RS64483B1 - Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha - Google Patents

Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha

Info

Publication number
RS64483B1
RS64483B1 RS20230689A RSP20230689A RS64483B1 RS 64483 B1 RS64483 B1 RS 64483B1 RS 20230689 A RS20230689 A RS 20230689A RS P20230689 A RSP20230689 A RS P20230689A RS 64483 B1 RS64483 B1 RS 64483B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
ldha
positions
strand
expression
Prior art date
Application number
RS20230689A
Other languages
English (en)
Inventor
Bob D Brown
Henryk T Dudek
Utsav Saxena
Natalie Pursell
Cheng Lai
Weimin Wang
Rachel Storr
Naim Nazef
Boyoung Kim
Original Assignee
Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=66101691&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64483(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk Healthcare Ag filed Critical Novo Nordisk Healthcare Ag
Publication of RS64483B1 publication Critical patent/RS64483B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/04—Drugs for disorders of the urinary system for urolithiasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na RNKi oligonukleotid i kompozicije koje sadrže oligonukleotid za smanjenje ekspresije LDHA.
POZADINA PRONALASKA
Primarne hiperoksalurije (PH) su autozomno recesivni poremećaji uzrokovani prekomernom proizvodnjom oksalata što dovodi do taloženja kalcijum oksalata u bubrezima i krajnjeg stadijuma bubrežne bolesti. Postoje tri oblika PH označene kao PH tipovi 1 (PH1), 2 (PH2) i 3 (PH3), kao i idiopatska hiperoksalurija. Laktat dehidrogenaza (LDH) je identifikovana kao meta za smanjenje proizvodnje oksalata u jetri, jer je ključni enzim odgovoran za pretvaranje glioksilata u oksalat, poslednji korak metabolizma oksalata u jetri. Razvijeni su RNKi oligonukleotidi koji ciljaju gene koji kodiraju LDH podjedinice.
WO2016/057932 (Dicerna Pharmaceuticals, Inc.) stavlja na uvid javnosti različite RNKi oligonukleotide za smanjenje ekspresije LDHA, uključujući Dicer supstrate koji se nazivaju DsiRNK.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje novi RNKi oligonukleotid koji sadrži strukturu urezane tetrapetlje na koju su konjugovani N-acetilgalaktozamin (GalNAc) delovi za specifičnu isporuku oligonukleotida u hepatocite da ciljaju ekspresiju LDHA, čime se izbegavaju ili minimiziraju potencijalni neželjeni efekti u drugim tkivima, kao što su mišići, koža ili materica. Takav RNKi oligonukleotid je koristan za smanjenje proizvodnje oksalata u jetri kod subjektanpr. pacijenta koji ima primarnu hiperoksaluriju. Takav RNKi oligonukleotid je koristan za smanjenje nivoa oksalata u urinu. Koristan je za lečenje primarne hiperoksalurije, uključujući PH1, PH2 i/ili PH3, kao i idiopatske hiperoksalurije.
Tačnije, sada je obezbeđen oligonukleotid za smanjenje ekspresije LDHA, oligonukleotid koji sadrži matrični (antismisaoni) lanac koji ima sekvencu navedenu kao UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) i kodirajući (smisaoni) lanac koji ima sekvencu navedenu kao UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 2) pri čemu su sve sledeće pozicije modifikovane sa 2′-O-metilom: pozicije 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 i 31-36 kodirajućeg lanca i pozicije 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 i 19-22 matričnog lanca. Pored toga, sve sledeće pozicije su modifikovane sa 2′-fluoro: pozicije 3, 5, 8-11, 13, 15 i 17 kodirajućeg lanca i pozicije 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 i 18 matričnog lanca.
Takođe, oligonukleotid ima fosfotioatnu vezu između svake od: pozicija 1 i 2 kodirajućeg lanca, pozicija 1 i 2 matričnog lanca, pozicija 2 i 3 matričnog lanca, pozicija 3 i 4 matričnog lanca, pozicija 20 i 21 matričnog lanca i pozicija 21 i 22 matričnog lanca.
Štaviše, uridin na prvoj poziciji matričnog lanca sadrži analog fosfata. Tačnije, oligonukleotid sadrži sledeću strukturu na poziciji 1 matričnog lanca:
.
Pored toga, svaki od nukleotida –GAAA– sekvence na kodirajućem lancu je konjugovan sa monovalentnim GalNac delom pri čemu –GAAA– motiv sadrži strukturu:
Dodatno je sada obezbeđena kompozicija koja sadrži oligonukleotid pronalaska kao što je gore opisano i Na<+>kontrajone. Videti Sliku 3.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje oligonukleotid ili kompoziciju pronalaska za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili je u riziku da ima PH1, PH2, PH3 i/ili idiopatsku hiperoksaluriju, i postupak koji obuhvata smanjenje ekspresije LDHA proteina u hepatocitima kod subjekta davanjem oligonukleotida ili kompozicije subjektu.
Tako, u jednoj realizaciji pronalaska, obezbeđen je oligonukleotid ili kompozicija pronalaska za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili je u riziku da ima primarnu hiperoksaluriju, pri čemu lečenje obuhvata davanje oligonukleotida ili kompozicije subjektu. U nekim realizacijama, oligonukleotid ili kompozicija se daje subjektu intravenozno ili supkutano.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1A je shema koja prikazuje RNKi oligonukleotid pronalaska koji ima vodeći (matrični) lanac sa regionom komplementarnosti sa LDHA mRNK minus GalNac delovi.
Slika 1B je prikaz sekvence petlje prisutne na pozicijama 27-30 putničkog (kodirajućeg) lanca prikazanog na Sl.1A.
SLIKA 1C je prikaz hemijske strukture modifikovanog uridina prikazanog na poziciji 1 vodećeg (matričnog) lanca prikazanog na Sl.1A. U hemijskoj formuli, ili je jednostruka veza u kojoj stereohemija delova koji su neposredno vezani za nju nije specifikovana.
Slika 2A je shema koja prikazuje vremensku liniju za in vivo procenu specifičnog oligonukleotida prikazanog na Sl.1A koristeći LDHA AAV model miša. Udrizgavanje AAV je izvedeno u nedelji -1, a pojedinačne doze oligonukleotida su ubrizgane supkutano u dozi od 0,5, 1, 3 ili 6 mg/kg kao što je prikazano. U 1, 2, 4, 6, 8. i 10. nedelji 4 mm biopsijski uzorak je sakupljen i brzo zamrznut u bloku i u RNAlater-u za analizu obaranja mRNK.
SLIKA 2B je grafikon koji pokazuje podskup rezultata studije opisane u Primeru 1. Procenat preostale hLDHA mRNK prikazan je u nedeljama nakon doziranja nakon doze od 1, 3 ili 6 mg/kg. Ovi rezultati su normalizovani na vremenski usklađeni PBS. Smanjenje humane LDHA mRNK u zavisnosti od doze trajalo je četiri nedelje nakon doziranja.
Slika 3 prikazuje hemijsku strukturu RNKi oligonukleotida pronalaska koji ima vodeći (matrični) lanac sa regionom komplementarnosti sa LDHA mRNK i putnički (kodirajući) lanac koji ima urezanu strukturu tetrapetlje sa Na<+>kontraijonima.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje smanjenje LDHA mRNK (gornji paneli), LDH proteina (srednji paneli) i aktivnosti LDH (% preostalog, donji paneli) posle dve doze oligonukleotida kao što je prikazano na Sl.3 kod majmuna mamaki rakojeda (mladunaca i mladih odraslih) 28. i 56. dana nakon prve doze.
Slika 5 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa LDH proteina (kao što je otkriveno Vestern blotom) posle dve doze oligonukleotida kao što je prikazano na Sl.3 kod mamaki rakojeda.
Slika 6 je grafikon koji pokazuje smanjenje ekspresije LDHA mRNK (% preostale) posle deset doza oligonukleotida kao što je prikazano na Sl.3 kod makaki rakojeda.
Slika 7 je grafikon koji prikazuje koncentracije oligonukleotida ugrađenog u Ago2/RISC nakon deset doza oligonukleotida kao što je prikazano na Sl.3 kod makaki rakojeda.
Fig. 8A-8B su grafikoni koji pokazuju efekat oligonukleotida kao što je prikazano na Sl. 3 u različitim dozama (1,5 mg/kg, 3 mg/kg ili 6 mg/kg) kod pacijenata sa PH u otvorenoj, multicentričnoj studiji. SLIKA 8A prikazuje promene apsolutne vrednosti sadržaja oksalata u urinu (UOX) kod ovih pacijenata tokom studije. Za grupu sa dozom od 1,5 mg/kg, n=2 posle D57. Za grupu sa dozom od 3 mg/kg n=2 posle D57. Za grupu sa dozom od 6 mg/kg, n=2 i n=1 posle D15. SLIKA 8B prikazuje promenu % oksalata u urinu (UOX) tokom 24 časa u odnosu na početnu vrednost kod pacijenata u grupi sa dozom od 1,5 mg/kg i grupi sa dozom od 3 mg/kg tokom studije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Kao što je gore navedeno, pronalazak obezbeđuje RNKi oligonukleotid koristan za redukciju LDHA u, na primer, ćelijama jetre (npr. hepatocitima). Takva represija jetrene LDH aktivnosti pruža terapeutski pristup za lečenje primarnih hiperoksalurija uključujući PH1, PH2 i/ili PH3, kao i idiopatske hiperoksalurije.
I. Definicije
Približno: Kako se ovde koristi, izraz „približno” ili „oko”, primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim realizacijama, približno „približno” ili „oko” odnosi se na opseg vrednosti koje spadaju u okvir od 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način očigledno iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
Primena: Kako se ovde koriste, izrazi „primenjivanje/davanje” ili „primena/davanje” označavaju obezbeđivanje supstance (npr. oligonukleotida) subjektu na način koji je farmakološki koristan (npr. za lečenje stanja kod subjekta).
Asijaloglikoproteinski receptor (ASGPR): Kako se ovde koristi, izraz „Asijaloglikoproteinski receptor” ili „ASGPR” odnosi se na bipartitni lektin C-tipa formiran od glavne 48 kDa (ASGPR-1) i manje 40 kDa podjedinice (ASGPR-2). ASGPR je primarno eksprimovan na sinusoidnoj površini ćelija hepatocita i ima glavnu ulogu u vezivanju, internalizaciji i naknadnom čišćenju cirkulirajućih glikoproteina koji sadrže terminalne ostatke galaktoze ili N-acetilgalaktozamina (asijaloglikoproteine).
Prigušivanje: Kako se ovde koristi, izraz „prigušuje” znači smanjuje ili efektivno zaustavlja. Kao neograničavajući primer, jedan ili više tretmana koji su ovde dati mogu smanjiti ili efikasno zaustaviti akumulaciju oksalata kod subjekta. Ovo prigušivanje može biti ilustrovano, na primer, smanjenjem jednog ili više aspekata (npr. simptoma, karakteristika tkiva i ćelija, itd.) akumulacije oksalata ili simptoma koji su rezultat takve akumulacije, izostankom detektabilne progresije (pogoršanja) jednog ili više aspekata akumulacije oksalata ili simptoma koji su rezultat takve akumulacije, ili izostankom detektabilne akumulacije oksalata ili simptoma koji su rezultat takve akumulacije kod subjekta kada bi se inače mogli očekivati.
Komplementaran: Kako se ovde koristi, izraz „komplementaran” se odnosi na strukturni odnos između dva nukleotida (npr. na dve suprotstavljene nukleinske kiseline ili na suprotne regione jednog lanca nukleinske kiseline) koji dozvoljava da dva nukleotida formiraju parove baza jedan sa drugim. Na primer, purinski nukleotid jedne nukleinske kiseline koji je komplementaran pirimidinskom nukleotidu naspramne nukleinske kiseline mogu se upariti formiranjem vodoničnih veza jedan sa drugim. U nekim realizacijama, komplementarni nukleotidi mogu da upare bazni par na Watson-Crick način ili na bilo koji drugi način koji omogućava formiranje stabilnih dupleksa. U nekim realizacijama, dve nukleinske kiseline mogu imati regione više nukleotida koji su međusobno komplementarni tako da formiraju regione komplementarnosti, kao što je ovde opisano.
Dezoksiribonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „dezoksiribonukleotid” se odnosi na nukleotid koji ima vodonik umesto hidroksila na 2′ poziciji svog pentoznog šećera u poređenju sa ribonukleotidom. Modifikovani dezoksiribonukleotid je dezoksiribonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija ili supstitucija atoma koje nisu na 2′ poziciji, uključujući modifikacije ili supstitucije u šećeru, fosfatnoj grupi ili bazi.
Dvolančani oligonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „dvolančani oligonukleotid” se odnosi na oligonukleotid koji je u suštini u obliku dupleksa. U nekim realizacijama, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona (jednog ili više) dvolančanog oligonukleotida se formira između antiparalelnih sekvenci nukleotida kovalentno odvojenih lanaca nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona (jednog ili više) dvolančanog oligonukleotida se formira između antiparalelnih sekvenci nukleotida lanaca nukleinske kiseline koji su kovalentno povezani. U nekim realizacijama, komplementarno uparivanje baza dupleks regiona (jednog ili više) dvolančanog oligonukleotida se formira od jednog lanca nukleinske kiseline koji je presavijen (npr. preko strukture ukosnice) da bi se obezbedile komplementarne antiparalelne sekvence nukleotida koje baze uparuju zajedno. U nekim realizacijama, dvolančani oligonukleotid obuhvata dva kovalentno odvojena lanca nukleinske kiseline koji su u potpunosti dupleksirani jedan sa drugim. Međutim, u nekim realizacijama, dvolančani oligonukleotid obuhvata dva kovalentno odvojena lanca nukleinske kiseline koji su delimično dupleksirani, npr. koji imaju produžetke na jednom ili oba kraja. U nekim realizacijama, dvolančani oligonukleotid sadrži antiparalelne sekvence nukleotida koje su delimično komplementarne, i prema tome, mogu da imaju jedno ili više nepodudaranja, što može uključivati unutrašnje nepodudaranje ili krajnje nepodudaranje.
Dupleks: Kako se ovde koristi, izraz „dupleks”, u odnosu na nukleinske kiseline (npr. oligonukleotidi), odnosi se na strukturu formiranu komplementarnim uparivanjem baza dve antiparalelne sekvence nukleotida.
Ekscipijens: Kako se ovde koristi, izraz „ekscipijens” se odnosi na neterapeutsko sredstvo koje može da bude uključeno u kompoziciju, na primer, da obezbedi ili doprinese željenoj konzistenciji ili efektu stabilizacije.
Hepatocit: Kako se ovde koristi, izraz „hepatocit” ili „hepatociti” se odnosi na ćelije parenhimskog tkiva jetre. Ove ćelije čine približno 70-85% mase jetre i proizvode serumski albumin, fibrinogen i protrombinsku grupu faktora zgrušavanja (osim Faktora 3 i 4). Markeri za ćelije hepatocitne loze mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na: transtiretin (Ttr), glutamin sintetazu (Glul), hepatocitni nuklearni faktor 1a (Hnf1a) i hepatocitni nuklearni faktor 4a (Hnf4a). Markeri za zrele hepatocite mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na: citohrom P450 (Cyp3a11), fumarilacetoacetat hidrolazu (Fah), glukozu 6-fosfat (G6p), albumin (Alb) i OC2-2F8. Videti, npr., Huch et al., (2013), Nature, 494(7436): 247-250.
Laktat dehidrogenaza (LDH): Kako se ovde koristi, izraz „laktat dehidrogenaza” ili „LDH” odnosi se na enzim koji reguliše homeostazu metabolizma laktata/piruvata, hidroksipiruvata/glicerata i glioksilata/oksalata. Funkcionalni LDH se sastoji od četiri monomerna polipeptidna lanca koji formiraju tetramer. Dve najčešće podjedinice, poznate kao mišićni (M) ili srčani (H) oblici LDH, kodirane su genima LDHA i LDHB, tim redosledom. Identifikovano je pet različitih izozima na osnovu njihovog sastava podjedinica (4H, 3H1M, 2H2M, 1H3M, 4M), koji pokazuju slične enzimske aktivnosti, ali različito kinetičko ponašanje i distribuciju u tkivu. Glavni izozim jetre i skeletnih mišića, LDH5, ima 4M podjedinice.
Laktat dehidrogenaza A (LDHA): Kako se ovde koristi, izraz „laktat dehidrogenaza A” ili „LDHA” odnosi se na monomer LDH enzima koji je kodiran LDHA genom (Entrez Genski ID: 3939), od koga postoji najmanje pet varijanti transkripta mRNK (e.g., NCBI referentna sekvenca: NM_005566.3, NM_001135239.1, NM_001165414.1, NM_001165415.1 i NM_001165416.1) koje kodiraju različite izoforme.
Laktat dehidrogenaza B (LDHB): Kako se ovde koristi, izraz „laktat dehidrogenaza B” ili „LDHB” odnosi se na monomer LDH enzima koji je kodiran LDHB genom (Entrez Genski ID: 3945), od koga postoje najmanje dve varijante transkripta mRNK (npr., NCBI referentna sekvenca: NM_001174097.2 i NM_001315537.1) koje kodiraju različite izoforme.
Petlja: Kako se ovde koristi, izraz „petlja” se odnosi na neupareni region nukleinske kiseline (npr. oligonukleotid) koji je okružen sa dva antiparalelna regiona nukleinske kiseline koja su dovoljno komplementarna jedan drugom, kao što je npr. da se pod odgovarajućim uslovima hibridizacije (npr. u fosfatnom puferu, u ćeliji), dva antiparalelna regiona, koja okružuju neupareni region, hibridizuju i formiraju dupleks (koji se naziva „stablo”) .
Modifikovana internukleotidna veza: Kako se ovde koristi, izraz „modifikovana internukleotidna veza” odnosi se na internukleotidnu vezu koja ima jednu ili više hemijskih modifikacija u poređenju sa referentnom internukleotidnom vezom koja sadrži fosfodiestarsku vezu. U nekim realizacijama, modifikovani nukleotid je veza koja se ne pojavljuje u prirodi. U nekim realizacijama, modifikovana internukleotidna veza daje jedno ili više poželjnih svojstava nukleinskoj kiselini u kojoj je prisutna modifikovana internukleotidna veza.
Modifikovani nukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „modifikovani nukleotid” se odnosi na nukleotid koji ima jednu ili više hemijskih modifikacija u poređenju sa odgovarajućim referentnim nukleotidom izabranim iz: adeninskog ribonukleotida, gvaninskog ribonukleotida, citozinskog ribonukleotida, uracilskog ribonukleotida, adeninskog dezoribonukleotida, gvaninskog dezoribonukleotida, citozinskog dezoksiribonukleotida i timidinskog dezoksiribonukleotida. U nekim realizacijama, modifikovani nukleotid je nukleotid koji se ne pojavljuje u prirodi. U nekim realizacijama, modifikovani nukleotid ima jednu ili više hemijskih modifikacija u svojoj šećernoj, nukleobaznoj i/ili fosfatnoj grupi. U nekim realizacijama, modifikovani nukleotid ima jedan ili više hemijskih delova konjugovanih sa odgovarajućim referentnim nukleotidom. U nekim realizacijama, ovde dat modifikovani nukleotid može doprineti poboljšanoj termičkoj stabilnosti, otpornosti na degradaciju, otpornosti na nukleaze, rastvorljivosti, bioraspoloživosti, bioaktivnosti, smanjenoj imunogenosti, itd.
Usečena struktura tetrapetlje: „Usečena struktura tetrapetlje” je struktura RNKi oligonukleotida koju karakteriše prisustvo odvojenih kodirajućih (putničkih) i matričnih (vodećih) lanaca, u kojima kodirajući lanac ima region komplementarnosti sa matričnim lancem, i u kojem najmanje jedan od lanaca, obično kodirajući lanac, ima tetrapetlju konfigurisanu da stabilizuje susedni region stabla formiran unutar najmanje jednog lanca.
Oligonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „oligonukleotid” se odnosi na kratku nukleinsku kiselinu, npr. dužine manje od 100 nukleotida. Oligonukleotid može biti jednolančani ili dvolančani. Oligonukleotid može ili ne mora imati dupleks regione. Kao skup neograničavajućih primera, oligonukleotid može biti, ali nije ograničen na, mala interferirajuća RNK (siRNA), mikroRNK (miRNK), kratka RNK sa strukturom ukosnice (shRNK), RNK koja interferira sa supstratom dicera (dsiRNK), matrični oligonukleotid, kratka siRNK ili jednolančana siRNK. U nekim realizacijama, dvolančani oligonukleotid je RNKi oligonukleotid.
Produžetak: Kako se ovde koristi, izraz „produžetak” se odnosi na terminalni(e) nukleotid(e) koji nisu upareni sa bazama koji su rezultat jednog lanca ili regiona koji se proteže izvan kraja komplementarnog lanca sa kojim jedan lanac ili region formiraju dupleks. U nekim realizacijama, produžetak sadrži jedan ili više neuparenih nukleotida koji se protežu od dupleks regiona na 5' kraju ili 3' kraju dvolančanog oligonukleotida. U određenim realizacijama, produžetak je 3′ ili 5′ produžetak na matričnom lancu ili kodirajućem lancu dvolančanog oligonukleotida.
Analog fosfata: Kako se ovde koristi, izraz „analog fosfata“ se odnosi na hemijski deo koji imitira elektrostatička i/ili sterična svojstva fosfatne grupe. U nekim realizacijama, oligonukleotid ima analog fosfata na 4′-ugljeničnoj poziciji šećera (koji se naziva „analog 4′-fosfata“) na 5′-terminalnom nukleotidu. Primer analoga 4′-fosfata je oksimetilfosfonat, u kome je atom kiseonika oksimetilne grupe vezan za deo šećera (npr. na svom 4′-ugljeniku) ili njegov analog.
Smanjena ekspresija: Kako se ovde koristi, izraz „smanjena ekspresija“ gena se odnosi na smanjenje količine RNK transkripta ili proteina kodiranog genom i/ili smanjenje količine aktivnosti gena u ćeliji ili subjektu, u poređenju sa odgovarajućom referentnom ćelijom ili subjektom. Na primer, čin tretmana ćelije dvolančanim oligonukleotidom (npr. onim koji ima matrični lanac koji je komplementaran sekvenci LDHA mRNK) može dovesti do smanjenja u količini transkripta mRNK, proteina i/ili enzimske aktivnosti (npr., kodiranog LDHA genom) u poređenju sa ćelijom koja nije tretirana dvolančanim oligonukleotidom. Slično, „smanjenje ekspresije“ kako se ovde koristi odnosi se na čin koji dovodi do smanjene ekspresije gena (npr.LDHA).
Region komplementarnosti: Kako se ovde koristi, izraz „region komplementarnosti“ odnosi se na sekvencu nukleotida nukleinske kiseline (npr. dvolančani oligonukleotid) koja je dovoljno komplementarna antiparalelnoj sekvenci nukleotida da omogući hibridizaciju između dve sekvence nukleotida pod odgovarajućim uslovima hibridizacije, npr. u fosfatnom puferu, u ćeliji, itd.
Ribonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „ribonukleotid“ se odnosi na nukleotid koji ima ribozu kao svoj pentozni šećer, koji sadrži hidroksilnu grupu na svojoj 2' poziciji. Modifikovani ribonukleotid je ribonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija ili supstitucija atoma koje nisu na 2′ poziciji, uključujući modifikacije ili supstitucije u ribozi, fosfatnoj grupi ili bazi.
RNKi oligonukleotid: Kako se ovde koristi, izraz „RNKi oligonukleotid“ se odnosi na (a) dvolančani oligonukleotid koji ima kodirajući lanac (putnički) i matrični lanac (vodeći), u kojem Argonaut 2 (Ago2) endonukleaza koristi matrični lanac ili deo matričnog lanca u cepanju ciljne mRNK ili (b) jednolančani oligonukleotid koji ima jedan matrični lanac, pri čemu taj matrični lanac (ili deo tog matričnog lanca) koristi Ago2 endonukleaza za cepanje ciljne mRNK.
Lanac: Kako se ovde koristi, izraz „lanac“ se odnosi na jednu kontinualnu sekvencu nukleotida povezanih zajedno preko internukleotidnih veza (npr. fosfodiestarske veze, fosfotioatne veze). U nekim realizacijama, lanac ima dva slobodna kraja, npr.5′-kraj i 3′-kraj.
Subjekt: Kako se ovde koristi, izraz „subjekt“ označava bilo kog sisara, uključujući miševe, zečeve i ljude. U jednoj realizaciji, subjekt je čovek ili primat koji nije čovek. Izrazi „pojedinac“ ili „pacijent“ mogu se koristiti naizmenično sa „subjekt.“
Sintetički: Kako se ovde koristi, izraz „sintetički“ se odnosi na nukleinsku kiselinu ili drugi molekul koji je veštački sintetisan (npr. korišćenjem mašine (npr. sintetizatora nukleinske kiseline u čvrstom stanju)) ili koji inače nije izveden iz prirodnog izvora (npr. ćelije ili organizma) koji normalno proizvodi molekul.
Ciljajući ligand: Kako se ovde koristi, izraz „ciljajući ligand“ se odnosi na molekul (npr., ugljeni hidrat, amino šećer, holesterol, polipeptid ili lipid) koji se selektivno vezuje za srodni molekul (npr. receptor) tkiva ili ćelije od interesa i koji je konjugovan sa drugom supstancom u svrhu ciljanja druge supstance na tkivu ili ćeliji od interesa. U nekim realizacijama, ciljajući ligand sadrži GalNac deo.
Tetrapetlja: Kako se ovde koristi, izraz „tetrapetlja“ se odnosi na petlju koja povećava stabilnost susednog dupleksa formiranog hibridizacijom bočnih sekvenci nukleotida. Povećanje stabilnosti se može detektovati kao povećanje temperature topljenja (Tm) susednog dupleksa stabla koja je veća od Tmsusednog dupleksa stabla očekivane, prosečno, iz skupa petlji uporedive dužine koje se sastoje od nasumično izabranih sekvenci nukleotida. Na primer, tetrapetlja može preneti temperaturu topljenja od najmanje 50 °C, najmanje 55 °C, najmanje 56 °C, najmanje 58 °C, najmanje 60 °C, najmanje 65 °C ili najmanje 75 °C u 10 mM NaHPO4do strukture ukosnice koja sadrži dupleks dužine od najmanje 2 para baza. Tetrapetlja može stabilizovati bazni par u susednom dupleksu stabla interakcijama slaganja. Pored toga, interakcije između nukleotida u tetrapetlji uključuju, ali nisu ograničene na uparivanje baza koje nije Watson-Crick, interakcije slaganja, vodonične veze i kontaktne interakcije (Cheong et al., Nature 1990 Aug. 16; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul.12;
253(5016):191-4). Kao što je gore navedeno, u RNKi oligonukleotidu pronalaska tetrapetlja se sastoji od četiri nukleotida GAAA. Standardni IUPAC-IUB simboli se mogu koristiti za upućivanje na nukleotide tetrapetlje kao što je opisano u Cornish-Bowden (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3021-3030. Na primer, slovo „N“ može da se koristi da znači da bilo koja baza može biti na toj poziciji, slovo „R“ se može koristiti da pokaže da A (adenin) ili G (gvanin) mogu biti na toj poziciji, i „ B” se može koristiti da pokaže da C (citozin), G (gvanin) ili T (timin) mogu biti na toj poziciji. Primeri tetrapetlji uključuju UNCG porodicu tetrapetlji (npr. UUCG), GNRA porodicu tetrapetlji (npr. GAAA) i CUUG tetrapetlje (Woese et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Novembar; 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res.1991 Nov.11;
19(21):5901-5). Primeri DNK tetrapetlji uključuju d(GNNA) porodicu tetrapetlji (npr., d(GTTA)), d(GNRA) porodicu tetrapetlji, d(GNAB) porodicu tetrapetlji, d(CNNG) porodicu tetrapetlji i d(TNCG) porodicu tetrapetlji (npr. d(TTCG)). Vidi, na primer: Nakano et al.
Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78th; NO.2; PAGE.731 (2000). Kao što je gore navedeno u RNKi oligonukleotidu pronalaska, tetrapetlja je sadržana u urezanoj strukturi tetrapetlje.
Tretirati: Kako se ovde koristi, izraz „tretirati” (lečiti) se odnosi na čin pružanja nege subjektu kome je to potrebno, npr. putem davanja terapeutskog sredstva (npr. oligonukleotida) subjektu, u svrhu poboljšanja zdravlja i/ili blagostanja subjekta u odnosu na postojeće stanje (npr. bolest, poremećaj) ili da bi se sprečila ili smanjila verovatnoća pojave bolesti. U nekim realizacijama, lečenje uključuje smanjenje učestalosti ili težine najmanje jednog znaka, simptoma ili faktora koji doprinosi stanju (npr. bolesti, poremećaju) koje je doživeo subjekt.
II. Oligonukleotidno-bazirani inhibitor LDHA ekspresije
i. Oligonukleotidna sekvenca
Oligonukleotid pronalaska kao što je gore navedeno ima vodeći (matrični) lanac koji ima sekvencu UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1). Kodirajući lanac formira dupleks sa matričnim lancem. Kodirajući lanac sadrži petlju stabla na svom 3′-kraju. Tačnije, kodirajući lanac sadrži na svom 3′-kraju petlju stabla prikazanu kao: S1-L-S2u kojem je S1komplementaran sa S2, i u kojem L formira petlja između S1i S24 nukleotida u dužinu. Dupleks formiran između S1i S2je dužine 6 parova baza. Petlja (L) petlje stabla je tetrapetlja unutar urezane strukture tetrapetlje. Tetrapetlja sadrži modifikovane nukleotide kao što je gore navedeno i dalje razmatrano u nastavku teksta.
Oligonukleotid ima kodirajući lanac sekvence AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2). Prema tome, kao što je prethodno navedeno, oligonukleotid sadrži matrični lanac sekvence UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) i kodirajući lanac AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2).
ii. Oligonukleotidne modifikacije
Oligonukleotid predmetnog pronalaska uključuje odgovarajuće nukleotidne modifikacije. Modifikovani nukleotid može imati modifikaciju u svojoj bazi (ili nukleobazi), šećeru (npr. ribozi, dezoksiribozi) ili fosfatnoj grupi. Oligonukleotid pronalaska ima sve modifikovane nukleotide.
a. Šećerne modifikacije
Modifikovani šećer (koji se ovde takođe naziva analog šećera) uključuje modifikovani deo dezoksiriboze ili riboze. Modifikacija nukleotida u šećeru može biti 2′-modifikacija. 2′-modifikacija može biti 2′-aminoetil, 2′-fluoro, 2′-O-metil, 2′-O-metoksietil ili 2′-dezoksi-2′-fluoro- β-d-arabinonukleinska kiselina. U oligonukleotidu pronalaska takva modifikacija je 2'-fluoro ili 2'-O-metil. Dakle, sve pozicije 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 i 31-36 kodirajući lanac i sve pozicije 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 i 19-22 matričnog lanca su modifikovani sa 2′-O-metilom. Pored toga, sve pozicije 3, 5, 8-11, 13, 15 i 17 kodirajućeg lanca i sve pozicije 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 i 18 matričnog lanca su modifikovane sa 2′-fluoro.
b. 5′ Terminalni fosfati
5′-terminalne fosfatne grupe oligonukleotida pojačavaju interakciju sa Argonautom 2. Međutim, oligonukleotidi koji sadrže 5′-fosfatnu grupu mogu biti podložni razgradnji preko fosfataza ili drugih enzima, što može ograničiti njihovu bioraspoloživost in vivo. Tako oligonukleotidi mogu uključivati analoge 5′ fosfata koji su otporni na takvu degradaciju.
Oligonukleotid može imati analog fosfata na 4′-ugljeničnoj poziciji šećera (koji se naziva „analog 4′-fosfata“). Videti, na primer, međunarodnu prijavu br. PCT/US2017/049909, pod naslovom 4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same, podnetu 1. septembra 2017. godine.
Kao što je gore navedeno, oligonukleotid pronalaska ima analog 4'-fosfata na 5'-terminalnom nukleotidu, tačnije na poziciji 1 matričnog lanca. Ovaj analog fosfata vezan za oligonukleotid je metoksi fosfonat (MOP), 5′ mono-metil zaštićen MOP. Tako se koristi sledeći uridinski nukleotid koji sadrži analog fosfata, na prvoj poziciji vodiča (matričnog) lanca:
taj modifikovani nukleotid se naziva [Mefosfonat-4O-mU] ili 5'-metoksi, fosfonat-4'oksi-2'-O-metiluridin. Ovo je u vezi sa upotrebom modifikovane internukleotidne veze između položaja 1 i 2 matričnog lanca kao što je dalje istaknuto u nastavku.
c. Modifikovane internukleotidne veze
Oligonukleotid pronalaska ima fosfotioatnu vezu između svake od: pozicija 1 i 2 kodirajućeg lanca, pozicija 1 i 2 matričnog lanca, pozicija 2 i 3 matričnog lanca, pozicija 3 i 4 matričnog lanca, pozicija 20 i 21 matričnog lanca i pozicija 21 i 22 matričnog lanca. Tako oligonukleotid obuhvata sledeću strukturu na poziciji 1 matričnog lanca:
iii. Ciljajući liganadi
Oligonukleotid prema predmetnom pronalasku je modifikovan da olakša isporuku oligonukleotida u hepatocite jetre.
Dakle, oligonukleotid sadrži nukleotide koji su konjugovani sa ciljajućim ligandom od kojih je svaki GalNAc deo. GalNAc je ligand visokog afiniteta za asijaloglikoproteinski receptor (ASGPR), koji je primarno eksprimovan na sinusoidnoj površini ćelija hepatocita i ima glavnu ulogu u vezivanju, internalizaciji i naknadnom čišćenju cirkulišućih glikoproteina koji sadrže ostatke terminalne galaktoze ili N-acetilgalaktozamina. (asijaloglkcoproteini).
Prema tome, kao što je gore navedeno, oligonukleotid predmetnog pronalaska ima monovalentni GalNac vezan za gvanidinski nukleotid, koji se naziva [ademG- GalNAc] ili 2'-aminodietoksimetanol-Gvanidin- GalNAc, kao što je prikazano u nastavku:
Oligonukleotid predmetnog pronalaska, takođe, ima monovalentni GalNAc vezan za adeninski nukleotid, koji se naziva [ademA- GalNAc] ili 2'-aminodietoksimetanol-Adenin-GalNAc, kao što je prikazano u nastavku.
Tačnije, svaki od 4 nukleotida petlje (L) petlje stabla je svaki konjugovan sa zasebnim monovalentnim GalNAc ostatkom. Takva konjugacija je prikazana u nastavku za petlju koja sadrži od 5′ do 3′ nukleotidnu sekvencu GAAA (L = linker, X = heteroatom), prikazane su tačke vezivanja stabla. Takva petlja može biti prisutna, na primer, na pozicijama 27-30
molekula prikazanog na Sl.1A. U hemijskoj formuli, je tačka vezivanja za oligonukleotidni lanac.
.
Odgovarajući postupci ili hemija (npr. klik hemija) mogu se koristiti za povezivanje ciljajućeg liganda sa nukleotidom. Linkeri bazirani na acetalu su stavljeni na uvid javnosti, na primer, u Međunarodnoj patentnoj prijavi broj publikacije WO2016100401 A1, koja je objavljena 23. juna 2016. i ovaj tip linkera se koristi u oligonukleotidu prema pronalasku za koji se zaštita traži.
Primer je prikazan u nastavku za petlju koja sadrži od 5' do 3' nukleotida GAAA, u kojoj su GalNac delovi vezani za nukleotide petlje pomoću acetalnog linkera. Takva petlja može biti prisutna, na primer, na pozicijama 27-30 molekula prikazanog na Sl.1A i karakteristika je
oligonukleotida predmetnog pronalaska. U hemijskoj formuli, je tačka vezivanja za oligonukleotidni lanac.
Ċ
III. Formulacije
Formulacije su ovde date da bi se olakšala upotreba oligonukleotida. Na primer, ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže oligonukleotid pronalaska za upotrebu u smanjenju ekspresije LDHA. Takve kompozicije mogu biti na odgovarajući način formulisane tako da kada se daju subjektu, bilo u neposredno okruženje ciljne ćelije ili sistemski, dovoljan deo oligonukleotida ulazi u ćeliju da smanji ekspresiju LDHA. U nekim realizacijama, formulacije kako su ovde otkrivene sadrže ekscipijens.
U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija je formulisana tako da bude kompatibilna sa svojim predviđenim načinom primene. Primeri načina primene uključuju, ali nisu ograničeni na, supkutanu, intradermalnu, transmukoznu, intravensku i rektalnu primenu.
Postupci upotrebe kompozicija pronalaska su dalje razmotreni u nastavku teksta, ali se podrazumeva da ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita kao takvi.
IV. Postupci upotrebe
i. Smanjenje LDHA ekspresije u ćelijama
Ovde su stavljeni na uvid javnosti postupci za isporuku efikasne količine oligonukleotida u ćeliju u svrhu smanjenja ekspresije LDHA u ćeliji. Postupci koji su ovde dati su korisni u bilo kom odgovarajućem tipu ćelije koji eksprimuje LDHA. Ćelija u koju se isporučuje oligonukleotid može biti ex vivo ili in vitro (tj. može biti isporučena u ćeliju u kulturi ili u organizam u kome se ćelija nalazi). Opisani su postupci za isporuku efikasne količine oligonukleotida u ćeliju u svrhu smanjenja ekspresije LDHA u hepatocitima.
Posledice inhibicije mogu se potvrditi odgovarajućim testom za procenu jednog ili više svojstava ćelije ili subjekta, ili biohemijskim tehnikama koje procenjuju molekule koji ukazuju na ekspresiju LDHA (npr. RNK, protein, aktivnost enzima, nivoi metabolita, nivoi oksalata, itd.). Stepen do kojeg oligonukleotid koji je ovde dat smanjuje nivoe ekspresije LDHA procenjuje se poređenjem nivoa ekspresije (npr. mRNK ili nivoa proteina LDHA sa odgovarajućom kontrolom (npr. nivoom ekspresije LDHA u ćeliji ili populaciji ćelija kojoj oligonukleotid nije isporučen ili kojoj je isporučena negativna kontrola. Odgovarajući nivo kontrole ekspresije LDHA može biti unapred određeni nivo ili vrednost, tako da kontrolni nivo ne mora da se meri svaki put. Unapred određen nivo ili vrednost može imati različite oblike. Unapred određeni nivo ili vrednost može biti pojedinačna granična vrednost, kao što je medijana ili srednja vrednost.
Primena oligonukleotida kao što je ovde opisano dovodi do smanjenja nivoa ekspresije LDHA u ćeliji. U nekim realizacijama, smanjenje nivoa ekspresije LDHA može biti sniženje na 1% ili niže, 5% ili niže, 10% ili niže, 15% ili niže, 20% ili niže, 25% ili niže, 30% ili niže, 35% ili niže, 40% ili niže, 45% ili niže, 50% ili niže, 55% ili niže, 60% ili niže, 70% ili niže, 80% ili niže, ili 90 % ili niže u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim nivoom LDHA. Odgovarajući kontrolni nivo može biti nivo ekspresije LDHA u ćeliji ili populaciji ćelija koje nisu bile u kontaktu sa oligonukleotidom kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, efekat isporuke oligonukleotida u ćeliju u skladu sa postupkom koji je ovde stavljen na uvdi se procenjuje nakon konačnog vremenskog perioda. Na primer, nivoi LDHA se mogu analizirati u ćeliji najmanje 8 sati, 12 sati, 18 sati, 24 sata; ili najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, četrnaest, dvadeset jedan, dvadeset osam, trideset pet ili više dana nakon uvođenja oligonukleotida u ćeliju.
ii. Postupci lečenja
RNKi oligonukleotid prema predmetnom pronalasku je koristan za smanjenje proizvodnje oksalata u jetri kod subjekta, npr. pacijenta koji ima primarnu hiperoksaluriju. Takav RNKi oligonukleotid je koristan za smanjenje nivoa oksalata u urinu. Takav RNKi oligonukleotid je koristan za lečenje primarne hiperoksalurije, uključujući PH1, PH2 i/ili PH3, kao i idiopatske hiperoksalurije. Takav tretman bi se mogao koristiti, na primer, za ublažavanje ili zaustavljanje akumulacije oksalata. Predmetni pronalazak obezbeđuje i profilaktičke i terapeutske metode lečenja subjekta koji je pod rizikom od (ili je podložan) bolesti ili poremećaja povezanim sa akumulacijom oksalata.
Subjekat koji se leči može biti bilo koji subjekat koji će imati terapeutske koristi od smanjenja akumulacije oksalata, npr. u jetri. Prema tome, subjekt koji se leči može biti subjekt koji ima ili se sumnja da ima stanje koje dovodi do akumulacije oksalata, bolesti bubrega ili primarne hiperoksalurije, uključujući PH1, PH2 i/ili PH3, kao i idiopatsku hiperoksaluriju.
Obično, oligonukleotid kao što je ovde otkriven može se primeniti intravenozno ili supkutano.
Kao neograničavajući skup primera, oligonukleotid iz predmetnog pronalaska bi se obično davao kvartalno (jednom svaka tri meseca), dvomesečno (jednom u dva meseca), mesečno ili nedeljno. Na primer, oligonukleotid se može primenjivati svake jedne, dve ili tri nedelje. U nekim slučajevima oligonukleotid se može primenjivati mesečno.
Subjekt koji se leči može biti čovek. Subjekt koji se leči može biti primat koji nije čovek ili drugi subjekt sisara (npr. miš ili pacov). Subjekt koji se leči može biti primat koji nije čovek ili drugi subjekt sisara koji je konstruisan da eksprimuje humani LDHA transkript (npr.
iz AAV isporučenog ekspresionog vektora).
PRIMERI
Primer 1: Specifični RNKi oligonukleotidi korisni u specifičnom obaranju LDHA
RNKi oligonukleotid koji ima matrični lanac sekvence UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) i kodirajući lanac sekvence AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2) je procenjen na njegovu sposobnost [da obori ekspresiju LDHA mRNK. U RNKi oligonukleotidu, sledeće pozicije su modifikovane sa 2′-O-metilom (prikazano kao 2′-OMe): pozicije 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, i 31-36 kodirajućeg lanca i pozicija 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 i 19-22 matričnog lanca. Sledeći položaji su modifikovani sa 2′-fluoro (prikazano kao 2′-F): pozicije 3, 5, 8-11, 13, 15i 17 kodirajućeg lanca i pozicije 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 i 18 matričnog lanca. RNKi oligonukleotid ima fosfotioatnu vezu između svake od: pozicija 1 i 2 kodirajućeg lanca, pozicija 1 i 2 matričnog lanca, pozicija 2 i 3 matričnog lanca, pozicija 3 i 4 matričnog lanca, pozicija 20 i 21 matričnog lanca i pozicija 21 i 22 matričnog lanca.
SLIKA 1B je prikaz hemijske strukture pozicija 27-30 putničkog (kodirajućeg) lanca prikazanog na Sl.1A i Sl.1C je prikaz hemijske strukture modifikovanog uridina prikazanog na poziciji 1 vodećeg (matričnog) lanca u istom molekulu. SLIKA 3 je hemijska struktura RNKi oligonukleotida. RNKi oligonukleotid ove hemijske strukture se naziva LDHA-1.
GalNAc šećeri su konjugovani sa nukleotidima koji obuhvataju pozicije od 27 do 30 na kodirajućem lancu. Odgovor na dozu i trajanje obaranja LDHA mRNK od strane LDHA-1 u jetri zdravih ženki miševa procenjeni su in vivo pomoću humanog LDHA AAV modela miša. Humana LDHA mRNK je eksprimovana pod kontrolom promotora globulina koji vezuje hormon štitne žlezde putem transdukcije virusa AAV9. Da bi se uspostavio mišji model, ženkama CD-1 miševa starim 4-6 nedelja doziran je intravenski (IV) kontrolisanim titrom virus AAV9 da bi se stvorila stabilna ekspresija humane LDHA mRNK. SLIKA 2A je shema koja prikazuje vremensku liniju ove evaluacije. AAV injekcija (u dozi od 7,5 x 10<11>genomskih kopija u 100 µL) desila se u sedmici -1, a pojedinačne doze LDHA-1 su ubrizgane supkutano nedelju dana kasnije u dozi od 0,5 mg/kg ( n = 20 miševa), 1 mg/kg (n = 30 miševa), 3 mg/kg (n = 30 miševa) ili 6 mg/kg (n = 30 miševa) kao što je prikazano. U 1, 2, 4, 6, 8. i 10. nedelj i 4 mm biopsija jetre je sakupljena i brzo zamrznuta u bloku i u RNAlater-u (ThermoFisher Scientific) za analizu obaranja mRNK.
Sl. 2B je grafik koji pokazuje podskup rezultata studije opisane na Sl.2A.
Procenat preostale hLDHA mRNK prikazan je u nedeljama nakon doziranja za doze od 1, 3 ili 6 mg/kg. Ovi rezultati su normalizovani na vremenski usklađen PBS (n = 40 miševa). Rezultati pokazuju da je brzo i dugotrajno obaranje ektopično eksprimovane LDHA mRNK postignuto nakon jedne SC doze od 1, 3 ili 6 mg/kg LDHA-1 kod zdravih miševa koji eksprimuju humani LDHA.
Jedna SC doza od 6 mg/kg LDHA-1 smanjila je ekspresiju humane LDHA mRNK u jetri za 90% u poređenju sa PBS kontrolom nedelju dana posle doziranja (p≤ 0,05). Smanjenje humane LDHA mRNK zavisno od doze trajalo je četiri nedelje nakon pojedinačne doze. Ekspresija LDHA je obnovljena 6 nedelja nakon pojedinačne doze.
Jedna SC doza od 3 mg/kg LDHA-1 smanjila je ekspresiju humane LDHA mRNK u jetri za 63% u poređenju sa PBS kontrolom nedelju dana posle doziranja. Stepen obaranja humane LDHA mRNK ostao je konstantan četiri nedelje nakon pojedinačne doze sa oporavkom početne ekspresije LDHA 6 nedelja nakon pojedinačne doze.
Jedna SC doza od 1 mg/kg LDHA-1 smanjila je ekspresiju humane LDHA mRNK u jetri za 50% u poređenju sa PBS kontrolom nedelju dana posle doziranja. Stepen uništenja humane LDHA mRNK je održan sa 45% oboren četiri nedelje nakon doziranja.
LDHA mRNK ekspresija se vratila na početnu vrednost 6 nedelja nakon pojedinačne doze.
Materijali i postupci za Primer 1
Životinje: Ženke CD-1 miševa, (datum rođenja 9.8.2016, datum prijema 13.9.2016.), kupljene su od Charles River Laboratories (Kingston, NY, Strain Code 022). Miševi su ostavljeni da se aklimatiziraju najmanje 3 dana pre početka doziranja. Miševi su držani u specifičnim uslovima uzgoja bez patogena, sa pristupom laboratorijskoj hrani i vodi ad libitum.
RNKi oligonukleotid LDHA-1 : hemijski sintetizovan dvolančani dupleks RNK oligonukleotid sa GalNAc funkcionalnošću u sterilnom fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS ). Oligonukleotidi su čuvani na -20°C. Pre upotrebe, oligonukleotidi su odmrznuti i dobro izmešani (nežno vorteksiranje), a zatim ekvilibrisani na sobnoj temperaturi najmanje 30 minuta.
LDHA mRNK Merenje pomoću RT-qPCR: Približno 50 mg uzorka je homogenizovano u 0,75 mL QIAzol reagensa za lizu na bazi fenola/gvanidina (Qiagen, Valencia, CA) korišćenjem Tissuelyser II (Qiagen, Valencia, CA). Homogenat je ekstrahovan sa 1-brom-3-hlorpropanom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). RNK je ekstrahovana iz 0,2 ml vodene faze korišćenjem MagMax tehnologije (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema uputstvima proizvođača. RNK je kvantifikovana spektrometrijom na 260 i 280 nm. RT-qPCR testovi kompanije Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) i reagensi iz ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) i BioRad Laboratories (Hercules, CA) korišćeni su za merenje nivoa LDHA mRNK sa normalizacijom na nivoe AA V9 plazmida. Stepen smanjenja LDHA mRNK u LDHA-1tretmanskim grupama izračunat je kao procenat ekspresije (normalizovan na broj kopija plazmida AAV9 određen qPCR DNK) u odnosu na prosečni nivo ekspresije PBS kontrolne grupe istog dana, gde je ekspresija LDHA mRNK u PBS kontrolnoj grupi postavljena na 100%. Grafikoni su generisani i podaci su analizirani korišćenjem GraphPad Prism. Jednosmerna analiza varijanse (ANOVA) korišćenjem Dunetovog testa višestrukih poređenja izvršena je da bi se uporedili nivoi LDHA mRNK (normalizovani na AAV9 broj kopija) u LDHA-1 tretiranim grupama u odnosu na PBS kontrolnu grupu u istoj vremenskoj tačci.
Primer 2: Studija toksičnost i toksikokinetička studija LDHA-1ciljanja LDHA kod mladunaca i mladih odraslih majmuna makaki rakojeda
Studija toksičnosti i toksikokinetička studija s ponovljenom dozom nakon 5-nedeljna supkutano je dizajnirana da pokaže efekat oligonukleotida koji ciljaju LDHA kod mladunaca i mladih odraslih majmuna makaki rakojeda kojima je dva puta supkutano dato 30, 100 ili 300 mg/kg LDHA-1 opisanog u Primeru 1 (videti takođe Sl.3). Mužjaci i ženke, mladunci i mladi odrasli majmuni makaki rakojeda primili su supkutane (SC) injekcije od 0 (sterilna voda za injekcije, SWFI prvog dana, sterilni fiziološki rastvor 29. dana), 30, 100 ili 300 mg/kg LDHA-1 u danima 1 i 29. Tkivo jetre je sakupljeno pri terminalnom žrtvovanju (31. dan) i žrtvovanju za oporavak (57. dan) za analizu nivoa LDHA mRNK pomoću RT-qPCR, nivoa LDH proteina Vestern blot analizom i aktivnosti LDH enzimskom analizom.
Dizajn studije prikazan je u Tabeli 1. Tkiva jetre su sakupljena od makaki rakojeda pri terminalnom žrtvovanju (31. dan) i žrtvovanju za oporavk (57. dan) i ili su brzo zamrznuta u tečnom azotu za Vestern blot i test aktivnosti LDH, ili inkubirana u RNAlater-u i zamrznuta za RT-qPCR analizu.
Nakon primene dve doze od 30, 100 ili 300 mg/kg LDHA-1, ekspresija LDHA mRNK kod majmuna, koncentracije LDH proteina i aktivnost LDH su bili svi su značajno smanjeni kod terminalnog žrtvovanja 31. dana (p≤ 0,0001) na svim nivoima doze bez očiglednog odgovora na dozu. Slični nalazi su primećeni kod žrtvovanja za oporavak 57. dana (p<0,0001, p≤0,001, p≤0,01 kao što je naznačeno, statistička značajnost izračunata korišćenjem neuparenog t testa); nije primećen oporavak od obaranja LDHA mRNK, LDH proteina i aktivnosti LDH (Sl.4). Efekti doze na nivoe jetrenog LDH proteina mereno Vestern blotom su prikazani na Sl.5. Nivoi LDH proteina su značajno smanjeni na svim nivoima doze i kod terminalnog žrtvovanja (31. dan) i kod žrtvovanja za oporavak (57. dan).
Rezultat je pokazao da je 31. dana LDHA-1 pokazao snažnu aktivnost u smanjenju ekspresije LDHA mRNK majmuna, koncentracije LDH proteina i aktivnosti LDH na svim nivoima doze u poređenju sa kontrolama bez očiglednog odgovora na dozu. Smanjenje je trajalo do 57. dana bez evidentnog oporavka od ciljnog obaranja.
Tabela 1. Dizajn studije o toksičnosti i toksikokinetičke studije
a. ukupna zapremina doze će se izračunati na osnovu najnovije telesne težine
b. Terminalna obdukcija 31. dana
c. obdukcija oporavka 57. dana
Pored toga, studija toksičnosti i toksikokinetička studija sa ponovljenom dozom 39-nedelje supkutano oligonukleotida koji ciljaju LDHA sprovedena je na mladuncima i mladim odraslim majmunima makaki rakojeda koji su dobili deset SC davanja 30, 100 ili 300 mg/kg LDHA-1 opisanog u Primeru 1 da bi se procenilo smanjenje nivoa LDHA mRNK i da bi se kvantifikovala koncentracija LDHA-1 ugrađenog u kompleks za RNK indukovano utišavanje (RISC). Mladunci majmuna su primili supkutane (SC) injekcije od 0 (fiziološki rastvor), 30, 100 ili 300 mg/kg LDHA-1, a mladi odrasli majmuni su primili SC injekcije od 0 (fiziološki rastvor) ili 300 mg/kg LDHA-1 u studiji 1, 29, 57, 85, 113, 141, 169, 197, 225. i 253. dana. Tkivo jetre je sakupljeno na terminalnoj žrtvi (255. dan, 2 dana nakon poslednje doze) i žrtvovanju za oporavak (309. dan, 8 nedelja nakon poslednje doze) za analizu nivoa LDHA mRNA pomoću RT-kPCR. Uzorci jetre prikupljeni 255. dana takođe su korišćeni za kvantifikaciju koncentracije LDHA-1 ugrađene u kompleks za RNK indukovano utišavanje (RISC), mereno imunoprecipitacijom Argonaut proteina 2 (Ago2), praćeno Stem-Loop (SL)-RT-qPCR .
Potentna farmakodinamička aktivnost LDHA-1 bila je evidentna na kraju perioda doziranja (255. dan). Ekspresija LDHA mRNK majmuna je smanjena (smanjenje od 91,4% do 86,1%, P ≤ 0,0001) na svim nivoima doze. Koncentracija LDHA-1 ubačenog u RISC kompleks bila je povezana sa dozom sa značajno većim koncentracijama na nivou doze od 300 mg/kg (5,6 ng/g) u poređenju sa 30 mg/kg (2,1 ng/g) (P ≤ 0,05) . Farmakodinamički efekti LDHA-1, kao što je naznačeno značajnim smanjenjem (92,0% do 86,2%) ekspresije LDHA mRNK, opstajali su najmanje 8 nedelja nakon doziranja bez uočenog oporavka (Sl.6).
Određivanje redukcije LDHA mRNK 309. dana se smatralo dovoljnim za procenu farmakodinamičkog oporavka, tako da koncentracije LDHA-1 napunjenog u RISC kompleks 309. dana nisu procenjene.
Kvantifikacija LDHA-1 ugrađene u RISC na 255. dan studije je prikazana na Sl. 7. Grafički prikaz srednje vrednosti ± SD za svaku doznu grupu. Dana 255, koncentracije LDHA-1 u jetri su se povećavale sa povećanjem doze. Koncentracije LDHA-1 su značajno povećane (P < 0,05 pri dozi od 300 mg/kg u poređenju sa dozom od 30 mg/kg. Koncentracije LDHA-1 inkorporiranog u RISC kompleks bile su uporedive između mladunaca i mladih odraslih majmuna doziranih sa 300 mg/kg.
Potentna farmakodinamička aktivnost LDHA-1 bila je evidentna na kraju perioda doziranja (255. dan). Ekspresija LDHA mRNK kod majmuna je smanjena na svim nivoima doze u poređenju sa kontrolama. Nasuprot tome, koncentracija LDHA-1 ugrađenog u RISC kompleks bila je povezana sa dozom, sa značajno višim koncentracijama na nivou doze od 300 mg/kg u poređenju sa 30 mg/kg. Farmakodinamički efekti LDHA-1, mereni smanjenjem LDHA mRNK, opstali su do 309. dana (8 nedelja nakon doze) bez evidentnog oporavka.
Materijal i postupci za Primer 2
LDHA mRNK merenje pomoću RT-qPCR: Približno 50 mg svakog uzorka je homogenizovano u 0,75 mL QIAzol reagensa za lizu na bazi fenola/gvanidina (Qiagen, Valencia, CA) korišćenjem Tissuelyser II (Qiagen, Valencia, CA). Homogenat je ekstrahovan sa 1-brom-3-hlorpropanom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). RNK je ekstrahovana iz 0,2 mL vodene faze korišćenjem MagMax tehnologije (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) prema uputstvima proizvođača. RNK je kvantifikovana spektrometrijom na 260 i 280 nm. RT-qPCR testovi i reagensi kompanije ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) korišćeni su za merenje nivoa LDHA mRNK sa normalizacijom na nivoe mRNK Peptidil-prolil cis-trans izomeraze B (PPIB). Stepen redukcije LDHA mRNK u LDHA-1 tretiranim grupama izračunat je kao procenat ekspresije (normalizovan na nivoe PPIB mRNK) u odnosu na prosečan nivo ekspresije kontrolne grupe istog dana, gde je ekspresija LDHA mRNK u kontrolnoj grupi postavljena na 100%.
LDH Vestern Blot: Lizati tkiva su pripremljeni korišćenjem TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA) sa T-PER reagensom za ekstrakciju proteina tkiva i koktelom inhibitora proteaze (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Ukupna koncentracija proteina je merena BCA testom proteina (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) i jednake koncentracije proteina su razdvojene pomoću NuPAGE 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Elektroforezirani proteini su prebačeni na nitrocelulozne membrane korišćenjem iBlot Dry Blotting sistema (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) i blokirani sa Odyssey blokirajućim puferom (PBS) (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Membrane su zatim inkubirane sa zečjim anti-LDHA antitelom (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i sa mišjim antitelom na anti-gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (Abeam, Cambridge, MA). Za detekciju su korišćena antizečja IRDye 680 i anti-mišja IRDye 800 sekundarna antitela (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE), a intenzitet signala je meren korišćenjem Odyssey Infrared Imaging sistema (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Integrisani intenzitet (mera jačine signala i oblasti na kojima je raspoređen) je meren za svaki opseg. Postupci 'prosečne ili srednje pozadine' su korišćene za korekciju signala šuma. Stepen smanjenja LDH proteina u LDHA-1 tretiranim grupama izračunat je kao procenat ekspresije (normalizovan na nivoe GAPDH proteina) u odnosu na prosečni nivo ekspresije kontrolne grupe istog dana, gde je ekspresija LDH proteina u kontrolnoj grupi postavljena na 100%.
Test LDH aktivnosti: Normalizovane koncentracije proteina u ekstraktima tkiva pripremljenim za LDH vestern blot u odeljku 6.2.2 procenjene su na aktivnost LDH korišćenjem Kompleta za ispitivanje laktat dehidrogenaze (Abeam, Inc., Cambridge, MA) prema uputstvima proizvođača . Ukratko, ekstrakti tkiva su razblaženi do koncentracije od 50 μg/mL u reagensu za ekstrakciju proteina tkiva T-PER, a zatim razblaženi 5 puta u ploči sa 96 ležišta u duplikatu dodavanjem 10 μL uzorka u 40 μL pufera za ispitivanje LDH. Serija standardnih rastvora nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) i LDH pozitivne kontrole je pripremljena prema uputstvima proizvođača. Ploča je mešana, zaštićena od svetlosti i inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Apsorbancija na 450 nanometara je izmerena 0 i 30 minuta nakon dodavanja reakcione smeše korišćenjem SpectraMax MS čitača ploča (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Stepen smanjenja aktivnosti LDH u LDHA-1 tretiranim grupama izračunat je kao procenat aktivnosti u odnosu na prosečan nivo aktivnosti kontrolne grupe istog dana, gde je aktivnost LDH u kontrolnoj grupi postavljena na 100%.
Merenje oligonukleotida povezanog sa Ago2 korišćenjem Sl-RT-qPCR:
Imunoprecipitacija Ago2 proteina iz brzo zamrznutih uzoraka jetre majmuna izvedena je korišćenjem Dynabeads Protein G. Nakon izolacije Ago2 proteina u uzorcima, korišćena je SL-RT-qPCR metoda zasnovana na istraživanju za kvantifikaciju koncentracije LDHA-1 povezane sa kompleksom Ago2. Da bi se kontrolisala varijabilnost imunoprecipitacije među uzorcima, miR-16, endogena mikroRNK koja je učitana u Ago2 kompleks, korišćena je kao normalizator. Detalji postupka su predstavljeni u Dodatku 10.2. Analizirani su samo uzorci od 255. dana da bi se dobile informacije o proporcionalnosti doze LDHA-1 napunjenog RISC pri visokim dozama gde je redukcija LDHA mRNK zasićena. Određivanje redukcije LDHA mRNK 309. dana smatrano je dovoljnim za procenu farmakodinamičkog oporavka.
Analiza podataka: Grafovi su generisani i podaci su analizirani korišćenjem GraphPad Prism. Jednosmerna ANOVA korišćenjem Dunetovog testa višestrukih poređenja izvedena je da bi se uporedili nivoi LDHA mRNK (normalizovani na nivoe PPIB mRNK), nivoi LDH proteina (normalizovani na nivo GAPDH proteina) i nivoi aktivnosti LDH u LDHA- 1 tretiranim grupama sa onim u kontrolnoj grupi u istoj vremenskoj tačci.
Jednosmerna ANOVA sa višestrukim poređenjima je korišćena da se uporede koncentracije LDHA-1 ugrađene u RISC, sa α = 0,05. ROUT analiza izlaznih vrednosti je izvršena na pojedinačnim podacima o životinjama za miR-16-normalizovana LDHA- i 1 izlazna vrednost je identifikovana i isključena iz svih analiza.
Primer 3: Dokaz koncepta u studiji na ljudima za RNKi oligonukleotid koji cilja LDHA u lečenju primarne hiperoksalurije
Cilj ove studije je bio da se proceni bezbednost, podnošljivost, farmakokinetika i farmakodinamika kod ljudi pojedinačnih rastućih doza RNKi oligonukleotida LDHA-1 iz Primera 1. Sekundarne krajnje tačke uključivale su procenu promene u 24-časovnoj ekskreciji oksalata u urinu u odnosu na početnu vrednost, definisanu kao srednja vrednost dve 24-časovne kolekcije tokom skrininga. Studija je podeljena u dve grupe:
Grupa A je osmišljena kao placebo kontrolisana, jednostruko slepa studija faze 1 kod 25 normalnih zdravih dobrovoljaca (NHV) uključenih na jednom mestu u Ujedinjenom Kraljevstvu. Grupa B je osmišljena kao otvorena, multicentrična studija LDHA-1 oligonukleotida opisanog u Primeru 1 kod 16 pacijenata sa PH, uključujući tri grupe pacijenata sa PH1 dozama od 1,5, 3 i 6 mg/kg, i četvrta kohorta sa samo PH2 sa fleksibilnim doziranjem. Pacijenti grupe B bili su upisani na pet lokacija u Evropskoj uniji (EU) i jednoj lokaciji u SAD.
U prvoj kohorti Grupe B (1,5 mg/kg), početni rezultati nakon jedne primene RNKi oligonukleotida pokazali su da su tri od četiri odrasla pacijenta do sada dostigla skoro normalne koncentracije (≤60 mmol/24 sata) oksalata u urinu između 43. i 57. dana. Četvrta odrasla osoba, čiji je osnovni nivo oksalata u urinu bio 2,28 mmol/24 sata, pokazala je značajna smanjenja, pri čemu je opservacija nakon 71. dana pokazala značajno smanjenje za tog pacijenta (urinarni oksalat (UOX) <1,0 mmol/24 sata). Rezultati su sumirani na Sl.8A i 8B.
U drugoj kohorti B grupe (3 mg/kg), dva od četiri odrasla pacijenta do sada su dostigla normalne koncentracije oksalata u urinu (≤0,46 mmol/24 sata) između 29. i 43. dana. Oba druga pacijenta su, takođe, imala značajno smanjenje oksalata. Jedan pacijent u ovoj grupi imao je povišen nivo oksalata u plazmi. Ipak, tokom lečenja sa LDHA-1, oksalat u plazmi je smanjen na normalne nivoe. Rezultati su sumirani na Sl.8A i 8B.
Jedan odrasli pacijent sa PH2 u četvrtoj kohorti B grupe takođe je doživeo značajno smanjenje 24-časovnog izlučivanja oksalata u urinu (više od 35%) u najmanje jednom od dana uzorkovanja (dan 57).
Dalje, primećene su samo tri blage do umerene reakcije na mestu injekcije. Sve su bile prolazne (<72 sata) i rešene su bez intervencije.
Ukratko, primena LDHA-1 dovela je nivoe oksalata u urinu u normalan raspon (definisan kao 24-časovno izlučivanje ≤0,46 mmol) ili blizu normalnog raspona (definisano kao 24-časovno izlučivanje ≤ 0,6 mmol) kod većine od 8 pacijenata sa primarnom hiperoksalurijom tipa 1 i tipa 2 (PH1 i PH2). Svi procenjeni pacijenti su doživeli suštinsko i klinički značajno smanjenje oksalata u urinu (definisano kao smanjenje >30% u poređenju sa početnom linijom). Pacijenti koji se procenjuju su oni pacijenti za koje su podaci dostupni do 6. nedelje ili 43. dana. Svi procenjeni pacijenti su odrasli i uključuju sedam pacijenata sa PH1 i jednog pacijenta sa PH2.
Ovi podaci iznad predstavljaju klinički dokaz koncepta za RNKi oligonukleotid LDHA-1 iz Primera 1 kod ljudi i takođe pokazuju da je LDHA-1 bio bezbedan i da se dobro toleriše. Rezultati pokazuju potenciju i trajanje delovanja nakon primene jedne doze, i u skladu su sa kvartalnom primenom ispitanicima i podržavaju je.
Veličina redukcije oksalata u urinu, zajedno sa trajanjem dejstva potvrđuju terapijsko ciljanje laktaze dehidrogenaze, koja je uključena u krajnji korak proizvodnje oksalata u jetri. Na osnovu ovog mehanizma delovanja, LDHA-1 se može koristiti u lečenju svih vrsta primarne hiperoksalurije. Značajna smanjenja oksalata u urinu potvrđuju da platforma može efikasno smanjiti ekspresiju ciljnog gena kod ljudi i upotrebu takvih RNKi terapeutika za lečenje višestrukih oblika primarne hiperoksalurije.
Materijali i postupci za Primer 3
LDHA-1 molekularna struktura (videti takođe Primer 1, Sl.1A i Sl.3)
Smisaoni lanac:
Hibridizovan na:
Antismisaoni lanac:
Legenda:
mX: 2’-O-metil ribonukleozid
fX 2’-fluor-deoksiribonukleozid
[ademA-GalNAc]: 2’-O-GalNAc-modifikovani adenozin
[ademG-GalNAc]: 2’-O-GalNAc-modifikovani guanozin
[Mefosfonat-4O-mU]: 4’-O-monometilfosfonat-2’-O-metil uridin
Veze: “-“ označava fosfoodiester
“-S-“ označava fosforotioat
Farmaceutski razvoj
Proizvod leka je bio sterilni tečni lek koji se sastojao od LDHA-1 kao rastvora u WFI (Vodi za injekcije) za SC primenu. Korišćena formulacija (170 mg/ml koncentracija LDHA-1 u WFI pri pH 6.2-8.2) odabrana je na osnovu pH, osmolalnosti (200-300 mOsm/kg), viskoziteta i kompatibilnosti sa načinom primene.
Dijagnostika i kriterijumi za uključivanje/uključivanje
Grupa A Kriterijumi za uključivanje:
1. Subjekt mora da razume punu prirodu i svrhu studije, uključujući moguće rizike i neželjene efekte, i da je voljan i sposoban da se pridržava svih procedura i ograničenja studije.
2. Muški ili ženski subjekti između 18 i 55 godina starosti, inkluzivno.
3. Subjekt mora da ima indeks telesne mase (BMI) od 19,0 do 32 kg/m2, inkluzivno.
4. Nepušači, najmanje 1 mesec bez duvana i voljni da ostanu bez duvana kroz EOS. Subjekti, takođe, moraju biti bez proizvoda koji sadrže nikotin (npr. nikotinskih flastera).
5. Subjekti su inače morali biti zdravi. Zdrav status je definisan na osnovu mišljenja lekara, odsustvom dokaza o bilo kakvoj klinički značajnoj, aktivnoj ili hroničnoj bolesti nakon detaljne medicinske i hirurške anamneze, kompletnog fizičkog pregleda uključujući vitalne znakove, 12-odvodni EKG, hematologiju, analizu krvi, serologiju i analiza urina.
6. Subjekti moraju da imaju hematološke i kliničko-hemijske testove i analize urina u granicama normale, osim ako istraživač ili kvalifikovano lice ne klasifikuje abnormalnosti kao neklinički značajne (NCS). Testovi panela jetre (ALT i AST) moraju biti normalni. Ponovni testovi su mogli biti sprovedeni jednom za rezultate panela jetre.
7. Žene i muškarci, kao i partnerke muških subjekata koji su u reproduktivnom periodu, moraju biti voljni da koriste visoko efikasne i odobrene metode kontracepcije od datuma informisanog pristanka do 12 nedelja nakon poslednje doze IMP-a. Veoma efikasan metod kontracepcije je definisan kao ispunjavanje najmanje jednog od sledećih:
a. Stroga apstinencija: Kada je ovo bilo u skladu sa preferiranim i uobičajenim načinom života pacijenta. [Periodična apstinencija (npr. kalendarska, ovulacija, simptomatske termalne metode, metode nakon ovulacije) i prekid odnosa nisu bili prihvatljivi metodi kontracepcije.]
b. Hirurška sterilizacija (podvrgavanje jednoj od sledećih hirurških procedura: histerektomija, bilateralna ligacija jajovoda, bilateralna ooforektomija ili bilateralna salpingektomija) i najmanje 6 nedelja nakon sterilizacije.
c. Kombinovani hormonski oralni kontraceptivi (estrogen i progesteron), implantirani ili injekcioni kontraceptivi u stabilnoj dozi najmanje 1 mesec pre posete za skrining plus barijerna metoda. Kombinovana hormonska kontracepcija se smatrala visoko efikasnim metodom kontracepcije samo ako je bila povezana sa inhibicijom ovulacije. Ako je povezana sa inhibicijom ovulacije, hormonska kontracepcija koja sadrži samo progesteron se takođe smatra visoko efikasnim metodom kontracepcije.
d. Intrauterini uređaji plus kondomi. Hormonski intrauterini uređaj (IUD) umetnut najmanje 1 mesec pre skrining posete.
e. Metode dvostruke barijere [npr. kondom i okluzivna kape (dijafragma ili cervikalne kape) sa spermicidnom penom / gelom / filmom / kremom / supozitorijom]. Treba napomenuti da ženski kondom i muški kondom, ili dva muška kondoma, ne bi trebalo da se koriste zajedno jer trenje između njih može dovesti do kvara oba proizvoda.
f. Partner sa vazektomijom (najmanje 6 meseci nakon procedure) pre skrining posete.
8. Žene u postmenopauzi: definisano kao 12 meseci bez menstruacije pre skrininga i FSH u serumu >26 IU/L tokom skrining posete.
9. Za žene: negativan test na trudnoću na skriningu i pri poseti 0. dana.
Grupa B – Kriterijumi za uključivanje pacijenata sa PH
Pacijenti sa PH moraju da ispunjavaju sve sledeće kriterijume da bi bili kvalifikovani za učešće u ovoj studiji.
1. Pacijent i/ili pacijentov roditelj ili staratelj ako je pacijent bio maloletan (definisan kao pacijent <18 godina ili mlađi od punoletstva, prema lokalnim propisima),
a. Mora da razume punu prirodu i svrhu studije, uključujući moguće rizike i neželjene efekte.
b. Mora da bude voljan i sposoban da se pridržava svih procedura ispitivanja uključujući prikupljanje 24-časovnih uzoraka urina.
c. Mora da da informisani pristanak. Adolescenti (od 12 do < 18 godina, ili stariji od 12 godina, ali mlađi od punoletstva, prema lokalnim propisima) moraju da budu u mogućnosti da daju pismenu saglasnost za učešće. Za decu mlađu od 12 godina, saglasnost bi bila zasnovana na lokalnim propisima.
2. Muško ili žensko, najmanje 6 godina starosti u vreme dobijanja informisanog pristanka.
3. Pacijent mora imati minimalnu telesnu težinu od 25 kg.
4. Dokumentovana dijagnoza PH1 ili PH2, potvrđena genotipizacijom (istorijski dostupne informacije o genotipu su prihvatljive za podobnost u studiji).
5. 24-časovna ekskrecija oksalata u urinu ≥0,7 mmol za pacijente starije od 18 godina, ili ≥0,7 mmol na 1,73 m2 telesne površine (BSA) za pacijente mlađe od 18 godina, na najmanje jednoj od dve procene sprovedene u skrining periodu, sa manje od 30% varijacije između oba merenja oksalata.
6. eGFR ≥30 mL/min normalizovan na 1,73 m2 BSA izračunat korišćenjem formule za modifikovanje ishrane kod bubrežne bolesti (MDRD) kod odraslih (starost ≥18 godina) ili formule po Švarcu kod pacijenata od 6 do < 18 godina
7. Pacijenti, pacijentkinje u reproduktivnom periodu i partnerke muških pacijenata u reproduktivnom dobu moraju biti voljni da koriste visoko efikasne i odobrene metode kontracepcije od datuma informisanog pristanka do 12 nedelja nakon poslednje doze IMP. Veoma efikasan metod kontracepcije bi se definisao kao ispunjavanje najmanje jednog od sledećeg:
a. Stroga apstinencija: Kada je ovo bilo u skladu sa preferiranim i uobičajenim načinom života pacijenta. [Periodična apstinencija (npr. kalendarska, ovulacija, simptomatske termalne metode, metode nakon ovulacije) i prekid odnosa ne bi bili prihvatljivi metodi kontracepcije.]
b. Hirurška sterilizacija (podvrgavanje jednoj od sledećih hirurških procedura: histerektomija, bilateralna ligacija jajovoda, bilateralna ooforektomija ili bilateralna salpingektomija) i najmanje 6 nedelja nakon sterilizacije.
c. Kombinovani hormonski oralni kontraceptivi (estrogen i progesteron), implantirani ili injekcioni kontraceptivi u stabilnoj dozi najmanje 1 mesec pre posete za skrining plus barijerna metoda. Kombinovana hormonska kontracepcija bi se smatrala visoko efikasnim metodom kontracepcije samo ako je bila povezana sa inhibicijom ovulacije. Ako je povezana sa inhibicijom ovulacije, hormonska kontracepcija koja sadrži samo progesteron bi se takođe smatrala visoko efikasnom metodom kontracepcije.
d. Intrauterini uređaji plus kondomi. Hormonski intrauterini uređaj (IUD) umetnut najmanje 1 mesec pre skrining posete.
e. Metode dvostruke barijere [npr. kondom i okluzivna kapa (dijafragma ili cervikalne kape) sa spermicidnom penom / gelom / filmom / kremom / supozitorijom]. Treba napomenuti da ženski kondom i muški kondom, ili dva muška kondoma, ne bi trebalo da se koriste zajedno jer trenje između njih može dovesti do kvara oba proizvoda.
f. Partner sa vazektomijom (najmanje 6 meseci nakon procedure) pre skrining posete.
8. Žene u postmenopauzi: definisano kao 12 meseci bez menstruacije pre skrininga i FSH u serumu >26 IU/L tokom skrininga.
9. Za žene u reproduktivnom periodu: negativan test na trudnoću na skriningu i pri poseti 0. dana.
10. Pacijenti sa PH1 koji primaju piridoksin u stabilnim dozama najmanje 4 nedelje pre ulaska u studiju moraju biti voljni da ostanu na istoj stabilnoj dozi tokom studije. U malo verovatnom slučaju da je pacijent sa PH2 primao piridoksin, ovo je trebalo prekinuti najmanje 4 nedelje pre ulaska u studiju.
Grupa A – Kriterijumi isključenja NHV
Volonteri normalnog zdravlja koji ispunjavaju bilo koji od sledećih kriterijuma bili bi isključeni iz ove studije:
1. Prisustvo bilo kakvog zdravstvenog stanja ili komorbiditeta koji bi ometao usklađenost studije ili tumačenje podataka ili bi potencijalno uticao na bezbednost ispitanika uključujući, ali ne ograničavajući se na:
a. teške interkurentne bolesti
b. rutinsku vakcinaciju u roku od 30 dana pre doziranja i tokom EOS posete
c. poznate uzroke aktivnog oboljenja jetre/povrede ili povećanja transaminaza (npr. alkoholna bolest jetre, nealkoholna bolest masne jetre/steatohepatitis (NAFLD/NASH))
d. zabrinutost lekara zbog prekomerne konzumacije alkohola
e. rutinsku ili hroničnu upotrebu više od 3 grama paracetamola dnevno.
2. Istorija kamena u bubregu.
3. Žene koje su bile trudne, dojile ili planirale da pokušaju da zatrudne tokom ove studije ili u roku od 90 dana nakon poslednje doze IMP.
4. Muškarci sa partnerkama koje su planirale da zatrudne tokom ove studije ili u roku od 90 dana nakon poslednje doze IMP.
5. Upotreba bilo kog ispitivanog sredstva u roku od 90 dana pre prve doze ispitivanog leka. Ako je subjekt učestvovao u prethodnim studijama siRNK ili antitela, bio bi potreban period ispiranja od najmanje 6 meseci pre prve primenjene doze u ovoj studiji.
6. Naporne aktivnosti, sunčanje i kontaktni sportovi u roku od 48 sati (2 dana) pre primene doze i do EOS posete ili 29. dana.
7. Istorija davanja više od 450 mL krvi u roku od 90 dana pre doziranja u kliničkom istraživačkom centru ili planirane donacije manje od 30 dana nakon primanja IMP.
8. Donacija plazme ili trombocita u roku od 7 dana od doziranja i tokom cele studije.
9. Istorija konzumacije alkohola koja prelazi više od 21 jedinice kod muškaraca, 14 jedinica kod žena, nedeljno, kako je utvrdio istražitelj. Konzumacija alkohola bi bila zabranjena 48 sati pre prijema u kliničku ustanovu i do kraja studije.
10. Pozitivan skrining test na površinski antigen hepatitisa B (HBsAg), antitela na virus hepatitisa C (HCV) ili antitela na virus humane imunodeficijencije (HIV) 1 i 2. Ako je subjekt bio testiran u poslednja 3 meseca, mogli su se koristiti istorijski podaci.
11. Istorija jedne ili više od sledećih reakcija na terapiju zasnovanu na oligonukleotidima a. Teška trombocitopenija
b. Hepatotoksičnost
c. Teški simptomi slični gripu koji dovode do prekida terapije
d. Lokalizovana kožna reakcija nakon injekcije (stepen 3 ili više) koja dovodi do prekida terapije.
e. Koagulopatija/klinički značajno produženje vremena zgrušavanja
Druga ograničenja:
Svi redovni netopikalni lekovi i neredovni lekovi (uključujući lekove bez recepta, zdravstvene suplemente i hronično doziranje biljnih lekova kao što je ekstrakt kantariona) moraju biti obustavljen najmanje 14 dana pre prijema u centar za klinička istraživanja i uključujući EOS posetu. Izuzetak bi bio napravljen za paracetamol (acetaminofen), koji bi bio dozvoljen do prijema u centar za klinička istraživanja. Međutim, NSAIL kao što su ibuprofen, aspirin, naproksen itd. moraju biti prekinuti najmanje 14 dana pre prijema u centar za klinička istraživanja. Subjekti ne bi trebalo da se bave intenzivnom vežbom tokom učešća u studiji (tj. između skrininga i EOS poseta). Tokom studije, od ispitanika bi se zahtevalo da izbegavaju hranu bogatu oksalatima i da jedu umerene količine proteina i kalcijuma, da ne prelaze nacionalne smernice za ishranu. Mora da se izbegavaju proteinski šejkovi.
Grupa B – Kriterijumi za isključenje pacijenata sa PH
Pacijenti sa PH koji ispunjavaju bilo koji od sledećih kriterijuma bili bi isključeni iz ove studije:
1. Prethodna transplantacija bubrega i/ili jetre.
2. Trenutno je na dijalizi.
3. Dokumentovani dokazi o kliničkim manifestacijama sistemske oksaloze.
4. Učešće u bilo kojoj kliničkoj studiji u kojoj su dobili ispitivani medicinski proizvodi u roku od 4 meseca pre prijave. Za IMP sa potencijalom da smanje Uox i/ili oksalat u plazmi, ove koncentracije moraju da se vrate na istorijske osnovne nivoe.
a. Ako je pacijent učestvovao u ranijoj kohorti u ovoj studiji, mora da prođe najmanje 8 nedelja pre ponovnog uključivanja i izlučivanje oksalata u urinu mora da se vrati na ≥80% početne vrednosti.
5. Prisustvo bilo kakvog zdravstvenog stanja ili komorbiditeta koji bi ometao usklađenost studije ili tumačenje podataka ili bi potencijalno uticao na bezbednost pacijenata uključujući, ali ne ograničavajući se na:
a. teške interkurentne bolesti
b. rutinsku vakcinaciju u roku od 30 dana pre doziranja i tokom EOS posete c. poznate uzroke aktivnog oboljenja jetre/povrede ili povećanja transaminaza (npr. alkoholna bolest jetre, nealkoholna masna bolest jetre/steatohepatitis (NAFLD/NASH)
d. zabrinutost lekara zbog prekomerne konzumacije alkohola
e. rutinska ili hronična upotreba više od 3 grama acetaminofena dnevno.
6. Istorija konzumacije alkohola koja prelazi više od 21 jedinice kod muškaraca, 14 jedinica kod žena, nedeljno, kako je utvrdio istražitelj.
7. Žene koje su trudne, doje ili planiraju da pokušaju da zatrudne tokom ove studije ili u roku od 90 dana nakon poslednje doze IMP.
8. Abnormalnosti testa funkcije jetre (LFT): ALT i/ili AST >1,5 puta GGN za uzrast i pol.
9. Istorija jedne ili više od sledećih reakcija na terapiju zasnovanu na oligonukleotidima
a. Teška trombocitopenija
b. Hepatotoksičnost
c. Teški simptomi slični gripu koji dovode do prekida terapije
d. Lokalizovana kožna reakcija nakon injekcije (stepen 3 ili više) koja dovodi do prekida terapije.
e. Koagulopatija/klinički značajno produženje vremena zgrušavanja
Druga ograničenja:
Pacijenti je takođe trebalo da izbegavaju uzimanje suplemenata vitamina C 24 sata pre i tokom 24-časovnog uzimanja uzoraka urina, kao i 24 sata pre uzimanja krvi za PD. Pacijenti ne bi trebalo da se bave intenzivnom vežbom tokom učešća u studiji (tj. između skrininga i EOS poseta). Tokom studije, pacijenti je trebalo da izbegavaju hranu bogatu oksalatima i da jedu umerene količine proteina i kalcijuma, da ne prelaze nacionalne smernice za ishranu. Mora da se izbegavaju proteinski šejkovi.
Merenje nivoa oksalata (UOX) u urinu
Uzorak urina od 24 sata je uzet od pacijenta i alikvot je zakiseljen da bi se poboljšala rastvorljivost oksalata. Generalno, oksalat je nerastvorljiv i formira kristale koji se mogu rastvoriti u kiselim uslovima. Solubilizovani UOX je zatim podvrgnut HPLC analizi da bi se odredio njegov nivo.
Ċ
LISTING SEKVENCI
<110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc.
<120> POSTUPCI I KOMPOZICIJE ZA INHIBICIJU EKSPRESIJE LDHA
<130> D0800.70011WO00
<140> PCT/US2018/055735
<141> 2018-10-12
<150> US 62/726,950
<151> 2018-09-04
<150> US 62/572,403
<151> 2017-10-13
<150> US 62/572,398
<151> 2017-10-13
<160> 2
<170> PatentIn verzija 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polinukleotid
<400> 1
ucagauaaaa aggacaacau gg 22
<210> 2
<211> 36
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polinukleotid
<400> 2
auguuguccu uuuuaucuga gcagccgaaa ggcugc 36

Claims (6)

  1. Patentni zahtevi 1. Oligonukleotid za smanjenje ekspresije laktat dehidrogenaze A LDHA, oligonukleotid koji sadrži matrični lanac koji ima sekvencu navedenu kao UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (SEQ ID NO: 1) i kodirajući lanac koji ima sekvencu navedenu kao AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO: 2), naznačen time što su sve pozicije 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 i 31-36 kodirajućeg lanca i pozicije 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 i 19-22 matričnog lanca modifikovane sa 2′-O-metilom, a sve pozicije 3, 5, 8-11, 13, 15 i 17 kodirajućeg lanca i pozicije 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 i 18 matričnog lanca su modifikovane sa 2'-fluoro; naznačen time što oligonukleotid ima fosfotioatnu vezu između svake od: pozicija 1 i 2 kodirajućeg lanca, pozicija 1 i 2 matričnog lanca, pozicija 2 i 3 matričnog lanca, pozicija 3 i 4 matričnog lanca, pozicija 20 i 21 matričnog lanca, i pozicija 21 i 22 matričnog lanca; naznačen time što oligonukleotid sadrži sledeću strukturu na poziciji 1 matričnog lanca:
    . naznačen time što je svaki od nukleotida –GAAA– sekvence na kodirajućem lancu konjugovan sa monovalentnim GalNac delom tako da sadrži strukturu:
  2. 2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži oligonukleotid prema zahtevu 1 za smanjenje ekspresije LDHA.
  3. 3. Kompozicija koja sadrži oligonukleotid prema zahtevu 1 i dalje sadrži Na<+>kontrajone.
  4. 4. Oligonukleotid prema zahtevu 1 ili kompozicija prema zahtevu 2 ili zahtevu 3 za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili je u riziku od primarne hiperoksalurije izabrane iz PH1, PH2, PH3 i/ili idiopatske hiperoksalurije, i postupak koji obuhvata smanjenje ekspresije LDHA proteina u hepatocitima kod subjekta davanjem oligonukleotida ili kompozicije.
  5. 5. Oligonukleotid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, naznačeni time što subjekt ima ili je u riziku od primarne hiperoksalurije.
  6. 6. Oligonukleotid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4 ili zahtevu 5, naznačeni time što se oligonukleotid ili kompozicija daje subjektu intravenski ili supkutano.
RS20230689A 2017-10-13 2018-10-12 Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha RS64483B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762572403P 2017-10-13 2017-10-13
US201762572398P 2017-10-13 2017-10-13
US201862726950P 2018-09-04 2018-09-04
PCT/US2018/055735 WO2019075419A1 (en) 2017-10-13 2018-10-12 METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING LDHA EXPRESSION
EP18867097.0A EP3679141B1 (en) 2017-10-13 2018-10-12 Methods and compositions for inhibiting expression of ldha

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64483B1 true RS64483B1 (sr) 2023-09-29

Family

ID=66101691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230689A RS64483B1 (sr) 2017-10-13 2018-10-12 Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha

Country Status (15)

Country Link
US (4) US11286488B2 (sr)
EP (2) EP3679141B1 (sr)
JP (2) JP7308213B2 (sr)
KR (2) KR102609396B1 (sr)
CN (3) CN118530989A (sr)
AU (1) AU2018346971B2 (sr)
CA (1) CA3078933A1 (sr)
ES (1) ES2955045T3 (sr)
HR (1) HRP20231063T1 (sr)
HU (1) HUE063026T2 (sr)
IL (1) IL273875B2 (sr)
MX (1) MX2020003836A (sr)
PL (1) PL3679141T3 (sr)
RS (1) RS64483B1 (sr)
WO (1) WO2019075419A1 (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3204497T3 (da) 2014-10-10 2020-05-25 Dicerna Pharmaceuticals Inc Terapeutisk hæmning af lactatdehydrogenase og midler dertil
WO2016161388A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 University Of Massachusetts Fully stabilized asymmetric sirna
WO2017030973A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
RS64483B1 (sr) * 2017-10-13 2023-09-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha
CN111372593B (zh) * 2017-10-20 2024-03-19 戴瑟纳制药公司 治疗乙型肝炎感染的方法
CN111601891A (zh) 2018-01-16 2020-08-28 迪克纳制药公司 用于抑制aldh2表达的组合物和方法
EP3840759A4 (en) 2018-08-23 2022-06-01 University Of Massachusetts O-METHYL RICH FULLY STABILIZED OLIGONUCLEOTIDES
CA3125441A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 University Of Massachusetts Dynamic pharmacokinetic-modifying anchors
EP4010476A4 (en) 2019-08-09 2023-12-27 University Of Massachusetts Chemically modified oligonucleotides targeting snps
JP2022545118A (ja) * 2019-08-23 2022-10-25 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ Ｏ－メチルリッチ完全安定化オリゴヌクレオチド
US12365894B2 (en) 2019-09-16 2025-07-22 University Of Massachusetts Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery
US20220389430A1 (en) * 2019-10-02 2022-12-08 Dicema Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of small interfering rna with minimal fluorine content
WO2021188611A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
US20250205203A1 (en) * 2020-05-18 2025-06-26 Chinook Therapeutics Canada, Inc. Substituted pyrazolyl compounds and methods of use thereof
EP4157289A4 (en) 2020-05-26 2024-06-26 University Of Massachusetts Synthetic oligonucleotides having regions of block and cluster modifications
WO2022104366A1 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications for inhibiting expression of aldh2
EP4276104A3 (en) 2021-03-19 2024-05-22 Bachem Holding AG Improved oligonucleotide synthesis suppressing depurination
JP2024513470A (ja) 2021-04-09 2024-03-25 バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成するための擬似固相保護基および方法
TWI849410B (zh) * 2021-04-19 2024-07-21 美商戴瑟納製藥股份有限公司 用於抑制核受體亞家族１群組ｈ成員３（ｎｒ１ｈ３）表現的組成物和方法
JP2024518564A (ja) * 2021-05-11 2024-05-01 ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 中枢神経系のニューロンを標的とするための脂質コンジュゲーション
JP2024523237A (ja) * 2021-06-18 2024-06-28 ホンジーン バイオテック コーポレイション 官能化されたｎ－アセチルガラクトサミンヌクレオシド
TW202333748A (zh) 2021-07-19 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 用於處置具有或有風險發展非原發性高草酸鹽尿疾病或病症的個體的方法及組成物
TW202308660A (zh) * 2021-08-25 2023-03-01 美商戴瑟納製藥股份有限公司 用於抑制α－１抗胰蛋白酶表現之組合物及方法
US11692001B2 (en) 2021-08-30 2023-07-04 Hongene Biotech Corporation Functionalized n-acetylgalactosamine analogs
TW202334414A (zh) * 2021-10-05 2023-09-01 美商黛瑟納製藥公司 用於抑制黑皮質素２受體和細胞色素ｐ４５０ １１ｂ１表現之組成物及方法
AU2022402155A1 (en) * 2021-12-01 2024-05-09 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apoc3 expression
US11993626B2 (en) 2021-12-15 2024-05-28 Hongene Biotech Corporation Functionalized N-acetylgalactosamine analogs
EP4590684A1 (en) 2022-09-19 2025-07-30 Bachem Holding AG Improved oligonucleotide synthesis
JP2025531341A (ja) * 2022-09-19 2025-09-19 カイロンノヴァ （シャーメン） バイオファーマ カンパニー，リミテッド 炭水化物－オリゴヌクレオチド複合体、薬物組成物および治療への応用
WO2024083746A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 Bachem Holding Ag Method and composition for oligonucleotide synthesis
WO2024118503A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 Hongene Biotech Corporation Functionalized n-acetylgalactosamine analogs
EP4695265A1 (en) 2023-10-16 2026-02-18 Bachem Holding AG Method and composition for oligonucleotide synthesis
WO2025196505A2 (en) 2024-03-22 2025-09-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods for inhibiting cytochrome p450 family 7 subfamily a member 1 (cyp7a1) expression
CN118460650B (zh) * 2024-07-10 2025-02-14 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 一种Nedosiran的制备方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10920226B2 (en) 2002-11-14 2021-02-16 Thermo Fisher Scientific Inc. siRNA targeting LDHA
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US20050014692A1 (en) 2003-01-21 2005-01-20 Newgard Christopher B. Lactate dehydrogenase as a novel target and reagent for diabetes therapy
EP2514758B2 (en) 2004-03-15 2021-06-23 City of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
CN101052717A (zh) 2004-05-11 2007-10-10 α基因株式会社 诱发rna干扰的多核苷酸以及使用该多核苷酸的基因表达抑制方法
CA2720473A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Calando Pharmaceuticals, Inc. Compositions and use of epas1 inhibitors
CA2729757A1 (en) 2008-07-01 2010-01-07 The Johns Hopkins University Methods for treating neoplasia by inhibiting lactate dehydrogenase and/or nicotinamide phosphoribosyltransferase
AU2009293636A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by dsRNA possessing modifications
US20110288147A1 (en) 2008-09-22 2011-11-24 Bob Dale Brown Compositions and methods for the specific inhibition of gene expression by DSRNA containing a tetraloop
US20100173973A1 (en) 2008-12-18 2010-07-08 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
US20120121515A1 (en) 2009-03-13 2012-05-17 Lenny Dang Methods and compositions for cell-proliferation-related disorders
AU2011219941C1 (en) 2010-02-24 2015-05-07 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions for targeted delivery of siRNA
WO2011150241A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Genentech, Inc. Decreasing lactate level and increasing polypeptide production by downregulating the expression of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase
JP2014518626A (ja) 2011-05-18 2014-08-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 被験者が慢性腎疾患を有する、または発症するリスクがあるかどうかを決定するための方法
JP2015502931A (ja) 2011-11-18 2015-01-29 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 修飾ＲＮＡｉ剤
TWI595885B (zh) 2012-05-02 2017-08-21 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
DK3204497T3 (da) 2014-10-10 2020-05-25 Dicerna Pharmaceuticals Inc Terapeutisk hæmning af lactatdehydrogenase og midler dertil
EP3569711B1 (en) 2014-12-15 2021-02-03 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
JP2018500905A (ja) 2014-12-18 2018-01-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ナノチューブを使用した核酸ポリメラーゼ立体構造変化の検出
EA201792103A1 (ru) * 2015-05-29 2018-06-29 Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии генов hif2альфа
RS64483B1 (sr) 2017-10-13 2023-09-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Postupci i kompozicije za inhibiciju ekspresije ldha

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018346971A1 (en) 2020-04-23
KR20230169413A (ko) 2023-12-15
AU2018346971B2 (en) 2025-01-09
US11286488B2 (en) 2022-03-29
JP7308213B2 (ja) 2023-07-13
US20200283775A1 (en) 2020-09-10
EP3679141C0 (en) 2023-06-07
US20250283091A1 (en) 2025-09-11
HRP20231063T1 (hr) 2023-12-22
CA3078933A1 (en) 2019-04-18
ES2955045T3 (es) 2023-11-28
EP4265261A2 (en) 2023-10-25
CN118530989A (zh) 2024-08-23
EP3679141B1 (en) 2023-06-07
US11661604B2 (en) 2023-05-30
EP4265261A3 (en) 2024-01-24
KR102609396B1 (ko) 2023-12-01
CN111448319A (zh) 2020-07-24
KR102609396B9 (ko) 2025-04-10
IL273875A (en) 2020-05-31
MX2020003836A (es) 2020-11-06
JP2023139014A (ja) 2023-10-03
JP7674420B2 (ja) 2025-05-09
JP2020536587A (ja) 2020-12-17
EP3679141A1 (en) 2020-07-15
CN111448319B (zh) 2024-05-17
US20210062199A1 (en) 2021-03-04
IL273875B1 (en) 2025-03-01
CN118440940A (zh) 2024-08-06
IL273875B2 (en) 2025-07-01
HUE063026T2 (hu) 2023-12-28
EP3679141A4 (en) 2021-06-16
US20240182901A1 (en) 2024-06-06
WO2019075419A1 (en) 2019-04-18
KR20200078530A (ko) 2020-07-01
PL3679141T3 (pl) 2023-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7674420B2 (ja) Ｌｄｈａの発現を阻害するための方法及び組成物
US10799524B2 (en) Methods for treating hepatitis B infection
KR20230043877A (ko) B형 간염 환자의 올리고뉴클레오티드 치료
JP2025511854A (ja) 非アルコール性脂肪肝疾患の治療
KR20220098231A (ko) Il-34 안티센스 제제 및 이의 사용 방법
KR20200127008A (ko) 담관 부족-연관된 상태의 치료를 위한 방법 및 조성물
HK40115827A (zh) 用於抑制ldha表达的方法和组合物
HK40026540B (zh) 用於抑制ldha表达的方法和组合物
HK40026540A (en) Methods and compositions for inhibiting expression of ldha
CA3128059A1 (en) Methods and compositions for inhibiting expression of cyp27a1
RU2780021C2 (ru) Способы лечения инфекции гепатита в