, poželjno najviše 50 ppb diacetila, u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata nakon inkubacije navedenog soja kvasca u navedenom ekstraktu.
84.Soj kvasca Saccharomyces pastorianus u skladu sa tačkom 83, pri čemu je soj kvasca definisan u bilo kojoj od tačaka 1 do 72.
Primeri
Materijali i metode
Priprema sladovine
[0165] Uopšteno govoreći, sladovina koji je korišćen u eksperimentalnim primerima ispod je napravljen gnječenjem 70% pilsner slada i 30% ječma u 2,7 L vode/kg slada.
[0166] Režim pasiranja je prikazan u tabeli 1 ispod:
Tabela 1. Režim gnječenja za pripremu sladovine.
[0167] Varijacije u ovom režimu gnječenja još uvek mogu proizvesti slad pogodan za fermentaciju.
[0168] Nakon gnječenja, sladovina je kuvana 60 min. Da bi se osiguralo da je sladovina pogodan za fermentaciju, poželjno je da ima sadržaj u sledećim opsezima:
•Glukoza 12-25 g/L
•Maltoza 60-80 g/L
•Maltotrioza 15-20 g/L
•Cink 0,16 do 0,18 mg/L
•Slobodni alfa amino azot (FAN) 110-250 mg/L
•Valin/FAN 0,6 do 0,8
[0169] Kao vodič, prosečan sadržaj slada napravljenog od 70% pilsner slada i 30% ječma je dat u tabeli 2 ispod. Od sladovina koje su izvan nekih od dole navedenih parametara i dalje se očekuje da proizvode dobro pivo.
4
Tabela 2. Primer sastava sladovine napravljene od 70% pilsner slada i 30% ječma.
[0170] Kako bi se potpomogla flokulacija kvasca, dodatni cink može da se doda u sladovinu pre fermentacije, kao što je opisano u nekim od primera u nastavku teksta.
Kapljična PCR
[0171] Genomska DNK je pripremljena od diploidnih sojeva kvasca i klonova haploidnih spora pomoću kompleta za prečišćevanje DNK, MasterPure Genomic DNA, kompanije Epicentre. Koncentracije svake finalne preparacije DNK podešene su na 50 ng/mikrolitru DNK pomoću Milli Q vode. DNK je kvantifikovana pomoću NanoDrop 2000 spektrofotometara (Thermo Scientific).
4
[0172] Pomoću kapljične PCR (QX200) kompanije Biorad i proba dizajniranih za aniling sa ILV2 genima Saccharomyces eubayanus i Saccharomyces cerevisiae.Ove sonde su korišćene za ciljanje genomske DNK u haploidnim spornim klonovima i kontrolu diploidnih sojeva kvasca.Koristeći ovu metodu, pronalazači su uspeli da kvantitativno odrede odnos između dva varijantna ILV2 gena.Da bi se razlikovali S. eubayanus i S . cerevisiaie ILV2 aleli dizajnirana je digitalna PCR reakcija specifična za vrstu na osnovu TakManovog testa.U tu svrhu ciljni specifični prajmeri su dizajnirani u homolognim regionima ILV2 gena za S. eubayanus i S. cerevisiae, što znači da bi isti prednji i obrnuti prajmer mogao istovremeno pojačati obe kopije ILV2 vrsta.Sonde specifične za vrstu su dizajnirane da budu identične osim jednog nukleotida, što omogućava diskriminaciju između ILV2 alela S. eubayanus i S. cerevisiae tipa Specifična vrsta sonde za S. cerevisiae ima T na nukleotidnoj poziciji 1515 u sekvenci divljeg tipa S. cerevisiae ILV2, dok proba specifična za vrstu za S. eubayanus ima C na nukleotidnoj poziciji 1515 u S. eubayanusSledeći prajmeri i sonde su razvijeni da razlikuju S. eubayanus ILV2 alela i S. cerevisiae ILV2 alela:
Ciljani specifični ILV2 prajmeri koji će pojačati i S. cerevisiae i S. eubayanus ILV2 Ciljni specifični prednji prajmer (5'- GCCAACGACAGAGAC - 3') (ID SEK BR: 1) Ciljni specifični obrnuti prajmer (5'- GTACCTAACCTGATGT - 3') (ID SEK BR: 2)
[0173] Vrste specifične sonde koje će omogućiti diskriminaciju između S. cerevisiae i S. eubayanus ILV2 kopija:
S . cerevisiae ILV2 alela specifične sonde (5'- TGGCTGCTCACACAC - 3') (SEQ ID: 3) -označen sa 5' FAM i 3' BHK1
S. eubayanus ILV2 alel specifična proba (5'- ACGTACGGAATGGATT - 3') (SEQ ID NO: 4) -označen sa 5' HEKS i 3' BHK1
[0174] Korišćenjem Droplet Digital PCR QX200 sistema (Bio-Rad Laboratorije), ddPCR je izveden prema uputstvima proizvođača.Za analitičke svrhe, 5µl prečišćene gDNK (koncentracija 5ng/µl DNK) sojeva kvasca je dodato u 17-µl PCR smešu koja sadrži 11 µl 2k ddPCR Supermik za sonde (No. dUTP; Bio-Rad), 900 nM ciljno-specifični PCR prednji prajmer, 900 nM ciljno-specifični PCR obrnuti prajmer, 250 nM S. cerevisiae ILV2 specifična proba za alel i 250 nM S. eubayanus ILV2 specifična proba.Reakciona smeša je učitana na AutoDG generator kapljica (Bio-Rad laboratorije) i generisanje kapljica izvršeno prema uputstvu proizvođača. Emulzija kapljica je termički ciklirana korišćenjem standardnih PCR uslova: denaturacija na 95 °C u trajanju od 10 min, 40 ciklusa PCR-a na 94 °C u trajanju od 30 sekundi i 55 °C u trajanju od 1 min, i konačno produženje na 98 °C u trajanju od 10 min pre skladištenja mikrotitarske ploče na 8 °C.PCR amplifikacija u kapljicama je potvrđena
4
korišćenjem QX200 Droplet Reader (Bio-Rad Laboratorije) a podaci su analizirani korišćenjem softvera KuantaSoft (verzija v1.7, Bio-Rad Laboratorije).
Detekcija ukupnog broja ILV2 kopije gena
[0175] U prvoj rundi su odnosi između S. eubayanus i S. cerevisiae ILV2 analizirani direktno na prečišćenoj genomskoj DNK iz svakog pojedinačnog klona spore.Neki klonovi spora, uprkos tome što potiču iz istog roditeljskog kvasca, imali su drugačiji ILV2 genetski sastav.Neki klonovi spora izgleda da imaju samo 100% S. cerevisiae ILV2 gene spore.Pošto je većina roditeljskih lager kvasaca tri- ili tetraploidni (Wahlter et al, 2014) može se pretpostaviti da 100% S. cerevisiae ILV2 spore klonovi mogu da imaju negde između 1-3 kopije.Za spore klonova sa oba tipa ILV2, kao što je 50/50 jedan bi pretpostavio 1 kopiju svakog tipa u spore klonova ili 2 2 u roditeljskim kvascima.Sojevi sa odnosima blizu 67/33 bi značilo 1 kopija S. cerevisiae i 2 kopije S . eubayanus ILV2.
[0176] Da bi se omogućila preciznija procena broja kopija u klonovima spora sa skoro 100% S. cerevisiae ILV2 ispitivanje je ponovljeno dodavanjem ili ubacivanjem čiste eksterne DNK S. eubayanus u uzorke, kako bi se dobila distribucija S. cerevisiae/S. eubayanus nakon ubacivanja.Odnosi ScILV2/ SeILV2 koji bi se snažno pomerali prema S. eubayanus nakon ubacivanja, ukazivali bi na mali broj kopija S. cerevisiae ILV2 i ako bi se odnos pomerao samo malo prema S. eubayanus DNK i dalje bi dominirao visok S. cerevisaie ILV2 bi ukazivao da originalni klon spore ima veliki broj kopija S.cerevisiae ILV2.
[0177] Ubacivanje je urađeno tako da je svaki uzorak od 50 ng/mikrolitru DNK pomešan sa S. eubayanus DNK iste koncentracije 50 ng/mikrolitru, u odnosu 50/50 (10 mikrolitara uzorka 10 mikrolitara S. eubayanus DNK).
[0178] Droplet metod procene QPCR kvantitativno odražava ukupne prisutne kopije ILV2, ali ne može da otkrije da li postoje neki inaktivirani ILV2 aleli usled prisustva određenih SNP polimorfizama ili mutacija pomaka okvira čitanja.Takve mutacije prvo mogu detektovati naknadnim sekvenciranjem genomske DNK pomoću Sangerovog sekvenciranja ili sekvenciranja sledeće generacije.
Skrining za flokulaciju
[0179] Da bi se procenile sposobnosti flokulacije klonova spora kvasca, oni su prvo gajeni u običnoj sladovini na sobnoj temperaturi nekoliko dana. Za svaki soj, 2 ml kulture je prebačeno u reakcionu epruvetu od 2 ml, temeljno vorteksovano i ćelije su ostavljene da se slegnu 10 min. Da bi se odredila kalcijum-zavisna flokulacija, ćelije iz 2 ml prethodno pomenutih kultura su sakupljene, dva puta oprane sa 50 mM EDTA rastvorom i naknadno resuspendovane u 2 ml 50 mM Tris, 50 mM ćilibarne kiseline i 100 mM KOH bez kalcijuma (Stratford 1996). pH vrednost
4
je podešena na pH 4,0, što je slično finalnim pH vrednostima kultura u sladovini. Ćelijske suspenzije su ponovo temeljno vorteksovane i ćelije su ostavljene da se slegnu 5 minuta. Rezultati su dokumentovani fotografski.
Merenje ukupnog diacetila klonova spora u fermentisanoj sladovini, pomoću cilindara sa magnetnim mešanjem
[0180] Klonovi spora i kontrolni kvasci su prethodno gajeni tri dana u 2 ml tečnosti na rotacionoj jedinici Stuart SB2 (www.stuart-equipment.com).Nezbunjujuće šejk bočice od 25 ml pasterizovane standardne Pilsner sladine od 16 Plato vakcinisane su sa dve ml prekultura i gajene na sobnoj temperaturi na stolu za mućenje sa srednjim mućkanjem tokom 5 dana kako bi se postigle guste kulture stacionarne faze.
[0181] Fermentacije piva su sprovedene u staklenim cilindrima kao što je prethodno opisano (Guiterrez et al., 2018).Fermentacije su izvedene u staklenim mernim cilindrima od 250 mL (331 × 39 × 39 mm; Duran) koji sadrže 200 mL Pilsner sladovine i zapečaćeni su prevrnutom staklenom čašom (Duran) na vrhu cilindra kako bi se omogućio izlaz ugljen-dioksida i lak pristup uzorkovanju za analize.Fermentacije su vršene uz kontinualno mešanje na 150 obrtaja u minuti korišćenjem magnetne šipke na mešajućoj Variomag mešačkoj platformi na 16 °C unutar frižidera (inkubatorski orman tipa TS 606-G/4-i).Broj ćelija kvasca je procenjen pomoću celometra (https://www.nexcelom.com/applications/cellometer) i inokulisan (nagnut) brzinom od 15 miliona ćelija po ml sladovine, a performanse fermentacije su praćene merenjem gubitka težine koji je rezultat metaboličkog oslobađanja CO2. Tokom fermentacije 2, 3. i 4. dana sakupljeni su uzorci od 10 ml za analiziranje diacetila.Uzorci su centrifugirani na 1900 g tokom 10 minuta, a supernatanti su čuvani u zamrzivaču na -20 °C do dalje upotrebe.Fermentacije su smatrane završenim kada se nije mogao meriti dalji gubitak težine cilindara za fermentaciju.Ukupni diacetil smo merili gasnom hromatografijom prema metodi EBC 9.24.2 Evropske konvencije o pivarstvu, koja uključuje period inkubacije uzoraka na 60 °C tokom 90 minuta kako bi se odredio ukupni diacetil, koji će odražavati ukupan zbir prekursora acetolaktata i slobodnog diacetila.
Sojevi kvasca
[0182] Hibridni kvasac 7 Saccharomyces pastorianus, je lager proizvodni soj i ima visoku flokulaciju koja omogućava sakupljanje kvasca na kraju fermentacije bez dodatnog hlađenja. Hibridni kvasac 7 se koristi kao referenca za kvasce prema predmetnom pronalasku.
ZDA1 je kvasac prema pronalasku.
ZDA2 je kvasac pronalaska.
ZDA3 je kvasac pronalaska.
4
[0183] W-34/78 Saccharomyces pastorianus, je komercijalno dostupan lager soj kvasca iz Veihenstephan Hefebank (info@hefebank-weihenstephan.de), Nemačka. Poznato je da ovaj kvasac prilično efikasno redukuje diacetil i pokazuje visoku flokulaciju, ali i dalje značajno manje od soja hibridnog kvasca 7 kada se fermentiše u gore opisanoj vrsti. Koristi se kao referenca za kvasac prema predmetnom pronalasku. W-34/78 se ovde takođe naziva WS34/78.
Primer 1 – Proba od 50 L na 16 i 18 °C sa sojem kvasca ZDA1 i komparativnim sojem Hibridni kvasac 7
[0184] Da bi se ispitala razlika u nivoima diacetila tokom fermentacije novog hibridnog soja kvasca u odnosu na kontrolni soj kvasca, pripremljeno je 50 L piva iz slada kao što je opisano u odeljku sa materijalima i metodama sa °Plato između 15 i 16. Pre fermentacije, slad je podešen na pH od 4,9 i dodat je cink u konačnoj koncentraciji od 0,30 mg/L. Sladovina je inokulisana sa 12-15 miliona vijabilnih ćelija kvasca po ml sladovine. Fermentacija je sprovedena na 16 °C ili 18 °C. Generalno, lageri se fermentišu između 12 °C i 16 °C. Ako kvasac toleriše 18 °C, to može poslužiti za ubrzavanje procesa fermentacije. Uzorci su dobijeni 0. dana i tokom fermentacije kao što je navedeno u tabeli koja sledi. Rezultati su dati u tabelama 3 i 4 ispod i grafički prikazani na slikama od 1 A do C.
Tabela 3. Fermentacija 50 L na 18 °C.
4
Tabela 4. Fermentacija 50 L na 16 °C.
[0185] Za pivo se kaže da je u spec. kada je nivo diacetila ispod 50 ppb, a Plato je stabilan (sav fermentisani šećer je iskorišćen). Prednost je dobiti pivo u spec. u najkraćem mogućem roku, uz proizvodnju najmanje slične količine alkohola u odnosu na kontrolni kvasac.
Nivoi diacetila na 18 °C
[0186] Kao što se može videti iz tabele 3 i slika 1B i 1C, soj kvasca ZDA1 je uspeo da proizvede fermentisanu slad (zeleno pivo) u roku od tri dana gde je nivo diacetila bio blizu 50 ppb i istovremeno je iskorišćen sav fermentisani šećer prisutan u sladu (što se vidi po padu temperature Plato manje od 0,50 tokom 24h) kada je fermentisan na 18 °C. Nasuprot tome, kontrolni soj kvasca Hibridni kvasac 7 je počeo sa veoma visokim nivoom diacetila (Slika 1B) i trebalo mu je 4 dana da dostigne sličan nivo diacetila kao soj ZDA13. dana.
[0187] Najranija tačka u vremenu gde se prividni ekstrakt nije smanjio za više od 0,50° Platona u prethodna 24 sata smatrala se 4. danom za oba soja. Četvrtog dana, zeleno pivo dobijeno sa hibridnim kvascem 7 sadržalo je pribl. 56 ppb diacetila, dok je zeleno pivo dobijeno sa ZDA1 sadržalo samo 26 ppb.
[0188] Kada je fermentacija izvedena na 16 °C (tabela 4 i slika 1A) najranija tačka u vremenu gde se prividni ekstrakt nije smanjio za više od 0,50° Platona u prethodna 24 sata bila je 5. dana za oba soja. U to vreme soj ZDA1 je dostigao željeni nivo diacetila od 50 ppm, dok je kontrolni kvasac hibridni kvasac 7 morao da fermentira dodatna dva dana da bi dostigao nivo diacetila ispod 50 ppm.
Nivoi propanola, izobutanola i SO 2 nakon fermentacije na 16 °C ili 18 °C 16 °C 18 °C [0189] Pored diacetila i Platona, nivo propanola i izobutanola je meren u finalnom pivu napravljenom od probnog piva od 50 L.Finalno pivo je podešeno na sadržaj alkohola od 5,0% po zapremini, CO2do 5,1 g/L i flaširano u zelene boce od 33 cl.Bez ograničavanja teorijom, propanol i izobutanol izobutanoli se veruju da su pokazatelji fluksa ograničenog puta unutar razgranatog lanca aminokiselinskog puta, posebno niske ILV2 aktivnosti kvasca, i stoga je dobar način da se proceni da li soj kvasca ima potencijal da bude nizak proizvođač diacetila.Visok odnos propanola i izobutanola je pokazatelj niskog kvasca koji proizvodi diacetil.Rezultati su prikazani u tabeli 5 u nastavku teksta:
Tabela 5. Sadržaj propanola i izobutanola u fermentisanoj sladovini (zeleno pivo)
[0190] Kao što se može videti iz tabele 5, kako na 16 °C, tako i na 18 °C, zeleno pivo dobijeno fermentacijom pomoću soja hibridnog kvasca ZDA1 pokazalo je više nivoe propanola u poređenju sa zelenim pivom dobijenim pomoću kontrolnog soja kvasca Hibridni kvasac 7. Sladovina inkubirana sa sojem hibridnog kvasca ZDA1 takođe je imala niže nivoe izobutanola u poređenju sa Hibridnim kvascem 7, što je rezultiralo najmanje 6,8 puta većom razlikom u odnosu propanol: izobutanol.
[0191] Takođe je primećeno da je nivo SO2u zelenom pivu dobijenom sa sojem kvasca ZDA1
1
bio viši nego u zelenom pivu od kontrolnog soja.Ovo može da obezbedi prednost u pogledu konzervisanja finalnog piva.
[0192] Slika 3 prikazuje odnos propanola po izobutanolu u komercijalnim pivima, u poređenju sa pivom "kontrolna boca 89-84393 ZDA2" proizvedenim pomoću soja kvasca ZDA2 prema pronalasku. "Kontrolna boca 89-84393 ZDA2" se proizvodi u probama od 50L i vrenjem se gubi do 5%. Sva komercijalna piva imaju niži odnos propanola i izobutanola.
Primer 2 - proba od 50 L na 16 °C sa sojevima kvasca ZDA2 i ZDA3
[0193] Identifikovana su još dva hibridna soja kvasca sa povoljnim diacetilnim profilima i upoređena sa sojem ZDA1 iz primera 1. 50 L piva je pripremljeno od sladovine kao što je opisano u odeljku o materijalima i metodama sa °Plato od 16.Pre fermentacije, sladovina je podešena na pH od 4,9 i dodat je cink do finalne koncentracije od 0,30 mg/L. Sladovina je inokulisana sa 14 miliona vijabilnih ćelija kvasca po ml sladovine.Kvasac za inokulaciju dobijen je iz prve fermentacije od 50 L, gde su ćelije kvasca sakupljene na kraju fermentacije i korišćene za ponovno postavljanje druge probe fermentacije od 50 L. Ovo podseća na način na koji se vrši proizvodnja piva velikih razmera.Fermentacija je sprovedena na 16 °C.Uzorci su dobijeni 0. dana i tokom fermentacije kao što je navedeno u tabeli koja sledi.Rezultati su prikazani u tabeli 6 u nastavku teksta:
Tabela 6. Fermentacija 50 L na 16 °C.
2
[0194] Kao što je prikazano u tabeli 6, sva tri kandidata (ZDA1, ZDA2 i ZDA3) su pokazala nivoe diacetila ispod 50 ppb na dan 4, što odgovara vremenu kada je prividni ekstrakt dostigao plato.Štaviše, ZDA3 je imao nivo diacetila ispod 50 ppb već 3. dana.
Primer 3 - Rezultati degustacije
[0195] Fermentisana sladovina dobijena u primeru 2 je dalje prerađena u finalna piva podešavanjem sadržaja alkohola na 5% po zapremini, CO2na 5,1 g/L i flaširana he u standardnim danskim zelenim bocama od 33 cl.Piva je ocenjivao panel specijalista za degustaciju piva, koji se sastojao od 10 degustatora.Svaki član panela za degustaciju je bio intenzivno obučen, a posebno je svaki član je bio stučan za procenu svojstava ukusa estara, viših alkohola, sumpornih komponenti i tela piva.Svaki član panela za degustaciju ocenjivao je različite note ukusa.Konkretno, ukupni ukus je ocenjivan na skali od 1 do 9 i dat je kao "Glavni rezultat" u tabeli 7 u nastavku teksta.
Tabela 7. Rezultati degustacije piva iz probe od 50 L iz primera 2.
[0196] Kao što je prikazano u tabeli 7, uzorci piva proizvedenih od strane svih sojeva kvasca ocenjeni su sa najmanje 5,7 (Zadovoljavajuće).
Primer 4 - 10 HL suđenja pivom na 16 °C sa sojem kvasca ZDA1 i komparativnim sojem Hibridni kvasac 7
[0197] Svrha ovog primera je bila da se ispita da li hibridni soj kvasca ZDA1 pokazuje isti povoljan diacetilni profil kao što je primećen na skali od 50 L u primeru 1. 10 HL pivo je pripremljeno od sladovine kao što je opisano u odeljku sa materijalima i metodama sa °Plato od pribl. 16. Pre fermentacije sladovina je podešena na pH od 4,95 i dodat je cink do finalne koncentracije od 0,8 mg/L. Sladovina je inokulisana sa najmanje 15 miliona vijabilnih ćelija kvasca po mL sladovine, hibridnih sojeva kvasca ZDA1 ili kontrolnog soja lager kvasca Hibridni kvasac 7, nakon čega je usledila fermentacija na pribl.16 °C. Kvasac za inokulaciju je dobijen iz prvog piva kao što je opisano u primeru 2. Uzorci su dobijeni na dan 0 i na dane navedene u tabeli 8 sa rezultatima, u nastavku teksta. Rezultati su prikazani u tabeli 8 i ilustrovani na slici 2A i B.
Tabela 8. Fermentacija 10 HL na 16°C.
4
[0198] Soj kvasca ZDA1 proizvodi prilično nizak početni nivo diacetila, a zeleno pivo dobijeno sa hibridnim sojevima kvasca ZDA1 dostiglo je blizu praga ukusa diacetila (50 ppb) 4. dana, a 5. dana je bilo smanjeno na 28 ppb. Zeleno pivo dobijeno sa kontrolnim sojem kvasca Hibridni kvasac 7, međutim, prvi put je dostiglo ovaj prag 7. dana (slika 2A). Slika 2B pokazuje da je ukupni nivo diacetila u zelenom pivu dobijenom sa hibridom kvasca ZDA1 blizu 50 ppb približno u isto vreme kada su šećeri koji mogu da fermentišu blizu potpune fermentacije, tj.4. dana.
Primer 5 - Rezultati u vezi sa ukusom
[0199] Fermentisana sladovina dobijena u primeru 4 je dalje prerađena u finalno pivo podešavanjem sadržaja alkohola na 4,6% po zapremini, CO2na 5,4 g/L i flaširana je u braon bocama od 33 cl.Piva su ocenjivana od strane panela specijalista za degustaciju piva u Danskoj i Francuskoj, koji se sastoji od 10 degustatora.Svaki član panela za degustaciju je bio intenzivno obučen, a posebno je svaki član je bio stručan za procenu svojstava ukusa estara, viših alkohola, sumpornih komponenti i tela piva.Svaki član panela za degustaciju ocenjivao je različite note ukusa.Konkretno, opšti ukus je ocenjen na skali od 1 do 9 i dat je kao "Glavni rezultat" u tabeli 9 u nastavku teksta.
Tabela 9. Rezultati degustacije za pivo iz probe od 10 HL iz primera 4.
[0200] Kao što je prikazano u tabeli 9, uzorci piva proizvedeni pomoću soja kvasca ZDA1 ocenjeni su sa 6,6 (Zadovoljavajuće), što je malo iznad piva proizvedenog pomoću kontrolnog soja Hibridni kvasac 7.
Primer 6 - Proba na 16 °C koja uključuje tri kontrolna soja lager kvasca
[0201] Ovaj eksperiment je sproveden da bi se uporedila tri nova soja kvasca iz primera 2 sa dodatnim komercijalno dostupnim sojevima kvasca, kao i kontrolom korišćenom u primerima 1, 2 i 4. 40 L piva je pripremljeno od sladovine kao što je opisano u odeljku o materijalima i metodama sa malom izmenom da je prvo držanje na 52 °C trajalo 30 min. Za fermentaciju, °Plato je bio između 15 i 16. Pre fermentacije, slad je podešen na pH od 4,9 i dodat je cink do finalne koncentracije od 0,30 mg/L. Sladovina je inokulisana sa 7,5 miliona vijabilnih ćelija kvasca po ml hibridnih sojeva kvasca ZDA1, ZDA2 i ZDA3, kao i sa kontrolnim sojem lager kvasca Hibridni kvasca 7, i kontrolnim sojevima lager kvasca W-34/78 koji je komercijalno dostupan iz pivare Vajenstefan, Nemačka. Sladovina je fermentisana na pribl. 16 °C. Uzorci su dobijeni 1. dana i dani su navedeni u tabeli sa rezultatima u nastavku teksta. Rezultati su prikazani u tabeli 10.
Tabela 10. Fermentacija 40 L na 16°C.
[0202] U ovom ispitivanju sva tri niska diacetil soja (ZDA1, ZDA2 i ZDA3) su pokazala nivoe diacetila ispod 50 ppb 5. dana, što odgovara vremenu kada je prividni ekstrakt dostigao plato za sve ispitivane sojeve kvasca, dok nijedan od kontrolnih sojeva nije pokazao nivoe diacetila ispod 110 ppb istog dana.Smatra se da je za sva ova ispitivanja 6. dan najranija tačka u vremenu kada se prividni ekstrakt nije smanjio za više od 0,50 ° Plato, u prethodna 24 sata.6. dana, svi sojevi sa niskim nivom diacetila (ZDA1, ZDA2 i ZDA3) imali su nivo diacetila ispod 45 ppb (24 ppb, 25 ppb i 18 ppb, respektivno), dok su kontrolni sojevi (Hibridni kvasac 7, W-34/70 i W-34/78) imali više nivoe diacetila (115 ppb, 62 ppb i 62 ppb, respektivno).
[0203] Ovi rezultati su prilično upečatljivi s obzirom na to da je Vajhenštefan kvasac manje flokulentan od soja Hibridni kvasca 7 i sojeva prema pronalasku. Broj ćelija u tečnosti (iznad peleta kvasca) na kraju fermentacije je dobra mera flokulacije. Ovi podaci su prikazani u tabeli 10 iznad kao Ćelije u tečnosti (što je niža vrednost, to je kvasac flokulentniji). Visoka flokulacija je prednost kada se kvasac sakuplja iz rezervoara za proizvodnju kako bi se inokulisala sledeća sladovina za proizvodnju piva. Ako je flokulacija kvasca niska, ovaj proces će zahtevati hlađenje zelenog piva i do 24 sata. Visoka flokulacija, s druge strane, može da dovede do manje kontakta između kvasca i sladovine tokom fermentacije, što će verovatno smanjiti brzinu kojom kvasac može da konzumira diacetil i produžiti vreme fermentacije.
[0204] Primeri opisani ovde dakleobezbeđuju sojeve kvasca koji su u stanju da smanje diacetil na manje od 50 ppb približno u isto vreme kada su šećeri koji mogu da se fermentišu potrošeni (ili čak i pre toga) i istovremeno, zbog svoje visoke flokulacije na 16°C, ne zahtevaju dodatno hlađenje zelenog piva kako bi se kvasac sakupio za sledeću proizvodnju piva.
[0205] Osim toga, može se videti da se sojevi kvasca sa niskim diacetilom lako mogu identifikovati putem odnosa propanol/izobutanol, jer su svi iznad 6, dok su kontrolni sojevi svi ispod 1,4.
Primer 7 - Genotipizacija sojeva kvasca
Asembliranje genoma
[0206] Za četiri (Hibridni kvasac 7, ZDA1, ZDA2 i W 34-78) od pet genoma primenjen je pristup tandem analize u kome se koriste NGS podaci sa platformi Illumina i Pacbio. Kontrola kvaliteta, filtriranje i asembliranje su sprovedeni u skladu sa in-house dizajniranim cevovodom. Svi genomi su de novo asemblirani pomoću softvera Canu 1.9 koji koristi podatke generisane od strane Pacbio platforme. Nakon toga su očitavanja generisana od strane Illumina platforme mapirana (Pilon 1.22) u poređenju sa asembliranim genomima koji je produkovao Canu 1.9, kako bi se poboljšala tačnost konsenzusa preliminarno asembliranih genoma. Za genom ZDA3, zbog odsustva Illumina podataka, korišćen je samo Canu 1.9 bez daljeg poboljšanja asembliranja.
[0207] Dobijeni asemblirani genomi su korišćeni u BLAST upitima.
Blast i poravnanje pogodaka
[0208] Za svaki od gena ( ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1, BAT2) korišćena je odgovarajuća aminokiselinska sekvenca gena S. cerevisiae kao sekvenca upita za svaki od 5 genoma, koristeći TBLAStN algoritam.N kraju su pogoci filtrirani zadržavanjem onih koji imaju najmanje 65-80% identičnosti sekvence ili pokrivaju najmanje 40% dužine sekvence upita.Poravnavanje sekvenci aminokiselina ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1, BAT2 između WS34-78, cer ( Saccharomyces cerevisiae) , eub (Saccharomyces eubayanus ), Hibrid7 (Hibridni kvasac 7), ZDA1 i ZDA2 su prikazani na slikama 4-9
[0209] BLAST analiza nije ponovljena za odgovarajuće gene S. Eubayanus, jer je u poslednjem koraku filtriranja bilo dozvoljeno da pogoci imaju samo 65% identičnosti sekvence, tako da bi u ovoj postavci svi pogoci i iz S. cerevisiae i iz S. eubayanus bili uhvaćeni zbog velike međusobne sličnosti.MUSCLE (3.8) alat za višestruko poravnavanje sekvenci korišćen je za poravnavanje svih pogodaka identifikovanih BLAST analizom.
Analiza za identifikaciju ploidije
[0210] Analiza za identifikaciju ploidije je sprovedena primenom modifikovane verzije spplDer algoritma.Kratka očitavanja četiri od pet genoma na Illumina platformi su mapirana u kombinovani referentni genom S. cerevisiae i S. eubayanus i očitavanja sa kvalitetom mapiranja (MQ) >3 su zadržana i sortirana u redosled kombinovanog referentnog genoma; zatim je izračunata pokrivenost u kombinovanom referentnom genomu.Prilagođeni skript je zatim izračunao srednju pokrivenost za svaku vrstu, i kombinovani referentni genom je podeljen u prozore.
Tehnički nedostaci BLAST analize
[0211] Korišćenje BLAST analize za proučavanje uticaja genomskih razlika na fenotip sojeva pati od različitih nedostataka, od kojih su najvažniji:
i) nemogućnost da se procene duplikacije na nivou gena i/ili hromozoma
ii) osetljivost na greške ili dvosmislenosti u proizvodima asembliranja
[0212] Sve metode asembliranja genoma imaju probleme pri kreiranju smislenih proizvoda asembliranja u prisustvu poliploidije.Ovo dovodi do ishoda gde se više regiona iz različitih hromozomskih kopija sklapa u jedan kostur.U principu, situacija je manje ozbiljna kada dođe do duplikacije gena, jer se one mogu identifikovati korišćenjem specifičnih metoda asembliranja i pravilnih eksperimentalnih postavki.Međutim, još uvek je vrlo verovatno da duplikacije gena neće biti pravilno detektovane u fazi asembliranja, posebno ako u različitim kopijama nema genomskih razlika, ili su ograničeno prisutne.Što se tiče druge tačke, BLAST bi u principu mogao da identifikuje detaljnije informacije o različitim varijantama, kao što su funkcionalni SNP i nefunkcionalni ORF.Međutim, greške ili dvosmislenost prilikom asembliranja mogu da produkuju veliki broj lažnih poziva - npr. lažne SNP i dvosmislene arhitekture gena.
[0213] Zbog toga smo odlučili da paralelno sa jednostavnom BLAST identifikacijom varijanti izvršimo procenu posmatrane ploidnosti svakog genomskog regiona u podacima o sekvenciranju, što je rezultiralo ploidnošću hromozoma i duplikacijom ili delecijom gena.
[0214] Generacija de novo asembliranog genoma sa razrešenim haplotipom i dalje ostaje veliki izazov. NGS tehnike (Pacbio i Illumina) proizvode ogromnu količinu podataka, ali je i dalje tehnički teško razlikovati greške i prave varijante sekvence. Povrh toga, potrebno je dodeliti prave varijante različitim kopijama genoma kada je uzorak poliploidan. Asemblirani genomi u ovim analizama su izvedeni korišćenjem algoritama koji nisu upoznati sa haplotipom, tako da je finalni asemblirani genom predstavljao genom sa smanjenim haplotipom.
Rezultati
[0215] Rezultati su prikazani u tabeli 11 u nastavku teksta.
1
Tabela 11. Identifikovane alelne kopije odabranih gena u sojevima kvasca ZDA1, ZDA2, ZDA3, W-34/78 i Hibridni kvasac 7
2
[0216] Broj u zagradama je režim ploidije hromozoma. Broj bez zagrada je ploidija genske lokacije na tom hromozomu.
Primer 8 - Komercijalni pivarski test sa sojem kvasca ZDA2 i komparativnim sojem Hibridni kvasac 7
[0217] Svrha ovog primera je bila da se ispita da li je hibridni soj kvasca ZDA2 pokazao isti povoljan profil diacetila kao u prethodnim primerima kada se primenjuje u komercijalnoj proizvodnji piva (približno 1800 HL) gde se kvasac sakuplja i ponovo ubacuje.
[0218] 1800 HL piva je pripremljeno od sladovine koja sadrži slad i pomoćne sastojke dobijene konvencionalnim infuzionim gnječenjem i sa °Plato od pribl. 16. Pre fermentacije sladvinao je podešena na pH od 4,9- 5,0. Sladovina je ponovo postavljen sa generacijom 8 i ZDA2 i kontrolnim lager sojem kvasca Hibridni kvasac 7, i fermentisan na približno 16 °C. Uzorci su dobijeni na dan 0 i na dane navedene u tabeli rezultata 12 ispod i ilustrovane na slici 10.
Tabela 12. Fermentacija 1800 HL na 16°C.
4
[0219] Soj kvasca ZDA2 produkuje dosta nizak nivo diacetila tokom celokupne fermentacije, a zeleno pivo dobijeno sa hibridnim sojem kvasca ZDA2 dostiglo je prag ukusa za diacetil (50 ppb) već 6. dana. U to vreme plato se nije smanjio za više od 0,5 u poslednja 24 sata.Zeleno pivo dobijeno sa kontrolnim sojem kvasca Hibridni kvasac 7, nije dostiglo prag ukusa za diacetil 7. dana, dva dana nakon što se plato nije smanjio više od 0,5 tokom 24 sata (slika 10).Shodno tome, specifikacije za zeleno pivo u smislu diacetila i platoa su dostignute najmanje 2 dana ranije kada se koristi kvasac ZDA2, u poređenju sa referentnim kvascem, Hibridnim kvascem 7.
[0220] Zanimljivo je da je ZDA2 kvasac dostigao pravi stepen fermentacije (RDF) koji je bio 2% niži od hibridnog kvasca 7, dok je procenat alkohola skoro sličan kod dva zelena piva.Shodno tome, ZDA kvasac je u stanju da proizvede istu količinu alkohola sa nižim stvarnim stepenom fermentacije, što će rezultirati pivom sa boljim osećajem u ustima.Ovaj trend smanjenja RDF-a od 1,5 do 2,5% na istom nivou alkohola za kvasac ZDA2 primećen je u svim generacijama fermentacija koje su prethodile 8<.>generaciji prikazanoj u ovom primeru (videti tabelu 13).
Tabela 13 - RDF i ABV tokom 8 generacija fermentacija.
Primer 9 - Hibrid Nanopore - Illumina sekvenciranje i bioinformatička evaluacija pivskih sojeva u cilju izračunavanja broja kopija relevantnih gena
[0221] Sojevi su sekvencirani korišćenjem platforme Illumina kao što je prethodno opisano.
[0222] Za nanoporno sekvenciranje, DNK ultra visoke molekulske mase je pripremljena korišćenjem metodologije koju su naveli Denis i saradnici.
[0223] Da bi se pripremila HMV gDNK za sekvenciranje, uzorci su obrađeni pomoću Zimo Genomic Clean and Concentrator kolona i nakon toga su provereni kvalitet i kvantitet pomoću fluorometrijskog testa širokog opsega deNovik dsDNK.
[0224] Svi uzorci su multipleksirani, a biblioteke su generisane korišćenjem SKK-LSK109 hemije i nativnih produžnih paketa barkoda EKSP-NBD104 i EKSP-NBD114 iz Oksford Nanopore Technologies.Svi neophodni koraci čišćenja izvršeni su korišćenjem Clean NA magnetnih perlica za NGS.Sekvenciranje genoma se odvijalo na MinlOn FlovCells FLO-MIN106D tokom 48-72h.
[0225] Sirovi podaci o sekvenciranju su bazirani korišćenjem bonito (https://github.com/nanoporetech/bonito) i demultipleksirani korišćenjem guppi (https://nanoporetech.com/nanopore-sequencing-data-analysis).Skupštine hibridnog genoma su izvedene korišćenjem Marsurke (https://github.com/alekseyzimin/masurca) u kombinaciji sa fastk fajlovima Nanopora i Ilumine i okupljeni genomi su označeni prokkom. (https://github.com/tseemann/prokka ).Pokrivenost sekvenciranjem i broj kopija gena od interesa izračunati su sa kvalimapom (http://qualimap.conesalab.org/ ) i vizualizovani pomoću Integrativnog prikazivača genomike (https://software.broadinstitute.org/software/igv/ ).
[0226] Mapiranje čitanja i detekcija SNP-a izvršeni su u radnoj klupi CLC Genomics (verzija 11).Ukratko, podšišani čitaoci su mapirani na hibridni genom kvasca "in silico" koji se sastojao od spoja S . eubayanus (Pristupanje: GCA_0012986.25.1) i S . cerevisiae (GCA_000146045.2) genoma.Koristeći osnovni alat za detekciju varijanti, detektovani su jednonukleotidni polimorfizmi (SNP) i insercije/brisanja (indeli).Ovde se broj funkcionalne kopije ILV2 gena može proceniti na osnovu dijagnostičkih SNP-a koji su postojali na pojedinačnim alelima unutar ZDA kvasca.
[0227] U S genima . cerevisiae ILV2 postoji C' frejmšift koji inaktivira dobijeni protein (Leu575fs) zbog umetanja T nukleotida unutar ovog kodona.Procenat Illumina očitanih mapiranja na ovoj frekvenciji bio je otprilike 33% što sugeriše da je 1 od 3 ILV2sc kopije inaktivirana.Dalje je uočeno da je kod eubajanusovih ILV2 alela, delecija T nukleotida dovela do promene okvira što rezultira inaktivirajućom skraćivanjem (Leu304fs).Poznavanje broja kopije (CN) ILV2 cerevisiae gena omogućilo je izračunavanje broja kopije drugih gena na osnovu mapiranja čitanja kao što je prethodno opisano.Procena WS34/78 CN je takođe zasnovana na proceni zasnovanoj na mapiranju očitavanja, gde je broj kopije ILV2 zasnovan na prethodnim dokazima da je veoma sličan soj (WS34/70) tetraploidni kvasac sa jednakim sadržajem S. cerevisiae i S. eubayanus genoma (Valther et al.2014).Štaviše, u primeru 10, prilikom uklanjanja ILV2 eubajanus alela, primećeno je da WS34/78 zaista ima dve kopije ILV2 euibanus alela (ukupno 4 ILV2 alela, uključujući cerevisiae alele).Ovi rezultati su sažeti u Tabeli 14.
Tabela 14. Izračunati brojevi funkcionalnih kopija gena od interesa.Cere se odnose na alele Cerevisiae, a Eub na alele Euybanus.
[0228] Referentni soj WS3478 ima 4 funkcionalne kopije ILV2 gena, dok ZDA1 i ZDA2 imaju samo 2 funkcionalne kopije ovog gena. Pored toga, WS3478 ima 4 funkcionalne kopije ILV3 i 3 funkcionalne kopije ILV5, dok je ovaj broj 6 i 5, respektivno, za ZDA1 i ZDA2 sojeve.
Primer 10 - Adaptacije broja kopija gena u modelu pivskog kvasca W-34/78
[0229] Generalni cilj ovog eksperimenta bio je da se broj kopija relevantnih gena u modelu soja kvasca (soj Saccharomyces pastorianus ssp. carlsbergensis (WS34/78) prilagodi tako da reflektuje genotip ZDA1 i ZDA2. WS34/78 je komercijalno dostupan u pivari Weihenstephan, Nemačka, a ovde se označava i kao W-34/78. Da bi se ovo postiglo, geni u soju WS34/78 morali su da budu ili inaktivirani ili dodatno eksprimirani u skladu sa Tabelom 15.
Tabela 15. Neophodne izmene u genotipu soja WS34/78 u cilju odražavanja relevantnog genotipa nisko-diacetilnih sojeva od interesa
[0230] Inaktivacija je urađena uz pomoć rezistencije na antibiotske kasete koje su ciljale kodirajuće sekvence gena od interesa (tj. ILV2). Ovde je kodirajuća DNK sekvenca (CD) petljana putem homologe rekombinacije na način da je ostalo samo 99 bp N-terminalnog regiona, i 107 bp C-terminalnog regiona gena. Prekomerna ekspresija gena (tj. ILV3 i ILV5) izvršena je na način koji je ostavio autentični genomski kontekst intaktnim, tj. klonirana je kaseta koja je obuhvatala otprilike 1 kbp uzvodno od CD-ova, CD-ova i 0,5 kbp nizvodno od CD-ova. Kaseta se sadrđi nativne promotorske i terminatorske sekvence, i ekspresija dodatnih kopija gena je verovatno pod nativnom kontrolom. Osim toga, korišćen je plazmid kvasca sa jednom kopijom, tako da je broj kopija bio pod kontrolom.
Transformacija WS34/78 ćelija
[0231] Ćelije Saccharomyces pastorianus ssp. carlsbergensis soja WS34/78 su kompetentne za unos DNK nakon metode koju su opisali Gietz and Schiestel (DOI: 10.1038/nprot.2007.17).Rutinski, ćelije su transformisane sa 1 µg plazmidne DNK ili PCR-amplikona.Trajanje tretmana toplotnim udarom smanjeno je na 15 min dok je temperatura održavana na 42°C.
Generisanje ekspresionih kaseta
[0232] Na osnovu informacija o DNK-sekvenci soja WS34/78 iz primera 9, ekspresione kasete generisane su PCR-amplifikacijom nativnih WS34/78 DNK-sekvenci koje se sastoje od otprilike 1000 bp uzvodno od CD-a i 500 bp nizvodno od CD-a, što obuhvata prirodne promotorske i terminatorske sekvence. Tačna dužina amplikona može se izvesti iz odgovarajućih sekvenci prajmera datih u primerima. cds-bočni regioni od 1000 bp ili 500 bp, treba da omoguće autentičnu / nativnu kontrolu gena od interesa. Klonirani PCR-amplikoni (u plazmidu / integrisani u hromozom) su kontrolisani Sanger-DNK sekvenciranjem sa izolovanom plazmidnom DNK kao matricom za reakcije sekvenciranja.
Integracija ekspresionih kaseta u hromozom
[0233] U prvom koraku, ekspresiona kaseta je asemblirana fuzijom modula ekspresije gena sa modulom rezistencije na antibiotike što omogućava pozitivnu selekciju integracionog događaja.Kaseta je spojena sa PCR-amplikonima koji kodiraju segmente DNK za homologu rekombinaciju sa hromozomom WS34/78.Mesta za integraciju su bila PAD1 lokusi WS34/78, jer ovaj gen nije funkcionalan u ovom kvascu, pa zamena ovog gena tako nema uticaja na profil ukusa.Bočni regioni koji su korišćeni za homologu rekombinaciju imali su dužinu od oko 500 bp.Klonovi kvasca koji su rasli u prisustvu antibiotika analizirani su pomoću PCR (tj. PCR u koloniji), radi verifikacije insercije kasete.Dalje su analizirane mutacije u ekspresionom modulu kod pozitivnih klonova.Amplikoni koji pokrivaju ekspresioni modul su kontrolisani DNK sekvenciranjem po Sangeru.
Kloniranje ILV-gena u plazmid PYESVIII
[0234] Plazmid pYESVIII (BRAIN;) je .coli - vektor šatla kvasca koji se replicira na visokom broju kopije u E. coli i održava se kao plazmid jedne kopije u ćelijama kvasca zbog CEN6 ori replikacije.Ekspresione kasete su rutinski umetnute u više lokacija za kloniranje pomoću Gibson sklopa.
[0235] Ako je trebalo inserirati dve kopije istog alela, poželjno je jedna kopija gena od interesa (GOI) imala autentičnu DNK sekvencu, dok su cd sekvence druge kopije izmenjene na način koji je ostavio nativnu proteinsku sekvencu nepromenjenom. Ovo je postignuto hemijskom sintezom gena koristeći algoritme za optimizaciju ekspresije gena u ćelijama kvasca (optimizacija upotrebe kodona). Ovo je učinjeno kako bi se smanjile šanse za rekombinacione događaja nakon transformacije plazmida u ćelije kvasca.
[0236] Za ekspresiju ILV3 gena iz plazmida, asembliran je tandem konstrukt (bi-cistronska ekspresija). Ovde jedan promotor upravlja ekspresijom dve ILV3 kodirajuće sekvence (jedna nativna, jedna sintetička cd sekvenca). Dve kodirajuće sekvence se spajaju 2A-peptidnim linkerom koji omogućava preskakanje ribozoma, tako da se obe cd sekvence translatiraju pod kontrolom nativnog ILV3 promotora.2A-peptidna tehnologija menja C-terminus prvog proteina dodavanjem 3 aminokiselinske oznake (NPG), dok N-terminus narednog proteina počinje sa prolinom (Liu, Z. et al., 2017; DOI: 10.1038/s41598-017-02460-2).
[0237] E. coli je transformisana sa in vitro asembliranim plazmidima, plazmidi su izolovani iz transformanata, kontrolisani restrikcionom digestijom i DNK sekvenciranjem, a zatim transformacijom kompetentnih WS34/78 ćelija.
Tabela 16. Sojevi i plazmidi koji se koriste/konstruišu u projektu.Subskript sc označava Saccharomyces cerevisiae gene i eu označava Saccharomyces eubayanus gene u interspecies hibridnog pivarskog kvasca WS34/78.
1
Primeri / mutantne varijante S. pastorianus WS34/78
Rekombinantni sojevi
Generisanje soja br.2
Matrice za PCR:
[0238] Plazmid pYES5-Cen6-Sh.ble (sc) 2.0 (BRAIN), koji kodira Sh.ble kasetu gDNK S. pastorianus WS34/78, soj br.1 (tabela 16)
Korišćeni prajmeri:
[0239]
CPA43: SEQ ID NO: 44
CPA44: SEQ ID NO: 45
CPA49: SEQ ID NO: 46
CPA50: SEQ ID NO: 47
CPA51: SEQ ID NO: 48
CPA52: SEQ ID NO: 49
[0240] Sh.ble-kaseta (fragment 1) je amplifikovana sa plazmida pYES5-Cen6-Sh.ble ( Saccharomyces cerevisiae (sc)) 2.0 (BRAIN Biotech AG) koristeći prajmere CPA43/44.Homologii krakovi su generisani amplifikacijom ILV2 ( Saccharomyces eubayanus (se)) bočnih regiona iz gDNK soja br.1 sa prajmerima specifičnim za alele CPA49/51 (5'-bočni region; fragment 2) i CPA50/52 (3'-bočni region; fragment 3).HR matrica je generisana uz
2
pomoć PCR ekstenzije preklapanja korišćenjem prajmera CPA49/50 i fragmenata 1 2 3 kao matrice.Alelno specifični nokaut ILV2 (se) putem homologe rekombinacije potpomognut je NUCLEASE tehnologijom koja je vlasništvo kompanije BRAIN.Ovo je rezultiralo velikim brojem sojeva koji su imali jednostruku ili dvostruku integraciju na ILV2 (se) lokusu i bili su vidljivi na agaroznom gelu.Za nizvodnu analizu izabran je soj sa dvostrukom delecijom ILV2 (se).
[0241] Sekvenca ILV2 (se) nokaut kasete: SEQ ID NO: 50
Generisanje soja br. 3
Matrice za PCR:
[0242]
gDNK S . pastorianus WS34/78, soj br.1 (tabela 16)
NTC-DNK kaseta (Nourseothricin); BRAIN Biotech AG
Korišćeni prajmeri:
[0243]
CPA70: SEQ ID NO: 51
CPA71: SEQ ID NO: 52
CPA91: SEQ ID NO: 53
CPA96: SEQ ID NO: 54
CPA111: SEQ ID NO: 55
CPA112: SEQ ID NO: 56
CPA113: SEQ ID NO: 57
CPA114: SEQ ID NO: 58
CPA128: SEQ ID NO: 59
CPA129: SEQ ID NO: 60
[0244] Ekspresiona kaseta ILV3 (se) (produkt1) amplifikovana je iz gDNK soja br. 1 sa prajmerima specifičnim za alele CPA70/71.Produkt1 je zatim dodatno amplifikovan pomoću prajmera CPA70/129, što je rezultiralo produktom2.Amplifikacija NTC-ekspresione kasete (produkta) izvršena je sa prajmerima CPA91/96 i NTC-DNK lancem kao matricom.Produkt4 je generisan amplifikacijom produkata pomoću prajmera CPA91/128.Proizvodi i produkt4 su asemblirani pomoću kompleta NEBuilder<®>HiFi DNA Assembly kit i amplifikovani pomoću prajmera CPA70/91, kako bi bio kreiran fragment1.Homologi krakovi su generisani amplifikacijom PAD1 bočnih regiona iz gDNK soja br. 1 sa prajmerima CPA111/112 (5'-bočni region; fragment 2) i CPA113/114 (3'-bočni region; fragment 3).Finalna ILV3-NTC integraciona kaseta generisana je asembliranjem fragmenta 1 2 3, a zatim je izvršena amplifikacija sa prajmerima CPA111/114.Da bi se generisao soj br. 3, soj br. 2 je transformisan sa finalnom ILV3-NTC integracionom kasetom.
Sekvenca ILV3 (se) - NTC integracione kasete: SEQ ID NO: 61
Rekombinantni plazmidi
Konstrukcija plazmida br. 1
Priprema vektora
[0245] Plazmid br. 0 (pYESVIII, BRAIN Biotech AG) je linearizovan korišćenjem Pmel prisutnog na mestu višestrukog kloniranja. Pre prečišćavanja hidrolizovani vektor je defosforilisan.
Generisanje vektorskog inserta
Matrica za PCR:
[0246] gDNA S. pastorianus WS34/78, soj br.1, tabela 16)
Korišćeni prajmeri:
[0247]
CPA74: SEQ ID BR: 62
CPA75: SEQ ID BR: 63
4
CPA86: SEQ ID BR: 64
CPA87: SEQ ID BR: 65
[0248] Nativna ILV5-ekspresiona kaseta (sc) je amplifikovana iz WS34/78 gDNK korišćenjem prajmera specifičnih za alele CPA74/75. Vektorski insert je tada generisan pojačavanjem dobijenog PCR proizvoda prajmerima CPA86/87.
[0249] ILV5-ekspresioni vektor (plazmid #1) je sastavljen preko NEBuilder<®>HiFi DNK asemblera i E. coli DH10transformisani su reakcionim proizvodom.
[0250] Nakon pripreme plazmida ekspresiona kaseta je analizirana Sanger-DNK sekvenciranjem.
Sekvenca ILV5 (sc) ekspresione kasete: SEQ ID NO: 66
Primer 11 - Dodatne adaptacije broja kopija gena u modelu pivskog kvasca WS34/78
[0251] Svrha ovog eksperimenta bila je slična kao u primeru 10, tj. da se generišu dodatno genetski modifikovani sojeve kvasca WS34/78 kako bi se broj kopija relevantnih gena prilagodio tako da odražava genotip ZDA1 i ZDA2.
PCR nativnih gena Saccharomyces cerevisiae
[0252] S. cerevisiae geni ILV3, BAT1, BAT2, i ILV6, zajedno sa svojim nativnim promotorima i terminatorskim regionima, pojačani su iz Vajhenštajn 34/78 (W34/78) lager kvasca koristeći prajmere SEQ ID br. 67 do SEQ ID br. 74 i Phusion<®>High-Fidelity DNA polimeraze (New England BioLabs).Regioni za ciljanje nativnog promotora i terminatora odabrani su približno 1000 baznih parova uzvodno od start kodona (promotora) i 400 baznih parova niz tok stop kodona (terminatora) prema prethodnoj literaturi (Mumberg et al, 1995).Genomska DNK korišćena kao matrica za PCR reakcije je ekstrahovana iz kvasca W34/78 pomoću kompleta MasterPure Yeast DNA Purification Kit fabr. br. MPY80200 kompanije Lucigen.
[0253] Prajmeri koji se koriste za amplifikaciju uzvodno i nizvodno od željenih S. cerevisiae gena:
ScILV3_F: SEQ ID NO: 67
ScILV3_R: SEQ ID NO: 68
ScBAT1_F: SEQ ID NO: 69
ScBAT1_R: SEQ ID NO: 70
ScBAT2_F: SEQ ID NO: 71
ScBAT2_R: SEQ ID NO: 72
ScILV6_F: SEQ ID NO: 73
ScILV6_R: SEQ ID NO: 74
Kloniranje PCR fragmenata u plazmidne vektore Gibsonovim asembliranjem i transformacija u ćelijama E. coli
[0254] Čisti PCR fragmenti su klonirani u centromerni vektor sa jednom kopijom koji sadrži kanMX G418 marker otpornosti.U nekim slučajevima, geni su kombinovani kako bi kreirali plazmide koji sadrže više od jednog gena. pSH67 firme Euroscarf (http://www.euroscarf.de/plasmid details.php?accno=P30673) je linearizovan pomoću Pvull-HF (New England BioLabs) na 37 ºC tokom 60 minuta da bi se uklonio konstrukt koji eksprimira Cre.Linearizovani plazmid je zatim ligiran T7 DNK ligazom (New England BioLabs) na 25 ºC preko noći.Ligirani plazmid je transformisan u kompetentne ćelije NEB 5αEscherichia coli (New England BioLabs) i položen na agar ploče Lysogeny Broth (LB) koje sadrže ampicilin (100 µg/mL).Ovaj plazmid je zatim korišćen kao okosnica za inserciju gena od interesa.
[0255] Vektor digeriran pomoću Pvull-HF i inserti amplifikovani pomoću PCR reakcije su asemblirani pomoću kompleta NEBuilder<®>HiFi DNA Assembly (New England BioLabs).Korišćen je odnos inserta i vektora 3:1 i reakcija je inkubirana na 50 ºC tokom 60 minuta.Reakcija je zatim transformisana u kompetentne ćelije NEB 5α E. coli (New England BioLabs) i zasejana na LB agar ploče koje sadrže ampicilin (100 µg/mL).Klonovi su gajeni na LB tečnom medijumu sa ampicilinom (100 µg/mL), a plazmid je ekstrahovan korišćenjem kompleta Monarch Plasmid MiniPrep Kit (New England BioLabs).
[0256] Plazmidi u jednoj kopiji, kreirani u ovoj studiji bili su:
1. pSH67-ScILV3
2. pSH67-ScILV3-ScBAT1
3. pSH67-ScILV3-ScBAT2
4. pSH67-ScILV6
5. pSH67-ScBAT2
Transformacija kvasca sa vektorima i konstruisanim kvascima
[0257] Kvasci Vajenstefan 34/78 i soj br. 2 iz primera 10 (Vajenstefan 34/78 sa dve izbrisane kopije gena S. eubayanus ILV2, takođe pod nazivom WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R) su transformisani sa plazmidima putem elektroporacije u skladu sa protokolom autora Benatuil et al. 2010. Izvršene su neke manje modifikacije: kvasac je gajen na 25 ºC i izdvojen 2-3 sata nakon elektroporacije i ćelije su posađene na YPD agar ploče koje sadrže geneticin G418 (200 µg/mL).
[0258] Kvasci generisani u ovoj studiji prikazani su u tabeli 17 u nastavku teksta.
Tabela 17.Kvasci generisani transformacijom plazmida sa jednom kopijom
Primer 12 - Procena svojstava fermentacije modifikovanih WS34/78 sojeva
[0259] Sojevi su fermentisani u cilindričnim sudovima kao što je prethodno opisano. Ćelije su gajene preko noći u 10 ml tečnog YPD koji sadrži 25 µg/ml gentamicina (G418) pre nego što su prebačene u 20ml prethodno opisane pilsner sladovine koja sadrži 100 µg/ml G418. Ispuštanje ćelija je izvršeno kao što je prethodno opisano u pilsner sladini koja sadrži 100 µg/ml G418. Merenje Plato stepeni, diacetila i isparljivih supstanci vršena su 3, 4. i 5. dana fermentacije. 5. dana su uzeti profili ugljenih hidrata i uzorci profila estara.
[0260] Genotipovi testiranih sojeva kvasca prikazani su u tabeli 18 u nastavku teksta.
Tabela 18. Genetski modifikovani kvasac kreiran u primerima 10 i 11, testiran u ovom primeru.
[0261] Rezultati fermentacije sa svakim sojem kvasca su sumirani u tabelama 19 i 20, u nastavku.
Tabela 19. Rezultati fermentacije sa genetski modifikovanim kvascem kreirani u primerima 10 i 11 (ukupan diacetil).
Tabela 20. Rezultati fermentacije genetski modifikovanim kvascem kreiranim u primerima 10 i 11 (odnos propanol/izobutanol). n.m. = nije mereno.
[0262] Treba napomenuti, da su genetski modifikovani sojevi ovog primera fermentisani u prisustvu antibiotika, pa bi rezultati gore navedeni mogli biti malo drugačiji kada se sojevi fermentišu industrijski bez prisustva antibiotika. Konkretno, sojevi će verovatno imati bržu stopu rasta, a fermentacija će se tako odvijati brže. Slično tome, očekuje se da će se redukcija inicijalno proizvedenog diacetila odvijati brže.
[0263] Soj sa najmanjom količinom ukupnog diacetila u test rastvoru 5. dana bio je soj sa dve kopije ILV2 gena deletirane, dodatna kopija ILV3 genomski integrisana i dodatna kopija ILV5 eksprimirana sa plazmida sa jednom kopijom (FGMO0094).
Spisak sekvenci
[0264]
1
2
Reference
[0265] Lorenzo Benatuil, Jennifer M. Perez, Jonathan Belk, Chung-Ming Hsieh, An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries, Protein Engineering, Design and Selection, Volume 23, Issue 4, April 2010, Pages 155-159, https://doi.org/10.1093/protein/gzq002
Briggs, D. E. et al. Malting and Brewing science. 1981.
Denis E, Sanchez S, Mairey B et al. Extracting high molecular weight genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae, Protocol Exchange DOI 10.1038/protex.2018.076
Hough, J. S. et al. Malting and Brewing science: Hopped Wort and Beer, Volume 2.1982.
Gutierrez A, Boekhout T, Gojkovic Z, Katz M. Evaluation of non-Saccharomyces yeasts in the fermentation of wine, beer and cider for the development of new beverages J Inst Brew 2018 DOI 10.1002/jib.512
Mumberg D, Müller R, Funk M
4
Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds Gene 1995:156:119-22.
doi: 10.1016/0378-1119(95)00037-7
Walther A, Hesselbart A, Wendland J. Genome Sequence of Saccharomyces Carlsbergensis, the World's First Pure Culture Lager Yeast G3 (Bethesda) 2014:4:783-93.

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Soj kvasca koji kodira u svom genomu
a. najviše dva funkcionalna gena koji kodiraju ILV2, pri čemu svaki gen koji kodira ILV2 kodira ScILV2 iz SEQ ID NO: 32 ili SeILV2 iz SEQ ID NO: 38, ili funkcionalni homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence; i
b. najmanje pet funkcionalnih gena, recimo najmanje šest funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, pri čemu svaki gen koji kodira ILV3 kodira ScILV3 iz SEQ ID NO: 35 ili SeILV3 iz SEQ ID NO: 41, ili funkcionalni homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
2. Postupak ili soj kvasca prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedeni soj kvasca kodira u svom genomu najmanje četiri funkcionalna gena koji kodiraju ILV5, recimo, najmanje pet gena koji kodiraju ILV5, pri čemu svaki gen koji kodira ILV5 kodira ScILV5 iz SEQ ID NO: 34 ili SeILV5 iz SEQ ID NO: 40, ili funkcionalni homolog sa njima koji deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
3. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što su geni koji kodiraju ILV2, ILV3 i/ili ILV5 eksprimirani sa svojih nativnih promotora, opciono pri čemu su geni koji kodiraju ILV6, BAT1 i/ili BAT2 eksprimirani sa svojih nativnih promotora.
4. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni soj kvasca ne sadrži heterologu DNK i/ili navedeni soj kvasca nije podvrgnut koraku genetskog inženjeringa.
5. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni soj kvasca ima najviše 15 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, kao što je između 5 i 10 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, kao što je između 5 i 6 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV3, i/ili
gde navedeni soj kvasca ima najviše 15 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, recimo između 4 i 10 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5, recimo između 4 i 5 funkcionalnih gena koji kodiraju ILV5 i/ili gde navedeni soj kvasca ima najviše četiri funkcionalna gena koji kodiraju ILV6, pri čemu svaki gen koji kodira ILV6 kodira SclLV6 iz SEQ ID NO: 33 ili SelLV6 iz SEQ ID NO: 39, ili homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence, i/ili
pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje tri funkcionalna gena, recimo najmanje četiri funkcionalna gena koji kodiraju BAT1, pri čemu svaki gen koji kodira BAT1 kodira ScBAT1 iz SEQ ID NO: 36 ili SeBAT1 iz SEQ ID NO: 42, ili homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence, i/ili
pri čemu navedeni soj kvasca ima najmanje četiri funkcionalna gena, recimo najmanje pet funkcionalnih gena koji kodiraju BAT2, pri čemu svaki gen koji kodira BAT2 kodira ScBAT2 iz SEQ ID NO: 37 ili SeBAT2 iz SEQ ID NO: 43, ili homolog koji sa njima deli najmanje 80% identičnosti sekvence.
6. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je zbir funkcionalnih gena u navedenom soju kvasca koji kodira ILV2 i ILV6 niži od zbira gena koji kodiraju ILV5 i ILV3.
7. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što u navedenom soju kvasca odnos funkcionalnih gena ILV5 i ILV3 prema ILV2 iznosi najmanje 1, recimo najmanje 1,5, recimo najmanje 2, recimo najmanje 2,5 ili recimo najmanje 3 i/ili u navedenom soju kvasca odnos funkcionalnih gena ILV5 i ILV3 prema ILV2 i ILV6 iznosi najmanje 1, recimo najmanje 1,2, recimo najmanje 1,4, recimo najmanje 1,6, recimo najmanje 1,8 ili, recimo, najmanje 2.
8. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što navedeni soj kvasca nosi mutaciju ili deleciju jednog ili više ILV2 gena i/ili navedeni soj kvasca nosi mutaciju promene okvira u jednom ili više ILV2 gena
i/ili navedeni soj kvasca nosi mutaciju koja rezultira manjom ili nikakvom ekspresijom jednog ili više ILV2 gena.
9. Soj kvasca prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je navedeni soj kvasca u stanju da proizvede fermentisani test rastvor nakon inkubacije u test rastvoru, pri čemu je test rastvor ekstrakt slada i/ili žitarica sa prividnim ekstraktom od najmanje 10° Plato, pri čemu navedeni test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila u najranijoj vremenskoj tački u kojoj prividni ekstrakt navedenog test rastvora nije smanjen za više od 0,50° Plato u prethodna 24 sata, pri čemu se navedena fermentacija odvija na temperaturi od najviše 18 °C.
10. Soj kvasca prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je navedeni soj kvasca u stanju da generiše najmanje 4,0 mL/L etanola po °Plato, kada se navedeni soj kvasca inkubira u navedenom test rastvoru.
11. Postupak ili soj kvasca prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu je navedeni soj kvasca u stanju da raste na medijima sa melibiozom kao jedinim izvorom ugljenika.
12. Soj kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 9 do 11, pri čemu navedeni fermentisani test rastvor sadrži najviše 60 ppb diacetila, kao što je najviše 55 ppb diacetila, kao što je najviše 50 ppb diacetila, kao što je najviše 45 ppb diacetila, kao što je najviše 40 ppb diacetila.
13. Soj kvasca prema bilo kom patentnom zahtevu od 9 do 12, pri čemu navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najmanje 25 mg/L propanola, recimo najmanje 30 mg/L propanola i/ili gde navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži najviše 8 mg/L izobutanola, recimo najviše 6 mg/L izobutanola i/ili gde navedeni fermentisani vodeni ekstrakt sadrži odnos propanola: izobutanola od najmanje 2,0, recimo najmanje 2,5. recimo najmanje 3,0, recimo najmanje 4,0, recimo najmanje 5,0, recimo najmanje 5.5.
14. Postupak proizvodnje fermentisanog vodenog ekstrakta, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake:
i) obezbeđivanje vodenog ekstrakta slada i/ili žitarica;
ii) obezbeđivanje soja kvasca vrste Saccharomyces pastorianus, pri čemu je navedeni soj kvasca u skladu sa bilo kojim od patentnih zahtev aod 1 do 13; i
iii) fermentacije vodenog ekstrakta obezbeđenog u koraku i) sa navedenim sojem kvasca iz koraka ii), čime se dobija fermentisani vodeni ekstrakt.
15. Postupak za proizvodnju napitka, naznačen time što navedeni postupak obuhvata korake: i. pripreme fermentisanog vodenog ekstrakta prema patentnom zahtevu 14, i
ii. prerade navedenog fermentisanog vodenog ekstrakta u napitak,
pri čemu, opciono, koraci prerade obuhvataju jedno ili više od sledećeg:
i.Filtraciju,
ii.Karbonaciju,
iii.Sazrevanje, ili
iv.Flaširanje
16. Napitak pripremljen postupkom prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što navedeni napitak ima odnos propanol:izobutanol od najmanje 3,0, recimo, najmanje 4,0, recimo, najmanje 5,0, recimo, najmanje 5,5.
17. Napitak prema patentnom zahtevu 16, naznačen time što je navedeni napitak pivo.
18. Napitak prema bilo kom od patentnih zahteva 16 do 17, naznačen time što navedeni napitak sadrži
najmanje 25 mg/L propanola, recimo, najmanje 30 mg/L propanola i/ili
najviše 8 mg/L izobutanola, recimo, najviše 6 mg/L izobutanola.
RS20241167A 2020-06-30 2021-06-29 Kvasac sa niskom produkcijom diacetila RS66083B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20183134 2020-06-30
PCT/EP2021/067882 WO2022002960A1 (en) 2020-06-30 2021-06-29 Low diacetyl yeast
EP21737438.8A EP4172301B1 (en) 2020-06-30 2021-06-29 Low diacetyl yeast

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66083B1 true RS66083B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=71409176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241167A RS66083B1 (sr) 2020-06-30 2021-06-29 Kvasac sa niskom produkcijom diacetila

Country Status (21)

Country Link
US (1) US20230323282A1 (sr)
EP (1) EP4172301B1 (sr)
JP (1) JP2023535281A (sr)
KR (1) KR20230029635A (sr)
CN (1) CN115997004A (sr)
AU (1) AU2021299952A1 (sr)
BR (1) BR112022025351A2 (sr)
CA (1) CA3183042A1 (sr)
CO (1) CO2022019173A2 (sr)
DK (1) DK4172301T3 (sr)
ES (1) ES2991537T3 (sr)
FI (1) FI4172301T3 (sr)
LT (1) LT4172301T (sr)
MX (1) MX2022016582A (sr)
PE (1) PE20231993A1 (sr)
PL (1) PL4172301T3 (sr)
PT (1) PT4172301T (sr)
RS (1) RS66083B1 (sr)
SI (1) SI4172301T1 (sr)
WO (1) WO2022002960A1 (sr)
ZA (1) ZA202212298B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230212487A1 (en) * 2019-08-30 2023-07-06 Carlsberg A/S Yeast for Preparing Beverages Without Phenolic Off-Flavors
PE20260007A1 (es) 2023-03-01 2026-01-06 Carlsberg As Cepas progenie de levaduras de bajo diacetilo
WO2026003169A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Carlsberg A/S Yeast strains producing high levels of hydrogen sulphide
WO2026003180A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Carlsberg A/S Yeast strains producing high levels of isoamyl acetate

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009504131A (ja) * 2005-08-12 2009-02-05 サントリー株式会社 ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子及びその用途
CA2602357A1 (en) * 2005-09-13 2007-03-22 Suntory Limited Branched-chain amino acid aminotransferase gene and use thereof
JP2009165351A (ja) * 2006-02-23 2009-07-30 Suntory Liquors Ltd アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子及びその用途
US20090087515A1 (en) * 2006-02-23 2009-04-02 Suntory Limited Gene encoding acetolactate synthase and use thereof
US20090041889A1 (en) * 2006-02-24 2009-02-12 Suntory Limited Gene Encoding Protein With Vicinal Diketone or Diacetyl-Reducing Activity and Use Thereof
CA2647327C (en) * 2006-07-13 2016-02-23 Dsm Ip Assets B.V. Improved brewing process
WO2009078108A1 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 Suntory Holdings Limited Mutant ilv5 gene and use thereof
US9249420B2 (en) * 2010-05-31 2016-02-02 Vib Vzw Isobutanol production using yeasts with modified transporter expression
JP2012217430A (ja) * 2011-04-13 2012-11-12 Asahi Breweries Ltd 低ｖｄｋ産生セルフクローニング酵母の造成
EP2615159A1 (en) * 2012-01-16 2013-07-17 Anheuser-Busch InBev S.A. Low alcohol or alcohol free fermented malt based beverage and method for producing it.
WO2013158749A2 (en) * 2012-04-17 2013-10-24 Gevo, Inc. Engineered microorganisms with improved growth properties
EP3020801A4 (en) * 2013-07-12 2017-01-18 Ajinomoto Co., Inc. YEAST WITH HIGH CONTENT OF Abu, upsilon-Glu-Abu, AND/OR UPSILON-Glu-Abu-Gly
CN115895804A (zh) 2016-07-01 2023-04-04 嘉士伯酿酒有限公司 精制的基于谷物的饮料
WO2020058914A1 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 Danstar Ferment Ag Expression of heterologous enzymes in yeast for reducing diacetyl and dextrin
CN110846238A (zh) 2019-11-28 2020-02-28 天津科技大学 一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用
CN110951633A (zh) 2019-11-28 2020-04-03 天津科技大学 一种过表达二羟异戊酸脱水酶的葡萄汁酵母菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3183042A1 (en) 2022-01-06
MX2022016582A (es) 2023-03-23
FI4172301T3 (fi) 2024-09-27
JP2023535281A (ja) 2023-08-17
KR20230029635A (ko) 2023-03-03
CO2022019173A2 (es) 2023-02-27
DK4172301T3 (da) 2024-10-21
PE20231993A1 (es) 2023-12-15
EP4172301B1 (en) 2024-07-24
BR112022025351A2 (pt) 2023-03-07
PT4172301T (pt) 2024-10-29
SI4172301T1 (sl) 2025-02-28
AU2021299952A1 (en) 2023-01-05
WO2022002960A1 (en) 2022-01-06
ZA202212298B (en) 2025-03-26
EP4172301A1 (en) 2023-05-03
ES2991537T3 (es) 2024-12-03
LT4172301T (lt) 2024-11-11
US20230323282A1 (en) 2023-10-12
CN115997004A (zh) 2023-04-21
PL4172301T3 (pl) 2024-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Saerens et al. Genetic improvement of brewer’s yeast: current state, perspectives and limits
RS66083B1 (sr) Kvasac sa niskom produkcijom diacetila
CN108064270B (zh) 用于制备酒精饮品的酵母
Gibson et al. Variation in α‐acetolactate production within the hybrid lager yeast group Saccharomyces pastorianus and affirmation of the central role of the ILV6 gene
US20220127552A1 (en) Maltotriose metabolizing mutants of saccharomyces eubayanus
JP2025163119A (ja) フェノール系オフフレーバーがない飲料を調製するための酵母
Setoguchi et al. Effect of pepA deletion and overexpression in Aspergillus luchuensis on sweet potato shochu brewing
EA046780B1 (ru) Дрожжи с низким содержанием диацетила
HK40091365B (en) Low diacetyl yeast
HK40091365A (en) Low diacetyl yeast
TW202607130A (zh) 生產高水準乙酸異戊酯的酵母菌株
WO2026003180A1 (en) Yeast strains producing high levels of isoamyl acetate
KR20250154395A (ko) 저 디아세틸 효모 자손 균주
WO2025144942A1 (en) Genetically engineered yeast cells and methods of use thereof