RS57798B1 - Kombinovana terapija za ishemiju - Google Patents

Description

Opis

Pozadina pronalaska

[0001] Ishemijski moždani udar je najčešći uzrok smrti i teškog invaliditeta i obično je uzrokovan blokadom u krvnom sudu koji vodi ili u intrakranijalnu šupljinu i/ili u mozak. Efikasni tretmani koji su dostupni su malobrojni. Jedan tretman se sastoji od uklanjanja blokade u krvnom sudu koji je u pitanju. Ostali tretmani se sastoje od menjanja perfuzionih pritisaka u mozgu povećanjem krvnog pritiska ka mozgu. Blokada krvnih sudova može da se ukloni pomoću šireg spektra mehaničkih uređaja ili primenom "agensa za razbijanje ugrušaka" koji se isporučuju intravenski ili intra-arterijski. Među takvim agensima za razbijanje ugrušaka je Tkivni aktivator plazminogena (tPA), trombolitički agens koji se primenjuje kod nekih subjekata sa moždanim udarom za rastvaranje embolije koja izaziva ishemiju i tako obnovi krvotok ka mozgu, i rekombinantni tPA kao što je Alteplaza, reteplaza i tenekteplaza. Drugi trombolitički lekovi koji razbijaju ugruške uključuju streptokinazu, urokinazu i dezmotaplazu. Među mehaničkim reperfuzionim uređajima su infra-arterijski kateteri, baloni, stentovi i razni uređaji za vađenje ugrušaka, poput Penumbra System Reperfusion Cather. Među tretmanima koji menjaju perfuzione pritiske u mozgu su uređaji koji povećavaju arterijski pritisak u mozgu, kao što su baloni koji se mogu naduvati u ekstra-cerebralnoj arteriji poput aorte čime se preusmerava krvotok iz drugih delova tela i povećava moždana arterijska perfuzija, kao što je kateterski uređaj CoAxia NeuroFlo™. Sve zajedno, ove strategije se mogu smatrati medicinskim i mehaničkim agensima koji poboljšavaju perfuziju mozga u trenutku ili nakon nastanka cerebralne ishemije (u daljem tekstu kolektivno "reperfuzione terapije").

[0002] Iako su tPA i druge reperfuzione terapije, koje se primenjuju odmah nakon pojave ishemije, efikasne u smanjenju smrtnosti ili invaliditeta od ishemijskog moždanog udara, manje od oko 3% ispitanika koji su imali moždani udar se tretira sa tPA ili drugim reperfuzionim terapijama. Retka primena tPA i drugih reperfuzionih terapija je delimično uslovljena rizikom od smrti ako se administrira pacijentu koji ima ili koji je pod povećanim rizikom za održavanje moždane hemoragije. Moždani udar može biti posledica ishemije ili hemoragije. Previše često, vreme potrebno da se subjekat dopremi u bolnicu, postavi inicijalna dijagnoza i obavi skeniranje mozga da se utvrdi razlika između ishemijskog i hemoragičnog moždanog udara subjekta bi ostavilo izvan vremenskog prozora u kojem tPA ili druge reperfuzione terapije mogu biti efikasne. Tako, mnogi subjekti sa ishemijskim moždanim udarom, koji bi mogli imati koristi od tPA ili drugih reperfuzionih terapija, ne dobiju takav tretman.

[0003] Drugačiji oblik lečenja moždanog udara i odgovarajući uslovi su sada predmet kliničkih studija (vidi WO 2010144721 i Aarts et al., Science 298, 846-850 (2002)). Ovaj tretman koristi Tat-NR2B9c (NA-1), agens koji inhibira PSD-95, ometajući time vezivanje za N-metil-D-aspartat receptore (NMDAR) i neuronske azot-monoksid sintaze (nNOS) i smanjujući ekscitotoksičnost indukovanu cerebralnom ishemijom. Lečenje smanjuje veličinu infarkta i funkcionalne deficite.

KRATAK OPIS SLIKA

[0004]

Slike 1A, B, C i D: Opis protokola za doziranje ne-humanih primata (NHP; A), i grafici dobijenih difuzionih zapremina na MRI koje označavaju područja oštećenja. B. DWI MRI 48 sati nakon početka moždanog udara od 4.5 sata. C. T2 zapremina 48 sati nakon nastanka moždanog udara od 4.5 sata. D. T2 zapremina 7 dana nakon početka moždanog udara od 4.5 sata.

Slike 2A, B. A Životinje su bile podvrgnute 4.5 sata MCAO i tretirane 5 minuta sa Tat-NR2B9c ili placebom. Vremenski tok porasta DWI hiperintenziteta posle MCAO kod tretiranih i kontrolnih životinja. B. Snimci perfuzije i MRI prikazi mozga u različitim vremenskim tačkama.

Slika 3. Vremenski razvoj neslaganja penumbre kod placebo ili Tat-NR2B9c životinja.

Slike 4A, B. Tat-NR2B9c smanjuje intracelularno trošenje ATP-a i štiti kortikalne neurone miša od citotoksičnosti indukovane deprivacijom kiseonik-glukoze (OGD). (A) Frakcija ćelijske smrti merena 20 sati nakon OGD pomoću propidijum jodida metodom obeležavanja. (B) Intracelularna koncentracija ATP iz kortikalnih neurona utvrđena hemiluminiscentnim testom za detekciju ATP, izražena kao (% koncentracija ATP u odnosu na normoksične kontrolne uzorke).

Slika 5: Demonstracija da NA-1 (Tat-NR2B9c), kada se administrira kao jedna doza nakon moždanog udara, može da zaustaviti razvoj lezija u mozgu, što je procenjeno pomoću Magnetno Rezonantnog Imidžinga (MRI) Ova efikasnost ne deluje preko modifikacije cerebralnog krvotoka.

Slika 6: A: Zapremine perfuzionih defekata na početku B: Analiza zapremina moždanog udara merenih pomoću DWI i T2 snimanja tokom 30 dana C: Reprezentativni T2-weighted imidži moždanog udara kod placebo i životinja koje su tretirane lekovima, 24 časa posle MCAO. D: Reprezentativne serijske histološke sekcije iz NA-1 (Tat-NR2B9c) i placebom tretiranih životinja tokom 30 dana, bojene hematoksilinom i eozinom. E: Zapremine moždanog udara izračunate korišćenjem 24h DWI i 30-dana T2-W zapremina. F: NHPSS u periodu posmatranja od 30 dana.

Slike 7A-F: A: zapremina perfuzionih defekata. B: zapremine moždanog udara merene pomoću DWI i T2 MRI tokom 7 dana. C: zapremine moždanog udara sa 48 h DWI i T2- i 7-dnevnih T2-W MRI skeniranja normalizovanih u odnosu na početni perfuzioni deficit svake životinje. D: Reprezentativni 7 dnevni MRI. E: Reprezentativna 7-dnevna histologija. P: NHPSS skorovi tokom perioda posmatranja od 7 dana.

Slike 8A-F: A: zapremina perfuzionih defekata. B: zapremine moždanog udara merene pomoću DWI i T2 MRI tokom 14 dana. C: zapremine moždanog udara 48 h DWI i T2- i 14-dnevnih T2-W MRI skeniranja normalizovane u odnosu na početni perfuzioni deficit svake životinje. D Reprezentativni 14-dnevni MRI. E: Reprezentativna 14-dnevna histologija. P: NHPSS skorovi tokom perioda posmatranja od 14 dana.

Slike 9A, B: A: Grafik koji prikazuje odnos PSD-95:NMDAR ko-imunoprecipitacije između ipsilateralnih i kontralateralnih hemisfera pacova posle moždanog udara i tretmana sa NA-1 (Tat-NR2B9c). B: Primer imunoblotova koji pokazuju količinu NMDAR imunoprecipitovanog sa anti-PSD-95 antitelom u prisustvu različitih koncentracija NA-1 ili kontrola.

Slika 10: Grafik koji prikazuje odnos PSD-95:NMDAR ko-imunoprecipitacije između ipsilateralnih i kontralateralnih hemisfera pacova u različitim vremenskim tačkama posle moždanog udara i tretmana sa NA-1 (Tat-NR2B9c).

Slika 11: Infarktna područja u mozgovima pacova 24 sata nakon što su podvrgnuti moždanom udaru i tretirani sa raznim kombinacijama i vremena tPA i NA-1 (Tat-NR2B9c) doziranja.

REZIME ZAHTEVANOG PRONALSKA

[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje predmet kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0006] Opisan je metod lečenja štetnog delovanja ishemije na centralni nervni sistem, koji obuhvata primenu inhibitora PSD95 na subjektu koji ima ili je pod rizikom od ishemije, i obavljanje reperfuzione terapije na subjektu, pri čemu PSD95-inhibitor i reperfuziona terapija tretiraju štetno delovanje ishemije na centralni nervni sistem subjekta. Opciono, PSD-95-inhibitor se administrira pre izvođenja reperfuzione terapije. Opciono, PSD-95-inhibitor se administrira subjektu koji je u opasnosti od ishemije pre početka ishemije, a reperfuziona terapija se izvodi posle početka ishemije. Opciono, PSD-95-inhibitor se administrira, a reperfuziona terapija se izvodi nakon pojave ishemije. U nekim metodama, ishemija je cerebralna ishemija. U nekim metodama, subjekat ima moždani udar. U nekim metodama, ishemija je srčana, plućna ili ishemija ekstremiteta koja utiče na centralni nervni sistem inhibira protok krvi u ili iz CNS. U nekim metodama, subjekat se testira na prisustvo cerebralne ishemije i/ili odsustvo cerebralne hemoragije između administracije agensa i izvođenja reperfuzione terapije. U nekim metodama, subjekat se procenjuje na prisustvo ili rizik od hemoragije između administracije aktivnog sredstva i izvođenja reperfuzione terapije. U nekim metodama, procena obuhvata obavljanje PET skeniranja, CAT skeniranja, MRI ili razmatranje medicinske istorije subjekta ili upotrebu jednog ili više biomarkera koji daju indikaciju ishemije. U nekim metodama, PSD-95-inhibitor je peptid. U nekim metodama, agens je NA-1 (TatNR2B9c). U nekim metodama, reperfuzija se izvodi primenom trombolitičkog agensa. U nekim metodama, trombolitički agens je aktivator plazminogena. U nekim metodama, trombolitički agens je tPA. U nekim metodama, reperfuziona terapija je mehanička reperfuzija. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi više od 3 sata posle pojave ishemije. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi više od 4.5 sata posle pojave ishemije. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi više od 4.5 sata, a manje od 24 sata posle pojave ishemije. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi nakon utvrđivanja da se subjekat kvalifikovao za reperfuziju na osnovu izostanka definitivnog infarkta, ishemične penumbre i nedostatka hemoragije kao što je prikazano pomoću CT, MRI ili PET analize. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi najmanje 12 ili najmanje 24 sata nakon pojave ishemije. U nekim metodama, reperfuziona terapija se izvodi 275-690 minuta nakon početka ishemije. U nekim metodama, interval između ordiniranja PSD-95 i reperfuzione terapije može biti 30 min do 6 časova. U nekim metodama, trombolitički agens se administrira lokalizovanom administracijom na mestu poremećenog krvotoka. U bilo kojoj od gornjih metoda, peptid ili drugi agens može biti vezan sa internalizacionim peptidom ili lipidovan sa njim čime se olakšava prolazak peptida kroz ćelijsku membranu ili krvno-moždanu barijeru. Neki peptidi ili drugi agensi su miristilovani. Miristilacija peptida se poželjno vrši na N-terminusu.

[0007] Zatim, otkriven je postupak tretiranja predmetne populacije koja pokazuje znak(e) i/ili simptom(e) ishemije, koji obuhvata administraciju PSD-95 inhibitora subjektima; pri čemu se subjekti analiziraju za neprihvatljiv rizik od neželjenih efekata reperfuzione terapije, i ispitanici bez neprihvatljivog rizika od neželjenih efekata dobijaju reperfuzionu terapiju, dok subjekti sa neprihvatljivim rizikom od neželjenih efekata ne dobijaju reperfuzionu terapiju. U nekim metodama, analiza neprihvatljivog rizika od neželjenih efekata obuhvata analizu za prisustvo ili rizik od hemoragije. U nekim postupcima, subjekti koji pokazuju znak(e) i/ili simptoma(e) moždanog udara, a analiza obuhvata skeniranje mozga koje razlikuje ishemijski i hemoragijski moždani udar i subjekti koji imaju ishemijski moždani udar primaju, a subjekti koji imaju hemoragijski moždani udar ne primaju reperfuzionu terapiju.

[0008] Opisan je agens koji inhibira vezivanje PSD-95 za NMDAR 2B ili drugu(e) NMDAR 2 podjedinicu(e) za upotrebu u lečenju štetnog delovanja ishemije na centralni nervni sistem kod subjekta koji takođe prima reperfuzionu terapiju, pri čemu reperfuziona terapija i agens tretiraju štetno delovanje ishemije na centralni nervni sistem.

[0009] Zatim je otkriven agens ili uređaj za primenu u reperfuzionoj terapiji kod subjekta koji takođe prima agens koji inhibira vezivanje PSD-95 sa NMDAR 2B, 2A ili nNOS pri čemu reperfuziona terapija i agens tretiraju štetno delovanje ishemije na centralni nervni sistem. Opciono, uređaj je spirala, stent, balon (na primer, intra-aortni balon, pumpa), kateter. Opciono, agens je trombolitik, vazodilatator ili hipertenzivni agens.

DEFINICIJE

[0010] "Himerni peptid" označava peptid koji ima dve peptidne komponente koje nisu prirodno povezane, a međusobno su povezane jedna sa drugom kao fuzioni protein ili pomoću hemijske veze.

[0011] "Fuzioni" protein ili polipeptid se odnosi na kompozitni polipeptid, odnosno, pojedinačnu aminokiselinsku sekvencu, sastavljenu od sekvenci dva (ili više) različitih, heterolognih polipeptida koji normalno nisu fuzionisani u pojedinačnoj polipeptidnoj sekvenci.

[0012] Izraz "PDZ domen" se odnosi na modularni proteinski domen od oko 90 aminokiselina, koje karakteriše značajan identitet sekvence (npr. najmanje 60%) sa moždanim sinaptičkim proteinom PSD-95, Drosophila septate disk veliki protein (DLG), i epitelijalni (eng. tight junction protein ZO1) (ZO1). PDZ domeni su takođe poznati kao Disk-Veliki homologni regioni ("DHR") i GLGF (SEK ID NO:7) domeni. Izgleda da PDZ domeni generalno održavaju konsenzus sekvence jezgra (Doyle, D.A., 1996, Cell 85: 1067-76). Primeri proteina koji sadrže PDZ domen i sekvence PDZ domena su opisane u U.S. Pat. Prijavi Br. 10/714,537, koja je ovde referencom inkorporirana u celini.

[0013] Izraz "PL protein" ili "PDZ Ligand protein" se odnosi na prirodni protein koji gradi molekulski kompleks sa PDZ-domenom ili sa proteinom čiji karboksi-terminus, kada se eksprimira odvojeno od proteina pune dužine (npr. kao peptidni fragment od 3-25 rezidua, npr. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 14 ili 16 rezidua), formira takav molekulski kompleks. Molekulski kompleks se može posmatrati in vitro pomoću "A testa" ili "G testa" opisanih, npr. u US 20060148711, ili in vivo.

[0014] Izraz "NMDA receptor" ili "NMDAR" se odnosi na protein asociran sa membranom za koji se zna da interaguje sa NMDA uključujući različite oblike podjedinica opisane dalje u tekstu. Takvi receptori mogu biti humani ili ne-humani (npr. miš, pacov, zec, majmun).

[0015] "PL motiv" se odnosi na aminokiselinsku sekvencu C-terminusa PL proteina (npr. C-terminalna 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 20 ili 25 susedna rezidua) ("C-terminalna PL sekvenca") ili na unutrašnju sekvencu za koju se zna da vezuje PDZ domen ("unutrašnja PL sekvenca").

[0016] A "PL peptid" je peptid koji sadrži ili se sastoji od, ili je na drugi način baziran na, PL motivu koji specifično vezuje PDZ domen.

[0017] Izrazi "izolovan" ili "prečišćen" znači da je predmetna vrsta (npr. peptid) prečišćena od zagađivača koji su prisutni u uzorku, kao što je uzorak dobijen iz prirodnih izvora koji sadrže predmetnu vrstu. Ako je predmetna vrsta koja je izolovana ili prečišćena, predominantno makromolekularna (npr. polipeptidna) vrsta prisutna u uzorku (tj. na molarnoj bazi brojnija od bilo koje druge pojedinačne vrste u kompoziciji), a poželjno predmetna vrsta obuhvata najmanje oko 50 procenata (na molarnoj bazi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta. Generalno, izolovani, prečišćeni ili suštinski čist preparat sadrži više od 80 do 90 procenata svih makromolekularnih vrsta prisutnih u kompoziciji. Najpoželjnije, predmetna vrsta je prečišćena do suštinske homogenosti (t.j. kontaminirajuće vrste u kompoziciji se ne mogu detektovati konvencionalnim metodama detekcije), pri čemu se kompozicija suštinski sastoji od jedne makromolekularne vrste. Izraz izolovani ili prečišćeni ne isključuje prisustvo drugih komponenata namenjenih da deluju u kombinaciji sa izolovanim vrstama. Na primer, za internalizacioni peptid se može reći da je izolovan bez obzira što je vezan za aktivni peptid.

[0018] "Peptidomimetik" se odnosi na sintetičko hemijsko jedinjenje koje u suštini ima strukturne i/ili funkcionalne karakteristike peptida koji se sastoji od prirodnih aminokiselina. Peptidomimetik može sadržati isključivo sintetičke, ne-prirodne analoge aminokiselina, ili može biti himerni molekul delimično prirodnih peptidnih aminokiselina i delimično ne prirodnih analoga aminokiselina. Peptidomimetik takođe može uključivati bilo koju količinu konzervativnih supstitucija prirodnih amino kiselina sve dok takve supstitucije takođe suštinski ne promene strukturu mimetika i/ili inhibitornu ili aktivnost vezivanja. Polipeptidne mimetičke kompozicije mogu sadržati bilo koju kombinaciju ne prirodnih strukturnih komponenata koje su obično iz tri strukturne grupe: a) grupe za vezivanje rezidua osim prirodnih amidnih veza ("peptidne veze") vezujuće grupe; b) ne-prirodne rezidue umesto prirodnih aminokiselinskih rezidua; ili c) rezidue koje indukuju sekundarnu strukturnu mimikriju, odnosno indukuju ili stabilizuju sekundarnu strukturu, na primer, beta zavoj, gama zavoj, beta list, alfa heliks konformaciju i slično. U peptidomimetiku himernog peptida koji sadrži aktivni peptid i internalizacioni peptid, aktivna grupa ili internalizaciona grupa ili obe mogu biti peptidomimetici.

[0019] Izraz "specifično vezivanje" se odnosi na vezivanje između dva molekula, na primer, liganda i receptora, koje karakteriše sposobnost molekula (liganda) za vezivanje sa drugim specifičnim molekulom (receptorom) čak i u prisustvu mnogih drugih različitih molekula, odnosno da pokazuje preferencijalno vezivanje jednog molekula za drugi u heterogenoj mešavini molekula. Specifično vezivanje liganda za receptor se i dokazuje smanjenim vezivanjem detektabilno obeleženog liganda za receptor u prisustvu viška neobeleženog liganda (t.j. test kompetitivnog vezivanja).

[0020] Ekcitotoksičnost je patološki process pomoću kojeg se neuroni oštećuju i ubijaju prekomernom aktivacijom receptora za ekscitatorni neurotransmiter glutamat, kao što su NMDA receptori, npr. NMDA receptori koji nose NMDAR 2B subjedinicu.

[0021] Izraz "subjekat" uključuje ljude i veterinarske životinje, kao što su sisari, kao i laboratorijske životinjske modele, kao što su miševi i pacovi koji se koriste u predkliničkim studijama.

[0022] Izraz "agens" obuhvata bilo koje jedinjenje, uključujući jedinjenja sa ili bez farmaceutske aktivnosti, prirodna jedinjenja, sintetička jedinjenja, male molekule, peptide i peptidomimetike. PSD-95 inhibitor je agens koji inhibira PSD-95 kao što je opisano u nastavku.

[0023] Termin "farmakološki agens" označava agens koji ima farmakološku aktivnost. Farmakološki agensi obuhvataju jedinjenja koja su poznata kao lekovi, jedinjenja za koje je identifikovana farmakološka aktivnost, ali koja prolaze dalju terapeutsku procenu u životinjskim modelima i kliničkim studijama. Himerni agens sadrži farmakološki agens vezan za internalizacioni peptid. Za agens se može reći da ima farmakološko dejstvo ako pokazuje aktivnost u sistemu skrininga koji ukazuje da aktivni agens jeste ili može biti koristan u profilaksi ili lečenju bolesti. Skrining sistem može biti in vitro, ćelijski, životinjski ili na čoveku. Za agens se može reći da ima ima farmakološku aktivnost uprkos tome što se mogu zahtevati dodatna ispitivanja da se utvrdi stvarna profilaktička ili terapeutska primena u lečenju bolesti.

[0024] Tat peptid označava peptid koji sadrži ili se sastoji od GRKKRRQRRR (SEK ID NO:1), u kojem je ne više od 5 rezidua izbrisano, supstituisano ili umetnuto unutar sekvence, koji zadržava sposobnost da olakša preuzimanje vezanog peptida ili drugog agensa u ćeliju. Poželjno bilo koja promena aminokiselina je konzervativna supstitucija. Poželjno, bilo supstitucije, delecije ili unutrašnje insercije u agregat ostavljaju peptid sa neto katjonskim naelektrisanjem, poželjno sličnim onom kod gornje sekvence. On se može izvesti bez supstitucije ili delecije značajnog broja R i K rezidua. Amino kiseline iz tat peptida se mogu derivatizovati pomoću biotina ili sličnog molekula za smanjenje inflamatornog odgovora.

[0025] Koadministracija farmakoloških agensa znači da se agensi administriraju u dovoljno bliskom vremenskom intervalu kako bi detektabilne količine agensa bile prisutne u plazmi istovremeno i/ili agensi ispoljili efekat lečenja na istu epizodu bolesti ili da agensi deluju kooperativno ili sinergijski u lečenju iste epizode bolesti. Na primer, anti-inflamatorni agens deluje kooperativno sa agensom koji sadrži tat peptid kada se dva agensa primene vremenski dovoljno približno da anti-inflamatorni agens može da inhibira anti-inflamatorni odgovor koji može da indukuje internalizacioni peptid.

[0026] Statistička značajnost se odnosi na p-vrednost koja je <0.05, poželjno <0.01 a najpoželjnije <0.001.

[0027] Epizoda bolesti označava period kada se prisutni znaci i/ili simptomi bolesti smenjuju sa dužim periodima u kojima su znaci i/ili simptomi ili odsutni ili prisutni u manjem obimu.

DETALJAN OPIS

I. Opšte

[0028] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju za upotrebu u lečenju ishemije ili na drugi način utiče na CNS, kao što je ishemijski moždani udar, kako je definisano u patentnim zahtevima. Lečenje obuhvata primenu inhibitora PSD95 i obavljanje reperfuzione terapije (npr. primenom tPA ili drugog trombolitičkog agensa, ili pomoću nekog mehaničkog uređaja za povećanje protoka krvi u ugroženoj oblasti CNS). U konvencionalnoj upotrebi tPA i drugih reperfuzionih terapija, efikasnost opada sa povećanjem vremena od početka ishemije, a potencijal za hemoragijske neželjene efekte se povećava. Tako se u slučaju tPA ova trombolitička strategija smatra neefikasnom nakon približno 3-4.5 sata od početka ishemije. Pronalazak je zasnovan delom na saznanju da administracija inhibitora PSD95 u kombinaciji sa reperfuzionom terapijom povećava efikasnost reperfuzione terapije i/ili usporava opadanje efikasnosti tPA ili drugih reperfuzionih terapija sa vremenom nakon pojave ishemije čime se produžava prozor u kojem se tPA ili druge reperfuzione terapije mogu administrirati.

[0029] Dok tPA i druge reperfuzione terapije mogu bezbedno biti primenjene samo na subjekte sa moždanim udarom za koje se zna da imaju ishemijski moždani udar, PSD-95 inhibitor se može administrirati bezbedno subjektima sa moždanim udarom ili subjektima sa mogućim moždanim udarom, bez obzira da li subjekat ima ishemijski ili hemoragijski moždani udar i bez obzira da li je subjekt uopšte imao moždani udar. Administriranjem PSD-95 inhibitora, ima više vremena na raspolaganju da se izvrši skeniranje mozga ili bilo koji drugi dijagnostički test kako bi se utvrdilo prisustvo ishemijskog moždanog udara, a zatim administrirao tPA ili druga reperfuziona terapija ako je odgovarajuća. Prema tome, veći broj subjekata sa ishemijskim moždanim udarom može imati koristi od tPA ili drugih reperfuzionih terapija i istovremeno korist od lečenja sa PSD-95 inhibitorom.

II. Agensi koji inhibiraju PSD-95

[0030] PSD-95 inhibitori inhibiraju interakciju između PSD-95 i jednog ili više NMDAR (npr. 2A, 2B, 2C ili 2D) ili nNOS (npr. Swiss-Prot P29475). Inhibicija može biti, na primer, rezultat specifičnog vezivanja inhibitora sa PSD-95. Takva sredstva su korisna za smanjenje jednog ili više štetnih uticaja moždanog udara i drugih neuroloških stanja posredovanih barem delimično pomoću NMDAR ekscitotoksičnosti. Takvi agensi uključuju peptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja uključuje ili je na bazi PL motiva NMDA Receptora ili PDZ domena PSD-95. Takvi peptidi takođe mogu da inhibiraju interakcije između PSD-95 i nNOS i drugih receptora glutamata (npr. kainit receptori ili AMPA receptori), kao što su KV1-4 i GluR6. Poželjni peptidi inhibiraju interakciju PDZ domena 1 i 2 proteina PSD-95 (eng. postsynaptic density protein 95) (humane aminokiselinske sekvence obezbeđene kod Stathakism, Genomics 44(1):71-82(1997)) i C-terminalne PL sekvence jedne ili više subjedinica NMDA receptora 2, uključujući NR2B subjedinicu neuronskog N-metil-D-aspartat receptora (Mandich et al., Genomics 22, 216-8 (1994)). NMDAR2B ima GenBank ID 4099612, C-terminalnih 20 aminokiselina FNGSSNGHVYEKLSSIESDV (SEK ID NO:11) i PL motiva ESDV (SEK ID NO:12). Poželjni peptidi inhibiraju humane forme PSD-95 i humane NMDAR receptore. Međutim, inhibicija može biti prikazana u varijantama vrsta proteina. Lista NMDA i glutamat receptora koji se mogu koristiti je data ispod:

Tabela 1: NMDA Receptori Sa PL Sekvencama

[0031] Neki peptidi inhibiraju interakcije između PSD-95 i multiplih NMDAR subjedinica. U takvim slučajevima, korišćenje peptida ne zahteva nužno razumevanje odgovarajućih doprinosa različitih NMDAR-a ekscitatornoj neurotransmisiji. Ostali peptidi su specifični za pojedinačni NMDAR.

[0032] Peptidi mogu uključivati ili biti bazirani na PL motivu C-terminusa neke od navedenih subjedinica i imati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži [S/T]-X-[V/L]. Ova sekvenca se poželjno javlja na C-terminusu peptida iz pronalaska. Poželjni peptidi imaju aminokiselinsku sekvencu koja sadrži [E/D/N/K]-[S/T]-[D/E/K/N]-[V/L] (SEK ID NO:38) na svom C-terminusu. Primeri ovih peptida obuhvataju: ESDV (SEK ID NO:12), ESEV (SEK ID NO:29), ETDV (SEK ID NO:39). ETEV (SEK ID NO:40), DTDV (SEK ID NO:41) i DTEV (SEK ID NO:42) kao C-terminalne aminokiseline. Dva naročito poželjna peptida su KLSSIESDV (SEK ID NO: 5), i KLSSIETDV (SEK ID NO:43). Poželjni su peptidi koji obično imaju 3-25 aminokiselina (bez internalizacionog peptida), peptidi dužine 5-10 aminokiselina, a naročito 9 aminokiselina (takođe bez internalizacionog peptida). U nekim takvim peptidima, sve aminokiseline su sa C-terminusa NMDA receptora (ne računajući aminokiseline iz internalizacionog peptida).

[0033] Drugi peptidi koji inhibiraju interakcije između PDS95 i NDMAR-a uključuju peptide PDZ domena 1 i/ili 2 iz PSD-95 ili subfragment bilo kojeg od njih koji inhibira interakcije između PSD-95 i NMDA receptora, poput NR2B. Takvi aktivni peptidi sadrže najmanje 50, 60, 70, 80 ili 90 amino kiselina PDZ domena 1 i/ili PDZ domena 2 iz PSD-95, koje su otprilike u opsegu aminokiselina 65-248 iz PSD-95 obezbeđenih kod Stathakism, Genomics 44(1):71-82 (1997) (humane sekvence) ili NP_031890.1, GI:6681195 (mišje sekvence) ili odgovarajući regioni varijanti drugih vrsta.

[0034] Peptidi i peptidomimetici mogu da sadrže modifikovane aminokiselinske rezidue na primer, rezidue koje su N-alkilovane. N-terminalne alkil modifikacije mogu da uključuju npr. N-Metil, N-Etil, N-Propil, N-Butil, N-Cikloheksilmetil, N-Cikliheksiletil, N-Benzil, N-Feniletil, N-Fenilpropil. N-(3,4-Dihlorofenil)propil, N-(3,4-Difluorofenil)propil, i N-(Naftalen-2-il) etil).

[0035] Bach, J. Med. Chem. 51, 6450-6459 (2008) i WO 2010/004003 opisuju seriju analoga NR2B9c (SEK ID NO:6). Aktivnost PDZ-vezivanja su ispoljili peptidi koji imaju samo tri C-terminalne aminokiseline (SDV). Bah je takođe prijavio analoge koji imaju aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata ili se sastoji od X1tSX2V (SEK ID NO:68), u kojoj su t i S alternativne aminokiseline, X1je izabran između E, Q i A, ili njihovog analoga, X2je izabran između A, Q, D, N, N-Me-a, N-Me-Q, N-Me-D i N-Me-N ili njihovog analoga. Opciono peptid je N-alkilovan u P3 položaju (treća aminokiselina od C-terminusa, odnosno položaju koji zauzima tS). Peptid može biti N-alkilovan sa cikloheksanom ili aromatičnim supstituentom i dalje sadrži spejser grupu između supstituenta i terminalne amino grupe peptida ili peptidnog analoga, gde je spejser alkil grupa, poželjno izabrana između metilena, etilena, propilena i butilena. Aromatični supstituent može biti naftalen-2-il grupa ili aromatični prsten supstituisan sa jednim ili dva halogena i/ili alkil grupom.

[0036] Druge modifikacije takođe mogu biti ugrađene bez negativnog uticaja na aktivnost i one obuhvataju supstituciju jedne ili više amino kiselina u prirodnom L-izomernom obliku sa aminokiselinama u D-izomernom obliku. Prema tome, bilo koja amino kiselina koja se prirodno javlja u L-konfiguraciji (koja se takođe može nazvati R ili S, u zavisnosti od strukture hemijskog entiteta) može biti zamenjena sa amino kiselinom istog hemijskog strukturnog tipa ili peptidomimetikom, ali suprotne hiralnosti, koja se uobičajeno označava kao D-amino kiselina, ali koja se dodatno može označiti kao R- ili S-oblik. Tako, peptidomimetik može da obuhvata 1, 2, 3, 4, 5, najmanje 50%, ili sve D-amino kiselinske rezidue. Peptidomimetik koji sadrži neke ili sve D rezidue se ponekad naziva "inverzni" peptid.

[0037] Peptidomimetici takođe obuhvataju retro peptide. Retro peptid ima obrnutu aminokiselinsku sekvencu. Peptidomimetici takođe uključuju retro-inverzne peptide u kojima je redosled aminokiselina obrnut tako da se prvobitne C-terminalne amino kiseline pojavljuju na N-terminalu i D-amino kiseline se koriste umesto L-amino kiselina. WO 2008/014917 opisuje retro-inverzni analog od Tat-NR2B9c koji ima amino kiselinsku sekvencu vdseisslk-rrrqrrkkrgyin (SEK ID NO:8) (mala slova označavaju D aminokiseline), i navodi da efikasno inhibira cerebralnu ishemiju. Drugi ovde opisani efikasan peptid je Rv-Tat-NR2B9c (RRRQRRKKRGYKLSSIESDV; SEK ID NO:70).

[0038] Linker, na primer, polietilen glikol linker se može koristiti za dimerizaciju aktivnog dela peptida ili peptidomimetika da se poveća njegov afinitet i selektivnost prema proteinima koji sadrže tandem PDZ domene. Vidi npr. Bach et al., (2009) Angev. Chem. Int. Ed. 48: 9685-9689 i WO 2010/004003. Peptid koji sadrži PL motiv je poželjno dimerizovan vezivanjem N-krajeva takva dva molekula, ostavljajući C-krajeve slobodnim. Bach dalje izveštava da je pentamer peptid IESDV (SEK ID BR:71) sa C-terminusa NMDAR 2B bio efikasan u inhibiciji vezivanja NMDAR 2B sa PSD-95. IETDV (SEK ID NO:73) se takođe može koristiti umesto IESDV. Opciono, oko 2-10 kopija PEG mogu da se veže u tandemu kao linker. Opciono, linker može biti vezan za internalizacioni peptid ili lipidovan da se poboljša ćelijsko preuzimanje. Primeri ilustrativnih dimernih inhibitora su prikazani ispod (vidi Bach et al., PNAS 109 (2012) 3317-3322). Bilo koji od PSD-95 inhibitora koji su ovde opisani mogu da se koriste umesto IETDV, i bilo koji internalizacioni peptid ili lipidacioni ostatak se može koristiti umesto masti. Takođe se mogu koristiti i drugi linkeri kao što je prikazano.

IETAV je dodeljen SEK ID NO:74, IGRKKRRKRRR SEK ID NO:2. i rrrqrrkkr, SEK ID NO:75, mala slova ukazuju na D-amino kiseline.

[0039] Odgovarajuće farmakološka aktivnost peptida, peptidomimetika ili drugih agensa može biti potvrđena ukoliko je potrebno, korišćenjem prethodno opisanih modela moždanog udara kod pacova pre testiranja na primatima i kliničkih studija opisanih u ovoj prijavi. Peptidi ili peptidomimetici se takođe mogu testirati za sposobnost inhibicije interakcije između PSD-95 i NMDAR 2b, pomoću eseja opisanih u npr., US 20050059597, koji je ovde inkorporiran referencom. Korisni peptidi obično imaju IC50vrednosti manje od 50 µM, 25 µM, 10 µM, 0.1 µM ili 0.01 µM u jednom takvom eseju. Poželjni peptidi tipično imaju IC50vrednost između 0.001-1 µM, a još poželjnije 0.001-0.05, 0.05-0.5 ili 0.05 do 0.1 µM. Kada je peptid ili drugi agens karakterisan da inhibira vezivanje u jednoj interakciji npr. PSD-95 interakciji sa NMDAR2B, takav opis ne isključuje da peptid ili agens takođe inhibira i drugu interakciju, na primer, inhibiciju PSD-95 vezivanja sa nNOS.

[0040] Peptidi kao što su oni upravo opisani mogu opciono biti derivatizovani (npr. acetilovani, fosforilovani, miristilovani, geranilovani i/ili glikozilovani) da se poboljša afinitet vezivanja inhibitora, poboljša sposobnost inhibitora za transport kroz ćelijsku membranu ili da se poboljša stabilnost. Kao konkretan primer inhibitora u kojima treća rezidua sa C-terminusa je S ili T, ova rezidua može biti fosforilisana pre upotrebe peptida.

[0041] Farmakološki agensi takođe uključuju male molekule koji inhibiraju interakcije između PSD-95 i NMDAR 2B i/ili druge interakcije koje su gore opisane. Pogodni inhibitori malih molekula su opisani u npr. WO/2009/006611. Primer klase pogodnih jedinjenja ima formulu:

u kojoj R<1>je član izabran iz grupe koju čine cikloheksil supstituisan sa 0-4 R<7>, fenil supstituisan sa 0-4 R<7>, -(CH2)u- (CHR<8>R<9>), razgranati C1-6alkil (izopropil, izobutil, 1-izopropil-2-metil-butil, 1-etil propil), i -NH-C(O)-(CR<10>R<11>)vH;

svaki R<7>je nezavisno član izabran iz grupe koju čine C1-6alkil, C1-6alkoksi, -C(O)R<12>, OH, COOH, -NO, N-supstituisani indolin i translokacioni peptid ćelijske membrane;

svaki R<8>i R<9>je nezavisno izabran iz grupe koju čine H, OH, cikloheksan, ciklopentan, fenil, supstituisani fenil i ciklopentadien;

svaki R<10>i R<11>is nezavisno odabrana iz grupe koju čine H, cikloheksan, fenil i translokacioni peptid ćelijske membrane;

R<12>je član izabran iz grupe koju čine C1-6alkil i aril; i svaki od u i v su nezavisno od 0 do 20;

Pri čemu jedan od R<2>, R<3>, R<4>, R<5>i R<6>je -COOH, a ostatak od R<2>, R<3>, R<4>, R<5>i R<6>su svaki nezavisno izabrani iz grupe koju čine F, H, OCH3i CH3.

[0042] Jedno takvo jedinjenje je 0620-0057, čija struktura je:

[0043] Farmakološki agens može biti povezan sa internalizacionim peptidom zbog lakšeg preuzimanja u ćelije i/ili kroz krvno-moždanu barijeru. Internalizacioni peptidi su dobro poznata klasa relativno kratkih peptida koja omogućava mnogim ćelijskim ili viralnim proteinima prolazak kroz membranu. Internalizacioni peptidi, takođe poznati i kao transdukcijski peptidi ćelijske membrane ili peptidi za ćelijsku penetraciju mogu imati npr, 5-30 aminokiselina. Takvi peptidi obično imaju katjonsko naelektrisanje iz gornjeg normalnog predstavljanja (u odnosu na proteine generalno) od argininskih i/ili lizinskih ostataka za koji se veruje da olakšava prolaz kroz membrane. Neki takvi peptidi imaju najmanje 5, 6, 7 ili 8 argininskih i/ili lizinskih rezidua. Primeri obuhvataju protein antennapedia (Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997)) (i njegove varijante), tat protein virusa humane imunodeficijencije, protein VP22, produkt UL49 gena herpes simpleks virusa tipa 1, Penetratin, SynB1 i 3, Transportan, Amphipathic, gp41NLS, polyArg, i nekoliko biljaka i bakterijskih proteinskih toksina kao što je ricin, abrin, modeccin, toksin difterije, toksin kolere, toksin antraksa, termolabilni toksini, i Pseudomonas aeruginosa egzotoksin A (ETA). Drugi primeri su opisani u sledećim referencama (Temsamani, Drug Discovery Today, 9(23):1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004, Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1):1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005); Gao, ACS Chem. Biol. 2011, 6, 484-491, SG3 (RLSGMNEVLSFRWL) (SEQ ID NO: 77) (sve uključeno referencom).

[0044] Poželjan internacionalizacioni peptid je tat iz HIV virusa. Tat peptid prijavljen u prethodnom radu obuhvata ili se sastoji od standardne amino kiselinske sekvence YGRKKRRQRRR (SEK ID NO: 2) nađene u HIV Tat proteinu. Ukoliko su prisutne dodatne bočne rezidue takvog tat motiva (pored farmakološkog agensa) rezidue mogu biti na primer prirodne aminokiseline bočne za ovaj segment iz tat proteina, spejser ili linker aminokiseline vrste koja se obično koristi za spajanje dva peptidna domena, npr, Gli (Ser)4(SEK ID NO:44), TGEKP (SEK ID NO:45), GGRRGGGS (SEK ID NO:46), ili LRQRDGERP (SEK ID NO:47) (vidi, npr. Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)), ili može biti bilo koja druga aminokiselina koja značajno ne smanjuje kapacitet da omogući preuzimanje varijante bez bočnih rezidua. Poželjno, broj bočnih aminokiselina osim aktivnog peptida ne prelazi deset sa svake strane YGRKKRRQRRR (SEK ID NO:2). Jedan pogodan tat peptid koji obuhvata dodatne aminokiselinske rezidue bočne za C-terminus YGRKKRRQRRR (SEK ID NO:2) je YGRKKRRQRRRPQ (SEK ID NO:48). Međutim, poželjno bočne aminokiseline nisu prisutne. Drugi tat peptidi koji se mogu upotrebiti obuhvataju GRKKRRQRRRPQ (SEK ID NO:4) i GRKKRRQRRRP (SEK ID NO:72).

[0045] Varijante gornjeg tat peptida koji ima smanjeni kapacitet da se veže za N-tip kalcijumovih kanala su opisane u WO/2008/109010. Ovakve varijante mogu da sadrže ili se sastoje od amino kiselinske sekvence XGRKKRRQRRR (SEK ID NO:49), u kojoj je X aminokiselina različita od Y ili ništa (u kom slučaju G je slobodna N-terminalna rezidua). Poželjan tat peptid ima N-terminalnu Y reziduu supstituisanu sa F. Dakle, tat peptid koji sadrži ili se sastoji od FGRKKRRQRRR (SEK ID NO:3) je poželjna. Druga poželjna varijanta tat peptida sadrži GRKKRRQRRR (SEK ID NO:1). Drugi poželjan tat peptid sadrži ili se sastoji od RRRQRRKKRG (SEK ID NO: 10) ili RRRQRRKKRGY (SEK ID NO: 26) (amino kiseline-10 ili 1-11 SEK ID NO:70). Drugi tat izvedeni peptidi koji olakšavaju preuzimanje farmakološkog agensa bez inhibiranja N-tipa kalcijumovih kanala uključuju one predstavljene u Tabeli 2 u nastavku.

Tabela 2

1

[0046] X može predstavljati slobodan amino terminus, jednu ili više amino kiselina, ili konjugovani ostatak. Internalizacioni peptidi se mogu koristiti u inverznom ili retro ili retro inverznom obliku sa ili bez vezanog peptida ili peptidomimetika koji je u takvom obliku. Na primer, poželjni himerni peptid ima amino kiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od RRRQRRKKRGYKLSSIESDV (SEK ID NO:70, takođe poznata kao NA-1 ili Tat-NR2B9c) ili ima amino kiselinsku sekvencu koja sadrži ili se sastoji od RRRQRRKKRGY-KLSSIETDV (SEK ID NO:37).

[0047] Internalizacioni peptidi mogu biti vezani za farmakološke agense pomoću konvencionalnih metoda. Na primer, agensi mogu biti vezani sa internalizacionim peptidom pomoću hemijske veze, na primer preko nekog agensa za kuplovanje ili konjugovanje. Brojna takva sredstva su komercijalno dostupna i razmatrao ih je S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Neki primeri reagensa za umrežavanje obuhvataju J-sukcinimidil 3-(2-piridilditio) propionat (SPDP) ili N,N'-(1,3-fenilen) bismaleimid; N,N'-etilen-bis-(jodoacetamid) ili drugi sličan reagens sa 6 do 11 mostova ugljenik-metilen (koji su relativno specifični za sulfhidrilne grupe); i 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (koji formira ireverzibilne spojeve sa amino i tirozin grupama). Drugi reagensi za umrežavanje uključuju p, p'-difluorom, m'-dinitrodifenilsulfon (koji formira ireverzibilne unakrsne veze sa amino i fenolnim grupama); dimetil adipimidat (koji je specifičan za amino grupe); fenol-1,4-disulfonilhlorid (koji reaguje prvenstveno sa amino grupama); heksametildiizocijanat ili diizotiocijanat ili azofenil-p-diizocijanat (koji reaguje prvenstveno sa amino grupama); glutaraldehid (koji reaguje sa nekoliko različitih bočnih lanaca) i disdiazobenzidin (koji reaguje prvenstveno sa tirozinom i histidinom).

[0048] Za farmakološke agense koji su peptidi veza sa internalizacionim peptidom može biti postignuta generisanjem fuzionog proteina koji sadrži peptidnu sekvencu fuzionisanu, poželjno na njegovom N-kraju, sa internalizacionim peptidom.

[0049] Umesto ili kao i vezivanjem peptida (ili drugog agensa) koji inhibira PSD-95 za internalizacioni peptid, takav peptid može biti vezan sa lipidom (lipidacija) da se poveća hidrofobnost konjugata u odnosu na sam peptid, a time i olakša prolazak vezanog peptida kroz ćelijske membrane i/ili kroz moždanu barijeru. Lipidacija se poželjno izvodi na N-terminalnoj aminokiselini ali se može izvesti na unutrašnjim aminokiselinama, pod uslovom da sposobnost peptida da inhibira interakciju između PSD-95 i NMDAR 2B nije smanjena više od 50%. Poželjno, lipidacija se vrši na amino kiselini, različitoj od jedne od četiri najviše C-terminalne aminokiseline. Lipidi su organski molekuli koji se bolje rastvaraju u etru nego u vodi i oobuhvataju masne kiseline, gliceride i sterole. Pogodni oblici lipidacije uključuju miristilaciju, palmitoilaciju ili adiciju drugih masnih kiselina poželjno sa dužinom lanca od 10-20 ugljenika, poput laurinske kiseline i stearinske kiseline, kao i geranilaciju, geranilgeranilaciju i izoprenilaciju. Poželjne su lipidacije tipa koji se javlja u posttranslacionoj modifikaciji prirodnih proteina. Takođe je poželjna lipidacija sa masnom kiselinom formiranjem amidne veze sa alfa-amino grupom N-terminalne aminokiseline peptida. Lipidacija može biti izvedena pomoću sinteze peptida uključujući prethodno lipidovanu aminokiselinu, može biti izvedena pomoću enzima in vitro ili rekombinantne ekspresijem, hemijskim umrežavanjem ili hemijskom derivatizacijom peptida. Aminokiseline modifikovane miristilacijom i drugim lipidnim modifikacijama su komercijalno dostupne.

[0050] Lipidacija poželjno olakšava prolazak vezanog peptida (npr. KLSSIESDV (SEK ID NO:5), ili KLSSIETDV (SEK ID NO:43)) kroz ćelijsku membranu i/ili krvno-moždanu barijeru bez izazivanja prolaznog smanjenja krvnog pritiska što je pronađeno kada je standardni tat peptid administriran u visokoj dozi (npr. jednakoj ili većoj od 3 mg/kg) ili bar sa manjom redukcijom u odnosu na isti peptid povezan sa standardnim tat peptidom.

[0051] Farmakološki peptidi, opciono fuzionisani sa TAT peptidima, mogu biti sintetisati sintezom čvrste faze ili rekombinantnim metodama. Peptidomimetici mogu biti sintetisani korišćenjem različitih postupaka i metodologija opisanih u naučnoj i patentnoj literaturi, npr, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley&Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol.1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers.3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol.267:220-234.

III. Agensi i Metode za Reperfuziju

[0052] Plakovi i krvni ugrušci (takođe poznati kao embolije) koji uzrokuju ishemiju mogu biti rastvoreni, uklonjeni ili zaobiđen kako farmakološkim tako i fizičkim sredstvima. Rastvaranje, uklanjanje plakova i krvnih ugrušaka i posledična obnova krvotoka se naziva reperfuzija. Jedna klasa sredstava deluje pomoću trombolize. Ovi agensi deluju podstičući fibrinolizu pomoću plazmina preko infuzije tkivnog aktivatora plazminogena (tPA). Plazmin uklanja fibrinsku mrežu (osnova ugruška), čineći ugrušak rastvorljivim i predmetom dalje proteolize od strane drugih enzima, i obnavlja protok krvi u okludiranim krvnim sudovima. Primeri trobolitičkih agensa uključuju aktivator tkivnog plazminogena t-PA, alteplazu (Activase), reteplazu (Retavase), tenekteplazu (TNKase), anistreplazu (Eminase), streptokinazu (Kabikinase, Streptase) i urokinazu (Abbokinase).

[0053] Druga klasa lekova koja se može koristiti za reperfuziju su vazodilatatori. Ovi lekovi deluju opuštajuće i otvaraju krvne sudove omogućavajući krvi da teče oko opstrukcija. Neki primeri tipova vazodilatatora antagonisti alfaadrenoceptora (alfa-blokatori), blokatori Angiotenzinskih receptora (ARB), Beta2-adrenergički agonisti (ß2-agonisti), blokatori kalcijumovih-kanala (CCBS), centralno delujući simpatolitici, direktno delujući vazodilatatori, antagonisti endotelinskog receptora, ganglionski blokatori, nitrodilatori, inhibitori fosfodiesteraze, otvarači kalijumovih kanala i reninski inhibitori.

[0054] Druga klasa lekova koji se mogu koristiti za reperfuzije su hipertenzivni lekovi (t.j. lekovi za podizanje krvnog pritiska), kao što su epinefrin, fenilefrinom, pseudoefedrin, norepinefrin; norefedrin; terbutalin; salbutamol; i metilefedrin. Povećan perfuzioni pritisak može povećati protok krvi oko opstrukcije.

[0055] Mehaničke metode reperfuzije uključuju angioplastiku, kateterizaciju i arterijsku bajpas graft hirurgiju, stentovanje, embolektomiju ili endarterektomiju. Takvi postupci protok plaka mehaničkim uklanjanjem plaka, držeći krvni sud otvoren, tako da krv može da teče oko plaka ili zaobilazeći plak.

[0056] Ostale mehaničke metode reperfuzije obuhvataju upotrebu uređaja koji preusmeravaju protok krvi iz drugih delova tela ka mozgu. Primer je kateter koji delimično okludira aortu, kao što je CoAxia NeuroFlo™ kateterski uređaj, koji je nedavno bio podvrgnut randomizovanoj studiji i može da dobije odobrenje FDA za lečenje moždanog udara. Ovaj uređaj je korišćen na subjektima koji su imali moždani udar do 14 sati nakon početka ishemije.

[0057] Upotreba ne-tromolitičkog agensa ili mehaničke metode reperfuzije ne izlažu peptid PSD-95 inhibitor proteolitičkom cepanju, što može biti prednost ukoliko se inhibitor PSD-95 i reperfuzija primenjuju istovremeno ili vremenski približno.

IV. Moždani udar

[0058] Moždani udar je stanje koje nastaje usled poremećenog krvotoka u CNS bez obzira na uzrok. Potencijalni uzroci uključuju emboliju, hemoragiju i trombozu. Neke neuronske ćelije odumiru odmah usled poremećenog krvotoka. Ove ćelije oslobađaju svoje molekulske komponente uključujući glutamat, što zauzvrat aktivira NMDA receptore, koji povećavaju intracelularni nivo kalcijuma, i intracelularne nivoe enzima dovodeći dalje do smrti neuronske ćelije (kaskada ekscitotoksičnosti). Smrt CNS tkiva se naziva infarkt. Zapremina infarkta (t.j. zapremina mrtvih neuronskih ćelija kao rezultat moždanog udara) se može koristiti kao indikator obima patološkog oštećenja usled moždanog udara. Simptomatski efekat zavisi i od zapremine infarkta i mesta u mozgu na kom se nalazi. Indeks onesposobljenosti se može koristiti kao mera simptomatskog oštećenja, kao što je Rankinova skala ishoda moždanog udara (Rankin, Scott Med J; 2:200-15 (1957)) i Bartelov Indeks. Rankinova skala se zasniva na direktnoj proceni globalnog stanja subjekta kako sledi.

Tabela 3

0 Bez simptoma

[0059] Bartelov Indeks se zasniva na seriji pitanja o sposobnosti subjekta da izvede 10 osnovnih aktivnosti svakodnevnog života dovodeći do skora između 0 i 100, niži skor ukazuje na teži invaliditet (Mahoney et al., Meryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).

[0060] Alternativno ozbiljnost/ishodi moždanog udara se mogu meriti pomoću NIH skale moždanog udara,<dostupne na>www.mnds.nih.gov/doctors/NIH Stroke Scale Booklet.pdf<.>

[0061] Skala je zasnovana na sposobnosti subjekta za obavljanje 11 grupa funkcija koje ukljucuju procenu subjektovog nivoa svesnosti, motornih, senzornih i jezičkih funkcija.

[0062] Ishemijski moždani udar se konkretno odnosi na tip moždanog udara koji je prouzrokovan blokadom protoka krvi u mozgu. Osnovni uslov za ovu vrstu blokade je najčešće razvoj masnih naslaga koje oblažu zidove krvnih sudova. Ovo stanje se naziva ateroskleroza. Ove masne naslage mogu izazvati dva tipa opstrukcija. Cerebralna tromboza se odnosi na tromb (krvni ugrušak) koji se razvija u začepljenom delu krvnog suda "Cerebralna embolija" se generalno odnosi na ugrušak krvi ili aterom koji se formira na drugoj lokaciji u cirkulatornom sistemu, obično srcu i velikim arterijama gornjeg dela grudnog koša i vrata. Deo krvnog ugruška i/ili ateroma se onda odlomi, uđe u krvotok i putuje kroz moždane krvne sudove dok ne dospe u sudove koji su suviše mali da bi mogali da ga propuste. Drugi važan uzrok embolije je nepravilan rad srca, poznat kao arterijska fibrilacija. Ona stvara uslove u kojima ugrušci mogu da se formiraju u srcu, napuste ga i otputuju ka mozgu. Dodatni potencijalni uzroci ishemijskog moždanog udara su hemoragija, tromboza, disekcija arterije ili vene, zastoj srca, šok od bilo kog uzroka uključujući hemoragiju, i jatrogeni uzroci, kao što je direktna hirurška povreda krvnih sudova mozga ili sudova koji vode ka mozgu ili operacija srca. Ishemijski moždani udar čini oko 83 odsto svih slučajeva moždanog udara.

[0063] Tranzitorni ishemijski ataci (TIA) su manji ili upozoravajući moždani udari. Kod TIA su prisutna stanja koja ukazuju na ishemijski moždani udar i razvijaju se tipični znaci upozorenja moždanog udara. Međutim, opstrukcija (krvni ugrušak) se javlja na kratko vreme i teži da se razgradi kroz normalne mehanizme. Subjekti podvrgnuti operaciji srca su u posebnom riziku od prolaznog cerebralnog ishemijskog napada.

[0064] Hemoragijski moždani udar čini oko 17 posto slučajeva moždanog udara. On je rezultat oslabljenog krvnog suda koji prska i krvari u okolni mozak. Krv se akumulira i pritiska okolno tkivo mozga. Ova dva opšta tipa hemoragičnog moždanog udara su intracerebralna hemoragija i subarahnoidalna hemoragija. Hemoragijski moždani udar je rezultat ruptura oslabljenog krvnog suda. Potencijalni uzroci rupture oslabljenog krvnog suda uključuju hipertenzivnu hemoragiju, kod koje visok krvni pritisak uzrokuje rupture krvnih sudova ili drugi osnovni uzrok oslabljenih krvnih sudova, kao što je rupturisana vaskularna malformacija mozga uključujući moždanu aneurizmu, arteriovenske malformacije (AVM) ili kavernozne malformacije. Hemoragijski moždani udari mogu nastati od hemoragijske transformacije ishemičnog moždanog udara koji slabi krvne sudove kod infarkta, ili krvarenja iz primarnih tumora ili metastaza u CNS koji sadrže abnormalno slabe krvne sudove. Hemoragijski moždani udar može nastati od jatrogenih uzroka, kao što je direktna hirurška povreda krvnog suda u mozgu. Aneurizma je proširivanje oslabljenog regiona krvnog suda. Ako se ne leči, aneurizma može da nastavi da slabi sve dok ne pukne i iskrvari u mozgu. Arteriovenska malformacija (AVM) je klaster abnormalno formiranih krvnih sudova. Kavernozna malformacija je venska abnormalnost koja može izazvati krvarenje iz oslabljenih venskih struktura. Bilo koji od ovih krvnih sudova može da pukne, takođe izazivajući krvarenje u mozgu. Hemoragijski moždani udar može rezultirati iz fizičke traume. Hemoragijski moždani udar u jednom delu mozga može dovesti do ishemijskog moždanog udara u drugom usled nedostatka krvi izgubljene u hemoragijskom moždanom udaru.

V. Subjekti podložni tretmanu

[0065] Subjekti podložni lečenju obuhvataju subjekte koji su imali znak(e) i/ili simptom(e) ishemije, bilo u CNS ili negde drugo u telu, ali koji utiču na krvni sud čija opstrukcija može ometati protok krvi u mozgu. Ovi subjekti uključuju subjekte koji pokazuju znak(e) i/ili simptom(e) moždanog udara, ishemije miokarda, plućne embolije, ishemije ekstremiteta, renalne ili retinalne ishemije. Takvi subjekti uključuju subjekte kod kojih se

1

sumnja na takvo stanje, ali se ne mogu isključiti i druga stanja, kao i subjekti koji su dijagnostikovani prema opšte priznatim kriterijumima, npr., DSM IV TR.

[0066] Subjekti podložni lečenju takođe obuhvataju subjekte pod rizikom od ishemije, kod kojih još nije došlo do početka ishemije. Subjekt je u opasnosti ako on ili ona ima veći rizik od razvoja ishemije od kontrolne grupe. Kontrolna populacija može uključivati jednog ili više pojedinaca izabranih nasumično iz opšte populacije (npr. odgovaraju prema starosti, polu, rasi i/ili etničkoj pripadnosti) koji nisu dijagnostikovani ili imaju porodičnu istoriju poremećaja. Može se smatrati da je subjekt pod rizikom od poremećaja ako se utvrdi da je "faktor rizika", koji je u vezi sa tim poremećajem, povezan sa tim subjektom. Faktor rizika može uključivati bilo koju aktivnost, osobinu, događaj ili svojstvo povezano sa određenim poremećajem, na primer, preko statističkih ili epidemioloških studija na populaciji subjekata. Prema tome subjekt se može klasifikovati da je pod rizikom od poremećaja iako studije koje identifikuju faktore rizika ne obuhvataju subjekt konkretno. Na primer, subjekt koji je prošao operaciju srca je pod rizikom od prolaznog cerebralnog ishemičnog napada pošto je učestalost prolaznog cerebralnog ishemičnog napada povećana u populaciji subjekata koji su prošli operaciju srca u odnosu na populaciju subjekata koji nisu.

[0067] Subjekti pod rizikom od ishemije koja pogađa mozak uključuju one podvrgnute hirurškoj proceduri na mozgu ili CNS, kao što je endovaskularna operacija, kliping, stentovanje ili mikrokateterizacija. Takvi subjekti obuhvataju i one koji su negde u telu podvrgnuti operaciji koja utiče na krvni sud koji snabdeva mozak (koji povezuje mozak sa srcem, na primer, karotidne arterije i jugularne vene) ili na arteriju koja snabdeva krvlju retinu, bubrege, kičmenu moždinu ili udove. Prioritetna klasa subjekata su oni podvrgnuti endovaskularnoj operaciji za lečenje mozdane aneurizme. Subjekti koji su bili podvrgnuti ovoj vrsti operacije imaju povećan rizik od ishemije koja pogađa CNS. Pacijenti sa rizikom od moždanog udara uključuju pacijente koji su pušači, htpertenzivni, dijabetičari ili pacijenti sa hiperholesterolemijom. Subjekti sa posebno visokim rizikom su oni koji su prethodno imali moždani udar, manji moždani udar ili prolazni ishemijski napad.

VI. Kombinovane Metode Lečenja

[0068] Kombinovane metode su uključivale administriranje PSD-95 inhibitora i oblika reperfuzione terapije subjektu koji je podložan tretmanu. PSD-95 inhibitor i reperfuzija se mogu primenjivati u bilo kom redosledu ili istovremeno. Obično se inhibitor PSD-95 i reperfuzija administriraju u isto, preklapajuće ili približno vreme (t.j. u 15-tominutnom intervalu) ili se prvo administrira inhibitor PSD-95.

[0069] Za lečenje ishemija koje se ne mogu unapred predvideti, inhibitor PSD-95 se može administrirati što je pre moguće ili praktično posle pojave ishemije. Na primer, inhibitor PSD-95 se može administrirati u periodu od 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 ili 24 časa nakon pojave ishemije. Za ishemije koji se mogu unapred predvideli, inhibitor PSD-95 se može administrirati pre, istovremeno ili posle pojave ishemije. Na primer, za ishemiju nastalu usled operacije, inhibitor PDS95 se ponekad rutinski administrira u periodu koji počinje 30 minuta pre početka operacije i završava 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12 ili 24 sata nakon operacije, bez obzira da li ishemija postoji ili će se razvijati. Pošto inhibitor PSD-95 nema ozbiljnih neželjenih efekata, može se primenjivati kada se sumnja na moždani udar ili druga ishemijska stanja, pre uspostavljana dijagnoze u skladu sa u struci priznatim kriterijumima. Na primer, inhibitor PSD-95 se može administrirati na lokaciji gde se dogodio moždani udar (npr. u kući pacijenta) ili ambulantnom vozilu prilikom prevoza pacijenta u bolnicu. PSD-95 inhibitor se može bezbedno administrirati subjektu koji je pod rizikom od moždanog udara ili drugih ishemijskih stanja pre nastanka, kod kojeg stanje može ali zapravo i ne mora da se razvije.

[0070] Posle a ponekad i pre, administracije inhibitora PSD-95, subjekt koji pokazuje znak(e) i/ili simptom(e) ishemije može biti predmet dalje dijagnostičke procene da se utvrdi da li subjekt ima ishemiju u CNS ili negde drugo koja utiče na CNS i utvrdi da li subjekat ima ili je podložan hemoragiji. Naročito kod subjekata sa simptomima moždanog udara, testiranje pokušava da razlikuje da li je moždani udar rezultat hemoragije ili ishemije, hemoragiji se pripisuje oko 17% moždanih udara. Dijagnostički testovi mogu uključivati skeniranje jednog ili više organa, kao što su CAT skeniranje, MRI ili PET imidžing skeniranje ili test krvi za biomarker koji ukazuje da je došlo do moždanog udara. Poznato je nekoliko biomarkera povezanih sa moždanim udarom, uključujući neurotrofni faktor rasta B-tipa, Fon Vilebrandov faktor, matriks metaloproteinaze-9 i monocitni kemotaktički protein 1 (vidi Reynolds et al., Clinical Chemistry 49: 1733-1739 (2003)). Skenirani organ(i) uključuju svaki koji je pod sumnjom da je mesto ishemije (npr. mozak, srce, ekstremiteti, kičma, pluća, bubreg, retina kao i bilo koji drugi, za koji se sumnja da je izvor hemoragije. Skeniranje mozga je uobičajena procedura za razlikovanje između ishemijskog i hemoragijskog moždanog udara. Dijagnostička procena može uključivati uzimanje ili razmatranje medicinske istorije subjekta i obavljanje drugih testova. Prisustvo bilo kojeg od sledećih faktora, samostalno ili u kombinaciji, se može koristiti u proceni da li reperfuziona terapija predstavlja neprihvatljiv rizik: subjektovi simptomi su minorni ili naglo poboljšani, subjekat je imao napad na početku moždanog udara, subjekat nije imao drugi udar ili teške traume glave tokom poslednja 3 meseca, subjekat je imao veliku operaciju u poslednjih 14 dana, subjekat ima poznatu istoriju intrakranijalnih krvarenja, subjekat je pretrpeo sistolni krvni pritisak > 185 mmHg, subjekat je pretrpeo dijastolni krvni pritisak > 110 mmHg, neophodno je agresivno lečenje za smanjenje krvnog pritiska subjekta, subjekat ima simptome koji ukazuju na subarahnoidne hemoragije, subjekat je imao gastrointestinalne ili hemoragije urinarnog trakta u poslednjih 21 dan, subjekat je imao arterijsku punkciju na nekompresibilnom mestu u poslednjih 7 dana, subjekat je primio heparin u poslednjih 48 sati i ima povišen PTT, protrombinsko vreme subjekta (PT) je > 15 sekundi, broj trombocita kod subjekta je < 100.000 mL, glukoza u serumu subjekta je < 50 mg/dL ili > 400 mg/dL, subjekat je hemofiličar ili ima druge nedostatke zgrušavanja.

[0071] Dalja dijagnostička ispitivanja utvrđuju u skladu sa priznatim kriterijumima ili bar sa velikom verovatnoćom da li je pre ispitivanja subjekat imao stanje ishemije i da li subjekt ima hemoragiju, neprihvatljiv rizik od hemoragije ili je na drugi način isključen od primanja reperfuzione terapije zbog neprihvatljivog rizika od neželjenih pojava. Subjekti kod kojih je potvrđena dijagnoza ishemijskog stanja u CNS ili stanja koje na drugi način verovatno utiče na CNS i koji je bez neprihvatljivog rizika od neželjenih pojava tada može biti podvrgnut reperfuzionoj terapiji. Poželjno, reperfuziona terapija se obavlja što je pre moguće, praktično nakon završetka svih dijagnostičkih procedura. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija se započinje ranije od 0, 1, 2, 3, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18 ili 24 h posle pojave ishemije. Kod moždanih udara koji se javljaju u medicinskom okruženju (npr, tokom endovaskularnih procedura) tretman može da započne manje od 1 sat posle početka. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje 0.5-6, 0.5-12, 0.5-18 ili 0.5-24 sati posle početka ishemije. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje izvan uobičajenog 3-4.5 časovnog prozora u kojem se reperfuziona terapija do sada smatrala efikasnom. Na primer, kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje više od 3 sata ili više od 4.5 sata posle početka ishemije i do 24 ili 48 sati posle početka ishemije. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje, nakon 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 sati i do 24 ili 48 sati nakon pojave ishemije. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje od 275-390 minuta posle početka ishemije. Kod nekih subjekata, reperfuziona terapija započinje nezavisno od momenta nastanka ishemije pod uslovom da su se kvalifikovali za reperfuziju na osnovu specifičnih dijagnostičkih kriterijuma kao što je odsustvo definitivnog infarkta na CT skeniranju, dokaz ishemijske penumbre kompjuterizovanom tomografijom (CT), magnetnom rezonancom (MRI) ili pomoću Pozitronske Emisione Tomografije (PET), i odsustvo krvarenja u mozgu.

[0072] Vreme reperfuzije se takođe može meriti od davanja inhibitora PSD-95. Interval može biti, na primer, 5 minuta do 24 ili 48 sati (interval između administracije PSD-95 i reperfuzije, ovde kao i na drugim mestima u ovoj prijavi, meren od inicijacije administracije PSD-95 inhibitora do inicijacije administracije reperfuzije). Interval može biti, na primer, 15 min do 6 časova, 15 min do 4.5 časa, 15 min do 3 časa, 15 min do 1 čas, 30 minuta do 6 časova, ili 30 min do 3 časa, ili 30 minuta do 4.5 časa ili 1-3 časa ili 1-4.5 časa. Duži interval može biti pogodan za peptidne PSD-95 inhibitore, kao što je tat-NR2B9c koji je korišćen u kombinaciji sa agensima za reperfuziju koji deluju preko proteolize (npr, tPA), pošto on inhibitoru daje duži period da ispolji dejstvo pre nego što bude podvrgnut proteolitičkoj degradaciji pomoću nastalog plazmina.

[0073] Subjektima kod kojih ishemično stanje nije potvrđeno ili ga verovatno nemaju, se obično ne administrira reperfuziona terapija. Takvi subjekti možda nisu imali nikakvu korist od PSD-95 inhibitora, ali nisu ništa lošije od netretiranih. Subjekti kod kojih je stanje ishemije potvrđeno ili se smatra verovatnim ali se smatra da poseduju neprihvatljiv rizik od neželjenih efekata reperfuzione terapije, se ova terapija ne administrira. Takvi subjekti mogu imati korist od PSD- 95 inhibitora, ali su pošteđeni rizika od neprihvatljivih neželjenih efekata reperfuzione terapije.

[0074] I tretman sa PSD-95 inhibitorom i reperfuziona terapija nezavisno mogu da smanje veličinu infarkta i funkcionalne deficite usled ishemije. Kada se koristi u kombinaciji prema predstavljenim metodama, smanjenje veličine infarkta i/ili funkcionalni deficiti su poželjno veći nego kod upotrebe ili samog agensa administriranog pod uporedivim režimom različitim od kombinacije (t.j. kooperativno). Poželjnije, smanjenje veličine infarkta i/ili funkcionalnih deficita je najmanje zbir ili poželjno više od zbira (t.j. sinergističko) smanjenja koja postižu sami agensi pod uporedivim režimom osim u kombinaciji. U nekim režimima reperfuziona terapija je efikasna u smanjenju veličine infarkta i/ili funkcionalnih vremena u periodu posle početka ishemije (npr. više od 4.5 sata) kada bi to bilo neefikasno ali uz istovremenu ili prethodnu administraciju PSD-95 inhibitora. Drugim rečima, kada se subjektu administrira PSD-95 inhibitor ili reperfuziona

1

terapija, reperfuziona terapija je poželjno je efikasna bar kao kada bi bila administrirana ranije bez PSD-95 inhibitora. Tako, inhibitor PSD-95 efektivno povećava efikasnost reperfuzione terapije smanjenjem jednog ili više štetnih efekata ishemije pre ili kada reperfuziona terapija počne da deluje. PSD-95 inhibitor tako može da nadoknadi zakašnjenja u administriranju reperfuzione terapije bilo da je kašnjenje usled zakašnjenja subjekta da prepozna opasnost svojih početnih simptoma, zakašnjenja u transportu subjekta u bolnicu ili drugu zdravstvenu ustanovu ili odlaganja obavljanja dijagnosti

ke procedure za utvrđivanje prisustva ishemije i/ili odsustva hemoragije ili njihovog neprihvatljivog rizika. Statistički značajni kombinovani efekti PSD-95 inhibitora i reperfuzione terapije uključujući dodatne ili sinergističke efekte mogu biti demonstrirani između populacija u kliničkoj studiji ili između populacija u životinjskim modelima u predkliničkom radu.

VI. Efikasni Režimi Administracije

[0075] A PSD-95 inhibitor se administrira u količini, frekvenciji i putu administracije efikasnom za smanjenje, inhibiranje ili odlaganje jednog ili više štetnih efekata ishemije na CNS. Ukoliko nije drugačije naznačeno, doze inhibitora koji su himerni agensi uključujući farmakološki agens povezan sa internalizacionim peptidom se odnose na ceo agens umesto samo na komponentu farmakološkog agensa himernog agensa. Efikasna količina označava količinu agensa dovoljnu da značajno smanji, inhibira ili odloži jedan ili više štetnih efekata ishemije u populaciji subjekata (ili životinjskim modelima) obolelim od bolesti koja se tretira sa agensom iz ovog pronalaska u odnosu na štetne efekte u kontrolnoj populaciji ispitanika (ili životinjskih modela) koji boluju od te bolesti ili stanja koji nisu tretirani agensom. Količina se takođe može smatrati delotvornom ako pojedinačno tretirani subjekt postiže ishod povoljniji od srednjeg ishoda u kontrolnoj populaciji uporedivih subjekata koji nisu lečeni postupcima prema predmetnom pronalasku. Delotvoran režim obuhvata primenu efikasne doze sa frekvencijom i putem administracije potrebnim da se postigne željeni cilj.

[0076] Kada je stanje koje zahteva lečenje moždani udar, ishod može biti određen zapreminom infarkta ili indeksom onesposobljenosti, doziranje može biti prepoznato kao efektivno, ako pojedinačni tretirani subjekt pokazuje invaliditet dva ili manje na Rankin skali i 75 ili više na Bartel skali, vidi Lees et at 1., N Engl J Med 2006;354:588-600 ili ako populacija lečenih subjekata pokazuje značajno bolju (tj., manju invalidnost) distribuciju bodova na bilo kojoj skali invalidnosti (npr., Barthel, Rankin, NIH Stroke Scale) nego uporediva netretirana populacija, ili ako populacija tretiranih subjekata pokazuje značajno manju veličinu infarkta ili broj u poređenju sa uporedivom netretiranom populacijom. Jedna doza agensa je obično dovoljna za lečenje moždanog udara. Medjutim, višestruke doze se mogu ordinirati u intervalima od na primer, 1, 2, 3, 6, 12, 18 ili 24 časa sve dok se na CT snimku ne utvrdi prisustvo definitivnog infarkta, ili se ne uočava dalji benefit.

[0077] U zavisnosti od agensa, administracija može biti parenteralna, intravenozna, nazalna, oralna, subkutana, intra-arterijska, intrakranijalna, intratekalna, intraperitonealna, topikalna, intranazalna ili intramuskularna. Za peptidne agense je poželjna intravenska administracija.

[0078] Za himerne agense uključujući i internalizacioni peptid, naročito HIV tat peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu YGRKKRRQRRR (SEK ID NO:2), administracija agensa se može ali ne mora kombinovati sa anti-inflamatornim agensom za smanjenje oslobađanja histamina i njegovih nizvodnih efekata povezanih sa visokim nivoima internalizacionog peptida. Poželjni agensi za koadministraciju su inhibitori degradacije mast ćelija, poput kromolina ili lodoksamida ili bilo koji drugi ovde naveden. Takođe se mogu koristiti anti-histamini ili kortikosteroidi, naročito u kombinacijama ili većim dozama (vidi WO2009/076105 i WO2010/144742).

[0079] Za administraciju ljudima, poželjna doza himernog agensa tat-NR2B9c je 2-3mg/kg a poželjnije 2.6 mg/kg. Navedene doze treba shvatiti tako da uključuju marginu greške inherentnu tačnosti sa kojom doze mogu da se mere u tipičnom bolničkom okruženju. Ta doza je poželjna zato što je to maksimalna doza sa kojom agens može da se administrira bez oslobađanja značajnih količina histamina i posledica koje će uslediti kod većine subjekata. Iako se oslobađanje histamina pri većim dozama može kontrolisati koadministracijom antiinflamatornog agensa kako je gore razmotreno i u svakom slučaju najčešće spontano rešava bez neželjenih dejstava, ono se najbolje može izbeći držanjem doze ispod 3 mg/kg, a poželjno 2-3 mg/kg, još poželjnije 2.6 mg/kg. Takve količine su za administraciju u jednoj dozi, odnosno jednoj dozi po epizodi bolesti. Takve doze takođe mogu biti administrirane dnevno ili još češće. Mogu se koristiti manje doze, opciono 1-2 mg/kg, odnosno 0.5-1 mg/kg, 0.1-0.5 mg/kg ili manje od 0.1 mg/kg. Za ponovljene dozne režime, mogu se koristiti i niže doze.

1

[0080] Doze naznačene gore su za himerni agens tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV; SEK ID NO:6). Ekvivalentne doze za druge agense za postizanje istog efekta mogu biti određene pomoću nekoliko pristupa. Za bliske varijante tog agensa u kojima su jedna ili nekoliko aminokiselina supstituisane, umetnute ili izbačene, a molekulska težina ostala ista u okviru od oko /- 25%, navedene doze su uvek dobar vodič. Međutim, generalno, za druge agense, ekvivalentne doze mogu varirati u zavisnosti od molekulske težine agensa sa i bez internalizacionog peptida ukoliko je prisutan, njegove Kdza njegovu metu, i farmakokinetičkih i farmakodinamskih parametara. Za neke agense, ekvivalentne doze se mogu izračunati tako da isporuče ekvimolarnu količinu farmakološkog agensa. Za druge agense, može biti izvršeno dodatno podešavanje da se uračunaju razlike u Kd ili farmakokinetičkih ili farmakodinamskih parametara. Za neke agense, ekvivalentne doze se empirijski određuju na osnovu doze koja je postignuta da bi se postigao isti krajnji rezultat u životinjskom modelu ili u kliničkoj studiji.

[0081] Peptidni agensi, poput Tat-NR2B9c se poželjno isporučuju infuzijom u krvni sud, poželjnije intravenoznom infuzijom. Za himerni agens Tat-NR2B9c, poželjno vreme infuzije koje obezbeđuje ravnotežu između ovih razmatranja je 5-15 minuta a poželjnije 10 minuta. Navedena vremena treba razumeti tako da uključuju učinjenu grešku od /- 10%. Vremena infuzije ne uključuju dodatno vreme za “wash out” difuziju za ispiranje kapljica zaostalih od inicijalne difuzije koja se inače odvijala do završetka. Vremena infuzije za TatNR2B9c mogu poslužiti kao vodič za ostale farmakološke agense, opciono vezane za internalizacione peptide, naročito za bliske varijante agensa TatNR2B9c, kako je gore diskutovano.

[0082] PSD-95 inhibitor može biti administriran u obliku farmaceutske kompozicije. Farmaceutske kompozicije se obično proizvode pod GMP uslovima. Farmaceutske kompozicije za parenteralnu administraciju su prevashodno sterilne (npr. sterilizacija peptida filtracijom) i apirogene. Farmaceutske kompozicije mogu biti isporučene u jediničnom doznom obliku (tj. doza za jednu administraciju). Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane na uobičajeni način pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenata ili pomoćnih agensa koji olakšavaju obradu himernih agensa u preparatima za farmaceutsku upotrebu. Pravilna formulacija zavisi od izabranog puta administracije.

[0083] Primer formulacije himernog agensa Tat-NR2B9c sadrži peptid u normalnom slanom rastvoru (0.8-1.0% a poželjno 0.9% slanom rastvoru) ili fosfatnom puferskom slanom rastvoru u koncentraciji od 10-30 mg/ml, na primer 16-20 ili 18 mg/ml ili 20 mg/ml. Kada se čuva zamrznuta, takva kompozicija je stabilna (zanemarljiva degradacija ili agregacija peptida) u periodu od četiri ili više godina. Iako mogu da se dodaju dodatni ekscipijenti, normalni fiziološki rastvor ili fosfatni puferovani slani rastvor bez takvih ekscipijenata je dovoljan za ostvaarivanje ove stabilnosti. Za upotrebu se takva kompozicija otapa i razblažuje u većoj zapremini normalnog fiziološkog rastvora za infuziju u krvni sud.

[0084] Mnogi primeri farmakološkog agensa za reperfuziju su u kliničkoj upotrebi. Takvi agensi se mogu koristiti u predstavljenim kombinovanim postupcima u skladu sa svojim konvencionalnim formulacijama, dozama, putevima primene, i učestalosti administracije (vidi Lekarski priručnik i uputstva za primenu preparata). Na primer, tPA ili drugi trombolitički agensi se ljudima mogu administrirati intravenski u dozi od npr. 0.5-1.5 mg/kg, poželjno 0.9 mg/kg. tPA i drugi trombolitički agensi takođe mogu biti administrirani intra-arterijski poželjno pri dozi od 0.02-0.1 mg/kg/čas humanim pacijentima u trajanju do 36 sati. tPA i drugi trombolitički agensi se takođe mogu administrirati direktno na mesto oštećenja krvotoka, npr., embolija u mozgu, za koju je poželjna doza 2 mg kod humanih pacijenata (ili manje kod bolesnika sa težinom ispod 30 kg). Poželjna je lokalizovana administracija preko katetera. Direktna administracija na mesto infarkta smanjuje potencijalno izlaganje peptidnih inhibitora PSD-95 proteolitičkoj degradaciji. Isto tako se mogu koristiti mehaničke metode reperfuzije u skladu sa uobičajenom praksom.

PRIMERI PRIMER 1:

Neuroprotekcija Nakon Moždanog Udara u Girencephalic Primata Starog Sveta

Uvod

[0085] Koristili smo girencefalne ne-humane primate (NHP) višeg reda koji imaju genetske, anatomske i bihejvioralne sličnosti sa ljudima i testirali neuroprotekciju PSD95 inhibitorima, jedinjenjima koja razdvaja postsinaptički protein gustine PSD-95 оd neurotoksičnih signalnih puteva. Ovde smo pokazali da se oštećenje od moždanog udara može sprečiti kod NHP u kojima se inhibitor PSD95 administrira posle početka moždanog

1

udara. Ovaj tretman je smanjio zapremine infarkta merene magnetnom rezonancom (MRI) i histološki, očuvao sposobnost ishemijskih ćelija da održe transkripciju gena u skriningu čitavog genoma ishemičnog moždanog tkiva, i značajno očuvao neurološku funkciju u neurobihejvioralnim testovima. Stepen neuroprotekcije tkiva prema MRI je snažno odgovarao očuvanju neurološke funkcije, podržavajući nedokazanu izreku da integritet moždanog tkiva može da odrazi funkcionalni ishod. Naši nalazi su ustanovili da se upotrebom PSD95 inhibitora nedvosmisleno može postići neuroprotekcija tkiva i poboljšan funkcionalni ishod posle moždanog udara kod girencefalnih NHP.

Generalni tok Eksperimenta i procene

[0086] Sve eksperimente smo izveli uz prikrivanje alokacija i slepu procenu svih ishoda. Primarna mera ishoda je bila zapremina infarkta nakon 30 dana merena u T2-W magnetno rezonantnoj MRI studiji. Anatomski sekundarni ishodi su bili zapremine infarkta na 4h i 24h pomoću difuzione magnetno rezonantne tomografije (DWI) MRI, nakon 24h pomoću T2 MRI i nakon 30d pomoću T2 MRI i histologije. Neurobihejvioralni ishodi su mereni tokom perioda od 30d posmatranja pomoću skale moždanog udara ne-humanih primata (NHPSS) i senzorimotorne baterije zadataka koja je sadržala zadatak brda i doline, zadatak dve cevi i zadatak šest rupa. Šema za tretman i procene je prikazana na Slici 1A, a opis sledi u nastavku. Vremena okluzije srednje cerebralne arterije među eksperimentima su varirali kako je opisano u nastavku.

[0087] Makakiji su randomizovani da prime 10 min intravensku infuziju Tat-NR2B9c (2.6mg/kg) ili placebo (0.9 % slani rastvor) počev od 1h ili 3h posle početka 90 min MCAO. Doza izabrana za NHP je aproksimativno određena iz proračuna "ekvivalentne doze primata" ekstrapolirane iz prethodnih doza koje su korišćene u studijama sa pacovima i bila je zasnovana na normalizaciji u odnosu na razlike telesne površine između vrsta.

[0088] Životinje su prebačene na MRI skener u okviru 15 min MCAO i sve prošle imidžing perfuzija da se kvantifikuje zapremina mozga bez krvotoka tokom MCAO (tkivo u riziku). Dodatno je sprovedena MR angiografija (MRA) da se potvrdi MCAO. Druga MRA je izvršena 90 min nakon prekida MCAO da se potvrdi reperfuzija MCA, a zatim difuzioni imidžing na 4h. Životinje su zatim probuđene i ostavljene da se oporave. One su ponovo anestetisane i ponovo je urađen imidžing na 24h i na 30 dana. NHPSS skorovi su bili određeni u roku od 8h MCAO i 30 dana, a preostali neurološki testovi su sprovedeni u dane 7 i 14 ili 30.

[0089] Nije bilo razlike u fiziološkim parametrima između grupa u eksperimentima ili u zapremini tkiva pod rizikom između lek i placebo grupa što je utvrđeno perfuzionim imidžingom tokom 15 minuta MCAO.

[0090] Sproveli smo neurološke procene tokom perioda posmatranja od 14 do 30d pomoću skale moždanog udara ne-humanih primata (NHPSS) i, u nekim slučajevima, senzorimotorne baterije zadataka uključujući Zadatak Brdo i dolina, zadatak izbora dve cevi i zadatak šest rupa. NHPSS je kompozitna ocena analogna NIH skali moždanog udara korišćenoj u ogledima moždanog udara kod ljudi. Rezultat od 41 poena predstavlja ozbiljno bilateralno neurološko oštećenje a 0 je normalno. Ostali testovi mere kombinaciju ukupne snage ekstremiteta, fine motoričke funkcije i uticaj hemi-zanemarivanja ili poremećaja defekt vizuelnog polja. Tat-NR2B9c tretman smanjuje moždanu ishemiju i može produžiti vremenski prozor za reperfuzionu terapiju izvan trenutno korisnog prozora od 4.5 časa za upotrebu tPA.

[0091] Trenutno, jedini široko odobreni tretman akutnog ishemičnog moždanog udara je reperfuzija okludiranih moždanih arterija korišćenjem intravenske infuzije fibrinolitičkog agensa, rt-PA (rekombinantni tkivni aktivator plazminogena). Konvencionalna reperfuzija sa intravenoznim rt-PA je najkorisnija u poboljšanju kliničkih rezultata kada se administrira u roku od 90 minuta nakon početka moždanog udara, a benefit se kasnije smanjuje dok ne postane marginalan ili nula na 4.5h. Ovaj uski prozor korisnosti reperfuzije ograničava broj pacijenata koji mogu imati korist. Prema tome, jedna potencijalna primena ranog tretmana neuroprotektantom je da se proširi interval tokom kojeg klinički benefit može biti dobijen od reperfuzione terapije. Neurohirurzi mogu koristiti reperfuzionu terapiju van standardnog prozora ako stanje mozga ukazuje da je još uvek korisno njegovo spašavanje i da bi bilo bezbedno da se to uradi bez rizika od hemoragije. Da bi to ispitali, vrednovali smo u NHP da li primena Tat-NR2B9c 60 minuta nakon početka MCAO može poboljšati ishod moždanog udara kada se reperfuzija odloži do vremenske tačke 4.5 h, u kojoj i.v. rt-PA više nije od značajne koristi kod ljudi (vidi i Cook et al., Nature.483, 213-72012).

[0092] Šest makakija su podvrgnuti stalnom MCAO, i tretirani sa Tat-NR2B9c ili placebom počev od 5 minuta nakon početka ishemije. Životinje su stavljene u MRI skener i DWI MRI su rađeni svakih 15 min (Slika 2A). Zapremina mozga u kojoj se mogao detektovati hiperintenzitet na DWI se povećavala tokom vremena u obe

1

grupe. Međutim, tretman sa Tat-NR2B9c je oslabio stopu ovog povećanja za oko dva puta (Sl. 2A; vremenske konstante = 2.20 ± 0.28h i 4.50 ± 0.54 za kontrolu i Tat-NR2B9c, respektivno, p = 0.019). Čak i nakon 4.5 sata MCAO, Tat-NR2B9c tretirane životinje su pokazale značajno smanjenje veličine infarkta na MRI i T2 skenovima nakon 48 časova i 7 dana (Slika 1B-D). Osim toga, u ishemičnoj zapremini, DWI intenzitet u mozgu životinja koje su tretirane sa Tat-NR2B9c ostaje niži nego u netretiranim kontrolama, što ukazuje da je tkivo u zapremini infarkta održalo bolji integritet (Slika 2B). Ovi rezultati obezbeđuju dokaze da ostaje mozak koji može biti spašen i administracija reperfuzionih lekova ili terapija bi verovatno mogla poboljšati reperfuziju i preživljavanje moždanog tkiva u vreme kada se to ne bi moglo očekivati zbog toga što je izvan efektivnog vremenskog prozora. Oni takođe pružaju dokaz da TAT-NR2B9c može da produži korisno vreme za reperfuziju mozga za spašavanje preostalog tkiva.

Tat-NR2B9c značajno smanjuje zapremine infarkta i neurološke deficite kod ne humanih primata podvrgnutih 90 minutnom moždanom udaru.

[0093] Sledeća studija koja je pratila uticaj Tat-NR2B9c kada je dat 1 sat nakon ishemijskog moždanog udara je testirana u ovom modelu. Dvadeset makakija su randomizirani da prime 10 min intravensku infuziju Tat-NR2B9c (2.6mg/kg) ili placebo (0.9% slani rastvor) sa početkom 1h nakon početka 90 min MCAO. Doza izabrana za NHP je aproksimativno određena iz proračuna "ekvivalentne doze primata" ekstrapolirane iz prethodnih doza koje su korišćene u studijama na pacovima i bila je bazirana na normalizaciji u odnosu na razlike telesne površine između različitih vrsta.

[0094] Životinje su prebačene u MRI skener u roku 15 min MCAO i sve prošle perfuzioni imidžing za kvantifikovanje zapremine mozga lišenog protoka krvi tokom MCAO (tkivo pod rizikom). Osim toga, MR angiografija (MRA) je sprovedena da potvrdi MCAO. Druga MRA je izvedena da potvrdi reperfuziju nakon 90 min MCAO, a zaatim je urađen difuzioni imidžing na 4h. Životinje su zatim probuđene i ostavljene da se oporave. One su ponovo podvrgnute anesteziji i ponovo je rađen imidžing na 24h i 30 dana. NHPSS skorovi su bili određeni u roku od 8h MCAO-a i sve do 30 dana, a preostali neurološki testovi su sprovedeni u dane 7 i 30.

[0095] Četiri od 10 životinja koje su primale placebo su uginule u roku od 48h od moždanog udara usled oticanja mozga i unkalne hernijacije. Tri životinje tretirane sa Tat-NR2B9c su uginule od posledica hirurških/anestetskih komplikacija koje nisu vezane za moždani udar ili lek. Ni jedna nije isključena iz (ITT) analize "intent-to-treat". Svi nedostajući podaci usled rane smrtnosti su pripisani da odraze najveće moguće zapremine infarkta i najgore neurološke skorove. Iako ovaj pristup odstupa od otkrivanja značajnog efekta tretmana, on je najkonzervativniji, i ima najbolju reflektivnost od svih koji se koriste u kliničkim ispitivanjima na ljudima.

[0096] Nije bilo razlike između lek i placebo grupa u fiziološkim parametrima ili zapremini tkiva pod rizikom određenog perfuzionim imidžingom u period 15 minutnog MCAO (Sl. 6A). Međutim, životinje tretirane na 24h sa Tat-NR2B9c su ispoljile značajno smanjenje zapremine infarkta u poređenju sa placebo grupom prema DWI imidžingu (smanjenje 44.0%; p = 0.039; Slika 6B) i T2-W magnetno rezonantnoj tomografiji (smanjenje 37.4%, p = 0.010; Sl. 6B, C). Ovo smanjenje zapremine infarkta je perzistiralo što se odražava na 30d T2- weighted magnetno rezonantnim MRI skenovima (smanjenje 38.7%, p = 0.013; Sl. 6C) i histološkoj evaluaciji na 30d (Sl.

6D; 59.3% i smanjenje zapremine infarkta od 73.6% kako je procenjeno pomoću ITT bez ranih uginuća, respektivno; p<0.001). Pošto NHP, kao i ljudi, mogu imati različite infarkte posle MCAO, zapremina infarkta svake životinje je normalizovana u odnosu na svoj MRI perfuzioni defekt meren u tokm 15 min MCAO. Ova normalizacija je otkrila da tretman sa Tat-NR2B9c smanjuje infarkt za 55% od zapremine pod rizikom do 24h kako je izmereno pomoću DWI imidžinga i 70% na 30d kako je izmereno sa T2-magnetno rezonantnom tomografijom MRI (Sl. 6E). Zapremine infarkta izračunate iz 24h DWI MRI su u dobroj korelaciji sa onim dobijenim na osnovu 30d histološke analize (R = 0.691, p < 0.01).

[0097] Izveli smo neurološke procene tokom 30d perioda posmatranja pomoću skale moždanog udara nehumanih primata (NHPSS) i senzorimotorne baterije zadataka koja uključuje Zadatak Brdo i dolina, zadatak izbora dve cevi i zadatak šest rupa. NHPSS je kompozitna ocena analogna NIH skali moždanog udara koja se koristi u studijama moždanog udara kod ljudi. Rezultat od 41 poena predstavlja ozbiljno bilateralno neurološko oštećenje, a 0 je normalno. Preostali testovi mere kombinaciju ukupne snage ekstremiteta, fine motorne funkcije i uticaj hemi-zanemarivanja ili defekt vizuelnog polja.

[0098] Životinje tretirane sa Tat-NR2B9c su pokazale poboljšane NHPSS skorove od najranije procene 8h nakon početka ishemije i tokom perioda posmatranja 30d (P=0.018, dvosmerna ANOVA sa ponovljenim merenjima; Sl.

1

6F). Učinak u zadatku izbora 2 cevi se vratio na nivoe pre moždanog udara kod životinja tretiranih sa Tat-NR2B9c, ali je ostao potpuno smanjen u placebo grupi, što ukazuje da spašavanje mozga sprečava "ekstinkciju", tendenciju da pažnja na stavke u ipsilesionalnoj hemisferi zaseni pažnju na stavke u kontralezionalnoj hemisferi. Tretman sa TatNR2B9c je takođe znatno poboljšao performanse levog gornjeg ekstremiteta životinja u zadacima 6 rupa i Brdo i Dolina Stepenište. Performanse desnog gornjeg ekstremiteta su takođe pokazale napredak, što ukazuje na ukupno poboljšanje pažnje i perceptivne sposobnosti.

Tat-NR2B9c je efikasan u smanjenju veličine infarkta i neuroloških deficita kod teških moždanih udara [0099] Zatim smo demonstrirali efikasnost Tat-NR2B9c u moždanim udarima koji su trajali duže od limita efikasnosti reperfuzije sa intravenskim tPA, 4.5 sata. Dvanaest makakija su randomizirani da prime 10 min intravensku infuziju Tat-NR2B9c (2.6mg/kg) ili placebo (0.9% slani rastvor) 1h posle pojave 4.5 h min MCAO. Inače, metode su bile slične našoj prvoj studiji, osim za vremena skenova magnetne rezonance i toga što su konačno snimanje i neurološke procene sprovedeni 7. dana.

[0100] Nije bilo uginuća i razlike između grupa lek i placebo u fizioloških parametrima ili u zapremini tkiva pod rizikom nakon MCAO (Sl. 7A). Međutim, uprkos dugotrajnom ishemijskom intervalu, životinje tretirane sa Tat-NR2B9c su ispoljile značajno smanjenje zapremine infarkta u poređenju sa placebom kada je procenjivano pomoću T2 i DWI imidžinga na 48h i T2-W magnetno rezonantne tomografije na 7 dana (Sl. 7B-E). Osim toga, životinje tretirane sa Tat-NR2B9c su pokazale poboljšane rezultate NHPSS u odnosu na najraniju procenu 12h posle početka ishemije i u periodu posmatranja od 7d (p=<0.001; dvosmerna ANOVA sa ponovljenim merenjima; Sl.7F), i trend boljih performansi u zadacima 6-rupa i Dolina Stepenište. Ovi rezultati pokazuju da rano lečenje sa Tat-NR2B9c može povećati prozor u kojem reperfuzija može imati funkcionalne benefite, čak i u modelu teškog MCAO u kojem je ograničena kolateralna cirkulacija, a penumbra je mala. Veličina benefita tretmana 4.5h posle moždanog udara, kao je izmereno pomoću MRI i neuroloških evaluacija ukazuju na potencijal korisnosti rane neuroprotekcije za produženje benefita reperfuzione terapije čak i izvan prozora od 4.5 h. Tat-NR2B9c je efikasan u smanjenju ishemijе i neuroloških deficita posle moždanog udara kada je dat 3 sata nakon početka moždanog udara.

[0101] Iako je tretman neuroprotektantom u roku od 60 minuta od početka moždanog udara izvodljiv kod malog broja pacijenata, produženje terapeutskog prozora administracije bi koristilo mnogo većem procentu žrtava moždanog udara. Tako smo utvrdili da li je davanje Tat-NR2B9c 3h nakon početka moždanog udara korisno u ambijentu produženog MCAO. Kod ljudi, reperfuzija sa i.v. rtPA administriranog 3h nakon početka moždanog udara je korisna čak i u odsustvu neuroprotekcije. To potvrđuje da postoji spasavanje penumbre u ovom trenutku kod mnogih pacijenata. Reprodukovali smo ovaj klinički scenario eksperimentalno pomoću MCAO modela u kojem su NHP pokazali značajno PWI/DWI neslaganje (penumbra) na 3h. Kao i kod ljudi, takvo neslaganje u odsustvu lečenja napreduje do infarkta.

[0102] Dvadeset četiri makakija su randomizirani da prime 10 min intravensku infuziju Tat-NR2B9c (2.6mg/kg) ili placebo (0.9% slani rastvor) počevši 3h posle početka 3.5h MCAO. Druge metode su bile nepromenjene, osim su poslednje snimanje i neurološke procene sprovedene 14. dana. Nije bilo uginuća i nije bilo razlike u fiziološkim parametrima ili zapremini tkiva pod rizikom tokom MCAO između grupa (Sl. 8a). Međutim, uprkos produženom ishemičnom intervalu i odloženom tretmanu sa Tat-NR2B9c lekom-tretirane životinje su pokazale značajno smanjenje zapremine infarkta u poređenju sa placebo grupom kako je ocenjeno pomoću anatomskih (MRI) kriterijuma na 48h i 14 dana (Sl. 8B-E). NHP tretirani sa Tat-NR2B9c su takođe pokazali poboljšane NHPSS skorove tokom perioda od 14d posmatranja (p=0.004 dvosmerna ANOVA sa ponovljenim merenjima; Sl. 8F), i trend ka boljim performansama u zadacima 6 otvora i Dolina Stepenište. Prema tome, tretman sa Tat-NR2B9c 3h posle početka moždanog udara je efikasan za smanjenje oštećenja od moždanog udara kod NHP. Pošto je ovaj terapeutski prozor praktičan za žrtve moždanog udara, tretman sa PSD95 inhibitorom može predstavljati klinički-ostvarivu terapeutsku strategiju i biti efikasniji od samostalne upotrebe reperfuzije.

Zaključci

[0103] Tat-NR2B9c može efikasno da redukuje ozbiljnost oštećenja nakon moždanog udara u mozgovima višeg reda kao što su majmuni i ljudi. Ispitivanja MRI DWI i T2 snimci u vremenskim tačkama posle moždanog udara pokazuju da su ishemična područja značajno manje oštećena od onih kod netretiranih životinja. Pored smanjenja zapremina lezija, ovo sugerišu manji intenziteti DWI-MR imidža i smanjeni intenzitet signala na T2 snimcima. Ovi podaci pružaju dokaz da je i dalje ostavljen mozak da se spase i da reperfuziona terapija i dalje

2

može da omogući da krv prodre unutra i deluje na veći deo mozga što bi inače bilo moguće bez TAT-NR2B9c tretmana. Stoga je reperfuziona terapija, posebno sa lekovima kao je tPA, u stanju da bolje prodre i bude efikasna u daljem povećanju protoka krvi u pogođenim područjima mozga.

Metode sa Ne-humanim Primatima

[0104] Model moždanog udara: Životinje su anestezirane (Izofluran 1.0-2.5%), intubirane i ventilirane. Uključen je neinvazivni monitoring BP preko nožne manžetne, end-tidal CO2, O2saturacija, EKG i temperatura pomoću rektalne sonde. Temperatura je održavana na (37 ± 0.5<o>C) pomoću zagrevanog ćebeta. Za praćenje krvnog pritiska i krvnih gasova je korišćena femoralna arterija. MCAO kod cynomolgus makaki majmuna (3.0-4.0 kg) je izveden primenom desne pterionalne kraniotomije i okluzijom desne MCA u Silvijevoj fisuri sa 5mm titanijumskim klipom za aneurizme distalno od orbitofrontalne grane i početka lentikulostrijatalne arterije.

[0105] Definisanje Ishemijskog Penumbra Tkiva: Penumbralno tkivo je operativno definisano kao tkivo koje još nije zahvaćeno infarktom u vreme uzimanja tkiva, ali koje konzistentno napreduje ka kasnijem infarktu. Pošto kod makakija penumbra može biti promenljiva uzeto je osam biopsija 2x2mm, 1h ili 6h posle MCAO iz korteksa sa cele MCA vaskularne distribucije ipsilateralno od moždanog udara a takođe kontralateralno od moždanog udara sa mesta naspram uzetih iz ishemičnog korteksa. Pozicije biopsija su fotografisane. Da se odredi koja od 8 biopsija predstavlja penumbralno tkivo, životinje su prebačene na 7T MRI skener i urađeni su Difuziona Magnetno Rezonantna tomografija (DWI), T2 i perfuzioni snimak u roku od 15 minuta nakon biopsije i nakon 5.75h. Penumbralno tkivo nakon 1h je definisano kao tkivo bez infarkta, koje je nakon 5.75h napredovalo do infarkta pomoću DWI. Penumbralno tkivo nakon 6h je definisano kao tkivo u granicama MR perfuzionog defekta ali koje nije pokazalo DWI i T2 hiperintenzitet. Upotreba MRI za definisanje penumbre kod NHP je ključna jer se količina tkiva koje se može spasiti sužava za 6h.

[0106] Generalna MRI procedura: Imidžing je izveden na 7-Tesla Bruker BioSpec sistemu koji koristi Paravision 4.0 softver, i koristi B-GA20S gradijentni namotaj. Za skeniranje NHP je korišćen kvadraturni zapreminski slanje/prijem namotaj unutrašnjeg prečnika 15.5cm. NHP su intubirani, ventilirani i snimljeni u prone položaju. Fiziološki monitoring je održavan sve vreme. Protokol daje mnoštvo 2D T2-weighted, perfuziono i diffusion-weighted snimaka u aksijalnoj ravni. T2-weighted imidžing koristi RARE metod, koja se naziva i fastspin echo (TE/TR = 84/5000 ms, rare faktor = 14, 225x225 matriks preko 9cm vidno polje za rezoluciju od 400x400x1500 mikrona). Difuziona Magnetno Rezonantna Tomografija koristi spin-echo multi-shot, eho-planarnu tehniku snimanja (TE/TR = 32/10000 ms, 9 EPI snimaka, širina frekventnog opsega 250 kHz, 3 ortogonalna pravca difuzije sa b = 1000 s/mm<2>, 10 proseka sa matricom 180x180 na vidnom polju od 9cm za rezoluciju 500x500x1500 mikrona). Perfuzioni imidžing je izveden korišćenjem dinamičke, kontrastne metode sa pojačanom osetljivosti, susceptibility-weighted perfuzione metode (T2*EPI, TE = 18ms, 2 EPI snimka, vremenska rezolucija 2-sek, i 90 ponavljanja, 180x180 matrica na vidnom polju od 9cm za rezoluciju 700x700x1500-mikrona preko 5 susednih slajsova). Za skeniranja perfuzije intravenozno je ubrizgan, bolus gadolinijum (0.1 mmol/kg), počev od trećeg ponavljanja sa ukupniim vremenom ubrizgavanja 7-sec periferno intravenozno. Difuzioni imidži su kasnije obrađeni u MATLAB (Natick, MA, USA) za dobijanje srednjeg imidža od tri b=1000 s/mm<2>imidža i za izračunavanje mapa Prividnog Koeficijenta Difuzije (ADC). Zapremine moždanog udara su izračunate pomoću ITK-Snap contouring softvera (Pitsburg, PA, SAD) iz mnoštva difuzionih imidža rekonstruisanih u tri dimenzije. Pperfuzioni imidžing je obrađen pomoću PerfTool softvera za izradu mapa cerebralnog krvotoka.

[0107] Eksperimentalni dizajn i statistička analiza: Еksperimenti moždanog udara su izvedeni u skladu sa "preporukama za obezbeđenje dobre naučne prakse" komiteta Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR). Veličina uzorka od 10 životinja/grupi je bila zasnovana na želji da se detektuje razlika od 40% zapremine infarkta između leka i placeba na osnovu 30d T2 W MRI pri snazi od 0.8, alfa = 0.05 i pretpostavljenoj standardnoj devijaciji od 30% od srednje vrednosti grupe. Primarna analiza je zasnovana na “intent-to-treat” (ITT) pristupu, bez izuzimanja bilo koje upisane životinje. 20 Cinomologus makaki majmuna je blok randomizovano za tretman lekom ili placebom (samo nosač). Istraživači odgovorni za indukciju, održavanje i ukidanje ishemije, za odluke u vezi sa brigom o eksperimentalnim životinjama (uključujući rano žrtvovanje), i procenu svih ishoda nisu znali kojoj eksperimentalnoj grupi životinja pripada. Razlike između grupa su merene korišćenjem t-testa ili ponovljenih merenja ANOVA, po potrebi. Nedostajuće vrednosti zbog ranog uginuća ili nemogućnosti da se zadatak završi su uračunate da reflektuju najgori skor koji se može ostvariti na tom zadatku, ili maksimalnu moguću zapreminu moždanog udara kako je definisano pomoću najveće zapremine infarkta postignutog kod svih životinja.

[0108] Neurološke procene: One su sprovedene korišćenjem predhodno validirane skale moždanog udara kod ne-ljudskih primata (NHPSS) i senzorimotorne baterije zadataka uključujući zadatak Brdo i dolina, zadatak izbora dve cevi i zadatak šest rupa. NHPSS skor je kompozitna ocena stanja svesti, odbrambenih reakcija; refleksa hvatanja, pokreta ekstremiteta, hoda, kruženja, bradikinezije, ravnoteže, zanemarivanja, gubitka vidnog polja/hemianopsija i facijalne slabosti, od kojih su mnogi takođe inkorporirani u NIH sistem bodovanja moždanog udara kod ljudi. Od ukupno 41 poena, 0 odgovara normalnom ponašanju, a 41 jakom bilateralnom neurološkom oštećenju. Preostali testovi su modifikovani od testova razvijenih za običnog marmoseta (Callithrix jacchus) kako je opisano na drugom mestu. Kao dodatak za vrednovanje finih senzorimotornih funkcija oni testiraju i ekstinkciju i perceptivno spacijalno oštećenje/zanemarivanje. U pilot eksperimentima na 5 makakija podvrgnutih 90 minuta MCAO, NHPSS rezultati su pokazali početni pik skora (srednja vrednost 36.3, SEM = 5.7) koji je trajao prvih 36 sati, a zatim je postepeno pao na plato između 14 i 30 dana (srednja vrednost 14.36, SEM = 3.2). Senzorimotorno testiranje je pokazalo da životinje imaju ozbiljno levo spaciotemporalno zanemarivanje i levu hemiparezu koja je pokazala manji oporavak tokom vremena na 7 i 30 dana posle moždanog udara. Ovi deficiti su bili evidentni kao značajna kašnjenja u završetku zadataka 6 rupa (srednja vrednost kašnjenja 7.8x i 5.33x od bazne linije) i Brdo i dolina za levu ruku (srednja vrednost kašnjenja 8.2x i 6.4x od bazne linije na segmentu Doline i srednja vrednost kašnjenja 7.6x i 5.8x od bazne linije na segmentu Brda).

PRIMER 2: PSD-95 Inhibitori Zamrzavaju Evoluciju Ishemijske Penumbre na Perfuzionom/ Difuzionom Magnetno Rezonantnom Imidžingu MRI

[0109] Svrha ovog primera je bila da pokaže da je neuroprotekcija korišćenjem PSD-95 inhibitora izvodljiva bez uvećanja protoka cerebralne krvi (reperfuzija) u eksperimentalnom permanentnom MCAO.

[0110] Metode: Pacovi su podvrgnuti pMCAO i bili tretirani 1h kasnije sa 5 minutnom intravenskom infuzijom PSD-95 inhibitora Tat-NR2B9c (7.5 mg/kg) ili slanim rastvorom. Perfuzioni magnetno rezonantni Imidžing MRI (PWI) i Difuzioni Magnetno Rezonantni Imidžing MRI (DWI) su urađeni na 4.7T Bruker sistemu 30, 45, 70, 70, 120, 150 i 180 minuta posle pMCAO za određivanje mapa cerebralnog krvotoka (CBF) i Prividnog Difuzionog Koeficijenta (eng. Apparent diffusion coefficient (ADC)). Posle 24 sata životinje su neurološki ocenjene, žrtvovane, a mozgovi sekcirani i obojeni sa TTC da se odrede zapremine infarkta korigovane za edem. Uticaj Tat-NR2B9c na nivoe ATP je izmeren in vitro u neuronima podvrgnutim OGD kako je opisano (Aarts et al. (2002), supra) i nivoi ATP su procenjeni pomoću CellTiter-Glo Luminescentnog testa vijabilnosti ćelija prema uputstvima proizvođača (Promega, Madison, WI).

[0111] Rezultati: Gasovi u krvi, elektroliti i glukoza u krvi se nisu razlikovali između dve grupe. Neuroskorovi na 24 sata su pokazali da je Tat-NR2B9c grupa imala značajno poboljšan neuroskor u poređenju sa placebom. Slika 3 pokazuje apsolutno neslaganje (eng. mismatch) između CBF i ADC-izvedenih zapremina lezija. U odnosu na placebo životinje, ADC/CBF neusklađenost količina lezija je znatno veća, sa početkom 90 minuta posle okluzije u Tat-NR2B9C grupi. Region analize interesa relativnih vrednosti CBF u jezgru i kortikalnim regionima penumbre nisu pokazali značajnu promenu relativnog CBF između vremenskih tačaka kod obe tretirane grupe, što ukazuje da Tat-NR2B9c tretman nema uticaj na CBF.

[0112] Spacijalnotemporalna evolucija ishemičnog moždanog udara opisana pomoću na osnovu graničnih vrednosti izvedenih ADC i CBF zapremina lezija, je u dobroj korelaciji sa TTC-izvedenim zapreminama lezija kod placebo tretiranih životinja. Kod životinja tretiranih sa Tat-NR2B9c, zapremina ADC lezija je porasla od vremenske tačke 25 minuta do vremenske tačke 45 minuta posle MCAO kao i u placebo grupi. Međutim, u vremenskoj tački 70 minuta, odmah nakon početka TAT-NR2B9c lek, porast je oslabljen. Nakon 120 minuta i kasnije, ADC lezija kod Tat-NR2B9c-tretiranih životinja je ostala i dalje znatno manja nego kod pacova tretiranih placebom. CBF-izvedene zapremine i TTC zapremine infarkta su značajno manje kod Tat-NR2B9c životinja. Slika 5 prikazuje apsolutno neslaganje između CBF i ADC izvedenih zapremina lezija. U odnosu na placebo životinje, neslaganje ADC/CBF zapremina lezija je znatno veće, počev od 90. minuta nakon uključivanja u Tat-NR2B9c grupu. Ovi rezultati sugerišu da Tat-NR2B9c ne smanjuje zapreminu infarkta niti poboljšava ishod smanjivanjem veličine ishemične penumbre, što bi se dogodilo ako bi peri-infarktni krvotok bio pojačan tretmanom. Umesto toga, sugerišu da Tat-NR2B9c deluje kao neuroprotektant koji poboljšava otpornost ishemičnog tkiva na postojeću ishemiju.

[0113] Primarne neuronske kulture tretirane sa 100nM Tat-NR2B9c nisu pokazale značajan utjecaj na ćelijsku smrt ili ATP nivoe u poređenju sa kontrolama sa slanim rastvorom u normoksičnim uslovima. Međutim, prethodno tretiranje sa 100nM Tat-NR2B9c je dovelo do smanjenja od 26% ćelijske smrti u odnosu na slani rastvor kontrole 20 sati nakon OGD (Slika 4A). Nivoi ATP su bili 34% veći kod kultura tretiranih sa Tat-NR2B9c 1 sat nakon OGD u poređenju sa kulturama tretiranim slanim rastvorom (Slika 4B).

[0114] Diskusija: Administracija Tat-NR2B9c 60 minuta nakon MCAO kod pacova ili miševa je dovela do značajnog smanjenja jačine ADC hipointenziteta i bila je u korelaciji sa smanjenjem zapremine infarkta prema TTC. Smanjenje zapremine infarkta je povezano sa značajnim poboljšanjem neuroloških rezultata 24 sata posle MCAO. Ova anatomska i neurološka poboljšanja ishoda moždanog udara nakon pMCAO su postignuta bez uticaja na cerebralni krvni protok, potvđujući da je terapija moždanog udara ostvariva neuroprotekcijom čak i bez povećanja protoka krvi. Prema tome, očekuje se da bi uparivanje tretmana PSD-95 inhibitorima sa reperfuzionim strategijama, bilo fizički ili terapeutski, verovatno dodatno poboljšati spašavanje neuronskog tkiva ili mozga nakon moždanog udara.

[0115] Posle pojave ishemije, javlja se brzi pad nivoa intracelularnog ATP u neuronima, sa prekidom homeostatskih mehanizama povezana glija, otkazivanje ćelijske funkcije i ćelijska smrt. Tretman PSD-95 inhibitorom dovodi do smanjenja osiromašenja ATP-a. Ovi rezultati potvrđuju da tretman PSD-95 inhibitorom čuva ishemičnu penumbru obezbeđujući održiv pristup proširenju terapeutskog ili vremenskog prozora za reperfuzionu terapiju.

PRIMER 3: Jedna Tat-NR2B9c infuzija u trajnju od 4-5 minuta je dovoljna da razgradi NMDAR: PSD95 kompleks u mozgovima glodara podvrgnutih moždanom udaru

Rezime Metoda:

[0116] Inhibitor Postsinaptičke Gustine-95 Tat-NR2B9c je sintetički peptid koji se sastoji od 9 c-terminalnih aminokiselina subjedinice NR2B (KLSSIESDV) fuzionisan sa proteinskim domenom transdukcije ćelijske membrane HIV-1-Tat proteina (IGRKKRRKRRR; Tat). Kontrola koja nema sposobnost vezivanja PSD95 je sličan peptid u kojem su 3 terminalne aminokiseline NR2B C-terminalne sekvence bile prebačene iz SDV u ASA ta kontrola je nazvana "ADA" peptid. Peptide u fiziološkom rastvoru je administrirao intravenozno tokom 4 do 5 minuta pojedinac koji nije bio upoznat sa identitetom jedinjenja i njihovom dozom.

[0117] Životinje Odrasli mužjaci Sprague-Dawley pacova (250 do 300g; Charles River Laboratories, Sherbrooke, Quebec, Kanada) su korišćeni prema procedurama odobrenim od strane institucionalne komisije za brigu o životinjama. Svi eksperimenti su izvedeni na neizgladnjivanim životinjama.

[0118] Hirurška priprema: Za permanentnu okluziju pijalnog suda (3PVO), pacovi su anestezirani sa 100 mg/kg ketamina, 2 mg/kg acepromazina i 50 mg/kg ksilazina. Pacovi su intubirani i ventilirani (60 udaha/min, tidalni volumen od 30 do 35 ml). Srednja vrednost arterijskog krvnog pritiska, krvni gasovi, pH i glukoza su praćeni pomoću katetera leve femoralne arterije. Isporuka leka je bila preko repne vene.

[0119] Eksperimentalna procedura. Životinje su podvrgnute 3PVO ishemiji. Jedan sat nakon toga, one su injektirane slanim rastvorom, 3nmol/g Tat-KLSSIEADA (SEK ID NO:76), ili 0.3nmol/g, 3nmol/g i 10nmol/g Tat-NR2B9c (Tat-KLSSIESDV). Nakon narednog sata, moždani korteks je brzo skinut sa ipsilateralne (moždani udar) strane, i sa kontralateralne strane od moždanog udara. Sham tretirane životinje su imale samo kraniotomiju, ali ne i moždani udar ili infuziju leka. Co-IP eksperimenti su zatim sprovedeni na uzetom tkivu korišćenjem rutinskih metoda. Nakon CoIP sa anti-NR2B ili anti-PSD95 antitelima, blotovi su inkubirani sa navedenim antitelima (anti NR2B, PSD95 i Src). Denzitometrijska analiza traka je izvedena pomoću Image J softvera. Za merenje efekata tretmana na CoIP asociranih proteina, nivoi svakog proteina na blotu su prvo normalizovani u odnosu na nivoe proteina koji je imunoprecipitovan (PSD95 ili NR2B), a zatim su nivoi sa ipsilateralne (moždani udar) strane normalizovani u odnosu na nivoe na kontralateralnoj strani.

[0120] Rezultati: Ogled je izveden u 5 replikata. Tkivo za svaki replikat je dobijeno od 6 različitih pacova (jedan po stanju). U svakom replikatu, tkivo je dobijeno sa obe strane srčanog udara (ipsilateralne) i kontralateralne hemisfere. Nije bilo dejstva sham tretmana (bez moždanog udara i bez infuzije leka) na koimunoprecipitaciju PSD95 i NR2B kako je ocenjeno imuno precipitacijama obavljenim sa antitelima za jedan ili drugi protein (Sl. 9A-B prikazan kao primer). Slično, tretman sa kontrolnim peptidom Tat-KLSSIEADA nije imao uticaja na ko-imunoprecipitaciju (ko-IP) PSD95 i NR2B. Međutim, tretman sa Tat-KLSSIESDV je inhibirao koimunoprecipitaciju PSD95 sa NR2B na dozno zavisan način (Sl. 9A-B). Stepen inhibicije ko-IP PSD95 sa NR2B učinio je sličnom potentnost Tat-NR2B9c u inhibiranju srčanih udara, pri čemu 0.3 nmol/g nije uticalo na smanjenje veličine infarkta u ovom modelu moždanog udara, a doze od 3 ili 10 nmol/g su bile efikasne. Konkretno, tretman sa dozom od 0nM/g ili 0.3nM/g Tat-NR2B9c, koji nije bio efikasan u smanjenju veličine

2

moždanog udara, nije značajno inhibirao asocijaciju PSD95 i NR2B. Nasuprot tome, tretmani sa TatNR2B9c u dozi od 3nm/g ili 10nm/g, koji su bili efikasni u inhibiciji oštećenja od moždanog udara su takođe značajno inhibirali asocijaciju NR2B sa PSD95. Kao dodatna kontrola, tkivo koje je bilo imuno-precipitovano sa PSD95 ili sa NR2B je inkubirano sa antitelima protiv NMDAR-asocirane protein kinaze Src, glavnog regulatornog proteina u NMDAR signalni kompleks 25. Tretman sa 10nm/g Tat-NR2B9c, koji disocira NR2B od PSD95 (Sl. 9A-B) nije imao uticaja na asocijaciju bilo PSD95 ili NR2B sa Src (nije prikazano). Ovo ukazuje da su dejstva TatNR2B9c u inhibiciji NR2B/PSD95 interakcije specifična, pošto TatNR2B9c nije imao uticaja na slične interakcije jednog ili drugog proteina sa Src.

[0121] Zaključci: Prvo, Tat-NR2B9c dospeva u mozak na strani moždanog udara i može da disocira prethodno formirane NR2B/PSD95 komplekse u ishemijskom mozgu kada se administrira posle moždanog udara. Drugo, Tat-NR2B9c ovo može da postigne na način zavisan od doze. Treće, doze pri kojima Tat-NR2B9c ostvaruje značajnu disocijaciju prethodno obrazovanih NR2B/PSD95 kompleksa u mozgu odgovaraju dozama, pri kojima je Tat-NR2B9c neuroprotektivan u istom životinjskom modelu moždanog udara. Četvrto, doze pri kojima Tat-NR2B9c nije u stanju da ostvari značajnu disocijaciju prethodno formiranih NR2B/PSD95 kompleksa u mozgu su takođe doze pri kojima Tat-NR2B9c nije neuroprotektivan u istom životinjskom modelu moždanog udara. Peto, Tat-NR2B9c ostvaruje svoje dejstvo na NR2B/PSD95 kompleks selektivno (t.j. nije nespecifično delovanje na molekule NMDAR signalnog kompleksa).

[0122] Druga studija je izvedena sa istim modelom i uslovima lečenja da se istraži vremenski tok razgradnje kompleksa PSD95-NMDAR u neuronima koji se nalaze u regionima mozga podvrgnutim moždanom udaru. Kao i kod prethodne studije, mozgovi pacova su uzimani na 2, 4, 8, 24 ili 48 sati nakon okluzije PIJALNOG krvnog suda za indukovanje moždanog udara. Grafik 10 prikazuje da je NMDAR: PSD-95 kompleks razgrađen najmanje 8 časova nakon jedne intravenozne infuzije Tat-NR2B9c a potencijalno nakon 24-48 časova. Prema tome, postoji širok vremenski prozor između momenta kada je Tat-NR2B9c mogao biti administriran pacijentu i kada je pacijent mogao imati koristi od reperfuzione terapije, bilo terapeutske ili mehaničke.

Detaljno Materijali i Metode

[0123] Materijali. NA1 (GMP lot 165I1107) i TAT-ADA (YGRKKRRQRRRKLSSIEADA) (SEK ID NO:9) su hemijski sintetisali Bachem i GeneScript, respektivno. Svi peptidi su prečišćeni tečnom hromatografijom visokih performansi do > 95%. Stokovi Peptida (3mm ili 10mm) su pripremljeni u sterilnom fiziološkom rastvoru i čuvani na 4 °C.

[0124] Antitela. Imunoprecipitacije i westerni: Mišje anti-NMDA2B (ab28373, Abcam), zečije anti-PSD95 (2507; Cell Signaling), zečije anti-NMDA2B (4212, Cell Signaling), mišje monoklonsko anti-PSD95 (MA1-046, Thermo), mišje monoklonsko anti-Src (ab16885-100) (Abcam). Za imunoprecipitacije je korišćen Dinabeads protein G Immunoprecipitation Kit (100.07D, Invitrogen). Sekundarna Antitela za Vestern blotove su bila peroksidazom konjugovano AffiniPure F(ab')2 Fragment Kozje anti-zečje IgG antitelo (111-036-047) i peroksidazom konjugovano AffiniPure F(ab')2 Fragment Kozje anti Mišje IgG (115-036-006) proizvođača Jackson ImmunoResearch Lab Inc.

eksperiment) težine između 250 i 300 g su korišćene za ovu studiju. Permanentna okluzija tri pijalnog krvnog suda (3PVO) je izvedena kao što je prethodno opisano. Ukratko, pacovi su anestezirani intramuskularnom injekciom ketamina 0.5 ml/kg (100 mg/kg), acepromazina (2 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg), sa dodatkom jedne trećine početne doze po potrebi. Ubačena je analna temperaturna sonda i životinja je postavljena na grejanu podlogu održavanu na 37 °C. Lobanja je bila otvorena rezom po srednjoj liniji i oslobođena tkiva. Koristeći disekcijski mikroskop i pneumatsku stomatološku bušilicu, napravljen je 6- do 8 mm kranijalni prozor preko desnog somatosenzorskog korteksa (2 mm kaudalno i 5 mm lateralno od bregme) bušenjem pravougaonika kroz lobanju i podizanjem dela lobanje zadržavajući duru intaktnom. 3 Pijalne arteriole srednje cerebralne arterijske grane oko “barrel korteksa” (gde su električno kauterizovane na 2 mesta po arteriji kroz duru). Posle kauterizacija, koža glave je zašivena. Jedan sat nakon 3PVO ishemije, pacovima je dat lek za tretman sa ukupno ~300 ul fiziološkog rastvora tokom 3 min kroz femoralnu venu (tačna zapremina za postizanje ciljne doze u mg/kg za životinju je odredivana prema težini životinje). 1 sat posle davanja leka za tretman (2 sata posle moždanog udara), pacovi su eutanazirani pomoću 3% izoflurana pomešanog sa kiseonikom.

[0125] Priprema moždanih lizata. Mozgovi su uklonjeni iz lobanje i ishemično područje korteksa i ekvivalentni uzorak sa suprotne strane su odmah uzeti. Svaki uzorak mozga je stavljen u 350 ul RIPA pufera za lizu (Tris-HCL 50mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS 0.1%, Deoksiholna kiselina 0.5%, NP-40 1% plus kompletan koktel inhibitora proteaze (PhosSTOP koktel inhibitora fosfataze, Roche)), homogenizovan i ostavljen na led.

[0126] Ko-imunoprecipitacija NMDAR i njegovih asociranih proteina iz korteksa pacova. Lizati pacovskih korteksa su inkubirani na ledu tokom jednog sata a zatim centrifugirani 20 min na 4 °C (12,000 rpm). Supernatanti su prebačeni u nove epruvete, inkubirane tokom noći na 4 °C sa 30ul Dynabeads protein G (Invitrogen) koje su prethodno napunjene sa 5ug antitela ili antiPSD95 ili anti-NMDAR (prema protokolu proizvođača koristeći predviđene pufere za ispiranje). Dynabead-antitelo-antigen kompleksi su isprani četiri puta i resuspendovani u 30 ul RIPA pufera 10 ul SDS-PAGE pufera (2.4 ml 1M Tris pH 6.8, 0.8 g SDS, 4 ml 100% glicerol, 0.1% bromofenol Blue, 1ml beta-merkaptoetanol, q.c. do 10 mL sa dH2O). Uzorci su zagrevani 10 min na 75<o>C, postavljeni na magnet da zadrže perlice a zatim su supernatanti prebačeni na SDS-PAGE gel za analizu.

[0127] SDS-PAGE i Vestern blot. Izolovani imunoprecipitati su razdvojeni pomoću 10% SDS-PAGE i odmah zatim preneti na nitroceluloznu membranu. Membrane su ispitivane sa anti-PSD95 pri 1:1000, zatim isprane i razvijene pomoću ECL kompleta za hemiluminiscenciju (Amersham/GE Healthcare). Snimci su dobijeni pomoću Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm) sa ekspozicijama od 30s do 2 min. Membrane su potom odlepljivane 10 minuta na sobnoj temperaturi (1.5% glicin, 0.1% SDS, 1% Tween 20 pH 2.2) i ponovo blokirane. Membrane su zatim ponovo inkubirane sa anti-NMDAR2B (1:1000) i anti-Src antitelima (1:500), isprane, razvijene i snimljene kako je gore opisano.

[0128] Analiza snimaka. Intenziteti traka na slikama su analizirani pomoću Image J (NIH). Ipsilateralne i kontralateralne trake su prvo normalizovane na nivoe imunoprecipitacije PSD95 ili NR2B pre generisanja odnosa gustine traka između ipsilateralnih i kontralateralnih imunoprecipitata od iste životinje.

PRIMER 4: Tat-NR2B9c i tPA se mogu dati istovremeno ili u različito vreme za poboljšanje ishoda moždanog udara.

[0129] Prvo, izvedena je studija in vitro da pokaže da TatNR2B9c nema uticaja na lizu ugruška i da TatNR2B9c ne utiče na sposobnost ili brzinu tPA da oslobodi fibrin iz ugrušaka. Ukratko, ljudska plazma koja sadrži<125>I obeleženi fibrinogen je inkubirana 2 sata na 37 °C sa različitim koncentracijama Tat-NR2B9c, Tat-NR2B9c 1500 ng/ml tPA, ili samim tPA u puferu koji sadrži 100 nM NaCl, 30nM Na2HPO4, 3mM 30nM NaH2PO4, pH 7.4. Kvantifikacija oslobađanja fibrina iz ugrušaka je izvršena scintilacionom brojanjem rastvorljive materije. Tat-NR2B9c nije lizirao ugruške, niti uticao na sposobnost tPA da oslobodi fibrinogen iz ugrušaka.

[0130] Da pokažemo da se Tat-NR2B9c i tPA mogu dati istovremeno u životinjskim modelima moždanog udara, ponovo smo koristili PIAL okluzivni model moždanog udara kod pacova kao i gore. Tat-NR2B9c je dat u obliku 4-5 minutne intravenske infuzije 1 sat posle moždanog udara, a tPA je dat kako je propisano kod ljudi (10% od doze prema težini kao bolus praćen sa preostalih 90% doze date kao infuzija tokom 1 sat), ali sa nivoima doze koji odgovaraju studijama sa glodarima (10 tostruka humana doza prema težini). Grupe (n = 10) su takođe uključivale životinje kojima su istovremeno dati i Tat-NR2B9c i tPA prema ovim doznim strategijama, ili sa tPA iniciranim 15 minuta nakon infuzije Tat-NR2B9c. Slika 11 prikazuje da je Tat-NR2B9c plus tPA efikasniji nego tPA sam kada se daje istovremeno ili kada Tat-NR2B9c doza prethodi tPA dozi. Iako je efikasnost kombinovanog tretmana kod pacova slična efikasnosti samog Tat-NR2B9c, efikasnost kombinovanih tretmana verovatno odražava doprinose oba, i tPA i Tat-NR2B9c pošto neki od Tat-NR2B9c podležu cepanju kao rezultat tPA pretvaranja plazminogena u plazmin proteazu, koja je u stanju da cepa Tat-NR2B9c u plazmi. Drugim rečima, podaci su u skladu sa gubitkom aktivnosti koja je rezultat Tat-NR2B9c cepanja pomoću plazmina što se kompenzuje tPA-posredovanom reperfuzijom. Očekuje se da se cepanje Tat-NR2B9c pomoću plazmina javi u manjoj meri kod ljudi nego kod pacova pošto je doza tPA (težinski) za aktivaciju plazminogena deset puta manja kod ljudi nego kod pacova. Prema tome, ovi podaci pružaju dokaze da se kod ljudi doprinos tPA može kombinovati sa onim koji ima Tat-NR2B9c u smanjenju štetnog delovanja moždanog udara ili druge ishemije na CNS sa većim efektom nego bilo koji od ovih agensa samostalno.

[0131] Iako je pronalazak opisan detaljno radi boljeg razumevanja, biće očigledno da se izvesne modifikacije mogu praktikovati u okviru priključenih patentnih zahteva. U meri u kojoj je više od jedne sekvence povezano sa pristupnim brojem u različito vreme, podrzumevaju se sekvence povezane sa pristupnim brojem od efektivnog datuma podnošenja ove prijave. Efektivni datum podnošenja je datum najranijeg prioriteta prijave koji otkriva koji pristupni broj je u pitanju. Osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta, bilo koji element, izvedba, korak, karakteristika ili aspekt pronalaska se može izvesti u kombinaciji sa bilo kojim drugim.

2

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. PSD-95 inhibitor za upotrebu u lečenju štetnog delovanja ishemije na centralni nervni sistem kod humanog subjekta koji ima ili je pod rizikom od ishemije kada se na subjektu izvodi reperfuziona terapija, a PSD-95 inhibitor i reperfuziona terapija tretiraju štetno delovanje ishemije na centralni nervni sistem subjekta, pri čemu se inhibitor PSD-95 administrira pre izvođenja reperfuzione terapije, pri čemu se reperfuziona terapija vrši nakon utvrđivanja da je predmet kvalifikovan za reperfuziju na osnovu ishemične penumbre i odsustva hemoragije kao što je prikazano pomoću CT, MRI ili PET analize, i pri čemu inhibitor sadrži peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji ili sadrži KLSSIESDV (SEK ID NO: 5) ili KLSSIETDV (SEK ID NO: 43), pri čemu je peptid povezan sa internalizacionim peptidom ili lipidovan sa njim povećavajući prolazak peptida kroz membranu ili krvno-moždanu barijeru.

2. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je ishemija cerebralna ishemija ili subjekat ima moždani udar ili je ishemija srčana, plućna ili ishemija ekstremiteta koja utiče na centralni nervni sistem inhibira protok krvi u ili iz CNS.

3. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu PSD-95 inhibitor je tat-NR2B9c.

4. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu se reperfuzija vrši davanjem trombolitičkog agensa, opciono, trombolitički agens je aktivator plazminogena, po mogućnosti, trombolitički agens je tPA.

5. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu je interval između administriranja PSD-95 i reperfuzione terapije 30 min do 6 sati ili se reperfuziona terapija izvodi više od 3 sata posle početka ishemije.

6. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu se trombolitički agens administrira lokalizovano na mestu smanjenog protoka krvi ili reperfuziona terapija je mehanička reperfuzija.

7. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu se reperfuziona terapija izvodi više od 3 sata posle pojave ishemije, a ponekad se pomenuta reperfuziona terapija izvodi više od 4.5 sata nakon početka ishemije ili se reperfuziona terapija izvodi više od 4.5 sata i manje od 24 sata posle početka ishemije.

8. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu se reperfuziona terapija izvodi najmanje 12 ili najmanje 24 sata nakon početka ishemije ili, se reperfuziona terapija izvodi 275-690 minuta nakon početka ishemije.

9. PSD-95 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što peptid ima miristoilaciju na N-terminusu peptida.

10. Sredstvo za primenu u reperfuzionoj terapiji kod čoveka koji takođe dobija agens koji inhibira vezivanje PSD-95 sa NMDAR 2B, 2A ili nNOS pri čemu reperfuziona terapija i agens tretiraju štetno delovanje ishemije na centralni nervni sistem, pri čemu je agens trombolitik, vazodilatator ili hipertenzivni agens, pri čemu se inhibitor PSD-95 administrira pre izvođenja reperfuzione terapije, pri čemu se reperfuziona terapija izvodi nakon utvrđivanja da je subjekat kvalifikovan za reperfuziju zasnovanu na ishemičnoj penumbri i nedostatku hemoragije što pokazuje CT, MRI ili PET analiza i pri čemu inhibitor sadrži peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji ili sadrži KLSSIESDV (SEK ID NO:5) ili KLSSIETDV (SEK ID NO:43), pri čemu je peptid vezan sa internalizacionim peptidom ili lipidovan sa njim povećavajući tako prolazak peptida kroz membranu ili krvno moždanu barijeru.

2