KR20230169413A - Ldha의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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웨이민 왕
레이첼 스톨
나임 나제프
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Abstract

본 개시내용은 특히 간세포에서 LDHA 발현을 감소시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
[대표도]
도 3

Description

LDHA의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING EXPRESSION OF LDHA}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2018년 9월 4일에 출원한, "LDHA의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물"의 명칭을 갖는 미국 가출원 번호 62/726950, 2017년 10월 13일에 출원한, "LDHA의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물"의 명칭을 갖는 미국 가출원 번호 62/572403, 및 2017년 10월 13일에 출원한, "LDHA의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물"의 명칭을 갖는 미국 가출원 번호 62/572398을 우선권으로 주장하며, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 유전자 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
원발성 고옥살산뇨증 (PH)은 신장에서 옥살산칼슘 침전 및 결국에는 말기 신장 질환을 야기하는 옥살레이트의 과다생성에 의해 초래되는 상염색체 열성 장애이다. PH 유형 1 (PH1), 2 (PH2) 및 3 (PH3)으로 지정되는 3가지 형태의 PH, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증이 있다. 락테이트 데히드로게나제 (LDH)는 간에서 옥살레이트 대사의 마지막 단계인 글리옥실레이트에서 옥살레이트로의 전환을 담당하는 주요 효소이기 때문에 간 옥살레이트 생성을 감소시키기 위한 표적으로서 확인되었다. LDH 서브유닛을 코딩하는 유전자를 표적화하는 RNAi 올리고뉴클레오티드가 개발되었다.
본 발명은 적어도 부분적으로 LDH 단백질의 지속적인 RNAi-기반 녹다운을 생성하여 LDH 효소 활성을 감소시키는 강력한 올리고뉴클레오티드의 확인을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 이전의 올리고뉴클레오티드와 비교하여 다른 특징들 중에서도 개선된 안정성, 개선된 생체이용률, 개선된 간 표적화, 및/또는 유전자 녹다운에 대한 개선된 지속적인 효과를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드를 간세포에 특이적으로 전달하여, 다른 조직, 예컨대 근육, 피부 또는 자궁에서의 잠재적인 바람직하지 않은 효과를 피하거나 최소화하기 위해 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티에 접합된 닉킹된 테트라루프 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 대상체, 예를 들어 원발성 고옥살산뇨증을 가진 환자에서 간 옥살레이트 생성을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 소변 옥살레이트 수준을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 원발성 고옥살산뇨증, 예컨대 PH1, PH2 및/또는 PH3, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증을 치료하는데 유용하다.
본 개시내용의 일부 측면은 UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하는, LDHA의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다. 일부 실시양태에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 또는 31-36 및/또는 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 또는 19-22. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-플루오로에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17 및/또는 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 또는 18. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17 및 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18 모두는 2'-플루오로에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 중 하나 이상의 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥의 제1 위치에서의 우리딘은 포스페이트 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 위치 1에서 하기 구조를 포함한다:
Figure pat00001
.
일부 실시양태에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 중 1개 이상은 1가 GalNac 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 1가 GalNac 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, -GAAA- 모티프는 하기 구조를 포함한다:
Figure pat00002
상기 식에서:
L은 결합, 클릭 화학 핸들, 또는 치환된 및 비치환된 알킬렌, 치환된 및 비치환된 알케닐렌, 치환된 및 비치환된 알키닐렌, 치환된 및 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 및 비치환된 헤테로알케닐렌, 치환된 및 비치환된 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 20개 (경계값 포함)의 연속적인 공유 결합된 원자 길이의 링커를 나타내고;
X는 O, S 또는 N이다.
일부 실시양태에서, L은 아세탈 링커이다. 일부 실시양태에서, X는 O이다.
일부 실시양태에서, -GAAA- 서열은 하기 구조를 포함한다:
Figure pat00003
.
일부 실시양태에서, LDHA의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드는 UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형되고, 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17 및 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18 모두는 2'-플루오로에 의해 변형되고;
올리고뉴클레오티드는 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 위치 1에서 하기 구조를 포함하고:
Figure pat00004
센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 하기 구조를 포함하는 1가 GalNac 모이어티에 접합된다:
Figure pat00005
.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드 및 Na+ 반대이온을 포함하는 조성물을 제공한다.
도 3에 도시된 화학 구조를 갖는 조성물 또한 제공된다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게 올리고뉴클레오티드를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 PH1, PH2, PH3, 및/또는 특발성 고옥살산뇨증을 갖거나 또는 가질 위험이 있고, 상기 방법은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여함으로써 대상체의 간세포에서 LDHA 단백질의 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 원발성 고옥살산뇨증을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체의 치료를 위한 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 용도를 제공하며, 상기 치료는 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 대상체에게 정맥내로 또는 피하로 투여된다.
본 명세서의 일부로 포함되고 그를 구성하는 첨부된 도면은 특정 실시양태를 설명하고, 서면 명세서와 함께 본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정한 측면의 비제한적인 예를 제공하는 역할을 한다.
도 1a는 LDHA mRNA에 대해 상보성인 영역을 갖는 가이드 (안티센스) 가닥을 가진 RNAi 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예를 도시하는 개략도이다.
도 1b는 도 1a에 도시된 패신저 (센스) 가닥의 위치 27-30에 존재하는 루프 서열의 예의 화학 구조에 대한 비제한적인 대표도이다.
도 1c는 도 1a에 도시된 가이드 (안티센스) 가닥의 위치 1에 도시된 변형된 우리딘의 화학 구조에 대한 비제한적인 대표도이다. 화학식에서,
Figure pat00006
또는
Figure pat00007
는 그에 바로 부착된 모이어티의 입체화학이 명시되지 않은 단일 결합이다.
도 2a는 LDHA AAV 마우스 모델을 이용하여 도 1a에 도시된 특정한 올리고뉴클레오티드의 생체내 평가를 위한 시간표을 도시하는 개략도이다. AAV 주사를 -1 주째에 수행하였고, 올리고뉴클레오티드의 단일 용량을 도시된 바와 같이 0.5, 1, 3 또는 6 mg/kg으로 피하 주사하였다. 1, 2, 4, 6, 8 및 10 주째에, 4 mm 생검 펀치를 수집하였고, mRNA 녹다운 분석을 위해 블록에서 및 RNA레이터(RNAlater)에서 급속 냉동시켰다.
도 2b는 실시예 1에 기재된 연구 결과의 세브세트를 입증하는 그래프이다. % 잔류 hLDHA mRNA가 1, 3 또는 6 mg/kg 용량에 대해 투여후 주에 도시된다. 이들 결과를 시간-매칭된 PBS에 대해 정규화하였다. 인간 LDHA mRNA의 용량-의존성 감소가 투여후 4 주 동안 지속되었다.
도 3은 LDHA mRNA에 대해 상보성인 영역을 갖는 가이드 (안티센스) 가닥 및 닉킹된 테트라루프 구조를 갖는 패신저 (센스) 가닥을 가진 RNAi 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 화학 구조이다.
도 4는 첫번째 투여후 28 및 56일째에 시노몰구스 원숭이 (유년기(juvenile) 및 청년기(young-adult))에서 도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드의 2회 투여후 LDHA mRNA (상부 패널), LDH 단백질 (중간 패널), 및 LDH 활성 (% 잔류, 하부 패널)의 감소를 도시하는 그래프이다.
도 5는 시노몰구스 원숭이에서 도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드의 2회 투여후 LDH 단백질 수준 (웨스턴 블롯에 의해 검출됨)의 감소를 도시하는 그래프이다.
도 6은 시노몰구스 원숭이에서 도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드의 10회 투여후 LDHA mRNA 발현 (% 잔류)의 감소를 도시하는 그래프이다.
도 7은 시노몰구스 원숭이에서 도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드의 10회 투여후 Ago2/RISC에 도입된 올리고뉴클레오티드의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 8a-8b는 개방-표지 다중심 연구에서 PH 환자에서 상이한 용량의 (1.5 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg) 도 3에 도시된 올리고뉴클레오티드의 효과를 도시하는 그래프이다. 도 8a는 연구 과정에 걸쳐 이들 환자에서 소변 옥살레이트 (UOX) 함량의 절대값에서의 변화를 도시한다. 1.5 mg/kg 용량 그룹의 경우에는, D57 이후에 n=2. 3 mg/kg 용량 그룹의 경우에는, D57 이후에 n=2. 6 mg/kg 용량 그룹의 경우에는, D15 이후에 n=2 및 n=1. 도 8b는 연구 과정에 걸쳐 1.5 mg/kg 용량 그룹 및 3 mg/kg 용량 그룹에서 환자에서 기준선으로부터의 24 시간 소변 옥살레이트 (UOX) % 변화를 도시한다.
일부 측면에 따라, 본 개시내용은 LDH 효소 활성을 감소시키는데 효과적인 LDHA mRNA를 표적화하는 RNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이들 RNAi 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 간 세포 (예를 들어, 간세포)에서 LDHA의 감소에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드를 이용하는 간 LDH 활성의 억제는 원발성 고옥살산뇨증, 예컨대 PH1, PH2 및/또는 PH3, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증을 치료하기 위한 치료 접근법을 제공한다.
정의된 용어의 기재를 비롯하여 본 개시내용의 추가의 측면이 하기에 제공된다.
I. 정의
대략적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, 1개 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 또는 문맥으로부터 명백하지 않다면 명시된 기준 값의 어느 방향으로 (초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
투여하는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 (예를 들어, 대상체에서 상태를 치료하기 위해) 약리학적으로 유용한 방식으로 대상체에게 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 제공하는 것을 의미한다.
아시알로당단백질 수용체 (ASGPR): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아시알로당단백질 수용체" 또는 "ASGPR"은 큰 48 kDa (ASGPR-1) 및 작은 40 kDa 서브유닛 (ASGPR-2)에 의해 형성된, 두 부분으로 나누어진 C-유형 렉틴을 지칭한다. ASGPR은 간세포의 동모양(sinusoidal) 표면 상에서 주로 발현되고, 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기 (아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질의 결합, 내재화 및 후속적인 클리어런스에서 주요 역할을 한다.
약화시키다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약화시키다"는 감소시키거나 또는 효율적으로 중단시키는 것을 의미한다. 비제한적인 예로서, 본원에 제공된 치료 중 하나 이상은 대상체에서 옥살레이트 축적을 감소시키거나 또는 효율적으로 중단시킬 수 있다. 이 약화는 예를 들어 옥살레이트 축적 또는 이러한 축적으로 인한 증상의 하나 이상의 측면 (예를 들어, 증상, 조직 특징, 및 세포성 등)에서의 감소, 옥살레이트 축적 또는 이러한 축적으로 인한 증상의 하나 이상의 측면의 검출가능한 진행 (악화) 없음, 또는 달리 예상될 수 있을 때 대상체에서 검출가능한 옥살레이트 축적 또는 이러한 축적으로 인한 증상 없음에 의해 예시될 수 있다.
상보성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성"은 2개의 뉴클레오티드가 서로 염기 쌍을 형성하는 것을 허용하는, (예를 들어, 2개의 대향 핵산 상에서 또는 단일 핵산 가닥의 대향 영역 상에서) 2개의 뉴클레오티드 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 대향 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드에 대해 상보성인 한 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보성 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 방식으로 또는 적합한 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 2개의 핵산은 상보성 영역을 형성하도록 서로 상보성인 다중 뉴클레오티드의 영역을 가질 수 있다.
데옥시리보뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드와 비교하여 그의 펜토스 당의 2' 위치에서 히드록실 대신에 수소를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 당, 포스페이트 기 또는 염기 내의 또는 그의 변형 또는 치환을 비롯하여, 2' 위치 이외에 있는 원자의 1개 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중-가닥 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 듀플렉스 형태인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 공유적으로 분리된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 공유적으로 연결된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보성 염기-쌍 형성은 함께 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드의 상보성 역평행 서열을 제공하기 위해 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 폴딩된 단일 핵산 가닥으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 서로 완전히 듀플렉스화된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 한쪽 또는 양쪽 말단에 오버행을 갖는 부분적으로 듀플렉스화된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 상보성인 뉴클레오티드의 역평행 서열을 포함하고, 따라서 1개 이상의 미스매치를 가질 수 있으며, 여기에는 내부 미스매치 또는 말단 미스매치가 포함될 수 있다.
듀플렉스: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 용어 "듀플렉스"는 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보성 염기 쌍 형성을 통해 형성된 구조체를 지칭한다.
부형제: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 점조도 또는 안정화 효과를 제공하거나 또는 부여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비치료적인 작용제를 지칭한다.
간세포: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "간세포" 또는 "간세포들"은 간의 실질 조직의 세포를 지칭한다. 이들 세포는 간 질량의 대략 70-85%를 구성하고, 혈청 알부민, 피브리노겐, 및 응고 인자의 프로트롬빈 그룹 (인자 3 및 4는 제외)을 제조한다. 간세포 계통 세포에 대한 마커에는 트랜스티레틴 (Ttr), 글루타민 신테타제 (Glul), 간세포 핵 인자 1a (Hnf1a), 및 간세포 핵 인자 4a (Hnf4a)가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 성숙한 간세포에 대한 마커에는 시토크롬 P450 (Cyp3a11), 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (Fah), 글루코스 6-포스페이트 (G6p), 알부민 (Alb), 및 OC2-2F8이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, [Huch et al., (2013), Nature, 494(7436): 247-250]을 참고하며, 간세포 마커와 관련된 내용은 본원에 참고로 포함된다.
락테이트 데히드로게나제 (LDH): 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "락테이트 데히드로게나제" 또는 "LDH"는 락테이트/피루베이트, 히드록시피루베이트/글리세레이트, 및 글리옥실레이트/옥살레이트 대사의 항상성을 조절하는 효소를 지칭한다. 기능적 LDH는 사합체를 형성하기 위해 4개의 단량체성 폴리펩티드 쇄로 구성된다. LDH의 근육 (M) 또는 심장 (H) 형태로 공지된 2가지 가장 흔한 서브유닛은 각각 LDHA 및 LDHB 유전자에 의해 코딩된다. 그들의 서브유닛 조성을 기반으로 하여 5가지 상이한 이소자임 (4H, 3H1M, 2H2M, 1H3M, 4M)이 확인되었고, 이들은 유사한 효소 활성을 나타내지만, 상이한 역학적 거동 및 조직 분포를 나타낸다. 간 및 골격근의 주요 이소자임인 LDH5는 4M 서브유닛을 갖는다.
락테이트 데히드로게나제 A ( LDHA ): 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "락테이트 데히드로게나제 A" 또는 "LDHA"는 LDHA 유전자 (엔트레즈(Entrez) 유전자 ID: 3939)에 의해 코딩되는 LDH 효소의 단량체를 지칭하며, 상이한 이소형을 코딩하는 적어도 5가지 mRNA 전사체 변이체가 존재한다 (예를 들어, NCBI 참고 서열: NM_005566.3, NM_001135239.1, NM_001165414.1, NM_001165415.1, 및 NM_001165416.1).
락테이트 데히드로게나제 B ( LDHB ): 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "락테이트 데히드로게나제 B" 또는 "LDHB"는 LDHB 유전자 (엔트레즈 유전자 ID: 3945)에 의해 코딩되는 LDH 효소의 단량체를 지칭하며, 상이한 이소형을 코딩하는 적어도 2가지 mRNA 전사체 변이체가 존재한다 (예를 들어, NCBI 참고 서열: NM_001174097.2 및 NM_001315537.1).
루프: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "루프"는 서로 충분히 상보성인 핵산의 2개의 역평행 영역에 의해 플랭킹된 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 쌍을 형성하지 않은 영역을 지칭하며, 이로써 적절한 혼성화 조건하에 (예를 들어, 포스페이트 완충제에서, 세포에서) 쌍을 형성하지 않은 영역을 플랭킹하는 2개의 역평행 영역이 혼성화하여 듀플렉스 ("스템"으로 지칭됨)를 형성한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 결합을 포함하는 기준 뉴클레오티드간 연결과 비교하여 1개 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 연결이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 성질을 부여한다.
변형된 뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오티드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오티드, 시토신 데옥시리보뉴클레오티드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 상응하는 기준 뉴클레오티드와 비교하여 1개 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에서 1개 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 상응하는 기준 뉴클레오티드에 접합된 1개 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 뉴클레오티드는 개선된 열 안정성, 분해에 대한 내성, 뉴클레아제 내성, 가용성, 생체이용률, 생활성, 감소된 면역원성 등에 기여할 수 있다.
닉킹된 테트라루프 구조: "닉킹된 테트라루프 구조"는 별개의 센스 (패신저) 및 안티센스 (가이드) 가닥의 존재를 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오티드의 구조이며, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 상보성 영역을 갖고, 가닥들 중 적어도 하나, 일반적으로 센스 가닥은 적어도 1개의 가닥 내에 형성된 인접한 스템 영역을 안정화시키도록 형성된 테트라루프를 갖는다.
올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 예를 들어 100개 미만의 뉴클레오티드 길이인 짧은 핵산을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 듀플렉스 영역을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다. 비제한적인 예의 집합으로서, 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 다이서 기질 간섭 RNA (dsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 siRNA, 또는 단일-가닥 siRNA일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
오버행: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "오버행"은 1개의 가닥 또는 영역이 함께 듀플렉스를 형성하는 상보성 가닥의 말단 너머로 연장된 1개의 가닥 또는 영역으로부터 생성된 말단의 염기 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 듀플렉스 영역으로부터 연장된 쌍을 형성하지 않은 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 상의 3' 또는 5' 오버행이다.
포스페이트 유사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 성질을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는 옥시메틸 기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 또는 그의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다.
감소된 발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 유전자의 "감소된 발현"은 적절한 기준 세포 또는 대상체와 비교하여 유전자에 의해 코딩된 RNA 전사체 또는 단백질의 양에서의 감소 및/또는 세포 또는 대상체에서 유전자 활성의 양에서의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, LDHA mRNA 서열에 대해 상보성인 안티센스 가닥을 갖는 것)로 세포를 처리하는 작용은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로 처리하지 않은 세포와 비교하여 (예를 들어, LDHA 유전자에 의해 코딩된) mRNA 전사체, 단백질 및/또는 효소 활성의 양에서의 감소를 일으킬 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용된 바와 같이 "발현을 감소시키는"은 유전자 (예를 들어, LDHA)의 감소된 발현을 일으키는 작용을 지칭한다.
상보성 영역: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건하에, 예를 들어 포스페이트 완충제에서, 세포 등에서 뉴클레오티드의 두 서열 사이에 혼성화를 허용하기 위해 뉴클레오티드의 역평행 서열에 대해 충분히 상보성인 핵산의 뉴클레오티드의 서열 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드)을 지칭한다.
리보뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오티드"는 그의 2' 위치에 히드록실 기를 함유하며 그의 펜토스 당으로서 리보스를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 리보스, 포스페이트 기 또는 염기 내의 또는 그의 변형 또는 치환을 비롯하여 2' 위치 이외에 있는 원자의 1개 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오티드이다.
RNAi 올리고뉴클레오티드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNAi 올리고뉴클레오티드"는 (a) 표적 mRNA의 절단에서 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부가 아르고너트(Argonaute) 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인, 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 (b) 표적 mRNA의 절단에서 안티센스 가닥 (또는 해당 안티센스 가닥의 일부)이 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 것인, 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
가닥: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가닥"은 뉴클레오티드간 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르 연결, 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오티드의 단일 인접한 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가닥은 2개의 유리 말단, 예를 들어 5'-말단 및 3'-말단을 갖는다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 마우스, 토끼 및 인간을 비롯한 임의의 포유류를 의미한다. 한 실시양태에서, 대상체은 인간 또는 비-인간 영장류이다. 용어 "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
합성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성"은 (예를 들어, 기계 (예를 들어, 고체 상태 핵산 합성기)를 사용하여) 인공적으로 합성되거나 또는 분자를 정상적으로 생성하는 천연 공급원 (예를 들어, 세포 또는 유기체)으로부터 달리 유래되지 않는 핵산 또는 다른 분자를 지칭한다.
표적화 리간드: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 리간드"는 관심 조직 또는 세포의 관련 분자 (예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고, 다른 물질을 관심 조직 또는 세포에 표적화시키기 위한 목적으로 또 다른 물질에 접합될 수 있는 분자 (예를 들어, 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 GalNac 모이어티를 포함한다.
테트라루프: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "테트라루프"는 뉴클레오티드의 플랭킹 서열의 혼성화에 의해 형성된 인접한 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성에서의 증가는, 무작위로 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 비등한 길이를 갖는 루프의 집합으로부터 평균적으로 예상되는 인접한 스템 듀플렉스의 Tm보다 높은, 인접한 스템 듀플렉스의 융점 (Tm)에서의 증가로서 검출가능하다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개 염기 쌍 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 10 mM NaHPO4 중에서 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 융점을 부여한다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 적층 상호작용에 의해 인접한 스템 듀플렉스에서 염기 쌍을 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서 뉴클레오티드 사이의 상호작용에는 비-왓슨-크릭 염기 쌍 형성, 적층 상호작용, 수소 결합, 및 접촉 상호작용이 포함되나 이에 제한되지 않는다 (Cheong et al., Nature 1990 Aug. 16; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul. 12; 253(5016):191-4). 일부 실시양태에서, 테트라루프는 3 내지 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 그로 이루어지고, 전형적으로 4 내지 5개 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있는 (예를 들어, 표적화 모이어티에 접합될 수 있거나 또는 접합되지 않을 수 있는) 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드로 이루어진다. [Cornish-Bowden (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3021-3030]에 기재된 바와 같이 표준 IUPAC-IUB 기호가 테트라루프 뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문자 "N"은 임의의 염기가 해당 위치에 있을 수 있음을 의미하기 위해 사용될 수 있고, 문자 "R"은 A (아데닌) 또는 G (구아닌)이 해당 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있고, "B"는 C (시토신), G (구아닌), 또는 T (티민)이 해당 위치에 있을 수 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 테트라루프의 예에는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프가 포함된다. (Woese et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1990 November; 87(21):8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov. 11; 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예에는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리 (예를 들어, d(GTTA)), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리 (예를 들어, d(TTCG))가 포함된다. 예를 들어 [Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78th; NO. 2; PAGE. 731 (2000)]을 참고하며, 그들의 관련 개시내용에 대해서는 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 테트라루프는 닉킹된 테트라루프 구조 내에 함유된다.
치료하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 기존 상태 (예를 들어, 질환, 장애)와 관련하여 대상체의 건강 및/또는 복지를 개선시키기 위해 또는 상태의 발병 가능성을 예방하거나 감소시키기 위해, 예를 들어 대상체에게 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 투여를 통해, 치료를 필요로 하는 대상체에게 치유를 제공하는 작용을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체가 경험한 상태 (예를 들어, 질환, 장애)의 적어도 하나의 징후, 증상 또는 기여 인자의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 수반한다.
II. LDHA 발현의 올리고뉴클레오티드-기반 억제제
i. 올리고뉴클레오티드 서열
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 서열 UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)을 갖는 가이드 (안티센스) 가닥을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥이 제공된다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 그의 3'-말단에 스템-루프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥은 (예를 들어, 그의 3'-말단에서) S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 대해 상보성이고, L은 S1과 S2 사이에 2 내지 6개 범위의 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성한다. 일부 실시양태에서, S1과 S2 사이에 형성된 듀플렉스는 4, 5, 6, 7 또는 8개 염기쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 스템-루프의 루프 (L)는 (예를 들어, 닉킹된 테트라루프 구조 내의) 테트라루프이다. 테트라루프는 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 및/또는 이들의 조합물을 함유할 수 있다. 전형적으로, 테트라루프는 4 내지 5개의 뉴클레오티드를 갖는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 테트라루프는 3 내지 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 전형적으로 4개 뉴클레오티드로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 테트라루프는 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 서열 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)의 센스 가닥을 갖는다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)의 안티센스 가닥 및 서열 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)의 센스 가닥을 포함한다.
ii. 올리고뉴클레오티드 변형
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 그의 염기 (또는 핵염기), 당 (예를 들어, 리보스, 데옥시리보스), 또는 포스페이트 기에서 변형을 갖는다. 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시양태에서, 절반이 넘는 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시양태에서, 절반 미만의 뉴클레오티드가 변형된다.
a. 당 변형
일부 실시양태에서, 변형된 당 (본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 당에서의 뉴클레오티드 변형은 2'-변형을 포함한다. 2'-변형은 2'-아미노에틸, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산일 수 있다. 전형적으로, 변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다. 일부 실시양태에서, 당에서의 변형은 당 고리의 변형을 포함하고, 이는 당 고리의 1개 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 또는 31-36 및/또는 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 또는 19-22. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 모두 및/또는 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-플루오로에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17 및/또는 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 또는 18. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 및 17 모두 및/또는 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18 모두는 2'-플루오로에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 말단의 3'-말단 기 (예를 들어, 3'-히드록실)는 포스페이트 기 또는 다른 기이고, 예를 들어 링커, 어댑터 또는 표지를 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
b. 5' 말단 포스페이트
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 기는 아르고너트 2와의 상호작용을 증강시킨다. 그러나, 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 또는 다른 효소를 통해 분해되기 쉬울 수 있고, 이는 생체 내에서 그들의 생체이용률을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이러한 분해에 대해 내성인 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당의 4'-탄소 위치에서 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 예를 들어, 2017년 9월 1일에 출원한, "4'-포스페이트 유사체 및 그를 포함하는 올리고뉴클레오티드"의 명칭을 갖는 국제 출원 번호 PCT/US2017/049909를 참고하며, 포스페이트 유사체에 관한 이들 각각의 내용은 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸 기의 산소 원자가 (예를 들어, 그의 4'-탄소에서) 당 모이어티에 결합되어 있는 옥시메틸포스포네이트 또는 그의 유사체이다. 다른 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 티오메틸 기의 황 원자 또는 아미노메틸 기의 질소 원자가 당 모이어티의 4'-탄소에 결합되어 있는 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트, 또는 그의 유사체이다. 특정 실시양태에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다.
특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 부착된 포스페이트 유사체는 메톡시 포스포네이트 (MOP)이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드에 부착된 포스페이트 유사체는 5' 모노-메틸 보호된 MOP이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 가이드 (안티센스) 가닥의 제1 위치에 포스페이트 유사체를 포함하는 하기 우리딘 뉴클레오티드가 사용될 수 있고:
Figure pat00008
변형된 뉴클레오티드는 [Me포스포네이트-4O-mU] 또는 5'-메톡시, 포스포네이트-4'옥시- 2'-O-메틸우리딘으로 지칭된다.
c. 변형된 뉴클레오티드간 연결
일부 실시양태에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 1개의 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 5개) 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 중 하나 이상의 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
iii. 표적화 리간드
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 특정한 조직, 세포 또는 장기의 표적화를 용이하게 하도록, 예를 들어 간으로 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 간의 간세포로 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 표적화 리간드에 접합된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적화 리간드는 1개 이상의 GalNAc 모이어티이다. GalNAc는 간세포의 동모양 표면에서 주로 발현되고, 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 함유하는 순환 당단백질 (아시알로당단백질)의 결합, 내재화 및 후속적인 제거에서 주요 역할을 하는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 대한 고친화도 리간드이다. 일부 실시양태에서, GalNAc 모이어티와 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드의 접합은 이들 올리고뉴클레오티드를 이들 간세포 세포 상에서 발현된 ASGPR에 대해 표적화하기 위해 이용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1가 GalNAc 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc, 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 올리고뉴클레오티드는 하기 도시된 바와 같이 [ademG-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-구아니딘-GalNAc로 지칭되는, 구아니딘 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNac를 포함한다:
Figure pat00009
일부 실시양태에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 하기 도시된 바와 같이 [ademA-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-아데닌-GalNAc로 지칭되는, 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNac를 포함한다.
Figure pat00010
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개 뉴클레오티드 각각은 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 스템-루프의 루프 (L)의 2 내지 4개 뉴클레오티드 각각은 별도의 GalNAc에 접합된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 3' 말단에 스템-루프를 포함할 수 있고, 루프의 4개 뉴클레오티드 모두는 개별적으로 1가 GalNAc 모이어티에 접합될 수 있다. 5'에서 3'으로 뉴클레오티드 서열 GAAA를 포함하는 루프에 대해 이러한 접합의 예가 하기에 도시되며 (L = 링커, X = 헤테로원자), 스템 부착점이 도시된다. 이러한 루프는 예를 들어 도 1a에 도시된 분자의 위치 27-30에 존재할 수 있다. 화학식에서,
Figure pat00011
는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착점이다.
Figure pat00012
적절한 방법 또는 화학 (예를 들어, 클릭 화학)을 이용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 연결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 링커는 더욱 안정하다. 일부 실시양태에서, 클릭 링커를 이용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 접합시킨다. 일부 실시양태에서, 아세탈-기반 링커를 이용하여 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 접합시킨다. 아세탈-기반 링커는 예를 들어 2016년 6월 23일에 출원한 국제 특허 출원 공개 번호 WO2016100401 A1에 개시되어 있으며, 이러한 링커에 관한 내용은 본원에 참고로 포함된다.
5'에서 3'으로 뉴클레오티드 GAAA를 포함하는 루프에 대한 예가 하기에 도시되고, 여기서 GalNac 모이어티는 아세탈 링커를 이용하여 루프의 뉴클레오티드에 접합된다. 이러한 루프는 예를 들어 도 1a에 도시된 분자의 위치 27-30에 존재할 수 있다. 화학식에서,
Figure pat00013
는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착점이다.
Figure pat00014
III. 제형
올리고뉴클레오티드의 사용을 용이하게 하기 위한 제형이 본원에 제공된다. 예를 들어, LDHA의 발현을 감소시키기 위해 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 표적 세포의 직면한 환경으로 또는 전신으로 대상체에게 투여될 때 올리고뉴클레오티드의 충분한 부분이 세포에 들어가서 LDHA 발현을 감소시키도록 적합하게 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 제형을 이용하여 본원에 개시된 바와 같이 LDHA의 감소를 위해 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제형은 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예에는 피하, 피내, 경점막, 정맥내 및 직장 투여가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
IV. 사용 방법
i. 세포에서 LDHA 발현의 감소
일부 실시양태에서, 세포에서 LDHA의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 방법은 임의의 적절한 세포 유형에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 세포는 LDHA를 발현하는 임의의 세포이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드가 전달되는 세포는 생체외 또는 시험관내에 있다 (즉, 배양물 중의 세포에 또는 세포가 존재하는 유기체에 전달될 수 있음). 구체적인 실시양태에서, 간세포에서 LDHA의 발현을 감소시키기 위한 목적으로 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
억제 결과는 세포 또는 대상체의 하나 이상의 성질을 평가하기 위한 적절한 검정에 의해, 또는 LDHA 발현을 나타내는 분자 (예를 들어, RNA, 단백질, 효소 활성, 대사산물 수준, 옥살레이트 수준 등)를 평가하는 생화학적 기술에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드가 LDHA의 발현 수준을 감소시키는 정도는 LDHA의 발현 수준 (예를 들어, mRNA 또는 단백질 수준)을 적절한 대조군 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 전달되지 않거나 또는 음성 대조군이 전달된 세포 또는 세포 집단에서 LDHA 발현 수준)과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, LDHA 발현의 적절한 대조군 수준은 예정된 수준 또는 값일 수 있고, 따라서 대조군 수준을 매번 측정할 필요는 없다. 예정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 예정된 수준 또는 값은 단일 컷-오프 값, 예컨대 중간 또는 평균일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포에서 LDHA 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, LDHA 발현 수준에서의 감소는 LDHA의 적절한 대조군 수준과 비교하여 1% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 40% 이하, 45% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하로의 감소일 수 있다. 적절한 대조군 수준은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않은 세포 또는 세포 집단에서의 LDHA 발현 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달 효과는 한정된 기간 후에 평가된다. 예를 들어, LDHA 수준은 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입한지 적어도 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 일 또는 그 초과 후에 세포에서 분석될 수 있다.
ii. 치료 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 대상체, 예를 들어 원발성 고옥살산뇨증을 가진 환자에서 간 옥살레이트 생성을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 소변 옥살레이트 수준을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 RNAi 올리고뉴클레오티드는 원발성 고옥살산뇨증, 예컨대 PH1, PH2 및/또는 PH3, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증을 치료하는데 유용하다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 옥살레이트 축적의 치료를 위해 LDHA 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 원발성 고옥살산뇨증, 예컨대 PH1, PH2 및/또는 PH3, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치료를 이용하여, 예를 들어 옥살레이트 축적을 약화시키거나 또는 중단시킬 수 있다. 본 개시내용은 옥살레이트 축적과 연관된 질환 또는 장애의 위험이 있는 (또는 그에 걸리기 쉬운) 대상체를 치료하는 예방적 및 치료적 방법 둘 다를 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 예를 들어 간에서 옥살레이트의 축적의 감소로부터 치료적 이익을 얻을 것인 대상체이다. 일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 옥살레이트 축적을 일으키는 상태, 신장 질환, 또는 원발성 고옥살산뇨증, 예컨대 PH1, PH2 및/또는 PH3, 뿐만 아니라 특발성 고옥살산뇨증을 갖거나 또는 가진 것으로 의심되는 대상체이다.
본원에 기재된 방법은 전형적으로 대상체에게 올리고뉴클레오티드의 유효량, 즉, 바람직한 치료 결과를 생성할 수 있는 양을 투여하는 것을 수반한다. 치료적으로 허용가능한 양은 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 양일 수 있다. 임의의 한 대상체에게 적절한 용량은 대상체의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여되는 특정한 조성물, 조성물 중의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 전반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯하여 특정 인자에 따라 좌우될 것이다. 전형적으로, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 정맥내로 또는 피하로 투여된다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 분기별로 (3 개월마다 한번), 격월로 (2 개월마다 한번), 매달 또는 매주 투여될 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 1, 2 또는 3 주마다 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 매일 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 비-인간 영장류 또는 다른 포유류 대상체 (예를 들어, 마우스 또는 래트)이다. 일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 대상체는 (예를 들어, AAV 전달된 발현 벡터로부터) 인간 LDHA 전사체를 발현하도록 조작된 비-인간 영장류 또는 다른 포유류 대상체이다.
실시예
실시예 1: LDHA의 특이적인 녹다운에 유용한 특이적인 RNAi 올리고뉴클레오티드
서열 UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)의 안티센스 가닥 및 서열 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)의 센스 가닥을 갖는 RNAi 올리고뉴클레오티드를 LDHA mRNA 발현을 녹다운시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. RNAi 올리고뉴클레오티드에서, 하기 위치는 2'-O-메틸 (2'-OMe로 나타냄)에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22. 하기 위치는 2'-플루오로 (2'-F로 나타냄)에 의해 변형된다: 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17 및 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18. RNAi 올리고뉴클레오티드는 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 도 1b는 도 1a에 도시된 패신저 (센스) 가닥의 위치 27-30의 화학 구조에 대한 대표도이고, 도 1c는 동일한 분자에서 가이드 (안티센스) 가닥의 위치 1에 도시된 변형된 우리딘의 화학 구조에 대한 대표도이다. 도 3은 RNAi 올리고뉴클레오티드의 화학 구조이다. 이 화학 구조의 RNAi 올리고뉴클레오티드는 LDHA-1로 지칭되었다. GalNAc 당이 센스 가닥 상에 위치 27 내지 30을 포함하는 뉴클레오티드에 접합된다. 건강한 암컷 마우스의 간에서 LDHA-1에 의한 LDHA mRNA의 녹다운의 용량 반응 및 지속을 인간 LDHA AAV 마우스 모델을 이용하여 생체 내에서 평가하였다. 인간 LDHA mRNA는 AAV9 바이러스 형질도입을 통한 갑상선 호르몬-결합 글로불린 프로모터의 제어하에 발현되었다. 마우스 모델을 정립하기 위해, 4-6 주령의 암컷 CD-1 마우스에게 제어된 역가의 AAV9 바이러스를 정맥내로 (IV) 투여하여, 안정한 인간 LDHA mRNA 발현을 생성하였다. 도 2a는 이 평가의 시간표를 도시하는 개략도이다. -1 주째에 AAV 주사 (100 μL 중 7.5 x 1011 게놈 카피의 용량)를 수행하였고, 1 주일 후에 LDHA-1의 단일 용량을 도시된 바와 같이 0.5 mg/kg (n = 20 마우스), 1 mg/kg (n = 30 마우스), 3 mg/kg (n = 30 마우스), 또는 6 mg/kg (n = 30 마우스)으로 피하 주사하였다. 1, 2, 4, 6, 8 및 10 주째에 4 mm 간 생검 펀치를 수집하였고, mRNA 녹다운 분석을 위해 블록에서 및 RNA레이터 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))에서 급속 냉동시켰다.
도 2b는 도 2a에 기재된 연구 결과의 서브세트를 입증하는 그래프이다. % 잔류 hLDHA mRNA가 1, 3 또는 6 mg/kg 용량에 대해 투여후 주에 도시된다. 이들 결과를 시간-매칭된 PBS에 대해 정규화하였다 (n = 40 마우스). 결과는 인간 LDHA를 발현하는 건강한 마우스에서 1, 3 또는 6 mg/kg의 LDHA-1의 단일 SC 투여 이후에 이소적으로 발현된 LDHA mRNA의 신속하고 지속적인 녹다운이 달성되었음을 보여준다.
6 mg/kg의 LDHA-1의 단일 SC 투여는 투여후 1 주째에 PBS 대조군과 비교하여 간에서 인간 LDHA mRNA 발현을 90%만큼 감소시켰다 (p≤ 0.05). 인간 LDHA mRNA의 용량-의존성 감소는 단일 투여후 4 주 동안 지속되었다. LDHA 발현은 단일 투여후 6 주째에 회복되었다.
3 mg/kg의 LDHA-1의 단일 SC 투여는 투여후 1 주째에 PBS 대조군과 비교하여 간에서 인간 LDHA mRNA 발현을 63%만큼 감소시켰다. 인간 LDHA mRNA 녹다운의 정도는 단일 투여후 4 주 동안 일정하게 유지되었고, 단일 투여후 6 주째에 기준선 LDHA 발현으로 회복되었다
1 mg/kg의 LDHA-1의 단일 SC 투여는 투여후 1 주째에 PBS 대조군과 비교하여 간에서 인간 LDHA mRNA 발현을 50%만큼 감소시켰다. 인간 LDHA mRNA 녹다운의 정도는 투여후 4 주 동안 45% 녹다운으로 유지되었다. LDHA mRNA 발현은 단일 투여후 6주째에 기준선으로 되돌아 왔다.
실시예 1에 대한 물질 및 방법
동물: 암컷 CD-1 마우스 (출생일 8/9/2016, 수령일 9/13/2016)를 챨스 리버 래버러토리즈 (Charles River Laboratories, 스트레인 코드 022 뉴욕주 킹스톤)로부터 구입하였다. 투약을 시작하기 전에 마우스를 적어도 3 일 동안 적응시켰다. 마우스를 실험실 음식 및 물에 자유롭게 접근가능하게 하면서 특정한 병원체-무함유 축산 조건하에 유지하였다.
RNAi 올리고뉴클레오티드 LDHA-1: 멸균 인산염-완충된 식염수 (PBS) 중에서 GalNAc 관능성을 갖는 화학적으로 합성된 이중-가닥 듀플렉스 RNA 올리고뉴클레오티드. 올리고뉴클레오티드를 -20℃에서 보관하였다. 사용하기 전에, 올리고뉴클레오티드를 해동시키고, 잘 혼합한 다음 (부드럽게 볼텍싱), 적어도 30 분 동안 실온으로 평형화시켰다.
RT-qPCR에 의한 LDHA mRNA 측정: 티슈라이저(Tissuelyser) II (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 0.75 mL 페놀/구아니딘-기반 퀴아졸(QIAzol) 용해 시약 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아) 중에서 대략 50 mg의 샘플을 균질화시켰다. 균질액을 1-브로모-3-클로로프로판 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)에 의해 추출하였다. 제조자의 지침에 따라 매그맥스 테크놀로지 (MagMax Technology, 써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)를 이용하여 RNA를 0.2 ml의 수성 상으로부터 추출하였다. 260 및 280 nm에서 분광법을 이용하여 RNA를 정량화하였다. 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈 (Integrated DNA Technologies, 아이오와주 코럴빌)로부터의 RT-qPCR 검정 및 써모피셔 사이언티픽 (메사추세츠주 월섬) 및 바이오라드 래버러토리즈 (BioRad Laboratories, 캘리포니아주 허큘레스)로부터의 시약을 사용하여, AA V9 플라스미드 수준에 대해 정규화하여 LDHA mRNA 수준을 측정하였다. LDHA-1-처리된 그룹에서 LDHA mRNA 감소의 정도를 동일한 날에 PBS 대조군 그룹의 평균 발현 수준에 비한 % 발현 (DNA의 qPCR에 의해 측정된 AAV9 플라스미드 카피 수에 대해 정규화됨)으로서 계산하였고, 여기서 PBS 대조군 그룹에서의 LDHA mRNA 발현은 100%로 설정되었다. 그래프를 생성하고, 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 분석하였다. 던닛(Dunnett) 다중 비교 검사를 이용하는 일원 변량 분석 (ANOVA)을 수행하여, LDHA-1-처리된 그룹에서의 LDHA mRNA 수준 (AAV9 카피 수에 대해 정규화됨)을 동일한 시점의 PBS 대조군 그룹과 비교하였다.
실시예 2: 유년기 및 청년기 시노몰구스 원숭이에서 LDHA-1 표적화 LDHA의 독성 및 독성역학 연구
실시예 1에 기재된 30, 100 또는 300 mg/kg의 LDHA-1 (도 3 또한 참고)의 2회 피하 투여를 제공한 유년기 및 청년기 시노몰구스 원숭이에서 LDHA-표적화 올리고뉴클레오티드의 효과를 입증하기 위해 5-주 반복-용량 피하 독성 및 독성역학 연구를 설계하였다. 수컷 및 암컷의 유년기 및 청년기 시노몰구스 원숭이에게 1 및 29 일째에 0 (멸균 주사용수, 1 일째에 SWFI, 29 일째에 멸균 식염수), 30, 100 또는 300 mg/kg의 LDHA-1을 피하 (SC) 주사하였다. RT-qPCR에 의한 LDHA mRNA 수준, 웨스턴 분석에 의한 LDH 단백질 수준, 및 효소적 검정에 의한 LDH 활성의 분석을 위해 말기 희생시에 (31 일째) 및 회복 희생시에 (57 일째) 간 조직을 수집하였다.
연구 설계를 표 1에 나타내었다. 말기 희생시에 (31 일째) 및 회복 희생시에 (57 일째) 시노몰구스 원숭이로부터 간 조직을 수집하였고, 웨스턴 블롯 및 LDH 활성 검정을 위해 액체 질소에서 급속 냉동시키거나, 또는 RNA레이터에서 인큐베이션하고 RT-qPCR 분석을 위해 냉동시켰다.
30, 100 또는 300 mg/kg LDHA-1의 2회 용량을 투여한 후, 원숭이 LDHA mRNA 발현, LDH 단백질 농도 및 LDH 활성 모두가 명백한 용량 반응이 없이 모든 용량 수준에서 31 일째에 말기 희생시에 유의하게 감소하였다 (p≤ 0.0001). 유사한 결과가 57 일째에 회복 희생시에 확인되었고 (나타낸 바와 같이 p< 0.0001, p≤0.001, p≤0.01, 독립표본 t-검사를 이용하여 계산된 통계적 유의성); LDHA mRNA, LDH 단백질 및 LDH 활성의 녹다운의 회복이 관찰되지 않았다 (도 4). 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 간 LDH 단백질 수준에 대한 용량의 효과가 도 5에 도시된다. LDH 단백질 수준은 말기 희생 (31 일째) 및 회복 희생 (57 일째) 둘 다에서 모든 용량 수준에서 현저하게 감소하였다.
결과는 31 일째에 LDHA-1이 명백한 용량 반응이 없이 대조군과 비교하여 모든 용량 수준에서 원숭이 LDHA mRNA 발현, LDH 단백질 농도 및 LDH 활성을 감소시키는데 있어서 강력한 활성을 나타내었음을 보여주었다. 표적 녹다운의 명백한 회복이 없이 57 일째까지 감소가 지속되었다.
표 1. 독성 및 독성역학 연구의 연구 설계
Figure pat00015
a. 총 용량 부피는 가장 최근의 체중을 기반으로 하여 계산될 것이다
b. 31 일째에 말기 부검
c. 57 일째에 회복 부검
추가로, LDHA-표적화 올리고뉴클레오티드의 39-주 반복-용량 피하 독성 및 독성역학 연구를 실시예 1에 기재된 30, 100 또는 300 mg/kg의 LDHA-1의 10회 SC 투여를 제공한 유년기 및 청년기 시노몰구스 원숭이에서 수행하여, LDHA mRNA 수준의 감소를 평가하고, RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)에 도입된 LDHA-1의 농도를 정량화하였다. 연구 1, 29, 57, 85, 113, 141, 169, 197, 225 및 253 일째에 유년기 원숭이에게 0 (식염수), 30, 100 또는 300 mg/kg의 LDHA-1을 피하 (SC) 주사하고, 청년기 원숭이에게 0 (식염수) 또는 300 mg/kg의 LDHA-1을 SC 주사하였다. RT-qPCR에 의한 LDHA mRNA 수준의 분석을 위해 말기 희생시에 (255 일째, 마지막 투여 2 일후) 및 회복 희생시에 (309 일째, 마지막 투여 8 주후) 간 조직을 수집하였다. 또한, 255 일째에 수집한 간 샘플을 사용하여, 아르고너트 단백질 2 (Ago2) 면역침전에 이어서 스템-루프 (SL)-RT-qPCR에 의해 측정되는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)에 도입된 LDHA-1의 농도를 정량화하였다.
LDHA-1의 강력한 약력학적 활성은 투약 기간의 마지막에 (255 일째) 명백하였다. 모든 용량 수준에서 원숭이 LDHA mRNA 발현이 감소되었다 (91.4%에서 86.1%로 감소, P ≤ 0.0001). RISC 복합체에 로딩된 LDHA-1의 농도는 용량과 관련이 있었고, 30 mg/kg (2.1 ng/g)에 비해 300 mg/kg (5.6 ng/g)의 용량 수준에서 유의하게 더 높은 농도를 가졌다 (P ≤ 0.05). LDHA mRNA 발현의 유의한 감소 (92.0%에서 86.2%로)에 의해 나타나는 LDHA-1의 약력학적 효과는 회복이 관찰되지 않으면서 투여후 적어도 8 주 동안 지속되었다 (도 6). 309 일째에 LDHA mRNA 감소의 측정은 약력학적 회복의 평가에 충분한 것으로 고려되었고, 따라서 309 일째에 RISC 복합체에 로딩된 LDHA-1의 농도는 평가하지 않았다.
연구 255 일째에 RISC에 도입된 LDHA-1의 정량화가 도 7에 보고된다. 그래프는 각각의 용량 그룹에 대한 평균 ± SD를 나타낸다. 255 일째에, 용량 증가에 따라 간에서 RISC-도입된 LDHA-1 농도가 증가하였다. LDHA-1 농도는 30 mg/kg 용량과 비교하여 300 mg/kg 용량에서 유의하게 증가하였다 (P < 0.05). RISC 복합체에 도입된 LDHA-1의 농도는 300 mg/kg 투여시 유년기와 청년기 원숭이 사이에서 비등하였다.
LDHA-1의 강력한 약력학적 활성은 투약 기간의 마지막에 (255 일째) 명백하였다. 원숭이 LDHA mRNA 발현은 대조군과 비교하여 모든 용량 수준에서 감소되었다. 대조적으로, RISC 복합체에 도입된 LDHA-1의 농도는 용량과 관련이 있었고, 30 mg/kg에 비해 300 mg/kg의 용량 수준에서 유의하게 더 높은 농도를 가졌다. LDHA mRNA에서의 감소에 의해 측정시 LDHA-1의 약력학적 효과는 명백한 회복이 없이 309 일째까지 (투여후 8 주) 지속되었다.
실시예 2에 대한 물질 및 방법
RT-qPCR에 의한 LDHA mRNA 측정: 티슈라이저 II (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 0.75 mL 페놀/구아니딘-기반 퀴아졸 용해 시약 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아) 중에서 대략 50 mg의 각각의 샘플을 균질화시켰다. 균질액을 1-브로모-3-클로로프로판 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)에 의해 추출하였다. 제조자의 지침에 따라 매그맥스 테크놀로지 (써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)를 이용하여 RNA를 0.2 ml의 수성 상으로부터 추출하였다. 260 및 280 nm에서 분광법을 이용하여 RNA를 정량화하였다. RT-qPCR 검정 및 써모피셔 사이언티픽 (메사추세츠주 월섬)으로부터의 시약을 사용하여 LDHA mRNA 수준을 측정하고, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머라제 B (PPIB) mRNA 수준에 대해 정규화하였다. LDHA-1-처리된 그룹에서 LDHA mRNA 감소의 정도를 동일한 날에 대조군 그룹의 평균 발현 수준에 비한 % 발현 (PPIB mRNA 수준에 대해 정규화됨)으로서 계산하였고, 여기서 대조군 그룹에서의 LDHA mRNA 발현은 100%로 설정되었다.
LDH 웨스턴 블롯: T-PER 조직 단백질 추출 시약 및 프로테아제 억제제 칵테일 (써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)과 함께 티슈라이저 II (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 조직 용해물을 제조하였다. 총 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 (써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)에 의해 측정하고, 동등한 단백질 농도를 NuPAGE 4-12 % 비스-트리스 SDS-PAGE (써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)에 의해 용해시켰다. 아이블롯 드라이 블롯팅 시스템 (iBlot Dry Blotting System, 써모피셔 사이언티픽, 메사추세츠주 월섬)을 이용하여 전기영동된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 오디세이(Odyssey) 차단 완충제 (PBS) (리-코어 바이오사이언시즈(Li-Cor Biosciences), 네브래스카주 링컨)에 의해 차단하였다. 이어서, 막을 토끼 항-LDHA 항체 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 메사추세츠주 댄버스) 및 마우스 항-글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 항체 (에이빔(Abeam), 메사추세츠주 캠브릿지)와 함께 인큐베이션하였다. 항-토끼 IRDye 680 및 항-마우스 IRDye 800 이차 항체 (리-코어 바이오사이언시즈, 네브래스카주 링컨)를 검출을 위해 사용하였고, 신호 강도를 오디세이 적외선 영상화 시스템 (리-코어 바이오사이언시즈, 네브래스카주 링컨)을 이용하여 측정하였다. 적분 강도 (신호의 강도 및 그것이 분포된 면적의 척도)를 각각의 밴드에 대해 측정하였다. '평균 또는 중앙 백그라운드' 방법을 이용하여 노이즈 신호에 대해 보정하였다. LDHA-1-처리된 그룹에서 LDH 단백질 감소의 정도를 동일한 날에 대조군 그룹의 평균 발현 수준에 비한 % 발현 (GAPDH 단백질 수준에 대해 정규화됨)으로서 계산하였고, 여기서 대조군 그룹에서의 LDH 단백질 발현은 100%로 설정되었다.
LDH 활성 검정: 분획 6.2.2에서 LDH 웨스턴 블롯에 대해 제조된 조직 추출물의 정규화된 단백질 농도를 제조자의 지침에 따라 락테이트 데히드로게나제 검정 키트 (에이빔, 인크.(Abeam, Inc.), 메사추세츠주 캠브릿지)를 사용하여 LDH 활성에 대해 평가하였다. 간략히, 조직 추출물을 T-PER 조직 단백질 추출 시약 중에서 50 μg/mL의 농도로 희석한 다음, 10 μL의 샘플을 40 μL의 LDH 검정 완충제에 첨가함으로써 96-웰 플레이트에서 이벌식으로 5배 희석하였다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)의 일련의 표준 용액 및 LDH 양성 대조군을 제조자의 지침에 따라 제조하였다. 플레이트를 혼합하고, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 첨가한지 0 및 30 분 후에 스펙트라맥스(SpectraMax) MS 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 450 나노미터에서의 흡광도를 측정하였다. LDHA-1-처리된 그룹에서 LDH 활성 감소의 정도를 동일한 날에 대조군 그룹의 평균 활성 수준에 비한 % 활성으로서 계산하였고, 여기서 대조군 그룹에서의 LDH 활성은 100%로 설정되었다.
Sl-RT-qPCR을 이용하여 Ago2-회합된 올리고뉴클레오티드의 측정: 급속 냉동된 원숭이 간 샘플로부터의 Ago2 단백질의 면역침전을 디나비즈(Dynabeads) 단백질 G를 사용하여 수행하였다. 샘플에서 Ago2 단백질의 단리 후, 조사-기반 SL-RT-qPCR 방법을 이용하여 Ago2 복합체와 회합된 LDHA-1의 농도를 정량화하였다. 면역침전에서 샘플간 변동성을 제어하기 위해, Ago2 복합체에 로딩된 내인성 마이크로RNA인 miR-16을 정규화군으로서 사용하였다. 절차에 대한 상세한 내용은 부록 10.2에 제시되어 있다. 255 일째로부터의 샘플만을 분석하여, LDHA mRNA 감소가 포화된 고용량의 RISC-로딩된 LDHA-1의 용량 비례에 대한 정보를 수득하였다. 309 일째에 LDHA mRNA 감소의 측정은 약력학적 회복의 평가에 충분한 것으로 고려되었다.
데이터 분석: 그래프를 생성하고, 데이터를 그래프패드 프리즘을 이용하여 분석하였다. 던넷 다중 비교 검사를 이용하는 일원 ANOVA를 수행하여, LDHA-1-처리된 그룹에서의 LDHA mRNA 수준 (PPIB mRNA 수준에 대해 정규화됨), LDH 단백질 수준 (GAPDH 단백질 수준에 대해 정규화됨), 및 LDH 활성 수준을 동일한 시점의 대조군 그룹에서의 것과 비교하였다. 다중 비교에 의한 일원 ANOVA를 이용하여, RISC에 도입된 LDHA-1의 농도를 비교하였다 (α = 0.05). 로우트(ROUT) 이상치 분석을 miR-16-정규화된 LDHA-에 대한 개별 동물 데이터에 대해 수행하고, 1 이상치를 확인하고 모든 분석으로부터 배제하였다.
실시예 3: 원발성 고옥살산뇨증의 치료에서 LDHA를 표적화하는 RNAi 올리고뉴클레오티드에 대한 인간 연구에서의 개념 증명
이 연구의 목적은 실시예 1의 RNAi 올리고뉴클레오티드 LDHA-1의 단일 상승 용량에 대해 인간에서의 안전성, 내약성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 것이다. 이차 종점에는 스크리닝 동안에 2회의 24 시간 수집의 평균으로 정의되는, 기준선으로부터 24 시간 소변 옥살레이트 배설에서의 변화를 평가하는 것이 포함되었다. 상기 연구를 두 그룹으로 나누었다:
그룹 A는 영국의 단일 지역에서 등록한 25명의 정상의 건강한 지원자 (NHV)에서 위약-대조군, 단일-맹검 1상 연구로 설계되었다. 그룹 B는 1.5, 3 및 6 mg/kg으로 투여된 PH1을 가진 환자의 3개의 코호트 및 융통성있게 투약한 4번째 PH2-단독 코호트를 비롯하여 PH를 가진 16명의 환자에서 실시예 1에 기재된 LDHA-1 올리고뉴클레오티드의 개방-표지 다중심 연구로서 설계되었다. 그룹 B 환자는 유럽 연합 (EU)의 5개 지역 및 미국의 1개 지역에서 등록하였다.
첫번째 그룹 B 코호트 (1.5 mg/kg)에서, RNAi 올리고뉴클레오티드의 단일 투여후 초기 결과는, 지금까지 4명 중 3명의 성인 환자가 43 일째와 57 일째 사이에 거의 정상의 소변 옥살레이트 농도 (≤60 mmol/24 hr)에 도달하였음을 보여주었다. 기준선 소변 옥살레이트 수준이 2.28 mmol/24hr이었던 4번째 성인은 실질적인 감소를 나타내었고, 71 일째 넘어서까지의 관찰은 해당 환자에 대해 유의한 감소를 나타내었다 (소변 옥살레이트 (UOX) <1.0 mmol/24hr). 결과는 도 8a 및 8b에 요약되어 있다.
두번째 그룹 B 코호트 (3 mg/kg)에서, 지금까지 4명 중 2명의 성인 환자가 29 일째와 43 일째 사이에 정상의 소변 옥살레이트 농도 (≤0.46 mmol/24hr)에 도달하였다. 다른 환자도 모두 실질적인 옥살레이트 감소를 가졌다. 이 그룹에서 1명의 환자는 상승된 혈장 옥살레이트 수준을 가졌다. 그럼에도 불구하고, LDHA-1에 의한 처리 동안에, 혈장 옥살레이트가 정상 수준으로 감소하였다. 결과는 도 8a 및 8b에 요약되어 있다.
4번째 그룹 B 코호트에서 PH2를 가진 1명의 성인 환자 또한 샘플링 날들 중 적어도 하루에 (57 일째) 24 시간 소변 옥살레이트 배설에서의 실질적인 감소 (35% 초과)를 경험하였다.
추가로, 3회의 경증 내지 중간 정도의 주사 부위 반응만이 관찰되었다. 모두 일시적이었고 (<72 시간), 개입 없이도 해결되었다.
요약하면, LDHA-1의 투여는 8명의 평가된 원발성 고옥살산뇨증 유형 1 및 유형 2 (PH1 및 PH2) 환자의 대부분에서 소변 옥살레이트 수준을 정상 범위 (24 시간 배설 ≤0.46 mmol로 정의됨) 또는 거의 정상인 범위 (24 시간 배설 ≤0.6 mmol로 정의됨)로 만들었다. 평가된 모든 환자는 소변 옥살레이트에서 실질적인 및 임상적으로 유의한 감소 (기준선과 비교하여 >30% 감소로 정의됨)를 경험하였다. 평가된 환자는 데이터가 6 주째 또는 43 일째까지 이용가능한 환자이다. 평가된 모든 환자는 성인이고, PH1을 가진 7명의 환자 및 PH2를 가진 1명의 환자를 포함한다.
상기한 이들 데이터는 인간에서 실시예 1의 RNAi 올리고뉴클레오티드 LDHA-1의 임상적 개념 증명을 구성하고, 또한 LDHA-1이 안전하고 잘 용인됨을 보여준다. 상기 결과는 단일 용량의 투여후 작용의 효능 및 지속을 입증하고, 대상체에 대한 분기별 투여와 일치하고 이를 뒷받침한다.
작용 지속과 함께 소변 옥살레이트의 감소 정도는 간 옥살레이트 생성의 최종 단계에 관여하는 락타제 데히드로게나제의 치료 표적화를 입증한다. 이러한 작용 메카니즘을 기반으로 하여, LDHA-1은 모든 유형의 원발성 고옥살산뇨증의 치료에 사용될 수 있다. 소변 옥살레이트에서의 실질적인 감소는, 상기 플랫폼이 인간에서 표적 유전자 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 이러한 RNAi 치료제를 사용하여 여러 형태의 원발성 고옥살산뇨증을 치료할 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 3에 대한 물질 및 방법
LDHA-1 분자 구조 (실시예 1, 도 1a 및 도 3 또한 참고)
센스 가닥:
Figure pat00016
하기에 혼성화됨:
안티센스 가닥:
범례:
mX: 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드
fX: 2'-플루오로-데옥시리보뉴클레오시드
[ademA-GalNAc]: 2'-O-GalNAc-변형된 아데노신
[ademG-GalNAc]: 2'-O-GalNAc-변형된 구아노신
[Me포스포네이트-4O-mU]: 4'-O-모노메틸포스포네이트-2'-O-메틸 우리딘
연결: "-"는 포스포디에스테르를 나타낸다.
"-S-"는 포스포로티오에이트를 나타낸다.
제약학적 개발
약물 제품은 SC 투여를 위한 WFI (주사용수) 중의 용액으로서 LDHA-1로 이루어진 멸균 액체 약물 제품이었다. 사용된 제형 (WFI 중 170 mg/ml 농도의 LDHA-1, pH 6.2-8.2)은 pH, 삼투성 (200-300 mOsm/kg), 점도 및 투여 경로와의 상용성을 기반으로 하여 선택되었다.
포함/배제에 대한 진단 및 기준
포함에 대한 그룹 A 기준:
1. 대상체는 가능한 위험 및 부작용을 비롯한 연구의 전체 본질 및 목적을 이해해야 하고, 모든 연구 절차 및 제한을 준수하려고 하고 준수할 수 있다.
2. 18세 내지 55세 (경계값 포함)의 남성 또는 여성 대상체.
3. 대상체는 19.0 내지 32 Kg/m2 (경계값 포함)의 체질량 지수 (BMI)를 가져야 했다.
4. 비흡연자, 적어도 1 개월 담배 금연, 및 EOS까지 담배 금연을 유지하려고 함. 대상체는 또한 니코틴-함유 제품 (예를 들어, 니코틴 패치)을 삼가해야 했다.
5. 대상체는 달리 건강해야 했다. 건강한 상태는 PI의 의견을 기반으로 하여 상세한 의학적 및 수술적 이력, 바이탈 사인, 12-리드 ECG, 혈액학, 혈액 화학, 혈청학 및 소변 검사를 비롯한 완전한 신체 검사에 따라 임의의 임상적으로 유의한, 활성 또는 만성 질환의 증거의 부재에 의해 정의되었다.
6. 이상이 연구자 또는 적격 지명자에 의해 임상적으로 유의하지 않은 (NCS) 것으로 분류되지 않았다면, 대상체는 정상 범위 내의 혈액학 및 임상 화학 검사 및 소변 분석을 가져야 했다. 간 패널 검사 (ALT 및 AST)는 정상이어야 했다. 간 패널 결과에 대해 재검사가 1회 수행될 수 있었다.
7. 여성 및 남성, 뿐만 아니라 남성 대상체의 임신가능성이 있는 여성 파트너(들)은 사전 동의한 날부터 IMP의 마지막 투여후 12 주째까지 매우 효과적이고 승인된 피임법(들)을 사용하려고 해야 했다. 매우 효과적인 피임 방법은 하기 중 적어도 하나를 충족시키는 것으로 정의되었다:
a. 엄격한 금욕: 이것이 환자의 바람직하고 일반적인 생활방식과 일치할 때. [주기적 금욕 (예를 들어, 자연주기법(calendar), 배란법, 증상-체온법, 배란후 방법) 및 질외사정(withdrawal)은 허용되는 피임 방법이 아니었음.]
b. 수술적 불임 (하기 수술 절차 중 하나를 겪었음: 자궁절제술, 양쪽 난관 결찰술, 양쪽 난소절제술, 또는 양쪽 난관절제술) 및 불임시술 이후 적어도 6 주.
c. 스크리닝 방문전 적어도 1 개월 동안 안정한 용량의 조합된 호르몬 경구 피임약 (에스트로겐 및 프로게스테론), 이식 또는 주사가능한 피임약, 및 차단 피임법. 조합된 호르몬 피임법은 배란 억제와 연관된 경우에만 매우 효과적인 피임 방법으로 고려되었다. 배란 억제와 연관된 경우, 프로게스테론-단독 호르몬 피임법 또한 매우 효과적인 피임 방법으로 고려된다.
d. 자궁내 장치 및 콘돔. 스크리닝 방문 적어도 1 개월전에 삽입된 호르몬성 자궁내 장치 (IUD).
e. 이중-차단 피임법 [예를 들어, 살정자 포움/겔/필름/크림/좌제와 함께 콘돔 및 폐쇄 캡 (다이어프램 또는 자경경부/볼트 캡)]. 참고로, 여성용 콘돔 및 남성용 콘돔, 또는 2개의 남성용 콘돔은 함께 사용해서는 안되었으며, 둘 사이의 마찰로 인해 제품 실패가 발생할 수 있기 때문이다.
f. 스크리닝 방문전 (시술후 적어도 6 개월) 정관절제된 파트너.
8. 폐경후 여성: 스크리닝전 12 개월 동안 월경이 없고, 스크리닝 방문시 혈청 FSH >26 IU/L로 정의됨.
9. 여성의 경우: 스크리닝시 및 0 일째 방문시 임신 검사 음상.
그룹 B - PH 환자 포함 기준
PH 환자는 이 연구에 참여하기에 적격이기 위해서는 하기 기준을 모두 충족해야 했다.
1. 환자가 미성년자인 경우에는 (< 18세, 또는 지역 규정에 따라 성년보다 어린 환자), 환자 및/또는 환자 부모 또는 보호자,
a. 가능한 위험 및 부작용을 비롯한 연구의 전체 본질 및 목적을 이해해야 했다.
b. 24 시간 소변 샘플의 수집을 비롯한 모든 연구 절차를 준수하려고 하고 준수할 수 있어야 했다.
c. 사전 동의서를 제공해야 한다. 유년기 (12 내지 < 18세, 또는 지역 규정에 따라 12세가 넘지만 성년보다 어린 환자)는 참여에 대한 서면 동의를 제공할 수 있어야 했다. 12세보다 어린 어린이의 경우에는, 지역 규정을 기반으로 하였다.
2. 정보 동의서를 얻는 시점에서 적어도 6세인 남성 또는 여성.
3. 환자는 25 Kg의 최소 체중을 가져야 했다.
4. 유전자형 분석에 의해 확인되는 PH1 또는 PH2의 문서화된 진단 (과거에 입수가능한 유전자형 정보는 연구 적격성을 위해 허용가능함).
5. 스크리닝 기간에 수행된 2가지 평가 중 적어도 하나에 대해, 18세 이상의 환자의 경우에는 24 시간 소변 옥살레이트 배설 ≥0.7 mmol, 또는 18세 미만의 환자의 경우에는 1.73 m2 체표면적 (BSA)당 ≥0.7 mmol, 둘 다의 옥살레이트 측정 사이에 30% 미만의 변동이 있음.
6. 성인 (≥18세)에서 신장 질환에서 식이의 변형 (MDRD) 식사, 또는 6 내지 < 18세의 환자에서 슈바르츠(Schwartz) 식사를 이용하여 계산된 1.73 m2 BSA에 대해 정규화된 eGFR ≥30 mL/min
7. 남성, 임신가능성이 있는 여성 환자, 및 남성 환자의 임신가능성이 있는 여성 파트너는 사전 동의한 날부터 IMP의 마지막 투여후 12 주째까지 매우 효과적이고 승인된 피임법(들)을 사용하려고 해야 했다. 매우 효과적인 피임 방법은 하기 중 적어도 하나를 충족시키는 것으로 정의되었다:
a. 엄격한 금욕: 이것이 환자의 바람직하고 일반적인 생활방식과 일치할 때. [주기적 금욕 (예를 들어, 자연주기법, 배란법, 증상-체온법, 배란후 방법) 및 질외사정은 허용되는 피임 방법이 아니었음.]
b. 수술적 불임 (하기 수술 절차 중 하나를 겪었음: 자궁절제술, 양쪽 난관 결찰술, 양쪽 난소절제술, 또는 양쪽 난관절제술) 및 불임시술 이후 적어도 6 주.
c. 스크리닝 방문전 적어도 1 개월 동안 안정한 용량의 조합된 호르몬 경구 피임약 (에스트로겐 및 프로게스테론), 이식 또는 주사가능한 피임약, 및 차단 피임법. 조합된 호르몬 피임법은 배란 억제와 연관된 경우에만 매우 효과적인 피임 방법으로 고려되었다. 배란 억제와 연관된 경우, 프로게스테론-단독 호르몬 피임법 또한 매우 효과적인 피임 방법으로 고려되었다.
d. 자궁내 장치 및 콘돔. 스크리닝 방문 적어도 1 개월전에 삽입된 호르몬성 IUD.
e. 이중-차단 피임법 [예를 들어, 살정자 포움/겔/필름/크림/좌제와 함께 콘돔 및 폐쇄 캡 (다이어프램 또는 자경경부/볼트 캡)]. 참고로, 여성용 콘돔 및 남성용 콘돔, 또는 2개의 남성용 콘돔은 함께 사용해서는 안되었으며, 둘 사이의 마찰로 인해 제품 실패가 발생할 수 있기 때문이다.
f. 스크리닝 방문전 (시술후 적어도 6 개월) 정관절제된 파트너.
8. 폐경후 여성: 스크리닝전 12 개월 동안 월경이 없고, 스크리닝시 혈청 FSH >26 IU/L로 정의됨.
9. WOCP의 경우: 스크리닝시 및 0 일째에 임신 검사 음상.
10. 연구에 참여하기 적어도 4 주전에 안정한 용량의 피리독신을 제공받은 PH1을 가진 환자는 연구 동안에 동일한 안정한 용량을 유지하려고 해야 했다. PH2를 가진 환자가 피리독신을 제공받는 드문 경우에는, 연구에 참여하기 적어도 4 주전에 이를 중단해야 했었다.
그룹 A - NHV 배제 기준
임의의 하기 기준을 충족하는 정상의 건강한 지원자는 이 연구로부터 배제되어야 했다:
1. 연구 준수 또는 데이터 해석을 방해하거나 또는 대상체 안전성에 잠재적으로 영향을 미치는, 하기를 비롯하여 이에 제한되지 않는 임의의 의학적 상태 또는 동반 질병의 존재:
a. 중증의 병발성 질병
b. 투약전 30 일 이내에 및 EOS 방문까지 정기적 예방접종
c. 활성 간 질환/ 손상 또는 트랜스아미나제 상승의 공지된 원인 (예를 들어, 알콜성 간 질환, 비알콜성 지방 간 질환/ 지방간염 (NAFLD/NASH))
d. 과도한 알콜 소비에 대한 의사의 우려
e. 매일 3 그램 초과의 파라세타몰의 정기적 또는 만성적 사용.
2. 신장 결석의 이력.
3. 이 연구 동안에 또는 IMP의 마지막 투약후 90 일 이내에 임신중이거나, 수유중이거나 또는 임신을 시도한 여성.
4. 이 연구 동안에 또는 IMP의 마지막 투약후 90 일 이내에 임신을 시도한 여성 파트너를 가진 남성.
5. 연구 의약의 첫번째 투여전 90 일 이내에 임의의 연구용 약품의 사용. 대상체가 이전의 siRNA 또는 항체 연구에 참여한 경우에는, 이 연구에서 첫번째 용량 투여전 적어도 6 개월의 세척 기간이 필요하였다.
6. 용량 투여전 48 시간 (2 일) 이내에 및 EOS 방문 또는 29 일째까지 격렬한 활동, 일광욕 및 접촉 스포츠.
7. 임상 연구 센터에서 투약전 90 일 이내에 450 mL 초과의 혈액 기증 또는 IMP를 제공받은 후 30 일 이내에 기증 계획의 이력.
8. 투약 7 일 이내에 또는 전체 연구 내내 혈장 또는 혈소판 기증.
9. 연구자에 의해 측정시 주당 남성의 경우 21개 단위, 여성의 경우 14개 단위를 초과하는 알콜 소비의 이력. 알콜 소비는 임상 시설에 입원하기 전 48 시간부터 연구 마지막까지 금지되었다.
10. B형 간염 표면 항원 (HBsAg), 항-C형 간염 바이러스 (HCV) 항체, 또는 항-인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 1 및 2 항체에 대한 스크리닝 검사 양성. 대상체를 과거 3 개월 내에 검사한 경우에는, 과거 데이터로 사용될 수 있었다.
11. 올리고뉴클레오티드-기반 요법에 대해 하기 반응 중 하나 이상의 이력
a. 중증 혈소판감소증
b. 간독성
c. 요법의 중단을 초래하는 중증의 독감-유사 증상
d. 요법의 중단을 초래하는 주사로 인한 국소 피부 반응 (등급 3 이상).
e. 응고장애/ 임상적으로 중요한 응고 시간 연장
다른 제한:
모든 규칙적인 비-국소 의약 및 불규칙적인 의약 (처방전 없이 살 수 있는 의약, 건강 보조제, 및 약초 치료, 예컨대 세인트 존스 워트(St. John's Wort) 추출물의 만성 투약을 포함함)은 임상 연구 센터로 입원하기 적어도 14 일 전부터 EOS 방문을 포함하여 그때까지 중단해야 했다. 파라세타몰 (아세트아미노펜)의 경우에는 임상 연구 센터에 입원할 수 있는 예외가 있었다. 그러나, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 아스피린, 나프록센 등은 임상 연구 센터에 입원하기 적어도 14 일 전에 중단해야 했다. 대상체는 연구 참여 동안에 (즉, 스크리닝과 EOS 방문 사이에) 격렬한 운동에 참여하지 않아야 했다. 연구 내내, 대상체는 옥살레이트-풍부 식품을 피하고, 국가 식이 지침을 초과하지 않는 적당량의 단백질 및 칼슘을 섭취해야 했다. 단백질 쉐이크는 피해야 했다.
그룹 B - PH 환자 배제 기준
임의의 하기 기준을 충족하는 PH 환자는 이 연구로부터 배재되었다:
1. 이전의 신장 및/또는 간 이식.
2. 현재 투석을 받고 있음.
3. 전신 옥살산증의 임상적 징후의 문서화된 증거.
4. 등록전 4 개월 이내에 연구 의약 제품을 제공받는 임의의 임상 연구에 참여. Uox 및/또는 혈장 옥살레이트를 감소시킬 가능성이 있는 IMP의 경우에는, 이들 농도가 과거 기준선 수준으로 되돌아 와야 했다.
a. 환자가 이 연구에서 초기 코호트에 참여한 경우에는, 재등록하기 전에 최소 8 주가 경과해야 했고, 소변 옥살레이트 배설이 기준선의 ≥80%로 되돌아 와야 했다.
5. 연구 준수 또는 데이터 해석을 방해하거나 또는 환자 안전성에 잠재적으로 영향을 미치는, 하기를 비롯하여 이에 제한되지 않는 임의의 의학적 상태 또는 동반 질병의 존재::
a. 중증의 병발성 질병
b. 투약전 30 일 이내에 및 EOS 방문까지 정기적 예방접종
c. 활성 간 질환/ 손상 또는 트랜스아미나제 상승의 공지된 원인 (예를 들어, 알콜성 간 질환, 비알콜성 지방 간 질환/ 지방간염 (NAFLD/NASH)
d. 과도한 알콜 소비에 대한 의사의 우려
e. 매일 3 그램 초과의 아세트아미노펜의 정기적 또는 만성적 사용.
6. 연구자에 의해 측정시 주당 남성의 경우 21개 단위, 여성의 경우 14개 단위를 초과하는 알콜 소비의 이력.
7. 이 연구 동안에 또는 IMP의 마지막 투약후 90 일 이내에 임신중이거나, 수유중이거나 또는 임신을 시도한 여성.
8. 간 기능 검사 (LFT) 이상: 연령 및 성별에 따라 ALT 및/또는 AST >1.5 배 ULN.
9. 올리고뉴클레오티드-기반 요법에 대해 하기 반응 중 하나 이상의 이력
a. 중증 혈소판감소증
b. 간독성
c. 요법의 중단을 초래하는 중증의 독감-유사 증상
d. 요법의 중단을 초래하는 주사로 인한 국소 피부 반응 (등급 3 이상).
e. 응고장애/ 임상적으로 중요한 응고 시간 연장
다른 제한:
환자는 또한 24 시간 소변 표본 수집전 24 시간 동안 및 수집 동안에, 및 PD 혈액 수집전 24 시간 동안 비타민 C 보충제의 복용을 피해야 했다. 환자는 연구 참여 동안에 (즉, 스크리닝과 EOS 방문 사이에) 격렬한 운동에 참여하지 않아야 했다. 연구 내내, 환자는 옥살레이트-풍부 식품을 피하고, 국가 식이 지침을 초과하지 않는 적당량의 단백질 및 칼슘을 섭취해야 했다. 단백질 쉐이크는 피해야 했다.
소변 옥살레이트 (UOX) 수준의 측정
24 시간 소변 샘플을 환자로부터 수득하였고, 분취량을 산성화시켜 옥살레이트의 용해도를 증가시켰다. 일반적으로, 옥살레이트는 불용성이고, 산성 상태에서 용해될 수 있는 결정을 형성한다. 이어서, 용해된 UOX를 HPLC 분석에 적용하여 그의 수준을 측정하였다.
본원에 예시적으로 기재된 본 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 예에서, 용어 "포함하는", "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 다른 두 용어와 교체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 기재의 측면에서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 도시되고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 제외하려는 의도는 없으며, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 임의적인 특징, 변형 및 변동이 관련 기술분야의 기술자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변동이 상기 기재 및 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대인적인 그룹의 용어로 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 서브그룹의 측면에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구항의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 파악되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"은 달리 언급되지 않는다면 개방형 용어로서 파악되어야 한다 (즉, "포함하나 이에 제한되지 않음"을 의미함). 본원에서 값의 범위의 기재는 단지 본원에서 달리 지시되지 않는다면 상기 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 작용하기 위해 단지 의도되는 것이고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예시 또는 예시적인 표현 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 의도된 것이고, 달리 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 표현도 본 발명의 실시에서 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 파악되어서는 안된다.
본 발명을 실시하기 위해 발명자들에게 공지된 최상의 방식을 비롯하여 본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변동은 상기 기재를 읽은 후에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 수 있다.
본 발명자들은 숙련가들이 이러한 변동을 적절하게 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명자들은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구항에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 그의 모든 가능한 변동에서 상기 기재된 요소들의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면 본 발명에 포함된다. 관련 기술분야의 기술자들은 일상적인 실험만으로도 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인식할 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc. <120> MEMETHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING EXPRESSION OF LDHA <130> D0800.70011WO00 <140> PCT/US2018/055735 <141> 2018-10-12 <150> US 62/726,950 <151> 2018-09-04 <150> US 62/572,403 <151> 2017-10-13 <150> US 62/572,398 <151> 2017-10-13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 ucagauaaaa aggacaacau gg 22 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 auguuguccu uuuuaucuga gcagccgaaa ggcugc 36

Claims (15)

  1. UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하는, 락테이트 데히드로게나제 A (LDHA)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며,
    여기서 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 중 1개 이상은 아세탈 링커를 이용하여 1가 GalNac 모이어티에 접합되고,
    센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형되고, 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 및 17 및 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18 모두는 2'-플루오로에 의해 변형되는 것인 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각이 1가 GalNac 모이어티에 접합된 것인 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 5'-말단 뉴클레오티드에 4'-옥시메틸포스포네이트를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  5. UCAGAUAAAAAGGACAACAUGG (서열식별번호: 1)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 AUGUUGUCCUUUUUAUCUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (서열식별번호: 2)에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하는, 락테이트 데히드로게나제 A (LDHA)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며,
    여기서 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 중 1개 이상은 아세탈 링커를 이용하여 1가 GalNac 모이어티에 접합되고, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로에 의해 변형되고, 적어도 1개의 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결로 변형되고, 안티센스 가닥은 5'-말단 뉴클레오티드에 4'-포스페이트 유사체를 포함하고,
    센스 가닥의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26 및 31-36 및 안티센스 가닥의 위치 1, 6, 8, 11-13, 15, 17 및 19-22 모두는 2'-O-메틸에 의해 변형되고, 센스 가닥의 위치 3, 5, 8-11, 13, 15 및 17 및 안티센스 가닥의 위치 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 및 18 모두는 2'-플루오로에 의해 변형되는 것인 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각이 1가 GalNac 모이어티에 접합된 것인 올리고뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 안티센스 가닥이 5'-말단 뉴클레오티드에 4'-옥시메틸포스포네이트를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드.
  8. 제5항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 각각 센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 1과 2, 안티센스 가닥의 위치 2와 3, 안티센스 가닥의 위치 3과 4, 안티센스 가닥의 위치 20과 21, 및 안티센스 가닥의 위치 21과 22 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는 것인 올리고뉴클레오티드.
  9. 하기 구조를 갖는, 락테이트 데히드로게나제 A (LDHA)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며:

    여기서 센스 가닥의 위치 27-30의 -GAAA- 서열은 하기 구조를 포함하고:
    , 또한
    안티센스 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드는 하기 구조를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드:
    .
  10. 제9항에 있어서, 하기 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드:


    .
  11. 제1항, 제5항 및 제9항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 및 부형제를 포함하는, 원발성 고옥살산뇨증을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체를 치료하거나 또는 대상체에서 간 옥살레이트 생산을 감소시키기 위한 조성물.
  12. 제11항에 있어서, Na+ 반대이온을 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 부형제가 인산염-완충된 식염수를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 원발성 고옥살산뇨증이 PH1, PH2, PH3 및 특발성 고옥살산뇨증으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 정맥내로 또는 피하로 투여되는 조성물.
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