RS61359B1

RS61359B1 - Postupci i sastavi vezani za upotrebu surfaktanata sa niskom hlb u proizvodnji sintetičkih nano nosača koji sadrže rapalog

Info

Publication number: RS61359B1
Application number: RS20210097A
Authority: RS
Inventors: Conlin O'neil; Aaron P Griset; David H Altreuter
Original assignee: Selecta Biosciences Inc
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2021-02-26
Also published as: IL295292A; SI3215133T1; CN107072965B; MX2021012273A; FI3834823T3; CA2966850A1; AU2021209204A1; IL288609B2; CN115212187A; IL288609A; JP7218089B2; MX2017005904A; JP2023169893A; EP4360633A2; CN107072964A; HUE067697T2; EP4356910A3; IL288609B; PL3215133T3; IL251620A0

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na sintetičke nano nosače i srodne sastave i postupke, koji sadrže hidrofobni nosač, rapalog i nejonski surfaktant sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom od 10.

REZIME PRONALASKA

[0002] Ovde su dati sintetički nano nosači koji mogu inhibirati ili smanjiti imuni odgovor na antigen, kao što je antigen koji se daje zajedno. Sintetički nano nosači sadrže hidrofobni materijal nosača, rapalog i nejonski surfaktant sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom od 10. Iznenađujuće je otkriveno da upotreba takvog nejonskog surfaktanta u formulaciji tokom formiranja sintetičkih nano nosača može rezultirati sintetičkim nano nosačima sa poboljšanom stabilnošću i performansama.

[0003] U jednom aspektu, sastav koji sadrži sintetičke nano nosače koji sadrži hidrofobni nosač, rapalog i nejonski surfaktant sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom 10, pri čemu je količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manja ili jednaka 10 je ≥ 0,01, ali je obezbeđeno ≤ 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom od 10/hidrofobnog materijala nosača.

[0004] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, mase su mase recepata materijala koji se kombinuju tokom formulacije sintetičkih nano nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, mase su mase materijala u rezultujućem sastavu sintetičkih nano nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, mase su mase recepata materijala koji se kombinuju tokom formulacije sintetičkih nano nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, mase su mase materijala u rezultujućem sastavu sintetičkih nano nosača.

[0005] U drugom aspektu, obezbeđen je komplet koji sadrži bilo koji od ovde datih sastava. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, sastav je namenjen za upotrebu u bilo kom od ovde navedenih postupaka. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, kada sastav ne sadrži antigen, komplet dalje sadrži antigen. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, sastav i antigen su sadržani u odvojenim ambalažama. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, sastav i antigen se nalaze u istoj posudi. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, komplet dalje sadrži uputstva za upotrebu. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih kompleta, uputstva za upotrebu uključuju opis bilo kog ovde datog postupka.

[0006] U drugom aspektu, obezbeđen je postupak koji uključuje davanje bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ispitaniku. U jednom otelotvorenju bilo kog od predviđenih postupaka, kada sastav ne sadrži antigen, postupak dalje uključuje davanje antigena ispitaniku. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, antigen se sastoji iz različitih sintetičkih nano nosača. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, antigen nije povezan sa bilo kojim sintetičkim nano nosačima. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, davanje se vrši intradermalno, intramuskularno, intravenozno, intraperitonealno ili subkutano.

[0007] U drugom aspektu, postupak za proizvodnju sintetičkih nano nosača koji sadrže nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapalog, koji obuhvata dobijanje ili obezbeđivanje hidrofobnog nosećeg materijala, dobijanje ili obezbeđivanje nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom manje ili jednako 10, dobijanje ili obezbeđivanje rapaloga i kombinovanje hidrofobnog nosača, nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjim ili jednakim 10 i rapaloga da bi se stvorili sintetički nano nosači, pri čemu količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,01, ali je obezbeđeno ≤ 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobni nosač. U jednom otelotvorenju bilo kog od ovde opisanih postupaka za proizvodnju, postupak dalje uključuje rastvaranje hidrofobnog nosača, nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapaloga u rastvaraču, dobijanje ili obezbeđivanje drugog surfaktanta, formiranje prve, a zatim druge O/V emulzije sa rastvorenim hidrofobnim materijalom nosača, nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapalogom i drugi surfaktant, mešajući prvu i drugu O/V emulziju i dozvoljavajući rastvaraču da ispari. U jednom otelotvorenju bilo kog ovde datog postupka za proizvodnju, rastvarač je dihlorometan, etil acetat, hloroform ili propilen karbonat. U jednom otelotvorenju bilo kog ovde datog postupka za proizvodnju, postupak dalje uključuje filtriranje rezultujućeg sastava. U jednom otelotvorenju bilo kog ovde datog postupka za proizvodnju, filtriranje uključuje filtriranje kroz filter od 0,22 µm.

[0008] U drugom aspektu, obezbeđen je sastav proizveden bilo kojim od ovde opisanih postupaka za proizvodnju. Postupak za proizvodnju može biti bilo koji od ponuđenih postupaka za proizvodnju, kao što je jedan od postupaka ilustrovanih u Primerima.

[0009] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički sastav nano nosača je u početku sterilna za filtriranje kroz filter od 0,22 µm.

[0010] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 10. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 9. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 8. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 7. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 6. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom od 5.

[0011] U jednom otelotvorenju bilo koje od ovde navedenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 sadrži sorbitan estar, masni alkohol, estar masnih kiselina, etoksilisani masni alkohol, poloksamer, masne kiseline, holesterol, derivat holesterola, ili žučnu kiselinu ili so. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 sadrži SPAN 40, SPAN 20, oleil alkohol, stearil alkohol, izopropil palmitat, glicerol monostearat, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic P-123, Pluronic L-31, palmitinsku kiselinu, dodekansku kiselinu, gliceril tripalmitat ili gliceril trilinoleat. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je SPAN 40.

[0012] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 inkapsuliran je u sintetičke nano nosače, prisutne na površini sintetičkih nano nosača, ili oboje.

[0013] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je ≥ 0,1, ali ≤ 15 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom do 10/hidrofobni materijal nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je ≥ 1, ali ≤ 13 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom do 10/hidrofobni materijal nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je ≥ 1, ali ≤ 9 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom do 10/hidrofobni materijal nosača.

[0014] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, hidrofobni nosač sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera ili lipida. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, hidrofobni materijal nosača sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera, a pri čemu jedan ili više hidrofobnih polimera sadrži poliester. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, poliester sadrži PLA, PLG, PLGA ili polikaprolakton. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, hidrofobni materijal nosača sadrži ili dalje sadrži PLA-PEG, PLGA-PEG ili PCL-PEG.

[0015] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkim nano nosačima je 5-95 % po masi hidrofobnog nosećeg materijala/ukupne čvrste supstance. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkim nano nosačima je 60-95 % po masi hidrofobnog nosećeg materijala/ukupne čvrste supstance.

[0016] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina rapaloga je ≥ 6, ali ≤ 50 % po masi rapaloga/hidrofobnog nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina rapaloga je ≥ 7, ali ≤ 30 % po masi rapaloga/hidrofobnog nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina rapaloga je ≥ 8, ali ≤ 24 % po masi rapaloga/hidrofobnog nosača.

[0017] U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, rapalog je enkapsuliran u sintetičkim nano nosačima.

[0018] U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, rapalog je rapamicin.

[0019] U jednom otelotvorenju bilo koje od ovde navedenih sastava ili postupaka, sastav dalje sadrži antigen.

[0020] U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, antigen se pomeša sa sintetičkim nano nosačima u sastavu.

[0021] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, srednja vrednost raspodele veličine čestica dobijena korišćenjem dinamičkog rasejanja svetlosti sintetičkih nano nosača je prečnik veći od 120 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je veći od 150 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je veći od 200 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je veći od 250 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je veći od 300 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je manji od 250 nm. U jednom otelotvorenju bilo kog od ponuđenih postupaka, prečnik je manji od 200 nm.

[0022] U jednom otelotvorenju bilo koje od ovde navedenih sastava ili postupaka, sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0023] U jednom otelotvorenju bilo kojeg od sastava ili postupaka, gde je rapalog rapamicin, hidrofobni nosač sadrži PLA ili PLGA i PLA-PEG, a nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je sorbitan monopalmitat, prečnik sintetičkih nano nosača je kao što je predviđeno u bilo kojem od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji sastav iz Primera. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od sastava ili postupaka, gde je rapalog rapamicin, hidrofobni nosač sadrži PLA ili PLGA i PLA-PEG, a nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je sorbitan monopalmitat, prečnik sintetičkih nano nosača i/ili % po masi rapamicina je kao što je predviđeno u bilo kojem od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji sastav iz Primera. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od sastava ili postupaka, gde je rapalog rapamicin, hidrofobni nosač sadrži PLA ili PLGA i PLA-PEG, a nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je sorbitan monopalmitat, prečnik sintetičkih nano nosača je kao što je predviđeno u bilo kojem sastavu koji je ovde dat, kao što je bilo koji sastav iz Primera i/ili % po masi rapamicina kao što je predviđeno u bilo kojem od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji od sastava Primera i/ili količina polimera je onako kako je predviđeno u bilo kom od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji od sastava Primera. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od sastava ili postupaka, gde je rapalog rapamicin, hidrofobni nosač sadrži PLA ili PLGA i PLA-PEG, a nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 je sorbitan monopalmitat, prečnik sintetičkih nano nosača je kao što je predviđeno u bilo kojem sastavu koji je ovde dat, kao što je bilo koji sastav iz Primera i/ili % po masi rapamicina kao što je predviđeno u bilo kojem od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji od sastava Primera i/ili količina polimera je onako kako je predviđeno u bilo kom od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji od sastava Primera i/ili količina sorbitan monopalmitata je predviđena u bilo kojem od ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji sastav iz Primera.

[0024] U drugom aspektu, obezbeđen je bilo koji ovde navedenih sastava, kao što je bilo koji iz Primera.

[0025] U drugom aspektu, obezbeđen je postupak proizvodnje bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili kompleta. U jednom otelotvorenju, postupak proizvodnje obuhvata korake bilo kog od ovde datih postupaka, kao što su koraci bilo kog od postupaka navedenih u Primerima.

[0026] U drugom aspektu, obezbeđena je upotreba bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili kompleta za proizvodnju leka za unapređenje imune tolerancije kod ispitanika. U još jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde predviđenih upotreba, upotreba je za postizanje bilo kojeg od ovde navedenih postupaka.

[0027] U drugom aspektu, bilo koji od ovde pripremljenih sastava ili kompleta može biti za upotrebu u bilo kom od ovde navedenih postupaka.

[0028] U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju leka namenjenog unapređenju imune tolerancije. U jednom otelotvorenju, lek sadrži bilo koji od ovde obezbeđenih sastava.

KRATAK OPIS SLIKA

[0029]

Sl. 1 pokazuje rezultate koji pokazuju sposobnost istovremeno davanog nano nosača i KLH (hemocijanin limpeta u ključaonici) sa rapamicinom (RAPA) da indukuju toleranciju. Serumi miševa su analizirani na antitela na KLH nakon svakog izazivanja KLH.

Sl. 2 prikazuje rezultate koji pokazuju trajno smanjenje titra antitela sa nano nosačima sa surfaktantima sa niskim HLB. Skraćenica „tSIP“ odnosi se na nano nosače kako je opisano.

Sl. 3 prikazuje rezultate koji pokazuju efikasnost sintetičkog nano nosača+KLH u poređenju sa slobodnim rapamicinom+KLH kod miševa. Anti-KLH EC50 na dan 35 i 42 titra antitela (nakon 2 ili 3 izazivanja samo sa KLH) za miševe koji su lečeni sintetičkim nano nosačem+KLH ili ne (simboli predstavljaju geometrijsku sredinu ± 95% CI). Skraćenica „NC“ odnosi se na nano nosače kako je opisano.

Sl. 4 prikazuje protokole lečenja za Primer 7. Skraćenica „NC“ odnosi se na nano nosače kako je opisano.

Sl. 5 prikazuje sintetički nano nosač+ KLH antigen specifičnost kod miševa. Anti-OVA EC50 na Dan 65 titra antitela za miševe koji su tretirani ili nisu sintetičkim nano nosačem+KLH (pruge predstavljaju geometrijsku sredinu ± 95% CI). Skraćenica „NC“ odnosi se na nano nosače kako je opisano.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0030] Pre detaljnog opisivanja predmetnog pronalaska, treba shvatiti da predmetni pronalazak nije ograničen na posebno ilustrovane materijale ili parametre procesa, jer takvi mogu, naravno, varirati. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija namenjena samo opisivanju određenih otelotvorenja pronalaska i nije namenjena ograničavanju upotrebe alternativne terminologije za opisivanje predmetnog pronalaska.

[0031] Sve ovdašnje objave, patenti i prijave patenata, bilo supra ili infra, su ovde u celosti uključene u sve svrhe.

[0032] Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju množinske reference, osim ako sadržaj jasno nalaže drugačije. Na primer, referenca na "polimer" uključuje smešu dva ili više takvih molekula ili smešu različitih molekulskih težina jedne vrste polimera, referenca na "sintetički nano nosač" uključuje smešu dva ili više takvih sintetičkih nano nosača ili mnoštvo takvih sintetičkih nano nosača i slično.

[0033] Kako se ovde koristi, pojam „sadržati“ ili njegove varijacije kao što je „sadrži“ ili „sadržavati“ treba čitati kako bi se naznačilo uključivanje bilo kog recitovanog celog broja (npr., obeležja, elementa, karakteristike, svojstva, koraka postupka/procesa ili ograničenja) ili grupa celih brojeva (npr., obeležja, elementi, karakteristike, svojstva, koraci postupka ili procesa ili ograničenja), ali ne i izuzeće bilo koje druge celobrojne ili grupe celih brojeva. Prema tome, kako se ovde koristi, termin "sadrži" uključuje i ne isključuje dodatne, ne registrovane cele brojeve ili korake postupka/procesa.

[0034] U otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava i postupaka, "sadrži" može biti zamenjeno sa "koji se sastoji u osnovi iz" ili "koji se sastoji iz". Termin „koji se u osnovi sastoji iz“ ovde se koristi da bi se zahtevali navedeni celi brojevi ili koraci, kao i oni koji materijalno ne utiču na karakter ili funkciju zahtevanog pronalaska. Kako se ovde koristi, termin „sastoji se“ koristi da označi prisustvo izgovorene celobrojne vrednosti (npr., svojstvo, element, karakteristika, svojstvo, korak postupka/procesa ili ograničenje postupka) ili grupe celih brojeva (npr., obeležja, elementi, karakteristike, svojstva , korake ili ograničenja postupka/procesa).

A. UVOD

[0035] Utvrđeno je da sintetičkim nano nosačima koji sadrže hidrofobni nosač u kombinaciji sa rapalogom, kao što je rapamicin, u početku može biti teško sterilni filter kroz filter od 0,22 µm. Upotreba takvog filtera u proizvodnji sintetičkih nano nosača je važna, jer filteri mogu ukloniti bakterije do željenog nivoa i rezultirati sterilnijim sastavom, korisnom osobinom za sastave koji se koriste za in vivo davanje. Iznenađujuće, zbog prirode dve hidrofobne komponente takvih sintetičkih nano nosača, otkriveno je da ugradnja nejonskog surfaktanta, poput sorbitan monopalmitata, u sintetičke nano nosače može rezultirati sintetičkim nano nosačima sa poboljšanom filtrabilnošću i, u nekim otelotvorenjima, poboljšano opterećenje rapalogom, a time i efikasnost kada se daje ispitaniku. Shodno tome, utvrđeno je da upotreba nejonskih surfaktanta čija je vrednost hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manja ili jednaka 10 može omogućiti efikasnije opterećenje rapaloga, po mogućnosti hidrofobnog, uz istovremeno poboljšanje početne sterilne filtrabilnosti.

[0036] Kao što je prikazano u Primerima, određeni broj takvih surfaktanta povećao je protok sintetičkih formulacija nano nosača kada su inicijalno prošli kroz filter od 0,22 µm. Takođe je utvrđeno da sintetički nano nosači sa takvim surfaktantima obezbeđuju veće opterećenja rapaloga, kao što je hidrofobni rapalog, koji su mogli da obezbede trajnu antigen-specifičnu toleranciju kod ispitanika. Iako je upotreba površinski aktivnih supstanci sa višim hidrofilnolipofilnim bilansom (HLB) tipična za suspenziju ili rastvaranje hidrofobnih sredstava u rastvaračima, uvođenje takvih sredstava u fazu rastvaranja u ulju tokom formulacije nano nosača, možda neće podržati optimizovanu proizvodnju visoko opterećenih rapalog, kao što je hidrofobni rapalog, u nano nosačima. Nego jonski surfaktanti sa HLB ≤ 10, poput sorbitan monopalmitata (SPAN 40) (HLB 6,7), predstavljaju klasu tenzida koji pomažu navedenoj optimizaciji.

[0037] Shodno tome, obezbeđeni su sastavi i s njima povezani postupci sintetičkih nano nosača koji sadrže hidrofobni nosač, rapalog, poželjno hidrofobni i nejonski surfaktant sa hidrofilno-lipofilnom ravnotežnom (HLB) vrednošću manjom ili jednakom 10. Takve smeše mogu pokazati poboljšanu početnu sterilnu filtrabilnost, u nekim otelotvorenjima, poboljšani rapalog, kao što je hidrofobni rapalog, opterećenje i performanse i mogu se koristiti u postupcima za smanjenje neželjene aktivacije imunološkog sistema specifičnog za antigen i/ili promovisanje specifične tolerancije za antigen.

[0038] Pronalazak će sada biti detaljnije opisan u nastavku.

B. DEFINICIJE

[0039] „Davanje“ ili „davati“ ili „uzimati“ znači pružanje materijala ispitaniku na način koji je farmakološki koristan. Termin treba da uključuje uzrok davanja u nekim otelotvorenjima. „Uzrokovanje davanja“ znači izazivanje, podsticanje, ohrabrivanje, pomaganje, podsticanje ili usmeravanje, direktno ili indirektno, druge strane da uzima materijal.

1

[0040] "Pomešano" se odnosi na mešanje jedne komponente, kao što je antigen, sa drugom, kao što su sintetički nano nosači, u sastavu. Komponente koje se mešaju izrađuju se ili dobijaju odvojeno i slažu zajedno. Shodno tome, komponente nisu međusobno povezane, osim zbog mogućih nekovalentnih interakcija koje mogu nastati kada se stave zajedno u sastav.

[0041] "Efikasna količina" u kontekstu sastava ili doze za primenu kod ispitanika odnosi se na količinu smeše ili doze koja daje jedan ili više željenih odgovora kod ispitanika, na primer, stvaranje antigen-specifičnog tolerogenog imunog odgovora. U nekim otelotvorenjima, efikasna količina je farmakodinamički efikasna količina. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, efikasna količina je bilo koja količina ovde pripremljene smeše ili doze koja proizvodi jedan ili više željenih terapeutskih efekata i/ili imunih odgovora kako je ovde dato. Ova količina može biti u in vitro ili in vivo svrhe. U in vivo svrhe, količina može biti ona za koju kliničar veruje da može imati kliničku korist za ispitanika kome je potrebna imunološka tolerancija specifična za antigen. Bilo koji sastav koji je ovde dat može biti koristan u količini.

[0042] Efikasne količine mogu da uključuju smanjenje nivoa neželjenog imunološkog odgovora, mada u nekim otelotvorenjima uključuje potpuno sprečavanje neželjenog imunog odgovora. Efikasne količine takođe mogu uključivati odlaganje pojave neželjenog imunološkog odgovora. Količina koja je efikasna takođe može biti količina koja daje željenu terapijsku krajnju tačku ili željeni terapijski rezultat. U drugim otelotvorenjima, efikasne količine mogu uključivati povećanje nivoa željenog odgovora, kao što je terapeutska krajnja tačka ili rezultat. Efikasne količine, poželjno, rezultiraju tolerogenim imunološkim odgovorom kod ispitanika na antigen. Postizanje bilo čega od navedenog može se pratiti rutinskim postupcima.

[0043] Efikasni iznosi zavise, naravno, od određenog predmeta koji se leči; ozbiljnost stanja, bolesti ili poremećaja; individualni parametri pacijenta, uključujući starost, fizičko stanje, veličinu i težinu; trajanje lečenja; priroda istovremene terapije (ako postoji); specifičan način davanja i slični faktori u okviru znanja i stručnosti zdravstvenog radnika. Ovi faktori su dobro poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti i mogu se rešavati samo sa rutinskim eksperimentisanjem. Generalno je poželjno da se koristi maksimalna doza, odnosno najviša sigurna doza prema zdravom medicinskom sudu. Stručnjaci u ovoj oblasti razumeće, međutim, da pacijent može insistirati na nižoj dozi ili podnošljivoj dozi iz medicinskih razloga, psiholoških razloga ili praktično iz bilo kog drugog razloga.

[0044] Generalno, doze komponenata u sastava pronalaska odnose se na količinu komponenata. Alternativno, doza se može primeniti na osnovu broja sintetičkih nano nosača koji pružaju željenu količinu.

[0045] „Antigen“ znači antigen B ćelije ili antigen T ćelije. „Tip (tipovi) antigena“ označava molekule koji imaju iste ili suštinski iste antigenske karakteristike. U nekim otelotvorenjima, antigeni mogu biti proteini, polipeptidi, peptidi, lipoproteini, glikolipidi, polinukleotidi, polisaharidi ili su sadržani ili eksprimirani u ćelijama. U nekim otelotvorenjima, kao na primer kada antigeni nisu dobro definisani ili okarakterisani, antigeni mogu biti sadržani u ćelijskom ili tkivnom preparatu, ćelijskim ostacima, ćelijskim egzozomima, uslovljenim medijima, itd.

[0046] „Antigen specifičan“ odnosi se na bilo koji imuni odgovor koji je rezultat prisustva antigena ili njegovog dela ili koji generiše molekule koji specifično prepoznaju ili vezuju antigen. Na primer, tamo gde je imuni odgovor proizvodnja antigena specifična za antigen, proizvode se antitela koja specifično vezuju antigen. Kao drugi primer, gde je imuni odgovor proliferacija i/ili aktivnost B ćelije ili CD4+ T ćelija specifične za antigen, proliferacija i/ili aktivnost proističe iz prepoznavanja antigena ili njegovog dela, samog ili u kompleksu sa molekulima MHC, B ćelije itd.

[0047] "Prosek", kako se ovde koristi, odnosi se na aritmetičku sredinu, ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0048] „Kapsula“ znači zatvaranje najmanje dela supstance u sintetički nano nosač. U nekim otelotvorenjima, supstanca je potpuno zatvorena u sintetičkom nano nosaču. U drugim otelotvorenjima, većina ili celokupna supstanca koja je inkapsulirana nije izložena lokalnom okruženju van sintetičkog nano nosača. U drugim otelotvorenjima, najviše 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ili 5% (masa/masa) je izloženo lokalnom okruženju. Kapsulacija se razlikuje od apsorpcije, koja većinu ili celokupnu supstancu postavlja na površinu sintetičkog nano nosača, a supstancu ostavlja izloženom lokalnom okruženju izvan sintetičkog nano nosača. U otelotvorenjima bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, rapalog i/ili nejonski surfaktant sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom 10 inkapsulirani su u sintetičke nano nosače.

[0049] "Hidrofobni nosač" odnosi se na bilo koji farmaceutski prihvatljiv nosač koji može da isporuči jedan ili više molekula (npr., rapalog i nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10) i koji ima hidrofobne karakteristike. Takvi materijali uključuju materijale koji mogu da formiraju sintetički nano nosač ili njegov deo i koji mogu da uključuju ili napune jedan ili više molekula (npr., rapalog i nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10). Generalno, nosači mogu omogućiti isporuku jednog ili više molekula (npr., rapaloga i nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10) do ciljnog mesta ili ciljne ćelije, kontrolisano oslobađanje jednog ili više više molekula i druge željene aktivnosti. Primeri hidrofobnih materijala-nosača uključuju, bez ograničenja, materijale koji se mogu koristiti za formiranje sintetičkih nano nosača i koji sadrže hidrofobne komponente, poput hidrofobnih polimera, kao što su poliesteri ili lipidi. "Hidrofobni" se odnosi na materijal koji u velikoj meri ne učestvuje u vezivanju vodonika sa vodom. Takvi materijali su uglavnom nepolarni, prvenstveno nepolarni ili neutralno nabijeni. Materijal nosača pogodan za ovde opisane sastave može se odabrati na osnovu toga što pokazuje hidrofobnost na nekom nivou. Prema tome, hidrofobni materijali nosači su oni koji su hidrofobni u celini i mogu se u potpunosti sastojati iz hidrofobnih komponenata, kao što su hidrofobni polimeri ili lipidi. U nekim otelotvorenjima, međutim, hidrofobni materijali nosači su u celini hidrofobni i sadrže hidrofobne komponente, kao što su hidrofobni polimeri ili lipidi, u kombinaciji sa nehidrofobnim komponentama.

[0050] „Početno sterilni filtrat“ odnosi se na sastav sintetičkih nano nosača koji prethodno nisu filtrirani, ali se mogu filtrirati kroz filter, kao što je filter od 0,22 µm, sa protokom od najmanje 50 grama nano nosača/m<2>površine membrane filtera. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, protok se određuje uzimanjem 9 ml zapremine sintetičke suspenzije nano nosača i stavljanjem u špric od 10 mL sa bilo kojim od filtera kako je ovde dato. Sintetička suspenzija nano nosača se zatim progura kroz filter sve dok dalje ne prolaze materijali suspenzije kroz filter. Propusnost se zatim može izračunati na osnovu materijala koji je proguran kroz filter i preostalog materijala suspenzije u špricu. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, prvobitno sterilni sastav koji se filtrira je nesterilisan i/ili nije pogodan za in vivo davanje (tj., nije u suštini čista i sadrži rastvorljive komponente koje su manje nego poželjne za primenu in vivo). U drugim

1

otelotvorenjima bilo kojeg ovde navedenih sastava ili postupka, prvobitno sterilni sastav koji se filtrira sadrži sintetičke nano nosače koji su proizvedeni, ali nisu dalje obrađeni da bi se dobio materijal kliničke ocene. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, prvobitno sterilni filtrirajući sastav prethodno nije filtriran, ali se može filtrirati kroz filter, kao što je filter od 0,22 µm, sa protokom od najmanje 60, 70, 80 , 90, 100, 120, 130, 140, 160, 200, 250, 300, 350, 500, 750, 1000 ili 1500 grama nano nosača/m<2>površine membrane filtera. Filter od 0,22 µm može biti bilo koji filter sa veličinom pora od 0,22 µm. Takvi filteri mogu biti izrađeni od raznih materijala, kao što su polietilen sulfon, poliviniliden fluorid, mešani estri celuloze, acetat bez rastvarača, regenerisana celuloza, najlon itd. Specifični primeri filtera uključuju Millipore SLGPM33R, Millipore SLGVM33RS, Millipore SLGSM33SS, Sartorius 16534, Sartorius 17764, Sartorius 17845 itd.

[0051] „Maksimalna dimenzija sintetičkog nano nosača“ označava najveću dimenziju nano nosača izmerenu duž bilo koje ose sintetičkog nano nosača. „Minimalna dimenzija sintetičkog nano nosača“ označava najmanju dimenziju sintetičkog nano nosača izmerenu duž bilo koje ose sintetičkog nano nosača. Na primer, za sferoidni sintetički nano nosač, maksimalna i minimalna dimenzija sintetičkog nano nosača bile bi u osnovi identične i bile bi veličine njegovog prečnika. Slično tome, za kubični sintetički nano nosač minimalna dimenzija sintetičkog nano nosača bila bi najmanja od njegove visine, širine ili dužine, dok bi maksimalna dimenzija sintetičkog nano nosača bila najveća od njegove visine, širine ili dužine. U jednom otelotvorenju, minimalna dimenzija od najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% sintetičkih nano nosača u uzorku, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača u uzorku, jednaka je ili veće od 100 nm. U jednom otelotvorenju, maksimalna dimenzija od najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% sintetičkih nano nosača u uzorku, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača u uzorku, jednaka je ili manja od 5 µm. Poželjno je da minimalna dimenzija od najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 90% sintetičkih nano nosača u uzorku, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača u uzorku, bude veća od 110 nm, poželjnije veće od 120 nm, poželjnije veće od 130 nm, a još poželjnije veće od 150 nm. Odnosi aspekata maksimalne i minimalne dimenzije sintetičkih nano nosača mogu se razlikovati u zavisnosti od otelotvorenja. Na primer, proporcije maksimalnih i minimalnih dimenzija sintetičkih nano nosača mogu varirati od 1:1 do 1.000.000:1, poželjno od 1:1 do 100.000:1, još poželjnije od 1:1 do 10.000:1, još poželjnije od 1:1 do 1000:1, još poželjnije od 1:1 do 100:1, a još poželjnije od 1:1 do 10:1.

[0052] Poželjno je da maksimalna dimenzija od najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% sintetičkih nano nosača u uzorku, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača u uzorku, bude jednaka ili manja od 3 µm, poželjnije jednak ili manji od 2 µm, poželjnije jednak ili manji od 1 µm, poželjnije jednak ili manji od 800 nm, poželjnije jednak ili manji od 600 nm, a još poželjnije i dalje jednak ili manji od 500 nm. U poželjnim otelotvorenjima, minimalna dimenzija od najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% sintetičkih nano nosača u uzorku, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača u uzorku, jednaka je ili veće od 100 nm, poželjnije jednako ili veće od 120 nm, poželjnije jednako ili veće od 130 nm, poželjnije jednako ili veće od 140 nm, a još poželjnije da je jednako ili veće od 150 nm. Merenje dimenzija sintetičkih nano nosača (npr. efektivnog prečnika) može se dobiti, u nekim otelotvorenjima, suspendovanjem sintetičkih nano nosača u tečnom (obično vodenom) medijumu i korišćenjem dinamičkog rasejanja svetlosti (DLS) (na primer, upotrebom Brookhaven ZetaPALS instrumenta). Na primer, suspenzija sintetičkih nano nosača može se razblažiti iz vodenog pufera u prečišćenoj vodi da bi se postigla konačna koncentracija suspenzije sintetičkih nano nosača od približno 0,01 do 0,5 mg/mL. Razblažena suspenzija se može pripremiti direktno unutar ili preneti u odgovarajuću kivetu za DLS analizu. Kiveta se tada može staviti u DLS, pustiti da se izjednači na kontrolisanu temperaturu, a zatim skenirati dovoljno vremena da se postigne stabilna i ponovljiva raspodela na osnovu odgovarajućih ulaza za viskoznost medijuma i indikatore refrakcije uzorka. Tada se navodi efektivni prečnik ili srednja vrednost raspodele. Određivanje efektivnih veličina visokog proporcija ili nesferoidnih sintetičkih nano nosača može zahtevati augumentativne tehnike, poput elektronske mikroskopije, da bi se dobila tačnija merenja. „Dimenzija“ ili „veličina“ ili „prečnik“ sintetičkih nano nosača znači srednju vrednost raspodele veličine čestica, na primer, dobijenu korišćenjem dinamičkog rasejanja svetlosti.

[0053] "Nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10", ili "surfaktant sa niskim HLB", kako se ovde koristi, odnosi se na nejonski amfifilni molekul koji ima strukturu koja sadrži najmanje jedan hidrofobni rep i hidrofilnu glavu ili koji ima hidrofobne grupe ili regione i hidrofilne grupe ili regione. Repni deo površinski aktivnih supstanci uglavnom se sastoji iz ugljovodoničnog lanca. Surfaktanti se mogu klasifikovati na osnovu karakteristika punjenja dela ili grupa ili regiona hidrofilne glave. Kako se ovde koristi, "HLB" se odnosi na

1

hidrofilno-lipofilnu ravnotežu ili hidrofilno-lipofilnu ravnotežu surfaktanta i predstavlja meru hidrofilne ili lipofilne prirode surfaktanta.

[0054] HLB bilo kog ovde navedenog surfaktanta može se izračunati pomoću Grifinovog postupka ili Daviejevog postupka. Na primer, koristeći Grifinov postupak, HLB surfaktanta je proizvod 20 pomnožen sa molekulskom masom hidrofilnog dela surfaktanta podeljenom sa molekulskom masom celokupnog surfaktanta. Vrednost HLB je na skali od 0 do 20, pri čemu 0 odgovara potpuno hidrofobnom (lipofilnom) molekulu, a 20 odgovara potpuno hidrofilnom (lipofobnom) molekulu. U nekim otelotvorenjima, HLB surfaktanta bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 (npr., kako je određeno Grifonovim ili Daviejevim postupkom). Primeri takvih surfaktanta za upotrebu u bilo kom od ovde pripremljenih sastava i postupaka uključuju, bez ograničenja, estere sorbitana, kao što su SPAN 40, SPAN 20; masne alkohole, kao što je oleil alkohol, stearil alkohol; estre masnih kiselina, kao što su izopropil palmitat, glicerol monostearat; etoksilirane masne alkohole, kao što su BRIJ 52, BRIJ 93; poloksamere, kao što su Pluronic P-123, Pluronic L-31; masne kiseline, poput palmitinske kiseline, dodekanske kiseline; trigliceride, poput gliceril tripalmitata, gliceril trilinoleata; holesterol; derivate holesterola, kao što su natrijum holesteril sulfat, holesteril dodekanoat; i žučne soli ili kiseline, kao što su litoholna kiselina, natrijum litoholat. Dalji primeri takvih surfaktanta uključuju sorbitan monostearat (SPAN 60), sorbitan tristearat (SPAN 65), sorbitan monooleat (SPAN 80), sorbitan seskuioleat (SPAN 83), sorbitan trioleat (SPAN 85), sorbitan seskuioleat (Arlacel 83), sorbitan, mono i digliceridi masnih kiselina, polioksietilen sorbitan trioleat (Tween 85), polioksietilen sorbitan heksaoleat (G 1086), sorbitan monoizostearat (Montan 70), polioksietilen alkoholi, polioksietilen glikol alkil eteri, polioksietilen (2) oletiletil eter (2) oleietil eter polioksietilen cetil etar (BRIJ 52), polietilen glikol dodecil etar (BRIJ L4); 1-monotetradekanoil-rac-glicerol; gliceril monostearat; glicerol monopalmitat; etilendiamin tetradkis tetrol (Tetronic 90R4, Tetronic 701), polioksietilen (5) nonilfenileter (IGEPAL CA-520), surfaktant MERPOL A, surfaktant MERPOL SE i poli (etilen glikol) sorbitol heksaoleat. Dalji primeri takođe bi bili očigledni stručnjaku iz ove oblasti.

[0055] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" ili "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava farmakološki neaktivan materijal koji se koristi zajedno sa farmakološki aktivnim materijalom za formulisanje sastava. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi sadrže razne materijale poznate u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na saharide (kao što su glukoza, laktoza i slično),

1

konzervanse kao što su antimikrobna sredstva, pomoćna sredstva za rekonstituciju, bojila, fiziološki rastvor (kao što je fiziološki rastvor puferisan fosfatom) i baferi.

[0056] „Pružanje“ označava radnju ili skup radnji koje pojedinac izvodi, a koje isporučuju potreban predmet ili skup predmeta ili postupaka za praktikovanje predmetnog pronalaska. Radnja ili skup radnji mogu se preduzeti bilo direktno ili indirektno.

[0057] "Rapalog" se odnosi na rapamicin i molekule koji su strukturno povezani sa (analogom) rapamicina (sirolimus), a poželjno su hidrofobni. Primeri rapaloga uključuju, bez ograničenja, temsirolimus (CCI-779), deforolimus, everolimus (RAD001), ridaforolimus (AP-23573), zotarolimus (ABT-578). Dodatni primeri rapaloga mogu se naći, na primer, u objavi WO 1998/002441 i U.S. Patent No.8,455,510, obelodanjivanja takvih rapaloga ovde su u celosti uključena kao referenca.

[0058] "Rastvarač" se odnosi na supstancu koja može da rastvori rastvorenu supstancu, poput bilo koje jedne ili više komponenata sintetičkih nano nosača kako je ovde dato. U nekim otelotvorenjima, rastvarači su oni koji su korisni u stvaranju sintetičkih nano nosača, kao što je postupak emulzije (npr., postupak dvostruke emulzije). Primeri takvih rastvarača uključuju dihlorometan, etil acetat, hloroform i propilen karbonat. Primeri takođe uključuju smeše rastvarača koje su kombinacija organskog rastvarača niske rastvorljivosti u vodi i rastvarača koji se meša sa vodom, kao što su aceton, etanol, dimetilsulfoksid, dimetilformamid, formamid itd. Dalji primeri biće poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0059] „Predmet“ znači životinje, uključujući toplokrvne sisare, kao što su ljudi i primati; avijani; domaće kućne ili poljoprivredne životinje kao što su mačke, psi, ovce, koze, goveda, konji i svinje; laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi i zamorci; riba; reptili; divlje životinje i životinje iz zoološkog vrta; i slično.

[0060] "Surfaktant" se odnosi na jedinjenje koje može smanjiti površinski napon između dve tečnosti ili između tečnosti i čvrste supstance. Površinski aktivne materije mogu delovati kao deterdženti, sredstva za vlaženje, emulgatori, sredstva za penjenje i disperzanti i mogu se koristiti u stvaranju sintetičkih nano nosača kao što je ovde dato. U nekim otelotvorenjima, surfaktanti su nejonski surfaktanti sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10.

1

[0061] „Sintetički nano nosač(i)“ označavaju diskretni objekat koji se ne nalazi u prirodi i koji poseduje najmanje jednu dimenziju koja je manja ili jednaka 5 mikrona. Kao što je ovde dato, sintetički nano nosači sadrže hidrofobni materijal nosača. Shodno tome, sintetički nano nosač može biti, ali nije ograničen na, sintetički nano nosače koji sadrže hidrofobne polimerne nanočestice, kao i nanočestice na bazi lipida. Sintetički nano nosači mogu biti različitih oblika, uključujući, ali bez ograničenja, sferoidne, kockaste, piramidalne, duguljaste, cilindrične, toroidne i slično. Sintetički nano nosači prema pronalasku sadrže jednu ili više površina. U otelotvorenjima, sintetički nano nosači mogu imati odnos širine i visine veće od 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 ili veće od 1:10.

[0062] Sintetički nano nosači prema pronalasku koji imaju minimalnu dimenziju jednaku ili manju od oko 100 nm, poželjno jednaku ili manju od 100 nm, ne sadrže površinu sa hidroksilnim grupama koje aktiviraju komplement ili alternativno sadrže površinu koja se u osnovi sastoji iz ostaci koji nisu hidroksilne grupe koje aktiviraju komplement. U poželjnom otelotvorenju, sintetički nano nosači prema pronalasku koji imaju minimalnu dimenziju jednaku ili manju od oko 100 nm, poželjno jednaku ili manju od 100 nm, ne sadrže površinu koja u suštini aktivira komplement ili alternativno sadrže površinu koja sastoji se u osnovi iz delova koji u suštini ne aktiviraju komplement. U još poželjnijem otelotvorenju, sintetički nano nosači prema pronalasku koji imaju minimalnu dimenziju jednaku ili manju od oko 100 nm, poželjno jednaku ili manju od 100 nm, ne sadrže površinu koja u suštini aktivira komplement ili alternativno sadrže površinu koja sastoji se u osnovi iz delova koji u suštini ne aktiviraju komplement.

[0063] „Ukupna čvrsta supstanca“ odnosi se na ukupnu težinu svih komponenti sadržanih u sastavu ili suspenziji sintetičkih nano nosača. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina ukupnih čvrstih supstanci određuje se kao ukupna masa suvog nano nosača po mL suspenzije. To se može utvrditi gravimetrijskim postupkom.

[0064] „% po masi“ odnosi se na odnos jedne mase prema drugoj masi puta 100. Na primer, % po masi može biti odnos težine jedne komponente prema drugoj puta 100 ili odnos mase jedne komponente prema ukupnoj masi većoj od jedne komponente puta 100. Generalno, % po masi se meri kao prosek u populaciji sintetičkih nano nosača ili prosek između sintetičkih nano nosača u sastavu ili suspenziji.

1

C. SASTAVI I SRODNI POSTUPCI

[0065] Ovde su dati sintetički sastavi nano nosača sa poboljšanom početnom sterilnom filtrabilnošću i, u nekim otelotvorenjima, poboljšanim opterećenjem rapaloga i, samim tim, efikasnošću kada se daju ispitaniku. Takvi sintetički nano nosači sadrže hidrofobni materijal nosača, kao i rapalog, koji je poželjno hidrofoban. Iznenađujuće je utvrđeno da su određena klasa površinski aktivnih supstanci, nejonskih površinski aktivnih supstanci čija je vrednost hidrofilno-lipofilnog bilansa (HLB) manja ili jednaka 10, mogla da omogući poboljšanu početnu sterilnu filtrabilnost i, u nekim otelotvorenjima, efikasniju opterećenja rapaloga u sintetičkim nano nosačima. Kao što je prikazano u Primerima, utvrđeno je da je povećana propusnost sastava sintetičkih nano nosača, kada su inicijalno propušteni kroz filter od 0,22 µm, otkrivena kada su surfaktanti, poput SPAN 40, ugrađeni u sintetičke sastave nano nosača. Kao što je takođe prikazano u Primerima, broj takvih sintetičkih nano nosača formulisanih sa nejonskim surfaktantom sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom 10 takođe je mogao da obezbedi trajnu antigen-specifičnu toleranciju kod ispitanika.

[0066] Takođe su otkrivene optimizovane količine nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima a kako je ovde dato. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,01, ali ≤ 20 % mase nejonskog surfaktanta sa HLB vrednost manja ili jednaka 10/hidrofobnog materijala nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,1 ali ≤ 15, ≥ 0,5, ali ≤ 13, ≥ 1 ali ≤ 9 ili 10 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,01, ali ≤ 17, ≥ 0,01 ali ≤ 15, ≥ 0,01 ali ≤ 13, ≥ 0,01 ali ≤ 12, ≥ 0,01 ali ≤ 11, ≥ 0,01, ali ≤ 10, ≥ 0,01, ali ≤ 9, ≥ 0,01, ali ≤ 8, ≥ 0,01, ali ≤ 7, ≥ 0,01, ali ≤ 6, ≥ 0,01, ali ≤ 5, itd. % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,1, ali ≤ 15, ≥ 0,1 ali ≤ 14, ≥ 0,1 ali ≤ 13, ≥ 0,1 ali ≤ 12, > 0,1 ali ≤ 11, ≥ 0,1, ali ≤ 10, ≥ 0,1, ali ≤ 9, ≥ 0,1, ali ≤ 8, ≥ 0,1, ali ≤ 7, ≥ 0,1, ali ≤ 6, ≥ 0,1,

1

ali ≤ 5, itd. % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U dodatnim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,5, ali ≤ 15, ≥ 0,5 ali ≤ 14, ≥ 0,5 ali ≤ 13, ≥ 0,5 ali ≤ 12, > 0,5 ali ≤ 11, ≥ 0,5, ali ≤ 10, ≥ 0,5, ali ≤ 9, ≥ 0,5, ali ≤ 8, ≥ 0,5, ali ≤ 7, ≥ 0,5, ali ≤ 6, ≥ 0,5, ali ≤ 5, itd. % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 1 ali ≤ 9, ≥ 1 ali ≤ 8, ≥ 1 ali ≤ 7, ≥ 1 ali ≤ 6, ≥ 1 ali ≤ 5 itd. % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U dodatnim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 5, ali ≤ 15, ≥ 5 ali ≤ 14, ≥ 5 ali ≤ 13, ≥ 5 ali ≤ 12, > 5 ali ≤ 11, ≥ 5, ali ≤ 10, ≥ 5, ali ≤ 9, ≥ 5, ali ≤ 8, ≥ 5, ali ≤ 7, ≥ 5, ali ≤ 6, itd. % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. U jednom otelotvorenju bilo kojeg od ovde navedenih kompozicija ili postupaka, količina nejonskog surfaktanta sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/hidrofobnog materijala nosača. Bilo koja od ovde navedenih vrednosti HLB može se odrediti pomoću Grifinovog ili Daviejevog postupka.

[0067] Takođe su utvrđene optimizovane količine hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkim sastavima nano nosača. Poželjno je da u nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka količina hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkom sastavu nano nosača iznosi 5-95 % po masi hidrofobnog nosećeg materijala/ukupne čvrste supstance. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina hidrofobnog nosača u sintetičkim nano nosačima je 10-95, 15-90, 20-90, 25-90, 30-80, 30-70, 30 -60, 30-50, itd. % po masi hidrofobnog nosača/ukupne čvrste materije. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, količina hidrofobnih nosećih materijala u sintetičkim nano nosačima je 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95 % po masi hidrofobnog nosača/ukupne čvrste materije.

2

[0068] Dalje, količina rapaloga, kao što je rapamicin, u sintetičkim nano nosačima takođe može biti optimizovana. Poželjno, takve količine mogu rezultirati efikasnim rezultatima (npr., trajna tolerancija specifična za antigen) kada se sintetički nano nosači daju ispitaniku. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički nano nosači sadrže ≥ 6, ali ≤ 50 % po masi rapalog/hidrofobnog nosača. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički nano nosači sadrže ≥ 6, ali ≤ 45, ≥ 6, ali ≤ 40, ≥ 6, ali ≤ 35, ≥ 6, ali ≤ 30, ≥ 6, ali ≤ 25, ≥ 6 ali ≤ 20, ≥ 6 ali ≤ 15 % po masi rapaloga/hidrofobnog nosača. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički nano nosači sadrže ≥ 7, ali ≤ 45, ≥ 7, ali ≤ 40, ≥ 7, ali ≤ 35, ≥ 7, ali ≤ 30, ≥ 7, ali ≤ 25, ≥ 7 ali ≤ 20, ≥ 7 ali ≤ 15 % po masi rapaloga/hidrofobnog nosača. U drugim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički nano nosači sadrže ≥ 8, ali ≤ 24 % po masi rapalog/hidrofobnog nosača. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde navedenih sastava ili postupaka, sintetički nano nosači sadrže 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 35, 45 ili više % po masi rapalog/hidrofobni materijal nosača.

[0069] Količine komponenata ili materijala kako su ovde navedene za bilo koji od ovde obezbeđenih sastava ili postupaka mogu se odrediti korišćenjem postupaka koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti ili su na drugi način ovde obezbeđeni. Na primer, količine nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 mogu se meriti ekstrakcijom praćenom kvantifikacijom HPLC postupkom. Količine hidrofobnog nosećeg materijala mogu se odrediti pomoću HPLC. Određivanje takve količine može, u nekim realizacijama, da sledi upotrebu protonskog NMR ili drugih ortogonalnih metoda, kao što je MALDI-MS, itd. da bi se utvrdio identitet hidrofobnog nosača. Slične metode se mogu koristiti za određivanje količina rapaloga u bilo kojoj od ovde pruženih sastava. U nekim otelotvorenjima, količina rapaloga određuje se pomoću HPLC. Dalji primeri postupaka za određivanje količina komponenata ili materijala dati su ovde negde drugde, kao u Primerima. Za bilo koji od ovde obezbeđenih sastava ili postupaka, količine komponenata ili materijala takođe se mogu odrediti na osnovu masa recepta formulacije nano nosača. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde obezbeđenih sastava ili postupaka, količine bilo koje od ovde obezbeđenih komponenti su one komponenata u vodenoj fazi tokom formulacije sintetičkih nano nosača. U nekim otelotvorenjima bilo kojeg od ovde pripremljenih sastava ili postupaka, količine bilo koje od komponenti su one u komponentama u sintetičkom sastavu nano nosača koji je proizveden i rezultat postupka formulacije.

[0070] Sintetički nano nosači kako su ovde dati sadrže hidrofobne noseće materijale, kao što su hidrofobni polimeri ili lipidi. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni sintetički nano nosači sadrže jedan ili više lipida. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosač može sadržati lipidni dvosloj. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosač može sadržati lipidni monosloj. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosač može sadržati jezgro koje sadrži polimernu matricu okruženu lipidnim slojem (npr., lipidni dvosloj, lipidni monosloj itd.). Dalji hidrofobni nosači uključuju lipide (sintetičke i prirodne), lipidnopolimerne konjugate, lipidno-proteinske konjugate i umrežena ulja, voskove, masti itd. Dalji primeri lipidnih materijala za upotrebu kao hidrofobni nosači, kao što je ovde dato, mogu se naći, na primer, u objavi PCT br.. WO2000/006120 i WO2013/056132, obelodanjivanja takvih materijala ovde su u celosti uključena putem reference.

[0071] Shodno tome, u nekim otelotvorenjima ovde obezbeđeni sintetički nano nosači mogu biti lipozomi. Lipozomi se mogu proizvesti standardnim postupcima kao što su oni o kojima izveštava Kim i dr. (1983, Biochim. Biophys. Acta 728, 339-348); Liu i dr. (1992, Biochim. Biophys. Acta 1104, 95-101); Lee i dr. (1992, Biochim. Biophys. Acta.1103, 185-197), Brey i dr. (U.S. Pat. prijava. obj.20020041861), Hass i dr. (U.S. Pat. prijava. obj.20050232984), Kisak i dr. (U.S. Pat. prijava. obj.20050260260) i Smyth-Templeton i dr. (U.S. Pat. prijava. obj. 20060204566), obelodanjivanje takvih lipozoma i postupci za njihovu proizvodnju ovde su uključeni u celosti referencom.

[0072] Hidrofobni materijal nosača kako je ovde dat sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera ili njihovih jedinica. Međutim, u nekim otelotvorenjima, dok je hidrofobni materijal nosača hidrofoban u celini, hidrofobni materijal nosač takođe može sadržati polimere ili njihove jedinice koje nisu hidrofobne.

[0073] Shodno tome, hidrofobni materijal nosača kako je ovde dat može sadržavati poliestere, kao što su hidrofobni poliesteri. Poliesteri uključuju kopolimere koji sadrže jedinice mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su poli(mlečna kiselina-ko-glikolna kiselina) i poli(laktidko-glikolid), ovde zajednički nazvani "PLGA"; i homopolimeri koji sadrže jedinice glikolne kiseline, ovde se nazivaju "PGA", i jedinice mlečne kiseline, kao što su poli-L-mlečna kiselina, poli-D-mlečna kiselina, poli-D, L-mlečna kiselina, poli-L-laktid , poli-D-laktid i poli-D, L-laktid, ovde zajednički nazvani "PLA". U nekim otelotvorenjima, primerni poliesteri uključuju, na primer, polihidroksi kiseline; PEG kopolimeri i kopolimeri laktida i glikolida (npr., PLA-PEG kopolimeri, PGA-PEG kopolimeri, PLGA-PEG kopolimeri i njihovi derivati. U nekim otelotvorenjima, poliesteri uključuju, na primer, poli(kaprolakton), poli(kaprolakton) -PEG kopolimeri, poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(serinski estar), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), poli[a-(4-aminobutil)-L-glikolna kiselina] i njihovi derivati.

[0074] U nekim otelotvorenjima, polimer hidrofobnog nosećeg materijala može biti PLGA. PLGA je biokompatibilan i biorazgradiv ko-polimer mlečne kiseline i glikolne kiseline, a različiti oblici PLGA karakterišu odnos mlečne kiseline i glikolne kiseline. Mlečna kiselina može biti L-mlečna kiselina, D-mlečna kiselina ili D, L-mlečna kiselina. Stopa razgradnje PLGA može se prilagoditi promenom odnosa mlečne kiseline i glikolne kiseline. U nekim otelotvorenjima, PLGA koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom karakteriše odnos mlečne kiseline i glikolne kiseline približno 85:15, približno 75:25, približno 60:40, približno 50:50, približno 40:60, približno 25:75 ili približno 15:85.

[0075] Hidrofobni nosači, kako su ovde dati, mogu sadržati jedan ili više polimera koji su nemetoksi-završeni pluronski polimer ili njihova jedinica. „Nemetoksi-završeni polimer“ označava polimer koji ima najmanje jedan kraj koji se završava delom koji nije metoksi. U nekim otelotvorenjima, polimer ima najmanje dva kraja koja se završavaju sa ostatkom koji nije metoksi. U drugim otelotvorenjima, polimer nema završetke koji se završavaju metoksi. "Nemetoksi-završeni, pluronski polimer" označava polimer koji nije linearni pluronski polimer sa metoksi na oba kraja.

[0076] Hidrofobni nosači mogu sadržati, u nekim otelotvorenjima, polihidroksialkanoate, poliamide, polietere, poliolefina, poliakrilate, polikarbonate, polistiren, silikone, fluoropolimeri ili njihovu jedinicu. Dalji primeri polimera koji mogu biti sadržani u ovde obezbeđenim hidrofobnim nosećim materijalima uključuju polikarbonat, poliamid ili polieter, ili njihovu jedinicu. U drugim otelotvorenjima, polimeri hidrofobnog nosača mogu sadržati poli(etilen glikol) (PEG), polipropilen glikol ili njihovu jedinicu.

[0077] U nekim otelotvorenjima, poželjno je da hidrofobni materijal nosača sadrži polimer koji je biorazgradiv. Prema tome, u takvim otelotvorenjima, polimeri hidrofobnih nosećih materijala mogu obuhvatati polieter, kao što je poli(etilen glikol) ili polipropilen glikol ili njegova jedinica. Pored toga, polimer može sadržati blok-polimer polietera i biorazgradivi polimer tako da je polimer biorazgradiv. U drugim otelotvorenjima, polimer ne sadrži samo

2

polieter ili njegovu jedinicu, kao što je poli(etilen glikol) ili polipropilen glikol ili njihova jedinica.

[0078] Ostali primeri polimera pogodnih za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen, polikarbonate (npr. poli(1,3-dioksan-2on)), polianhidride (npr. poli(sebački anhidrid)), polipropilfumerate, poliamide (npr. polikaprolaktam), poliacetali, polieteri, poliesteri (npr. polilaktid, poliglikolid, polilaktid-ko-glikolid, polikaprolakton, polihidroksikiselina (npr. poli(β-hidroksialkanoat))), poli(ortoestri), policijanoakrilati, polivinil-alkoholni alkoholi, polivinil-alkoholni alkoholi, polivinil-alkoholni alkoholi, polimetakrilati, poliurea, polistireni i poliamini, polilizin, polisin-PEG kopolimeri i poli(etilenimin), poli(etilen imin)-PEG kopolimeri.

[0079] Još drugi primeri polimera koji mogu biti uključeni u hidrofobni materijal nosača uključuju akrilne polimere, na primer kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, kopolimeri metil metakrilata, etoksietil metakrilati, cijanoetil metakrilat, kopolimeri aminoalkil metakrilata, poli(akrilna kiselina), poli(metakrilna kiselina), kopolimer alkilamidne kiseline metakrilne kiseline, poli(metil metakrilat), poli(anhidrid metakrilne kiseline), metil metakrilat, polimetakrilat, poli(metil metakrilat) kopolimer, poliakrilamid, aminoalkil metakrilat kopolimeri glicidil metakrilatni kopolimeri, policijanoakrilati i kombinacije koje sadrže jedan ili više prethodno navedenih polimera.

[0080] U nekim otelotvorenjima, polimeri hidrofobnog nosača mogu se povezati da bi formirali polimernu matricu. Široka paleta polimera i postupaka za njihovo formiranje polimernih matrica su poznati konvencionalno. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosač koji sadrži hidrofobnu polimernu matricu stvara hidrofobno okruženje unutar sintetičkog nano nosača.

[0081] U nekim otelotvorenjima, polimeri se mogu modifikovati sa jednim ili više delova i/ili funkcionalnih grupa. Različite grupe ili funkcionalne grupe mogu se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom. U nekim otelotvorenjima, polimeri se mogu modifikovati polietilen glikolom (PEG), ugljenim hidratom i/ili acikličnim poliacetalima izvedenim iz polisaharida (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Određena otelotvorenja mogu se napraviti koristeći opšte tehnike iz patenta SAD br.5543158 do Gref i dr., ili WO objave WO2009/051837 od Von Andrian i dr.

[0082] U nekim otelotvorenjima, polimeri se mogu modifikovati lipidnom ili masnom kiselinskom grupom. U nekim otelotvorenjima, grupa masnih kiselina može biti jedna ili više od maslačne, kaproične, kaprilne, kaprinske, laurinske, miristinske, palmitinske, stearinske, arahidne, behenske ili lignocerične kiseline. U nekim otelotvorenjima, grupa masnih kiselina može biti jedna ili više palmitoleinske, oleinske, vakcenske, linolne, alfa-linolne, gamalinolne, arahidonske, gadoleinske, arahidonske, eikosapentaenske, dokosaheksaenske ili erukinske kiseline.

[0083] U nekim otelotvorenjima, poželjno je da je polimer biorazgradiv. U nekim otelotvorenjima, polimeri u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju polimere koji su odobreni za upotrebu kod ljudi od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) pod 21 C.F.R. § 177.2600.

[0084] Polimeri mogu biti prirodni ili neprirodni (sintetički) polimeri. Polimeri mogu biti homopolimeri ili kopolimeri koji sadrže dva ili više monomera. U pogledu sekvence, kopolimeri mogu biti nasumični, blokirati ili sadržati kombinaciju slučajnih i blok sekvenci. Tipično, polimeri u skladu sa predmetnim pronalaskom su organski polimeri.

[0085] U nekim otelotvorenjima, polimeri mogu biti linearni ili razgranati polimeri. U nekim otelotvorenjima, polimeri mogu biti dendrimeri. U nekim otelotvorenjima, polimeri mogu u osnovi biti međusobno umreženi. U nekim otelotvorenjima, polimeri mogu u osnovi biti bez poprečnih veza. U nekim otelotvorenjima, polimeri se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom bez prolaska kroz korak umrežavanja. Dalje se razume da sintetički nano nosači mogu sadržati blok-kopolimere, kalemljene kopolimere, mešavine, smeše i/ili adukte bilo kog od prethodnih i drugih polimera. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće da ovde navedeni polimeri predstavljaju primernu, a ne sveobuhvatnu listu polimera koji mogu biti korisni u skladu sa predmetnim pronalaskom pod uslovom da ispunjavaju željene kriterijume.

[0086] Osobine ovih i drugih polimera i postupci za njihovu pripremu dobro su poznati u tehnici (videti, na primer, patente SAD 6,123,727; 5,804,178; 5,770,417; 5,736,372;

5,716,404; 6,095,148; 5,837,752; 5,902,599; 5,696,175; 5,514,378; 5,512,600; 5,399,665; 5,019,379; 5,010,167; 4,806,621; 4,638,045; i 4,946,929; Wang i dr., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim i dr., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem.

2

Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; i Uhrich i dr., 1999, Chem. Rev., 99:3181). Uopštenije, niz postupaka za sintezu određenih pogodnih polimera je opisano u Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock i dr., Prentice-Hall, 1981; Deming i dr., 1997, Nature, 390:386; i u patentima SAD 6,506,577, 6,632,922, 6,686,446, i 6,818,732.

[0087] Široka paleta sintetičkih nano nosača može se koristiti prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosači su sfere ili sferoidi. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosači su ravni ili u obliku ploče. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosači su kocke ili kubici. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosači su ovali ili elipse. U nekim otelotvorenjima, sintetički nano nosači su cilindri, konusi ili piramide.

[0088] U nekim otelotvorenjima, poželjno je koristiti populaciju sintetičkih nano nosača koja je relativno jednolična u pogledu veličine ili oblika tako da svaki sintetički nano nosač ima slična svojstva. Na primer, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% sintetičkih nano nosača, na osnovu ukupnog broja sintetičkih nano nosača, može imati minimalnu dimenziju ili maksimalnu dimenziju koja spada u 5%, 10%, ili 20% prosečnog prečnika ili prosečne dimenzije sintetičkih nano nosača.

[0089] Sastavi prema pronalasku mogu da sadrže elemente u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, poput konzervansa, pufera, fiziološkog rastvora ili fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom. Sastavi se mogu napraviti koristeći konvencionalne tehnike farmaceutske proizvodnje i mešanja kako bi se došlo do korisnih oblika doziranja. U jednom otelotvorenju, smeše, poput onih koje sadrže sintetičke nano nosače, suspendovane su u sterilnom fiziološkom rastvoru za injekcije zajedno sa konzervansom.

[0090] U nekim otelotvorenjima, bilo koja komponenta sintetičkih nano nosača kako je ovde dato može biti izolovana. Izolovan se odnosi na element koji je odvojen od svog izvornog okruženja i prisutan u dovoljnim količinama da omogući njegovu identifikaciju ili upotrebu. To znači, na primer, da se element može prečistiti hromatografijom ili elektroforezom.

Izolovani elementi mogu biti, ali ne moraju biti, u suštini čisti. Budući da se izolovani element može mešati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom u farmaceutskom preparatu, taj

2

element može sadržati samo mali procenat masenog procenta preparata. Element je bez obzira na to izolovan po tome što je odvojen od supstanci sa kojima može biti povezan u živim sistemima, tj., izolovan od drugih lipida ili proteina. Bilo koji od ovde obezbeđenih elemenata može biti izolovan i uključen u sastave ili upotrebljen u postupcima u izolovanom obliku.

D. POSTUPCI IZRADE I KORIŠĆENJE SASTAVA I SRODNIH POSTUPAKA [0091] Sintetički nano nosači mogu se pripremiti primenom širokog spektra postupaka poznatih u tehnici. Na primer, sintetički nano nosači mogu se formirati postupcima kao što su nanotaloženje, fokusiranje protoka koristeći fluidne kanale, raspršivanje sušenjem, isparavanje rastvarača sa jednom i dvostrukom emulzijom, ekstrakcija rastvarača, razdvajanje faza, mlevenje (uključujući automatsko), nadkritična tečnost (kao što je nadkritični ugljendioksid) obrada, postupci mikroemulzije, mikrofabrikacija, nanofabrikacija, žrtveni slojevi, jednostavna i složena koacervacija i drugi postupci dobro poznati onima koji su uobičajeni u tehnici. Alternativno ili dodatno, opisane su vodene i organske sinteze rastvarača za monodisperzne poluprovodničke, provodne, magnetne, organske i druge nanomaterijale (Pellegrino i dr., 2005, Small, 1:48; Murray i dr., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; i Trindade i dr., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Dodatni postupci su opisani u literaturi (videti npr., Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz i dr., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz i dr., 1987, Reactive Polymers, 6:275; i Mathiowitz i dr., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; US Patents 5578325 i 6007845; P. Paolicelli i dr., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).

[0092] Razni materijali mogu se inkapsulirati u sintetičke nano nosače po želji, koristeći različite postupke uključujući, ali ne ograničavajući se na njih C. Astete i dr., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol.17, No.3, pp.

247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); C. Reis i dr., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8- 21 (2006); P. Paolicelli i dr., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Mogu se koristiti i drugi postupci pogodni za kapsuliranje materijala u sintetičke nano nosače, uključujući bez ograničenja

2

postupke obelodanjene u patentu SAD 6,632,671 do Unger objavljen 14. oktobra, 2003.

[0093] U određenim otelotvorenjima, sintetički nano nosači se pripremaju postupkom nanotaloženja ili sušenjem sprejom. Uslovi koji se koriste u pripremi sintetičkih nano nosača mogu se promeniti tako da daju čestice željene veličine ili svojstva (npr., hidrofobnost, hidrofilnost, spoljna morfologija, "lepljivost", oblik itd.). Postupak za pripremu sintetičkih nano nosača i uslovi (npr., rastvarač, temperatura, koncentracija, brzina protoka vazduha itd.) mogu zavisiti od materijala koji se uključuju u sintetičke nano nosače i/ili sastava matrice nosača.

[0094] Ako sintetički nano nosači pripremljeni bilo kojim od iznad navedenih postupaka imaju opseg veličine izvan željenog opsega, takvi sintetički nano nosači mogu da se dimenzionišu, na primer, pomoću sita.

[0095] U otelotvorenjima, sintetički nano nosači mogu se kombinovati sa antigenom ili drugim sastavom mešanjem u istom nosaču ili sistemu za isporuku.

[0096] kalijumove soli fosfata, karbonata, acetata ili citrata) i sredstva za podešavanje pH (npr., hlorovodonična kiselina, natrijum ili kalijum hidroksid, soli citrata ili acetata, aminokiseline i njihove soli) antioksidanti (npr., askorbinska kiselina, alfa-tokoferol), površinski aktivne supstance (npr., polisorbat 20, polisorbat 80, polioksietilen9-10 nonil fenol, natrijum dezoksiholat), rastvor i/ili krio/lio stabilizatori (npr., saharoza, laktoza, manitol, trehaloza), sredstva za osmotsko podešavanje (npr., soli ili šećeri), antibakterijska sredstva (npr., benzoeva kiselina, fenol, gentamicin), sredstva protiv penjenja (npr., polidimetilsilozon), konzervansi (npr., timerosal, 2-fenoksietanol, EDTA), polimerni stabilizatori i sredstva za podešavanje viskoznosti (npr., polivinilpirolidon, poloksamer 488, karboksimetilceluloza) i ko-rastvarači (npr., glicerol, polietilen glikol, etanol).

[0097] Sastavi prema pronalasku mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijense.

Sastavi se mogu napraviti koristeći konvencionalne tehnike farmaceutske proizvodnje i mešanja kako bi se došlo do korisnih oblika doziranja. Tehnike pogodne za upotrebu u praktikovanju predmetnog pronalaska mogu se naći u Handbook of Industrial Mixing:

Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; i Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design,

2

2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. U jednom otelotvorenju, smeše se suspenduju u sterilnom fiziološkom rastvoru za injekcije zajedno sa konzervansom.

[0098] Podrazumeva se da se sastavi prema pronalasku mogu praviti na bilo koji pogodan način, a pronalazak ni na koji način nije ograničen na sastave koji se mogu proizvesti upotrebom ovde opisanih postupaka. Izbor odgovarajućeg načina proizvodnje može zahtevati pažnju na svojstva određenih elemenata koji se povezuju.

[0099] U nekim otelotvorenjima, sastavi se proizvode u sterilnim uslovima ili se inicijalno ili na kraju sterilizuju. Ovo može osigurati da rezultujuće smeše budu sterilne i neinfektivne, što poboljšava sigurnost u poređenju sa nesterilnim sastavima. Ovo pruža dragocenu meru bezbednosti, posebno kada ispitanici koji dobijaju sastave imaju imunološke nedostatke, pate od infekcije i/ili su podložni infekciji. U nekim otelotvorenjima, sastavi se mogu liofilizovati i čuvati u suspenziji ili kao liofilizovani prah u zavisnosti od strategije formulacije tokom dužih perioda bez gubitka aktivnosti.

[0100] Davanje prema predmetnom pronalasku može biti na različite načine, uključujući, ali bez ograničenja, intradermalne, intramuskularne, potkožne, intravenske i intraperitonealne puteve. Sastavi koji su ovde pomenuti mogu se proizvesti i pripremiti za davanje konvencionalnim postupcima.

[0101] Sastavi pronalaska mogu se primenjivati u efikasnim količinama, kao što su ovde opisane efikasne količine. Doze oblika doziranja mogu sadržati različite količine elemenata prema pronalasku. Količina elemenata prisutnih u oblicima doziranja prema pronalasku može se menjati u zavisnosti od njihove prirode, terapijske koristi koju treba postići i drugih takvih parametara. U otelotvorenjima, ispitivanja raspona doza mogu se sprovesti kako bi se uspostavile optimalne terapeutske količine koje će biti prisutne u doznom obliku. U otelotvorenjima, elementi su prisutni u doznom obliku u količini koja je efikasna za generisanje željenog efekta i/ili smanjenog imunološkog odgovora nakon davanja ispitaniku. Može biti moguće odrediti količine za postizanje željenog rezultata koristeći konvencionalna ispitivanja i tehnike raspona doza kod ispitanika. Oblici doziranja pronalaska mogu se primenjivati pri različitim frekvencijama. U jednom otelotvorenju, najmanje jedno davanje ovde obezbeđenih sastava je dovoljno da generiše farmakološki relevantan odgovor.

2

[0102] Drugi aspekt obelodanjivanja odnosi se na komplete. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži bilo koju od ovde datih sastava. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, komplet sadrži rapalog, hidrofobni materijal nosača i nejonski surfaktant sa vrednošću hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manjom ili jednakom 10. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, količine rapaloga, hidrofobnog nosača i nejonskog surfaktanta sa hidrofilno-lipofilnom ravnotežom (HLB) vrednošću manjom ili jednakom 10 nalaze se u bilo kojoj od ovde datih količina za tu komponentu. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, komplet dalje sadrži antigen. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, sastavi ili njihovi elementi mogu biti sadržani u odvojenim kontejnerima ili u istom kontejneru u kompletu. U nekim otelotvorenjima bilo kog od priloženih kompleta, kontejner je bočica ili ampula. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, sastavi ili njihovi elementi nalaze se u rastvoru odvojenom od ambalaže, tako da se sastavi ili elementi mogu dodavati u ambalažu naknadno. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, njihovi sastavi ili elementi su u liofilizovanom obliku, svaki u posebnoj ambalaži ili u istoj ambalaži, tako da se mogu naknadno rekonstituisati. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, komplet dalje sadrži uputstva za rekonstituciju, mešanje, davanje itd. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ponuđenih kompleta, uputstva uključuju opis ovde opisanih postupaka. Uputstva mogu biti u bilo kom pogodnom obliku, npr., u obliku odštampanog umetka ili nalepnice. U nekim otelotvorenjima bilo kog od ovde datih kompleta, komplet dalje sadrži jedan ili više špriceva ili drugih uređaja koji mogu isporučiti sintetičke nano nosače in vivo ispitaniku.

PRIMERI

Primer 1 - Surfaktant sa niskim HLB, SM, povećava opterećenje RAPA i filtriranje sintetičkih nano nosača

[0103] Sintetizovani su sastavi nano nosača koji sadrže polimere PLA (inherentna viskoznost 0,41 dL/g) i PLA-PEG (5 kDa PEG blok, svojstvena viskoznost 0,50 dL/g), kao i hidrofobni lek rapamicin (RAPA), sa ili bez dodavanja nisko HLB surfaktant sorbitan monopalmitate (SM), primenom postupka isparavanja emulzije ulje-u-vodi. Organska faza je nastala rastvaranjem polimera i RAPA u dihlorometanu. Emulzija je nastala homogenizacijom organske faze u vodenoj fazi koja je sadržala surfaktant PVA pomoću sonikatora sonde.

Emulzija je zatim kombinovana sa većom količinom vodenog pufera i mešana da omogući rastvaranje i isparavanje rastvarača. Dobijeni nano nosači su isprani i filtrirani kroz filter od 0,22 µm. Svi sastavi su sadržali 100 mg polimera. Sadržaj RAPA u različitim sastavima bio je različit.

[0104] Za sastave koji ne sadrže surfaktant SM (uzorci 1, 2 i 3), primećeno je nekoliko indikacija ograničavajuće sposobnosti da se u potpunosti ugradi RAPA u sastav nano nosača kako su dodavane sve veće količine RAPA. Rastuća razlika između veličina nano nosača pre i posle filtracije na višim nivoima formulacije RAPA u odsustvu SM ukazivale su na prisustvo većih čestica (pojedinačnih čestica ili agregata) koje su uklonjene tokom procesa pranja i/ili filtracije. Na to ukazuje i smanjena propusnost filtera pre začepljenja. Konačno, dodavanje sve veće količine RAPA sastavima nano nosača bez SM nije rezultiralo povećanim opterećenjem RAPA (na primer, uzorak 1 u poređenju sa uzorkom 3), što ukazuje da se dodatni RAPA mogao odvojiti od većine nano nosača i uklonjen tokom pranja i/ili korake filtracije.

[0105] Suprotno tome, sastavi koji sadrže surfaktant SM lako su ugrađivale povećane količine RAPA. Na veličinu nano nosača nije uticala filtracija, a povećana količina RAPA dodata u sastav rezultirala je povećanim opterećenjem RAPA nano nosača. Izvesno smanjenje protoka filtera primećeno je na najvišem nivou opterećenja (uzorak 6), ali to je možda zbog inherentno veće veličine nano nosača. Ukratko, inkorporacija SM je pomogla da se poveća opterećenje RAPA i sposobnost filtriranja sintetičkih sastava nano nosača.

Primer 2 - SM i holesterol povećali su učitavanje RAPA i mogućnost filtriranja [0106] Sastavi nano nosača proizvedeni su korišćenjem materijala i postupaka opisanih u Primeru 1. Nanonosači koji sadrže polimer i RAPA proizvedeni su sa različitim nivoima opterećenja RAPA. Pored toga, nano nosači visoko opterećeni RAPA takođe su proizvedeni

1

upotrebom pomoćne supstance, surfaktanta SM ili holesterola, u masenom odnosu pomoćne supstance:RAPA od 3,2:1.

[0107] Uzorci nano nosača proizvedeni u odsustvu pomoćnih supstanci (uzorci 7 i 8) pokazali su da povećanje opterećenja RAPA izvan tačke očiglednog zasićenja nano nosača dovodi do smanjenja propusnosti filtera. Dodavanje SM ili holesterola rezultiralo je većim opterećenjem RAPA zadržavajući stabilnost (uzorci 9 i 10).

[0108] Da bi se procenila sposobnost sastava da indukuju imunološku toleranciju, miševima su intravenozno ubrizgavane tri puta nedeljno sa nano nosačem i KLH (hemocijanin limf u ključaonici) sa istom dozom RAPA, a zatim su izazivane nedeljno samo sa KLH. Zatim su serumi miševa analizirani na antitela na KLH nakon svakog izazivanja KLH (Sl.1).

[0109] Dok su svi miševi koji su primali tretman RAPA nano nosačima primili iste doze RAPA, različite grupe pokazuju različit stepen tolerisanja na KLH. Svih 5 miševa koji su primili sastave nano nosača sa najmanjim opterećenjem (uzorak 7) imali su merljive titre anti-KHL antitela nakon trećeg izaziva KLH (40. dan). Ova grupa miševa je razvila smanjene titre antitela na KLH u poređenju sa miševima koji su primili samo PBS, ali su pokazali najmanju toleranciju u poređenju sa ostalim grupama nano nosača. Povećanje opterećenja RAPA nano nosačima u odsustvu pomoćne supstance (SM ili holesterol) (uzorak 8) značajno je poboljšalo tolerisanje, sa samo 2 od 5 miševa koji su pokazali merljive titre nakon 3 izazova sa KLH (na 40. dan). Sastav koji sadrži holesterol kao pomoćnu supstancu (uzorak 10), uprkos velikom opterećenju RAPA nano nosačima, rezultirao je da su četiri od pet miševa pokazala značajne titre anti-KLH antitela nakon samo dva izazova (na dan 33). Sastav nano nosača koji sadrži SM (uzorak 9) pokazao je propusnost filtera visoke propusnosti od 0,22 µm tokom proizvodnje i superiornu tolerizaciju, pri čemu je samo jedan od pet miševa razvio merljivi titar anti-KLH antitela nakon tri izaziva KLH (na 40. dan). Rezultati ovog ispitivanja

2

pokazuju da su obe pomoćne supstance (SM i holesterol) omogućile povećano opterećenje nano nosača u skladu sa performansama koje indukuju toleranciju i pogodnošću obrade, kao što je naznačeno protokom filtracije. Nisko HLB surfaktant SM pruža osobine potrebne za povećanje stabilnosti nano nosača i pokazuje veće performanse.

Primer 3 - Efekti površinski aktivnog sredstva sa niskim HLB na opterećenje i filtrabilnost RAPA

Materijali i postupci

[0110] Kupljen je PLA sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), šifra proizvoda 100 DL 4A. PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), šifra proizvoda 100 DL mPEG 50005CE.

Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), šifra proizvoda SIROLIMUS. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88, USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccoov fiziološki rastvor puferisan fosfatom IX (DPBS) je kupljen od Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland), šifra proizvoda 17-512Q. Sorbitan monopalmitat je kupljen od Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), šifra proizvoda SPAN 40. Polisorbat 80 je kupljen od NOF America Corporation (One North Broadway, Suite 912 White Plains, NY 10601), šifra proizvoda Polisorbat 80 (HX2). Sorbitan monolaurat (SPAN 20) je kupljen od Alfa Aesar (26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835), šifra proizvoda L12099. Sorbitan stearat (SPAN 60) je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda S7010. Sorbitan monooleat (SPAN 80) je kupljen od Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (9211 North Harborgate Street Portland, OR 97203), šifra proizvoda S0060. Oktil β-D-glukopiranozid je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 08001. Oleil alkohol je kupljen od Alfa Aesar (26 Parkridge Rd Ward Hill, MA 01835), šifra proizvoda A18018. Izopropil palmitat je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda W515604.

Polietilen glikol heksadecil eter (BRIJ 52) je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 388831. Polietilen glikol oleil etar (BRIJ 93) je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 388866. Poli(etilen glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilen glikol) (Pluronic L-31) je kupljen od SigmaAldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 435406. Poli(etilen glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilen glikol) (Pluronic P-123) je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 435465. Palmitinska kiselina je kupljena od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda P0500. DL-α-palmitin je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda M1640. Gliceril Tripalmitat je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda T5888.

[0111] Za Uzorak 11, rastvori su pripremljeni kao što sledi:

Rastvor 1: Smeša polimera i rapamicina je pripremljena rastvaranjem PLA u 75 mg/mL, PLA-PEG-Ome u 25 mg/mL i rapamicina u 16 mg/mL u dihlormetanu. Rastvor 2: Smeša Polisorbata80 je pripremljena rastvaranjem Polisorbata80 u 80 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 3: Polivinil alkohol je pripremljen pri 50 mg/mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0112] Emulzija O/W pripremljena je kombinovanjem Rastvora 1 (0,5 mL), Rastvora 2 (0,1 mL), dihlormetana (0,4 mL) i Rastvora 3 (3,0 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom, mešanih vrtlog 10 sekundi i zatim ultrazvukom obrađivan pod amplitudom od 30% tokom jednog minuta pod pritiskom cevi potopljene u kupatilo sa ledenom kupkom, koristeći Branson Digital Sonifier 250. Zatim je emulzija dodata u čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (30 mL). Druga O/W emulzija je pripremljena korišćenjem istih materijala i postupka kao iznad, a zatim je dodata u istu ambalažu koja sadrži prvu emulziju i DPBS. Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS koja sadrži 0,25% w/v PVA.

Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS koji sadrži 0,25% w/v PVA da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Suspenzija nano nosača je zatim filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špricu (Millipore deo broj SLGP033RB). Filtrirana suspenzija nano nosača je zatim čuvana na -20 °C.

[0113] Za uzorke 12-25, rastvori su pripremljeni kao što sledi:

Rastvor 1: Smeša polimera i rapamicina je pripremljena rastvaranjem PLA u 75 mg/mL, PLA-PEG-Ome u 25 mg/mL i rapamicina u 16 mg/mL u dihlormetanu. Rastvor 2: Smeša

4

HLB je pripremljena rastvaranjem HLB surfaktanta na 5,0 mg/mL u dihlorometanu. HLB tenzidi uključuju SPAN 20, SPAN 40, SPAN 60, SPAN 80, oktil b-D-glukopiranozid, oleilnu kiselinu, izopropil palmitat, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic L-31, Pluronic P-123, palmitinsku kiselinu, DL-α-palmitin i gliceril tripalmitat. Rastvor 3: Polivinil alkohol je pripremljen pri 62,5 mg/mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0114] Emulzija O/W pripremljena je kombinovanjem Rastvora 1 (0,5 mL), Rastvora 2 (0,5 mL) i Rastvora 3 (3,0 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom, mešanih vrtlog 10 sekundi i zatim ultrazvukom obrađivan pod amplitudom od 30% tokom jednog minuta pod pritiskom cevi potopljene u kupatilo sa ledenom kupkom, koristeći Branson Digital Sonifier 250. Zatim je emulzija dodata u čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (30 mL). Druga O/W emulzija je pripremljena korišćenjem istih materijala i postupaka kao iznad, a zatim je dodata u istu čašu koja je sadržala prvu emulziju i DPBS. Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS koja sadrži 0,25% w/v PVA. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS koji sadrži 0,25% w/v PVA da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Suspenzija nano nosača je zatim filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špricu (Millipore deo broj SLGP033RB). Filtrirana suspenzija nano nosača je zatim čuvana na -20°C.

[0115] HLB za većinu površinski aktivnih supstanci sa niskim HLB određen je pomoću javno dostupnih informacija. Za DL-α-Palmitin, HLB je izračunat koristeći sledeću formulu: Mw = 330,5 g/mol, hidrofilni deo = 119,0 g/mol; HLB = 119,0/330,5 ∗ 100/5 = 7,2. Za Gliceril Palmitat, HLB je izračunat koristeći sledeću formulu: Mw = 807,3 g/mol, hidrofilni deo = 173,0 g/mol; HLB = 173,0/807,3 ∗ 100/5 = 4,3. Za Izopropil Palmitat, HLB je izračunat koristeći sledeću formulu: Mw = 298,5 g/mol, hidrofilni deo = 44,0 g/mol; HLB = 44,0/298,5 ∗ 100/5 = 2,9. Za Oleil alkohol, HLB je izračunat koristeći sledeću formulu: Mw = 268,5 g/mol, hidrofilni deo =17,0 g/mol; HLB = 17,0/268,5 ∗ 100/5 = 1,3. Pored toga, opterećenje surfaktanta sa niskim HLB mereno je ekstrakcijom, praćeno kvantifikacijom HPLC postupka.

[0116] Pre injekcije u životinje, suspenzija nano nosača u odvojenom obliku odmrzavala se u vodenoj kupki sobne temperature tokom 30 minuta. Nanonosači su razblaženi sa DPBS da bi se postigla željena koncentracija od 278 µg/mL rapamicina. Ženke miševa C57BL/6 starosti 6 nedelja lečene su intravenozno d0, 7 i 14 nano nosačima (1,17 mL) pomešanim sa 130 µL 10x KLH (hemocijanin limpet u ključaonici). Miševima je pojačano 200 µg KLH 21., 28., 35. i 42. dana. Anti-KLH IgG titri (izmereni ELISA-om) očitani su 40, 47 i 61 dana. Rezultati pokazuju da surfaktant sa niskim HLB može rezultirati značajnim opterećenjima rapamicina i filtrabilnošću sintetičkih nano nosača. Pored toga, svi nano nosači sa surfaktantima sa niskim HLB, kao što je prikazano na Sl.2, rezultirali su smanjenim titrima antitela tokom najmanje 40 i 47 dana.

Primer 4 - Uticaj surfaktanta sa niskim HLB na filtrabilnost sintetičkih nano nosača Materijali i postupci

[0117] PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Evonik Industries (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen, Germany), šifra proizvoda 100 DL mPEG 5000 5CE. Kupljen je PLA sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Evonik Industries (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen Germany), šifra proizvoda 100 DL 4A. Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited, 1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India. Šifra proizvoda SIROLIMUS. Everolimus je kupljen od LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Proizvođački broj E-4040. Temsirolimus je kupljen od LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Kataloški broj T-8040.

Sorbitan monopalmitat je kupljen od Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720), šifra proizvoda SPAN 40. Dihlorometan je kupljen od Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027). Kataloški broj M1266. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88, USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccoov fiziološki rastvor puferisan fosfatom, IX, 0,0095 M (PO4), bez kalcijuma i magnezijuma, kupljen je od BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547), proizvođački broj #12001, šifra proizvoda Lonza DPBS. Emulgiranje je izvedeno pomoću Branson Digital Sonifier 250 sa 1/8" konusnim vrhom od titanove sonde.

[0118] Rastvori su pripremljeni na sledeći način:

Rastvor 1: Polimerna smeša je pripremljena rastvaranjem PLA-PEG-OMe (100 DL mPEG 5000 5CE) na 50 mg po 1 mL i PLA (100 DL 4A) na 150 mg po mL u dihlorometanu.

Rastvor 2: Rapamicin je rastvoren u 160 mg po 1 mL u dihlormetanu. Rastvor 3: Everolimus je rastvoren u 150 mg po mL u dihlormetanu. Rastvor 4: Temsirolimus je rastvoren u 150 mg po mL u dihlormetanu. Rastvor 5: Sorbitan monopalmitat (SPAN 40) rastvoren je u 50 mg po 1 mL u dihlormetanu. Rastvor 6: Dihlorometan je sterilno filtriran upotrebom 0,2 µm PTFE membranskog filtera za špric (VWR proizvođački broj 28145-491).

Rastvor 7: Rastvor polivinil alkohola je pripremljen rastvaranjem polivinil alkohola (EMPROVE® Polivinil Alkohol 4-88) pri 75 mg po 1 mL u 100 mM pH 8 fosfatnog pufera.

Rastvor 8: Polivinil alkohol i fiziološki rastvor puferisan sa Dulbeccoovim fosfatom, IX, 0,0095 M (PO4) smeša je pripremljena rastvaranjem polivinil alkohola (EMPROVE® Polivinil Alkohol 4-88) pri 2,5 mg po 1 mL u Dulbeccoovim fiziološkom rastvoru puferisan fosfatom, IX, 0,0095 M (PO4) (Lonza DPBS).

[0119] Za uzorak 26 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 2 (0,1 mL), rastvora 5 (0,1 mL) i rastvora 6 (0,30 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0120] Za uzorak 27 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 2 (0,1 mL) i rastvora 6 (0,40 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim je emulzija dodata u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0121] Za uzorak 28 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 3 (0,2 mL), rastvora 5 (0,1 mL) i rastvora 6 (0,20 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0122] Za uzorak 29 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 3 (0,2 mL) i rastvora 6 (0,30 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0123] Za uzorak 30 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 4 (0,2 mL), rastvora 5 (0,1 mL) i rastvora 6 (0,20 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0124] Za uzorak 31 pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (0,5 mL), rastvora 4 (0,2 mL), rastvora 6 (0,30 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i formulacija se meša u vrtlogu deset sekundi. Formulacija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u Rastvoru 8. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u Rastvoru 8 da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima

4

nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0125] Veličina nano nosača je određena dinamičkim rasipanjem svetlosti. Količina rapaloga u nano nosaču određena je HPLC analizom. Ukupna masa suvog nano nosača po mL suspenzije određena je gravimetrijskim postupkom. Filtriranost je procenjena količinom filtrata koji je prošao kroz prvi filter.

[0126] Podaci pokazuju da je za određeni broj rapaloga ugradnja SPAN 40 u sintetičke nano nosače rezultirala povećanom filtrabilnošću sastava sintetičkih nano nosača.

Primer 5 - Efekti SPAN 40 na filtrabilnost sintetičkih nano nosača koji sadrže nepoliesterske polimere

Materijali i postupci

[0127] Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited, 1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India). Šifra proizvoda SIROLIMUS. Poli(stiren)-blok-poli(etilen glikol) (PS-PEG) sa PEG blokom završenim sa metil eterom otprilike 700-1,100 Da je kupljen od Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103). Kataloški broj 686476. Poli(stiren)-blok-Poli(metil metakrilat) (PS-PMMA) (Mw = 30.000 Da) sa metakrilatom: odnos stirena od 1:1 je kupljen od Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103). Kataloški broj 749184. 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC) je kupljen od Avanti Polar Lipids, Inc (Avanti Polar Lipids, Inc.700 Industrial Park Drive Alabaster, Alabama 35007-9105). Kataloški broj 850345P. Poli(etilen glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilen glikol) (P-123) sa PEG:PPG:PEG odnosom od 20:70:20 je kupljen od Sigma Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103). Šifra proizvoda Pluronic® P-123, proizvođački broj 435465.

Dihlorometan je kupljen od Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027).

Kataloški broj M1266. Sorbitan monopalmitat je kupljen od Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720). Šifra proizvoda SPAN 40. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88, USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027). Šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccoov fiziološki rastvor puferisan fosfatom (DPBS), IX, 0,0095 M (PO4), bez kalcijuma i magnezijuma, kupljen je od BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547).

Kataloški broj 17-512Q. Emulgiranje je izvedeno pomoću Branson Digital Sonifier 250 sa 1/8" konusnim vrhom od titanove sonde.

[0128] Rastvori su pripremljeni na sledeći način:

Rastvor 1: Rastvor polimera i rapamicina je pripremljen rastvaranjem PS-PEG-a na 50 mg po mL i rapamicina na 8 mg po mL u dihlorometanu. Rastvor 2: Rastvor polimera i rapamicina je pripremljen rastvaranjem PS-PMMA (Mw = 30.000 Da) u 50 mg po mL i rapamicina u 8 mg po mL u dihlormetanu. Rastvor 3: Lipid i rastvor rapamicina je pripremljen rastvaranjem PS-DMPC na 50 mg po mL i rapamicina na 8 mg po mL u dihlorometanu. Rastvor 4:

Rastvor polimera i rapamicina je pripremljen rastvaranjem (P-123) na 50 mg po mL i rapamicina na 8 mg po mL u dihlorometanu. Rastvor 5: Dihlorometan je sterilno filtriran upotrebom 0,2 µm PTFE membranskog filtera za špric (VWR proizvođački broj 28145-491).

Rastvor 6: SPAN 40 je rastvoren u 50 mg po mL u dihlormetanu. Rastvor 7: PVA je rastvoren sa 62,5 mg po mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0129] Za uzorak 28, pripremljena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora 1 (1,0 mL) i rastvora 5 (0,05 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom, prethodno ohlađenoj > 4 minuta u ledenoj kupki. Zatim se dodaje rastvor 7 (3,0 mL) i cev pod pritiskom se meša u vrtlogu deset sekundi. Emulzija je zatim podvrgnuta ultrazvuku pomoću cevi za pritisak uronjene u ledenu kupku u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Dobijena nanoemulzija je zatim dodata u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (15 mL), a preko otvorene čaše stavljen je komad aluminijumske folije. Druga emulzija je pripremljena korišćenjem istog postupka i dodata je prvoj emulziji u istoj čaši od 50 mL sa svežom alikvotom DPBS (15 mL). Čaša je ostala nepokrivena, a aluminijumska folija bačena. Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0130] Uzorak 29 je pripremljen isto kao uzorak 28, koristeći Rastvor 6 umesto Rastvora 5. Uzorak 30 je pripremljen isto kao uzorak 28, koristeći Rastvor 2 umesto Rastvora 1. Uzorak 31 je pripremljen isto kao uzorak 30, koristeći Rastvor 6 umesto Rastvora 5. Uzorak 32 je pripremljen isto kao uzorak 28, koristeći Rastvor 3 umesto Rastvora 1. Uzorak 33 je pripremljen isto kao uzorak 32, koristeći Rastvor 6 umesto Rastvora 5. Uzorak 34 je pripremljen isto kao uzorak 28, koristeći Rastvor 4 umesto Rastvora 1. Uzorak 35 je pripremljen isto kao uzorak 34, koristeći Rastvor 6 umesto Rastvora 5.

[0131] Veličina nano nosača je određena dinamičkim rasipanjem svetlosti. Količina rapamicina u nano nosaču određena je HPLC analizom. Ukupna masa suvog nano nosača po mL suspenzije određena je gravimetrijskim postupkom. Filtrabilnost je procenjena masom filtrata nano nosača kroz prvi špric filter od 33 mm PES membrane sa 0,22 µm.

[0132] Ispod rezultata se vidi da, iako nije optimizovano, uključivanje SPAN 40 u sintetičke nano nosače sa polimerima koji nisu od poliestera može povećati filtrabilnost sintetičkih nano nosača u nekim otelotvorenjima.

4

Primer 6 - SPAN 40 Značajno povećava filtrabilnost sintetičkih nano nosača koji sadrže poliesterske polimere

Materijali i postupci

[0133] Kupljen PLA (100 DL 4A) je sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Evonik Industries (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen Germany), šifra proizvoda 100 DL 4A. PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Evonik Industries AG (Rellinghauser Straβe 1-11, Essen, Germany), šifra proizvoda 100 DL mPEG 50005CE. Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), šifra proizvoda SIROLIMUS. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88 (PVA), USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccov fiziološki rastvor puferisan fosfatom 1X (DPBS) je kupljen od Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland), šifra proizvoda 17-512Q. Sorbitan monopalmitat (SPAN 40) je kupljen od Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), šifra proizvoda SPAN 40. PLGA (5050 DLG 2.5A), sa približno 54 % po masi laktida i 46 % po masi glikolida, a svojstvena viskoznost od 0,24 dL/g je kupljena od Evonik Industries AG (Rellinghauser Straβe 1-11, Essen Germany), šifra proizvoda 5050 DLG 2.5A. PLGA (7525 DLG 4A), sa približno 73% po masi laktida i 27% po masi glikolida, a svojstvena viskoznost od 0,39 dL/g je kupljena od Evonik Industries AG (Rellinghauser Straβe 1-11, Essen Germany), šifra proizvoda 7525 DLG 4A. Kupljen je polikaprolakton (PCL), prosečno Mw 14.000 Da i Mn od 10.000 Da Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 440752.

[0134] Za uzorke 1,3,5 i 7, rastvori su pripremljeni kao što sledi:

Rastvor 1: PLA-PEG-Ome u količini od 50 mg po mL, raspon 40 pri 10 mg po mL i rapamicin od 32 mg po mL rastvoreni su u dihlorometanu. Rastvor 2: 100 DL 4A je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 3: 5050 DLG 2,5A je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 4: 7525 DLG 4A je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 5: PCL je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 6: PVA je pripremljen pri 75 mg/mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0135] Izrađena je O/W emulzija prenošenjem rastvora 1 (0,5 mL) u staklenu cev pod pritiskom sa debelim zidovima. Ovome je u seriju 2 dodat rastvor 2 (0,5 mL), u seriju 3 dodat je rastvor 3 (0,5 mL), u seriju 5 je dodato 4 (0,5 mL), a u partija 7 je dodat rastvor 5 (0,5 mL). Dva rastvora su zatim pomešana ponovljenim pipetiranjem. Sledeće, dodat je Rastvor 6 (3,0 mL), epruveta je mešana vorteksom 10 sekundi, a zatim je emulgovana ultrazvukom pod amplitudom od 30% u trajanju od 1 minuta sa potisnom cevčicom uronjenom u kupatilo sa ledenom vodom koristeći Branson Digital Sonifier 250. Zatim je emulzija dodata u čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Suspenzija nano nosača je zatim filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špricu (Millipore deo broj SLGP033RB) i ako je potrebno: 0.45 µm PES membranski špric-filter (PALL proizvođački broj 4614) i/ili 1,2 µm PES membranski špricfilter (PALL proizvođački broj 4656). Filtrirana suspenzija nano nosača je zatim čuvana na -20 °C.

[0136] Veličina nano nosača je određena dinamičkim rasipanjem svetlosti. Količina rapamicina u nano nosaču određena je HPLC analizom. Filtrabilnost je određena upoređivanjem težine protoka kroz prvi sterilni filter od 0,22 µm sa prinosom da bi se utvrdila stvarna masa nano nosača koji su prošli pre blokiranja filtera, ili ukupna masa kroz prvi i jedini filter. Ukupna masa suvog nano nosača po mL suspenzije određena je gravimetrijskim postupkom.

[0137] Za uzorke 2, 4, 6 i 8, rastvori su pripremljeni kao što sledi:

Rastvor 1: Smeša polimera i rapamicina je pripremljen rastvaranjem PLA-PEG-Ome na 50 mg po mL i rapamicina na 32 mg po mL u dihlorometanu. Rastvor 2: 100 DL 4A je

4

rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 3: 5050 DLG 2,5A je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 4: 7525 DLG 4A je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 5: PCL je rastvoreno u dihlorometanu na 150 mg po mL. Rastvor 6: Polivinil alkohol je pripremljen pri 75 mg po mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0138] Izrađena je O/W emulzija prenošenjem rastvora 1 (0,5 mL) u staklenu cev pod pritiskom sa debelim zidovima. Ovome je u seriju 2 dodat rastvor 2 (0,5 mL), u seriju 4 dodat je rastvor 3 (0,5 mL), u seriju 6 je dodato 4 (0,5 mL), a u partija 8 je dodat rastvor 5 (0,5 mL). Dva rastvora su zatim pomešana ponovljenim pipetiranjem. Dodavanje PVA rastvora, pranje, filtracija i skladištenje su isti kao iznad.

[0139] Veličina nano nosača je procenjena na isti način kao i iznad.

[0140] Rezultati pokazuju značajan porast filtrabilnosti sintetičkih nano nosača koji sadrže poliesterske polimere sa uključivanjem SPAN 40 u sintetičke nano nosače.

Primer 7 - Sintetički nano nosači sa niskim HLB surfaktantima i značajnim rezultatima RAPA opterećenja u trajnoj toleranciji specifičnoj za antigen

Materijali i postupci

[0141] Kupljen je PLA sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Lakeshore Biomaterials

4

(756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), šifra proizvoda 100 DL 4A. PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Lakeshore Biomaterials (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211), šifra proizvoda 100 DL mPEG 50005CE. Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), šifra proizvoda SIROLIMUS. Sorbitan monopalmitat je kupljen od Sigma-Aldrich (3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103), šifra proizvoda 388920. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88 (PVA), USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccov fiziološki rastvor puferisan fosfatom IX (DPBS) je kupljen od Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland), šifra proizvoda 17-512Q.

[0142] Rastvori su pripremljeni na sledeći način:

Rastvor 1: Smeša polimera, rapamicina i sorbitan monopalmitata pripremljena je rastvaranjem PLA u 37,5 mg/mL, PLA-PEG-Ome u 12,5 mg/mL, rapamicina u 8 mg/mL i sorbitan monopalmitata u 2,5 u dihlormetanu. Rastvor 2: Polivinil alkohol je pripremljen pri 50 mg/mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0143] Emulzija O/W pripremljena je kombinovanjem rastvora 1 (1,0 mL) i rastvora 2 (3 mL) u maloj staklenoj epruveti pod pritiskom, mešanih u vrtlogu 10 sekundi. Formulacija je zatim homogenizovana ultrazvukom pod amplitudom od 30% tokom 1 minuta. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od koja sadrži DPBS (30 mL). Druga O/W emulzija je pripremljena korišćenjem istih materijala i postupaka kao iznad, a zatim je dodata u istu čašu koja je sadržala prvu emulziju i DPBS. Kombinovana emulzija je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS koja sadrži 0,25% w/v PVA. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS koji sadrži 0,25% w/v PVA da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Suspenzija nano nosača je zatim filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špricu (Millipore deo broj SLGP033RB). Filtrirana suspenzija nano nosača je zatim čuvana na -20 °C.

4

[0144] Veličina nano nosača je određena dinamičkim rasipanjem svetlosti. Količina rapamicina u nano nosaču određena je HPLC analizom. Ukupna masa suvog nano nosača po mL suspenzije određena je gravimetrijskim postupkom.

[0145] Procenjena je sposobnost sintetičkih nano nosača, u poređenju sa slobodnim rapamicinom, da indukuju trajnu imunološku toleranciju prema modelnom antigenu KLH. Grupama naivnih miševa C57BL/6 (n=10 po grupi) dozirane su intravenski 0, 7 i 14 dana sa PBS (grupa 1), 50µg (∼2mg/kg) slobodni rapamicin sam ili pomešan sa KLH (grupe 2 i 3, respektivno), ili 50µg rapamicina kapsuliranog samo u sintetičke nano nosače (grupa 6) ili pomešan sa KLH (grupe 7 i 8) (Sl.3). Da bi se utvrdili efekti hroničnog davanja rapamicina, grupa 4 je primala besplatni rapamicin sam pet puta nedeljno (50 µg/dan) od Dana 0 do Dana 20 ili u kombinaciji sa KLH koji se primenjuje jednom nedeljno (grupa 5). Sve grupe su potom izazvane sa 200 µg KLH 21., 28. i 35. dana. Prikupljeni su serumi i izmereni su odgovori na antitela na KLH na 35. i 42. dan (posle 2 i 3 injekcije, respektivno). Efikasnost je procenjena kao EC50 za titar antitela na KLH, kako je određeno ELISA. Sl.4 ilustruje protokol.

[0146] Kontrolni miševi tretirani sa PBS razvili su visok nivo anti-KLH antitela na 35. i 42. dan, posle 2 i 3 injekcije KLH, respektivno. Miševi tretirani slobodnim rapamicinom (bilo nedeljno ili svakodnevno) u odsustvu KLH razvili su slične nivoe anti-KLH antitela kao grupa tretirana PBS. Miševi tretirani sintetičkim nano nosačima sami ili svakodnevno slobodnim rapamicinom i KLH pokazali su odloženi odgovor u poređenju sa PBS kontrolnom grupom, ali su titri pojačani sa svakim izazovom sa KLH. Ovi rezultati ukazuju da samo lečenje sintetičkim nano nosačima ne indukuje hroničnu imunosupresiju i da KLH primenjen sa svakodnevnim slobodnim rapamicinom, čak i kada je pet puta veća ukupna nedeljna doza rapamicina davana u sintetičkim nano nosačima, ne indukuje trajnu imunološku toleranciju.

[0147] Nasuprot tome, miševi tretirani sintetičkim nano nosačima+KLH (grupe 7 i 8), koji su sadržavali značajnu količinu rapamicina, razvili su malo ili nimalo detektabilnih anti-KLH antitela, čak i nakon što su primili tri izazova KLH posle tretmana (ukupno 6 KLH injekcija), što ukazuje na trajnu imunološku toleranciju. Obe serije sintetičkih nano nosača bile su slično

4

efikasne. Sve grupe, osim onih koje su lečene sintetičkim nano nosačima+KLH, razvile su anafilaktičke reakcije do 42. dana. Ovi rezultati ukazuju da je tolerisanje na KLH izazvano tretmanom sintetičkim nano nosačem koji sadrži značajnu količinu rapamicina i KLH sprečilo razvoj reakcija preosetljivosti.

[0148] Da bi se procenila antigenska specifičnost tolerancije na KLH, svim životinjama je izazvano OVA+CpG s.c. (35 µg 20 µg) u zadnjem udu 49. i 56. dana. Sl.5 pokazuje da su sve životinje razvile slične nivoe titra protiv OVA, pokazujući da istovremena primena antigena sa sintetičkim nano nosačem može dati imunološku toleranciju i da tretman sintetičkim nano nosačima ne izaziva hroničnu imunosupresiju. Ovi rezultati pokazuju da je nano nosač, umesto slobodni rapamicin, (kada je prisutan u značajnoj količini, indukovao trajnu i antigen-specifičnu imunološku toleranciju kada se istovremeno daje sa ciljnim antigenom.

Primer 8 - SPAN 40 povećava filtrabilnost rapaloga, rapamicina i Everolimusa Materijali i postupci

[0149] Kupljen je PLA sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Evonik Industries AG (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen Germany), šifra proizvoda 100 DL 4A. PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Evonik Industries AG (Rellinghauser Straβe 1-11, Essen, Germany), šifra proizvoda 100 DL mPEG 50005CE. Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited (1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India), šifra proizvoda SIROLIMUS. Everolimus je kupljen od LC Laboratories (165 New Boston St # T Woburn, MA 01801). Šifra proizvoda E-4040. Temsirolimus je kupljen od LC Laboratories (165 New Boston Street Woburn, MA 01801). Kataloški broj T-8040. Deforolimus je kupljen od MedChem Express (11 Deer Park Drive, Suite 102D Monmouth Junction, NJ 08852). Šifra proizvoda HY-50908. EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88, USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccoov fiziološki rastvor puferisan fosfatom IX (DPBS) je kupljen od Lonza (Muenchensteinerstrasse 38, CH-4002 Basel, Switzerland), šifra proizvoda 17-512Q. Sorbitan monopalmitat je kupljen od Croda International (300-A Columbus Circle, Edison, NJ 08837), šifra proizvoda SPAN 40.

4

[0150] Rastvori su pripremljeni na sledeći način. Rastvor 1: Smeša polimera i rapamicina je pripremljena rastvaranjem PLA u 150 mg/mL i PLA-PEG-Ome u 50 mg/mL. Rastvor 2: Rastvor rapamicina je pripremljen sa 100 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 3: Rastvor everolimusa je pripremljen sa 100 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 4: Rastvor temsirolimusa je pripremljen sa 100 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 5: Rastvor deforolimusa je pripremljen sa 100 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 6: Rastvor sorbitan monopalmitata je pripremljen rastvaranjem SPAN 40 u 50 mg/mL u dihlorometanu. Rastvor 7: Polivinil alkohol je pripremljen pri 75 mg/mL u 100 mM fosfatnom puferu pH 8.

[0151] O/W emulzije su pripremljene dodavanjem rastvora 1 (0,5 mL) u debelu zidnu potisnu cev. Za serije 1, 3, 5 i 7, ovo je kombinovano sa rastvorom 6 (0,1 mL) i dihlorometanom (0,28 mL). Partija 1 ih je zatim kombinovao sa rastvorom 2 (0,12 mL), partija 3 sa rastvorom 3 (0,12 mL), partija 5 sa rastvorom 4 (0,12 mL) i partija 7 sa rastvorom 4 (0,12 mL). Na sličan način, partije 2, 4, 6 i 8 su kombinovane sa dihlorometanom (0,38 mL), a zatim partija 2 kombinovana sa rastvorom 2 (0,12 mL), partija 4 sa rastvorom 3 (0,12 mL), partija 6 sa rastvorom 4 (0,12 mL) i partija 8 sa rastvorom 5 (0,12 mL). Stoga je za svaku pojedinačnu partiju ukupna zapremina organske faze bila 1 mL. Kombinovani rastvori organske faze su mešani ponovljenim pipetiranjem. Sledeće, dodat je Rastvor 7 (3,0 mL), epruveta je mešana vorteksom 10 sekundi, a zatim je emulgovana ultrazvukom pod amplitudom od 30% u trajanju od 1 minuta sa potisnom cevčicom uronjenom u kupatilo sa ledenom vodom koristeći Branson Digital Sonifier 250. Zatim je emulzija dodata u čašu od 50 mL koja sadrži DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario brzo da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u DPBS koja sadrži 0,25% w/v PVA. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u DPBS koji sadrži 0,25% w/v PVA da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Suspenzija nano nosača je zatim filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špricu (Millipore deo broj SLGP033RB). Filtrirana suspenzija nano nosača je zatim čuvana na -20 °C.

[0152] Rezultati pokazuju da je ugradnja SPAN 40 u sintetičke nano nosače povećala sposobnost filtriranja rapaloga, rapamicina i everolimusa.

Primer 9 - Prikazuje efekte količine komponenata na opterećenje rapamicinom i filtrabilnost sintetičkih nano nosača

Materijali i postupci

[0153] PLA-PEG-OMe blok ko-polimer sa PEG blokom završenim sa metil eterom od približno 5.000 Da i ukupnom inherentnom viskoznošću od 0,50 DL/g kupljen je od Evonik Industries (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen, Germany), šifra proizvoda 100 DL mPEG 5000 5CE. Kupljen je PLA sa svojstvenom viskoznošću od 0,41 dL/g Evonik Industries (Rellinghauser Straβe 1-1145128 Essen Germany), šifra proizvoda 100 DL 4A. Rapamicin je kupljen od Concord Biotech Limited, 1482-1486 Trasad Road, Dholka 382225, Ahmedabad India. Šifra proizvoda SIROLIMUS. Sorbitan monopalmitat je kupljen od Croda (315 Cherry Lane New Castle Delaware 19720), šifra proizvoda SPAN 40. Dihlorometan je kupljen od Spectrum (14422 S San Pedro Gardena CA, 90248-2027). Kataloški broj M1266.

EMPROVE® Polivinil alkohol 4-88 (PVA), USP (85-89% hidrolizovano, viskoznost od 3,4-4,6 mPa·s) je kupljen od EMD Chemicals Inc. (480 South Democrat Road Gibbstown, NJ 08027), šifra proizvoda 1.41350. Dulbeccoov fiziološki rastvor puferisan fosfatom (DPBS), IX, 0,0095 M (PO4), bez kalcijuma i magnezijuma, kupljen je od BioWhittaker (8316 West Route 24 Mapleton, IL 61547), proizvođački broj #12001, šifra proizvoda Lonza DPBS. Emulgiranje je izvedeno pomoću Branson Digital Sonifier 250 sa 1/8" konusnim vrhom od titanove sonde.

[0154] Rastvori su pripremljeni na sledeći način:

1

Polimerni rastvor: Polimerna smeša je pripremljena rastvaranjem PLA-PEG-OMe (100 DL mPEG 50005CE) i PLA (100 DL 4A) u naznačenim mg po mL u dihlorometanu u razmeri PLA-PEG i PLA u razmeri 1:3. Rastvor rapamicina: Rapamicin je rastvoren u naznačenim mg na 1 mL u dihlormetanu. SPAN 40 rastvor: Sorbitan monopalmitat (SPAN 40) je rastvoren u naznačenim mg po mL u dihlorometanu. CH2Cl2 rastvor: Dihlorometan (CH2CI2) je sterilno filtriran upotrebom 0,2 µm PTFE membranskog filtera za špricu (VWR proizvođački broj 28145-491). PVA rastvor: Rastvor polivinil alkohola je pripremljen rastvaranjem polivinil alkohola (EMPROVE® Polivinil Alkohol 4-88) pri ukazanom po 1 mL u 100 mM pH 8 fosfatnog pufera. DPBS PVA rastvor: Polivinil alkohol i fiziološki rastvor puferisan sa Dulbeccoovim fosfatom, 1X, 0,0095 M (PO4) smeša je pripremljena rastvaranjem polivinil alkohola (EMPROVE® Polivinil Alkohol 4-88) pri 2,5 mg po 1 mL u Dulbeccoovim fiziološkom rastvoru puferisan fosfatom, 1X, 0,0095 M (PO4) (Lonza DPBS).

[0155] Izrađena je O/W emulzija kombinovanjem rastvora polimera, rapamicin rastvora, rastvora SPAN 40 i/ili rastvora CH2Cl2 (ukupna zapremina 1-2 mL) u staklenoj cevi sa debelim zidovima. Rastvor je mešan ponovljenim pipetiranjem. Zatim je dodat PVA rastvor (3 do 6 mL) (etar kao pojedinačna emulzija sa 1 mL organske faze i 3 mL vodenog rastvora PVA, ili kao dve pojedinačne emulzije pripremljene jedna za drugom). Formulacija je mešana u vorteksu tokom deset sekundi, a zatim je podvrgnuta ultrazvuku pod pritiskom cevi uronjene u ledeno kupatilo u trajanju od 1 minuta sa amplitudom od 30%. Zatim se emulzija dodaje u otvorenu čašu od 50 mL koja sadrži Lonza DPBS (30 mL). Ovo je zatim mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi dihlorometan ispario i da bi se nano nosači stvorili. Deo nano nosača je ispran prenosom suspenzije nano nosača u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiranjem na 75.600 × g i 4 °C tokom 50 minuta, uklanjanjem supernatanta, i ponovnim suspendovanjem peleta u rastvoru DPBS PVA. Ponovljen je postupak ispiranja, a zatim je peleta ponovo suspendovana u rastvoru DPBS PVA da bi se dobila suspenzija nano nosača koja ima nominalnu koncentraciju od 10 mg/mL na polimernoj osnovi. Formulacija nano nosača je filtrirana upotrebom 0,22 µm PES membranskog filtera za špric (Millex broj dela SLGP033RS). Izmerena je masa propusnosti filtera za rastvor nano nosača. Filtrirani rastvor nano nosača je zatim čuvan na -20 °C.

[0156] Filtrabilnost je data u g/m<2>površine membrane filtera, izmerenog nano nosača koji prolazi kroz jedan filter od 33 mm PES membrane 0,22 µm šprica od Millipore, broj dela SLGP033RB.

2

[0157] Rezultati pokazuju količinu različitih komponenata u brojnim sintetičkim nano nosačima, što može rezultirati inicijalnim sterilnim sintetičkim nano nosačima koji se mogu filtrirati sa količinom rapamicina za koju se očekuje da bude efikasna in vivo.

Claims

Patentni zahtevi

1. Sastav koji sadrži sintetičke nano nosače koji sadrži:

hidrofobni materijal nosača,

rapalog, i

nejonski surfaktant čija je vrednost hidrofilno-lipofilne ravnoteže (HLB) manja od ili jednaka 10;

pri čemu je količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 ≥ 0,01, ali ≤ 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/masi hidrofobnog nosača,

poželjno pri čemu je sastav u početku sterilan za filtriranje kroz filter od 0,22 µm.

2. Postupak za proizvodnju sintetičkih nano nosača koji sadrže nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapalogom, koji sadrži:

dobijanje ili obezbeđivanje hidrofobnog nosećeg materijala,

dobijanje ili obezbeđivanje nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10,

pribavljanje ili pružanje rapaloga i

kombinovanjem hidrofobnog nosećeg materijala, nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapaloga da bi se stvorili sintetički nano nosači,

pri čemu je količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 u sintetičkim nano nosačima je ≥ 0,01, ali ≤ 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/masi hidrofobnog nosača.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, koji dalje sadrži:

rastvaranje hidrofobnog nosećeg materijala, nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapaloga u rastvaraču;

dobijanje ili obezbeđivanje drugog surfaktanta;

formiranje prve, a zatim druge O/W emulzije sa rastvorenim hidrofobnim nosećim materijalom, nejonskim surfaktantom sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 i rapalogom, i drugim surfaktantom;

mešanje prve i druge O/W emulzije; i

omogućavanje rastvaraču da ispari, poželjno gde je rastvarač dihlorometan, etil acetat, hloroform ili propilen karbonat.

4

4. Sastav prema patentnom zahtevu 1 ili postupak prema patentnom zahtevu 2 ili 3, gde: (i) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 10;

(ii) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 9;

(iii) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 8;

(iv) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 7;

(v) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 6; ili

(vi) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom od 5.

5. Sastav prema patentnim zahtevima 1 ili 4, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 4, gde:

(i) nejonski surfaktant čija je vrednost HLB manja ili jednaka 10 sadrži sorbitan estar, masni alkohol, estar masnih kiselina, etoksilisani masni alkohol, poloksamer ili masnu kiselinu; (ii) nejonski surfaktant čija je vrednost HLB manja ili jednaka 10 sadrži sorbitan estar, masni alkohol, estar masnih kiselina, etoksilisani masni alkohol, poloksamer ili masnu kiselinu, i pri čemu nejonski surfaktant sa vrednošću HLB manjom ili jednakom 10 sadrži SPAN 40, SPAN 20, oleil alkohol, stearil alkohol, izopropil palmitat, glicerol monostearat, BRIJ 52, BRIJ 93, Pluronic P-123, Pluronic L-31, palmitinsku kiselinu, dodekansku kiselinu, gliceril tripalmitat ili gliceril trilinoleat; ili

(iii) nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 je SPAN 40.

6. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1, 4 ili 5, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, gde je nejonski surfaktant sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 inkapsuliran u sintetičke nano nosače, prisutan na površini sintetičkih nano nosača, ili oboje.

7. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 6, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 6, gde:

(i) količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 ≥ 0,1, ali ≤ 20 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/masi hidrofobnog nosača,

(ii) količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 ≥ 1, ali ≤ 13 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/masi hidrofobnog nosača; ili

(iii) količina nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10 ≥ 1, ali ≤ 9 % po masi nejonskog surfaktanta sa HLB vrednošću manjom ili jednakom 10/masi hidrofobnog nosača.

8. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 7, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 7, gde:

(i) hidrofobni materijal nosača sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera ili lipida;

(ii) hidrofobni materijal nosača sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera, a pri čemu jedan ili više hidrofobnih polimera sadrži poliester, poželjno gde poliester sadrži PLA, PLG, PLGA ili polikaprolakton;

(iii) hidrofobni materijal nosača sadrži jedan ili više hidrofobnih polimera, a pri čemu jedan ili više hidrofobnih polimera sadrži poliester, poželjno gde poliester sadrži PLA, PLG, PLGA ili polikaprolakton, a gde hidrofobni materijal nosača sadrži ili dalje sadrži PLA -PEG, PLGA-PEG ili PCL-PEG.

9. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 8, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 8, gde:

(i) količina hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkim nano nosačima je 5-95 % po masi hidrofobnog nosećeg materijala/ukupne čvrste supstance; ili

(ii) količina hidrofobnog nosećeg materijala u sintetičkim nano nosačima je 60-95 % po masi hidrofobnog nosećeg materijala/ukupne čvrste supstance.

10. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 9, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 9, gde:

(i) količina rapaloga je ≥ 6, ali ≤ 50 % po masi rapaloga/masi hidrofobnog nosača;

(ii) količina rapaloga je ≥ 7, ali ≤ 30 % po masi rapaloga/masi hidrofobnog nosača; ili (iii) količina rapaloga je ≥ 8, ali ≤ 24 % po masi rapaloga/masi hidrofobnog nosača.

11. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 10, ili postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 10, gde je rapalog inkapsuliran u sintetičke nano nosače i/ili gde je rapalog rapamicin.

12. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 11, gde:

(i) sastav dalje sadrži antigen; ili

(ii) sastav dalje sadrži antigen, pri čemu se antigen pomeša sa sintetičkim nano nosačima u sastavu.

13. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 12, gde je srednja vrednost raspodele veličine čestica dobijena korišćenjem dinamičkog rasejanja svetlosti sintetičkih nano nosača prečnika većeg od 120 nm, poželjno gde je prečnik veći od 150 nm.

14. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 13, gde sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Komplet sadrži: sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 14.

16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 11, gde:

(i) postupak dalje uključuje filtriranje dobijenog sastava; ili

(ii) postupak dalje uključuje filtriranje dobijenog sastava,

pri čemu filtriranje uključuje filtriranje kroz filter od 0,22 µm.

17. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4 do 14 za upotrebu u modulaciji imunološkog odgovora.