CZ2012476A3 - Lipidované peptidy jako antiobezitika - Google Patents
Lipidované peptidy jako antiobezitika Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2012476A3 CZ2012476A3 CZ2012-476A CZ2012476A CZ2012476A3 CZ 2012476 A3 CZ2012476 A3 CZ 2012476A3 CZ 2012476 A CZ2012476 A CZ 2012476A CZ 2012476 A3 CZ2012476 A3 CZ 2012476A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dpr
- lipidated
- myr
- amino acid
- palm
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000883 anti-obesity agent Substances 0.000 title description 2
- 229940125710 antiobesity agent Drugs 0.000 title 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims abstract description 47
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 28
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 101001123492 Homo sapiens Prolactin-releasing peptide receptor Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100029002 Prolactin-releasing peptide receptor Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000002891 anorexigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 19
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 18
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 18
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 18
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 16
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- -1 dodecylamino Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000001539 anorectic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 claims description 4
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- FQRURPFZTFUXEZ-MRVPVSSYSA-N (2s)-2,3,3,3-tetrafluoro-2-(n-fluoroanilino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@](F)(C(F)(F)F)N(F)C1=CC=CC=C1 FQRURPFZTFUXEZ-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 2
- FOYXZVHDLXZETB-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-(benzylazaniumyl)-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoate Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NCC=1C=CC=CC=1)C1=CNC=N1 FOYXZVHDLXZETB-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 2
- OPOTYPXOKUZEKY-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-nitramido-3-phenylpropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 OPOTYPXOKUZEKY-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 3-amino-L-alanine Chemical compound [NH3+]C[C@H](N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N N-methyl-L-alanine Chemical compound C[NH2+][C@@H](C)C([O-])=O GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- GHBAYRBVXCRIHT-VIFPVBQESA-N S-benzyl-L-cysteine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCC1=CC=CC=C1 GHBAYRBVXCRIHT-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 102100028850 Prolactin-releasing peptide Human genes 0.000 claims 2
- 101710087617 Prolactin-releasing peptide Proteins 0.000 claims 2
- 108010087786 Prolactin-Releasing Hormone Proteins 0.000 abstract description 107
- 239000002877 prolactin releasing hormone Substances 0.000 abstract description 105
- 102000009087 Prolactin-Releasing Hormone Human genes 0.000 abstract description 102
- HWYCFZUSOBOBIN-AQJXLSMYSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-(diaminome Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 HWYCFZUSOBOBIN-AQJXLSMYSA-N 0.000 abstract description 33
- RLWIQKPYEREBED-YZZKORDDSA-N prrp20 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 RLWIQKPYEREBED-YZZKORDDSA-N 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- AOHAPDDBNAPPIN-UHFFFAOYSA-N 3-Methoxy-4,5-methylenedioxybenzoic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC2=C1OCO2 AOHAPDDBNAPPIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 abstract description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 abstract description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 9
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 9
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 8
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 6
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 235000018770 reduced food intake Nutrition 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 101000577767 Rattus norvegicus Prolactin-releasing peptide Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 4
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800001982 Cholecystokinin Proteins 0.000 description 3
- 102100025841 Cholecystokinin Human genes 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000577765 Homo sapiens Prolactin-releasing peptide Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 3
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 229940107137 cholecystokinin Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- SZHOJFHSIKHZHA-UHFFFAOYSA-N tridecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC(O)=O SZHOJFHSIKHZHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 101000984722 Bos taurus Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000015494 Mitochondrial Uncoupling Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010069820 Pro-Opiomelanocortin Proteins 0.000 description 2
- 239000000683 Pro-Opiomelanocortin Substances 0.000 description 2
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 2
- 102000056271 Prolactin-releasing peptide receptors Human genes 0.000 description 2
- 108700024163 Prolactin-releasing peptide receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 102000050810 human PRLH Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 2
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- HEAUFJZALFKPBA-JPQUDPSNSA-N (3s)-3-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-[[(2s)-1-amino-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 HEAUFJZALFKPBA-JPQUDPSNSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001631457 Cannula Species 0.000 description 1
- 102100035932 Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101001031598 Dictyostelium discoideum Probable serine/threonine-protein kinase fhkC Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000715592 Homo sapiens Cocaine- and amphetamine-regulated transcript protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 229940086609 Lipase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 102400000097 Neurokinin A Human genes 0.000 description 1
- 101800000399 Neurokinin A Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 101710119110 Prolactin-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710092489 Protein kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 229940121991 Serotonin and norepinephrine reuptake inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 229940124332 anorexigenic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002830 appetite depressant Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108700032673 cocaine- and amphetamine-regulated transcript Proteins 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N orlistat Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](OC(=O)[C@H](CC(C)C)NC=O)C[C@@H]1OC(=O)[C@H]1CCCCCC AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N 0.000 description 1
- 229960001243 orlistat Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002993 phenylalanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010022711 pyroglutamyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- UNAANXDKBXWMLN-UHFFFAOYSA-N sibutramine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C1(C(N(C)C)CC(C)C)CCC1 UNAANXDKBXWMLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004425 sibutramine Drugs 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000211 third ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2257—Prolactin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Lipidované peptidy, analogy obou forem peptidu uvolňujícího prolaktinu, PrRP31 a PrRP20, představují anorexigenní látky snižující příjem potravy, které po periferním podání působí v mozku. Analogy PrRP31 a PrRP20 lipidované na N-konci myristovou nebo palmitovou kyselinou se vážou s vysokou afinitou k potkaní hypofyzární buněčné linii RC-4B/C s endogenním receptorem GPR10. Tyto lipidované peptidy po periferním podání rovněž výrazně snižují příjem potravy u hladových myší v závislosti na dávce a mají ve srovnatelných dávkách podobné účinky jako centrálně podaný přirozený PrRP31, avšak mnohem výraznější a déle trvající.
Description
Nové analogy peptidu uvolňujícího prolaktin představují anorexigenní látky, které po periferním podání snižují příjem potravy. Popsána je syntéza těchto lipidovaných peptidů a jejich farmakologické účinky in vitro a in vivo.
Dosavadní stav techniky
Obezita představuje stále rostoucí problém rozvíjejících se i vyspělých zemí, pro který zatím neexistují účinné terapie. Jediným lékem dostupným v ČR je Orlistat, inhibitor střevní lipázy, který snižuje vstřebávání tuků z tenkého střeva. Má však vedlejší účinky, jako např. průjmy. Z trhu byl stažen Sibutramin, inhibitor zpětného vychytávání serotoninu a noradrenalinu, který navozuje pocit sytosti, při jehož užívání bylo zjištěno zvýšené riziko výskytu srdečních chorob (Strader and Woods, 2005; Heal et al., 2012). V posledním desetiletí 20. století pak byla objevena řada látek, které zásadně ovlivňují regulaci energetického metabolismu, a mezi nimi i neuropeptid PrRP (prolactin-releasing peptide, peptid uvolňující prolaktin) (Hinuma et al., 1998).
V organismu se vyskytují dvě formy PrRP, jedna obsahuje 31 aminokyselin (PrRP/1-31/; PrRP31) a druhá 20 aminokyselin (PrRP/12-31/; PrRP20) (Hinuma et al., 1998). C-koncový dvacetipeptid je identický, přičemž C-koncový dipeptid RF-amid, tvořený argininem a amidovaným fenylalaninem, je zcela nezbytný pro zachování biologické aktivity (Fukusumi et al., 2006).
PrRP má v organismu více úloh. Prvním popsaným biologickým účinkem PrRP byla stimulace uvolňování prolaktinu (Hinuma et al., 1998). Následně však bylo zjištěno, že u potkaních samců není tento účinek ovlivněn, a tudíž pravděpodobně není primární úlohou PrRP (Jarry et al., 2000). Díky objevu PrRP v hypotalamických jádrech PVN a DMN (paraventrikulámím a dorsomediálním jádru), která jsou důležitá pro udržování energetické rovnováhy, se o PrRP začalo uvažovat jako o faktoru ovlivňujícím příjem potravy (Lawrence • «η · · · · ♦ ♦ * · * • «. «> « · · »««« * · * * · ν .»·«’« · * ·
2- > fc fr 4» • · · · · * · ♦· · ······· et al., 2000). Výskyt PrRP a jeho receptoru v dalších oblastech mozku pak naznačují, že PrRP působí i při regulaci odpovědi na stres a na bolestivé podněty (Onaka et al., 2010).
Anorexigenní efekt PrRP31 se projevil po jeho injektování do třetí mozkové komory, jejíž přední stěna a dno jsou tvořeny hypotalamem (tzv. intracerebroventrikulámí podání, ICV). U potkanů došlo k významnému krátkodobému snížení příjmu potravy, které dále způsobilo snížení hmotnosti (Lawrence et al., 2000; Lawrence et al., 2004). Toto snížení příjmu potravy neovlivnilo příjem vody ani chování pokusných zvířat. Nebyla prokázána nevolnost ani nechutenství (Lawrence et al., 2002).
Působení PrRP jako anorexigenní látky bylo prokázáno i při dalších experimentech. Bylo zjištěno, že při negativní energetické bilanci, ke které dochází např. při kojení či při hladovění, dochází ke snížení transkripce genu pro PrRP. To je typické i pro další anorexigenní neuropeptidy, jako je např. peptid CART (cocaine- and amphetamine-regulated transcript) či POMC (proopiomelanocortin) (Lawrence et al., 2000; Ellacott et al., 2002). K redukci hmotnosti po ICV injikaci PrRP však nedochází pouze snížením příjmu potravy, ale projeví se i zvýšení tělesné teploty a spotřeby kyslíku, což jsou nepřímé důkazy zvýšeného energetického výdeje. Vyšší je rovněž produkce mRNA pro tzv. uncoupling protein 1 (UCP1) v hnědé tukové tkáni, což taktéž svědčí pro zvýšený energetický výdej (Ellacott et al., 2003).
Ke zjišťování funkcí PrRP v organismu byla využívána i geneticky modifikovaná zvířata (tzv. knock-out, KO zvířata s vyloučeným genem kódujícím PrRP či jeho receptor GPR10) (Bjursell et al., 2007; Takayanagi et al., 2008). Myši s vyloučeným genem pro PrRP trpí hyperfagií, kdy není ovlivněna frekvence příjmu jednotlivých dávek potravy, ale dochází ke zvětšení každé jednotlivé dávky jídla. U těchto jedinců nedochází ke snížení energetického výdeje, neboť jejich tělesná teplota i spotřeba kyslíku jsou srovnatelné s kontrolními jedinci (Takayanagi et al., 2008; Mochiduki et aL, 2010).
Myši s vyloučeným genem pro receptor GPR10 rovněž vykázaly vyšší příjem potravy vedoucí k obezitě, významnější pak u samic (Gu et al., 2004; Bjursell et al., 2007). Zároveň bylo zjištěno, že uGPRIO KO zvířat nebyl příjem potravy snížen ani po podání cholecystokininu (CCK). Tento nález potvrzuje hypotézu, že systém GPR10-PrRP může mít
*. ® » * · ·····*· · * « · · 4 klíčovou úlohu v přenosu signálu CCK, periferního peptidů, který navozuje pocit sytosti při příjmu potravy (Bechtold and Luckman, 2006).
Pokud se týká strukturních požadavků, pro správnou funkci PrRP je nezbytně nutná přítomnost argininu v pozici 30. Při jeho modifikaci či záměně za jinou aminokyselinu dochází k úplné ztrátě vazby k receptorů i biologické aktivity. Pro vazbu PrRP k receptorů GPR10 je dále důležitá pozice 31, vyžadující přítomnost fenylalaninu či jiné aminokyseliny s aromatickou skupinou navázanou k minimálně jedné skupině CH2 postranního řetězce aminokyseliny (Boyle et al., 2005).
Pro vazebné experimenty s analogy PrRP je využíván PrRP se 125I na tyrosinu v pozici 20 (Satoh et al., 2000). Bylo potvrzeno, že monojodace tyrosinu neovlivní vazbu PrRP k receptorů (Maixnerová et al., 2011). V nedávné studii (Maletínská et al., 2011) byly využity modifikace přirozeného peptidů PrRP20, jehož biologická aktivita in vitro je srovnatelná sPrRP31 (Langmead et al., 2000; Maixnerová et al., 2011a). C-koncový fenylalanin byl nahrazen nekódovými aminokyselinami, deriváty fenylalaninu PheCl2, PheF5 a PheNO2, nebo nekódovými aminokyselinami s objemným naftylalaninem 1-Nal a 2-Nal, nebo tyrosinem. Všechny analogy měly zachován C-koncový amid, který je nezbytný pro biologickou aktivitu (Hinuma et al., 1998; Roland et al., 1999) a navíc byly acetylovány na N-konci peptidového řetězce, aby byla zvýšena jejich stabilita, zvláště při experimentech in vivo. Biologická aktivita není závislá na obměně aminokyselin v polohách před C-koncovým heptapeptidem.
K hypofyzámí buněčné linii RC-4B/C, u které se přirozeně vyskytuje receptor GPR10 v řádu desetitisíců vazebných míst na buňku (Maixnerová et al., 2011), se [Tyr31]PrRP20, [1Nal3l]PrRP20, [PheF531]PrRP20, [PheCl231]PrRP20 a [PheNO23,]PrRP20 vázaly s Kit řádově srovnatelnou s hodnotami pro PrRP31 a PrRP20 (Maletínská et al., 2011). Kromě toho všechny zmíněné analogy PrRP zvyšovaly v buňkách RC-4B/C fosforylaci enzymů MAPK/ERK1/2 (mitogen activated phosphorylase/extracellular-regulated kinase) i proteinu CREB (cAMP response element-binding protein) a stimulovaly uvolňování prolaktinu do média s podobnou hodnotou EC50 jako PrRP20 (Hinuma et al., 1998). Jmenované analogy PrRP po ICV podání v dávce 10 nmol způsobily statisticky významné snížení příjmu potravy u hladových myší (Maletínská et al., 2011). Tyto analogy tedy přestavují velmi účinné
anorexigenní peptidy, příjem potravy však snižují pouze po centrálním, nikoliv po periferním podání.
Nyní bylo zjištěno, že navázání mastné kyseliny na N-konec zvyšuje řádově funkčnost jak PrRP20 a PrRP 31, tak zejména analogů obou těchto forem. Účinek byl pozorován jak při pokusech in vitro, tak in vivo. Statisticky velmi významného snížení příjmu potravy u hladových myší po podání lipidovaných peptidů PrRP 20 i 31 a zvláště pak jejich analogů bylo zcela nově dosaženo i po periferním (subkutánním, SC) podání.
Podstata vynálezu
Byly připraveny neuropeptidy PrRP31 i PrRP20 a jejich analogy s obměněným aminokyselinovým složením, lipidované mastnou kyselinou (např. myristoylem či palmitoylem) na N-konci peptidu. Oba typy neuropeptidů s rozdílnou délkou řetězce se vázaly s vysokou afinitou k receptoru pro PrRP v podmínkách in vitro a vykázaly až velmi signifikantní (P < 0.001) snížení příjmu potravy u hladových myší v závislosti na dávce nejen po centrálním, ale také po periferním podání. Lipidizace neuropeptidů ovlivňujících příjem potravy, které působí v hypotalamu a mozkovém kmeni, představuje novou možnost, jak tyto peptidy dopravit přes hematoencefalickou bariéru po periferním injekčním podání. Až doposud nebyly publikovány žádné lipidované analogy neuropeptidů, které by po periferním podání snižovaly příjem potravy.
Předmětem vynálezu jsou lipidované peptidy tvořené 20 nebo 31 aminokyselinami, přičemž jejich C-konec tvoří sekvence IRPVGRF—NH2, v níž isoleucin muže být nahrazen fenylglycinem či alaninem a valin může být nahrazen fenylglycinem, koncový fenylalanin může být nahrazen aminokyselinou s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-SCH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, přičemž na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, která je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující serin, kyselina diaminopropionová a threonin, je amidovou vazbou navázána C6 až Cl8 mastná kyselina, případně je N-koncovou aminokyselinou samotná kyselina diaminopropionová.
Význakem vynálezu je, že zmíněné lipidované peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
o « « * · · · · · * · · • » * » * · * w * , #· » » · ♦ * 5« «ί * * ··«··»· ·« · ·······
X-TPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, a
X-SRmHnHSqETRTPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, kde m je T, A nebo methylalanin, o je G nebo S, n je Q nebo R, p je G, A, P nebo S, q je M nebo norleucin, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina C6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že výše zmíněné lipidované peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
X-TPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, a
X-SRmHnHSMETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina 6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
Dalším význakem předkládaného vynálezu je to, že výše zmíněné lipidované peptidy nesou C-koncovou aminokyselinu, zvolenou ze skupiny, zahrnující naftylalanin, benzylcystein, benzylhistidin, pentafluorofenylalanin, nitrofenylalanin.
Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že mastná kyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující mastné kyseliny o 6 až 18, s výhodou 13 až 18 uhlíkových atomech.
Předmětem vynálezu jsou dále peptidy zvolené ze skupiny, zahrnující:
(Dpr(oct))RmHnHSN/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 • » · · · * ♦ * * « e * · * · - * 6» * * * ·····*· · · · »····· (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-A«/-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA/eETRTPDWAWYmoRGrRPsGR7-AG/-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-W-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AG/-NH2 kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1-Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidu kreceptoru GPR10 nad Kj 10'6 moLf1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
Předmětem vynálezu jsou rovněž peptidy zvolené ze skupiny, zahrnující: (Dpr(oct))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINP A WYmoRGIRP V GRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 (Dpr(dodcc))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-M//-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-A«/-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-W-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-7Va/-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 • · * · · ♦ · · ·t · · ♦ , , β » * * * *· * ® · * * f » * · “'·*
7» · Λ í ® ······· · · · ·*····· kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidů kreceptoru GPR10 nad K, 10 6 mold a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
Předmětem vynálezu je i použití výše zmíněných lipidovaných peptidů jako anorexigenních látek, snižujících příjem potravy po periferním podání.
Předmětem vynálezu je konečně i použití uváděných lipidovaných peptidů k výrobě léčiva pro léčení obezity.
Na základě struktumě-aktivitních studií byly navrženy analogy potkaního (identický s myším) a lidského PrRP31 a PrRP20, lipidované na N-koncové aminoskupině nebo postranní skupině N-koncové aminokyseliny pomocí mastné kyseliny, obsahující výhodně C14 až Cl 8. Methionin v poloze 8 byl vPrRP31 byl nahražen stabilnějším norleucinem. Rovněž bylo zjištěno, že pro zachování anorektické aktivity u myší po centrálním podání nestačí kratší peptid obsahující klíčovou koncovou sekvenci, jako tridekapeptid PrRP13 (obsahující aminokyseliny 18 až 31 zPrRP31) a je nutné použít analogy přirozených PrRP31 nebo PrRP20.
Aminokyseliny ležící v polohách před C-koncovým heptapeptidem nejsou pro popsanou biologickou aktivitu lipidovaných peptidů zásadní. Jejich záměna za jinou aminokyselinu je možná za předpokladu, že výsledný lipidovaný peptid bude mít vazebnou afinitu k receptoru pro PrRP s K, řádově 10’6 mol.!-1 a méně (výhodněji 1(Γ8 mokl'1 a méně), bude vykazovat agonistickou aktivitu vzhledem kPrRP (určovanou pomocí signalizace MAPK/ERK1/2 v buňkách RC-4B/C) a anorektickou aktivitu, stanovenou pomocí testu příjmu potravy u hladových myší po jeho centrálním i periferním podání, stejnou jako PrRP, nebo vyšší.
Získané výsledky lze shrnout následovně:
• · · · » · · · · · ·· * « · * - * * · « * e · *· » Λ » ·' > * · ·
8- » $» ·»···<·· · · · *··**··
- Lipidizace peptidů, které jsou analogy PrRP31 a PrRP20 na N-konci umožňuje centrální účinek neuropeptidu, endogenně specificky exprimovaného v hypotalamu, po subkutánním, tedy periferním podání.
- Lipidizace všech těchto peptidů vedla ke zlepšení vazby k receptorů - snížení K, při vazbě na buňky RC-4B/C v závislosti na délce řetězce mastné kyseliny. Navázání mastné kyseliny tedy nejenom zachovalo vazbu k receptorů (v důsledku lipidace na N-konci peptidu, zatímco pro vazbu na receptor je důležitý zejména C-koncový RF-amid), ale dokonce došlo až k jejímu řádovému zlepšení.
- Příslušné lipidované peptidy jako analogy lidského i potkaního PrRP se vázaly se stejnou afinitou k potkanímu receptorů na buňkách RC-4B/C a to bez ohledu na to, zda vytěsňovaly vazbu potkaního či lidského l25I-PrRP31.
- Všechny testované peptidy byly agonisté PrRP (což bylo stanoveno signalizací MAPK/ERK1/2, mitogenem aktivované proteinkinázy/extracelulámím signálem regulované proteinkinázy 1/2 v buňkách RC-4B/C).
- Lipidované peptidy jako analogy PrRP v žádném z provedených testů po SC podání myším nevyvolaly sekreci prolaktinu.
- V testu příjmu potravy po SC podání myším peptidy lipidované kyselinou myristovou nebo palmitovou, částečně i kyselinou tridekanovou, významně snižovaly příjem potravy v závislosti na dávce. Jde o vůbec první popis modifikovaného neuropeptidu, který snižuje příjem potravy po periferním podání. Látky byly po periferním podání účinnější než po podání centrálním do 3. mozkové komory.
- Účinek na příjem potravy byl dlouhodobý, v závislosti na dávce přetrvával více než 10 hodin po podání. Je to patrně v důsledku jak zvýšené odolnosti proti degradaci proteázami (vnesení mastné kyseliny a nekódových aminokyselin), tak vazby lipopeptidu na sérový albumin.
Nejúčinnějšími z testovaných analogů PrRP31 byly potkaní myristované analogy č. 5 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2, a č. 9 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR /-AW-NH2, a palmitovaný analog:
č. 10 (Dpr(palm)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2.
Nejúčinnějším z testovaných analogůPrRP20 byl myristovaný analog
č. 10 (myr)TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2.
* « » · » · · * · · » · » '· · « ·»“<* · ‘· *
Λ ve* y «···«·· · · · ···*···
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po ICV podání PrRP31 hladovým myším C57BL/6 v dávce 4 a 10 nmol/myš. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6-7). Signifikance je **P < 0,01, ***P < 0,001 vs fyz. roztok v čase 45 a 75 min po injekci (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, o - PrRP31 (4 nmol), · - PrRP31 (10 nmol).
Obrázek 2 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po ICV podání analogů PrRP31 s různě dlouhým lipidovým řetězcem hladovým myším C57BL/6 v dávce 4 nmol/myš. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n =6-7). Signifikance je *P < 0,05, ***P < 0,001 vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, · - PrRP31, Δ - analog 1, - analog 2, A analog 5.
Obrázek 3 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání analogů PrRP31 s různě dlouhým lipidovým řetězcem hladovým myším C57BL/6 v dávce 5 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je *P < 0,05, ***p < 0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). — fyz. roztok, Δ - analog 1, - analog 2, - analog 3, A - analog 4, A - analog 5, A analog 6.
Obrázek 4 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání lidských a potkaních lipidovaných analogů PrRP31 a PrRP20 hladovým myším C57BL/6 v dávce 5 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je ***P<0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem), vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem).
- fyz. roztok, - analog 5, A - analog 10, - analog 12, ♦ - analog 13.
» »> * * · fe · · * * * » ' « - * ·. * · * · · ’ * ····**· · · · * · * · · ··
Obrázek 5 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání myristoylovaného analogu [Dpr']PrRP31 (č.5) hladovým myším C57BL/6 v dávce 1, 2, 5 a 10 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je ***P < 0,001 vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým posthoc testem). - fyz. roztok, Δ - analog 5: 1 mg/kg, - analog 5: 2 mg/kg, A - analog 5: 5 mg/kg, A - analog 5:10 mg/kg.
Obrázek 6 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání myristoylovaného analogu [Dpr',Nal3']PrRP31 (č. 9) hladovým myším C57BL/6 v dávce 1, 2, 5 a 10 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je **P<0,01, ***P<0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, o - analog 9: 1 mg/kg, - analog 9: 2 mg/kg, · - analog 9: 5 mg/kg, • - analog 9: 10 mg/kg.
Příklady provedení vynálezu
Použité zkratky
ANOVA analýza rozptylu
BSA hovězí sérový albumin
BPTI hovězí pankreatický inhibitor trypsinu
EGF epidermální růstový faktor
HEPES kyselina (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
SDS dodecylsulfát sodný
TBS Trisem pufrovaný fyziologický roztok obsahující Tween-20
Metody použité v testech s analogy PrRP
Peptidy byly syntetizovány metodou syntézy na pevné fázi na dle postupu Maixnerové a kol. (Maixnerová et al., 2007) s využitím Fmoc strategie na syntetizátoru ABI 433A (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). Lipidizace příslušnou mastnou kyselinou byla provedena před odštěpením peptidů z pryskyřice popsaným postupem (Maletínská et al., 2012).
Peptid PrRP31 byl jodován pomocí Na125! činidlem lodo-Gen (Pierce, Rockford, IL, USA) dle popsaného postupu (Maixnerová et al., 2011). Monojodovaný peptid byl uchován v alikvotech při -20 °C a byl spotřebován při vazebných studiích v průběhu jednoho měsíce.
Příklad 1: Kompetitivní vazebné experimenty
Kompetitivní vazebné experimenty byly prováděny podle principů Motulského a Neubiga (Motulsky and Neubig, 2002). Pro vazebné pokusy se hypofyzámí potkaní buněčná linie RC4B/C (ATCC, Manassas, USA) pěstovala na 24-jamkových destičkách, jejichž dno bylo potaženo polyetyleniminem. Buňky byly pěstovány do optimálního počtu 300-450 tisíc buněk/jamku. Pro experiment byl použit vazebný pufr (20 mmol.r1 HEPES o pH 7,4; 118 mmol.r1 NaCl, 4,7 mmol.r1 KC1, 5 mmol.r1 MgCl2, 5,5 mmol.r1 glukosa, 1 mg/ml BSA, 0,1 mg/ml BPTI), neznačené analogy PrRP s finální koncentrací v rozmezí 10’11 až 10'4 mol.I’1 a 125I-PrRP31 s finální koncentraci 10’10 mokl'1 (Maixnerová et ak, 2011). Destička pak byla inkubována 60 min při laboratorní teplotě. Po inkubaci byly buňky solubilizovány v 0,1 mol/1 roztoku NaOH a radioaktivita navázaná na buňkách byla změřena v γ-čítači. Pokusy byly vždy prováděny v duplikátech a nejméně třikrát opakovány.
Všechny testované potkaní analogy PrRP (struktura viz tabulka 1), tedy lipidované peptidy, se vázaly s vysokou afinitou k receptoru v buňkách RC-4B/C (řádově vnmol.l'1 oblasti). S prodlužujícím se řetězcem navázané mastné kyseliny se hodnoty Kj snižovala, tedy vazba zvyšovala, a to až o 1 řád proti původnímu peptidů (viz tabulka 2).
Lidské lipidované analogy PrRP (struktura viz tabulka 1) vytěsňovaly srovnatelně jak vazbu !25I-PrRP potkaního, tak lidského, k buňkám RC-4B/C s potkaním receptorem pro PrRP, a to v nmol.r1 oblasti (viz tabulka 3).
Tab. 1 Struktura lipidovaných analogů PrRP31 a PrRP20 a/ Lipidované analogy PrRP31 - potkaní
PrRP31 SRAHQHSMETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1 -Nal-NH2 (Dpr(oct)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1 -Nal-NH2 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1-Nal-NH2 b/ Lipidované analogy PrRP20 - potkaní
PrRP20 TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 c/ Lipidované lidské analogy PrRP31 a PrRP20 hPrRP31 SRTHRHSMETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RTHRHS Nle ETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr)) RTHRHS Nle ETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2
Dpr - diaminopropionová kyselina, oct - oktanoyl, dodec - dodekanoyl, tridec — tridekanoyl, myr - myristoyl, palm - palmitoyl, Nle — norleucin, 1-Nal - naftylalanin.
Příklad 2: Buněčná signalizace.
Buňky RC-4B/C, které byly využity k prokázání, zda lipidované analogy PrRP20 spouští signalizační dráhu MAPK/ERK1/2, byly pěstovány na 6-jamkových destičkách do optimální hustoty 700-900 tisíc buněk/jamku. 17 hodin před sběrem vzorků bylo vyměněno růstové médium za médium bez séra a bez EGF (epidermal growth factor). Do každé jamky byl přidán příslušný lipidovaný analog PrRP ve finální koncentraci 10'6 molT1. Po 5 minutové inkubaci při 37 °C byla destička vložena na led a každá jamka byla třikrát propláchnuta pufrem PBS o pH 7,4 (137 mmolT1 NaCl, 2,7 mmolT1 KC1, 8 mmol.!’1 Na2HPO4.2H2O a 1,76 mmolT1 KH2PO4), který byl temperován na teplotu 4 °C. Buňky pak byly solubilizovány ve vzorkovém pufru (62,5 mmol.l1 Tris-HCl pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromfenolová modř, 5% merkaptoethanol, 50 mmolT1 NaF a 1 mmol.l1 Na3VO4), odebrány λ » - e ·» « · * * » . * < - · Λ « «'
1β ·*.*»»** · * · * ’ r ·· ► * · do mikrozkumavek a zamraženy při teplotě -20 °C. Vzorky byly sbírány alespoň ve třech nezávislých pokusech.
K prokazování, zda lipidované analogy PrRP20 spouští signalizační dráhu MAPK/ERK1/2, byla využita metoda Western blotu. Elektroforéza byla prováděna na 5% /12% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) na přístroji Mini-Protean 3 (BioRad, Herkules, CA, USA). Vzorky, které byly na gely nanášeny, byly 1 minutu dezintegrovány ultrazvukem, poté 2 minuty zahřívány při 100 °C a nakonec odstřed ovány 5 minut při 500 x g při laboratorní teplotě. Jako pozitivní kontrola byl využit PrRP20, u kterého bylo prokázáno, že spouští signalizační dráhy MAPK/ERK1/2 (Maixnerová et al., 2011). Elektroforéza probíhala za stálého napětí 100 V 10 minut a asi 60 minut při napětí 150 V.
Pro prokázání přítomnosti fosforylovaných proteinů ve vzorcích byly proteiny z SDS-PAGE gelu přeneseny na membránu Immobilon™-P PVDF (difluorid polyvinylidenu) (SigmaAldrich, USA). Přenos probíhal v blotovacím pufru o pH 8,3 (25 mmol.l·1 Tris, 192 mmol.l1 glycin a 20% methanol) po dobu 20 hodin při 4 °C za konstantního napětí 30 V.
Po přenesení proteinů na PVDF membránu byly membrány 5 minut promývány v promývacím TBS pufru (20 mmol.l1 Tris, 140 mmol.l NaCl a 0,1% Tween-20) a poté byly jednu hodinu inkubovány v blokovacím pufru (TBS s 5% odtučněným sušeným mlékem a 5 mmolT1 Na3VO4 a 50 mmolT1 NaF) při laboratorní teplotě. Následně byly membrány třikrát promyty promývacím TBS pufrem po dobu 5 minut. Dále byly membrány jednu hodinu inkubovány s primární protilátkou proti Fosfo-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA), která byla ředěna v blokovacím pufru v poměru 1:1000. Po opětovném trojím promytí membrán promývacím TBS pufrem po dobu 5 minut byly membrány jednu hodinu inkubovány s králičí sekundární protilátkou značenou peroxidázou (Sigma, St Louis, USA), která byla ředěna v blokovacím pufru v poměru 1.12 000.
Poté byly membrány opět třikrát promyty v promývacím TBS pufru po dobu 5 minut a následně na ně byl aplikován roztok Femto (Pierce SuperSignal, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), který způsobil chemiluminiscenci, která byla detekována pomocí CCD kamery LAS-3000 (Fuji Photo Film GmBH, Dusseldorf, Německo).
► 1* «· *< W «
Výsledky stanovení signalizace MAPK/ERK1/2 v buňkách RC-4B/C ukazuje tabulka 2.
Tab. 2
Afinita lipidovaných peptidických analogů potkaního PrRP31 a PrRP20 k potkanímu receptorů a biologická aktivita v buňkách RC-4B/C
Vytěsnění potkaního 125I-PrRP31 lipidovanými peptidy - analogy PrRP31 a PrRP20
| Analog | l25I-potkaní PrRP31 | signalizace ERK. | |
| Kj (nM) | % vazby PrRP31 | ||
| PrRP31 | 4.93 ± 0.61 | 100 | agonista |
| 1 | 3.74 ±0.29 | 132 | agonista |
| 2 | 2.86 ±0.17 | 172 | agonista |
| 3 | 1.12 ± 0.12 | 440 | agonista |
| 4 | 0.51 ±0.03 | 967 | agonista |
| 5 | 0.82 ±0.13 | 601 | agonista |
| 6 | 0.46 ± 0.06 | 1072 | agonista |
| 7 | 60.07 ±2.10 | 8 | agonista |
| 8 | 39.24 ±2.71 | 13 | agonista |
| 9 | 2.95 ±0.62 | 167 | agonista |
| PrRP20 | 3.44 ±0.85 | 143 | agonista |
| 10 | 0.78 ±0.45 | 632 | agonista |
Všechny testované lipidované peptidy vykazovaly pozitivní výsledek signalizace v buňkách RC-4B/C, který byl srovnatelný nebo vyšší než účinek PrRP31. Všechny lipidované peptidy jsou tedy agonisté in vitro.
Vyhodnocení in vitro experimentů.
Pro vyhodnocení kompetitivních vazebných experimentů byl využit program Graph Pad Prism Software (San Diego, CA, USA). Pro vyhodnocení spouštění signalizačních drah bylo využito denzitometrické stanovení pomocí programu Quantity One (BioRad, Hercules, CA,
USA).
• ·· · · · · * · · · · • * · · e » » » » »« » e * t ť« K * · · ► · v« · · * ·····»· ·· « ·······
Pro kompetitivní vazebné experimenty byla využita metoda nelineární regrese za předpokladu jednoho vazebného místa. Hodnotu K, byla vypočítaná pomocí rovnice Chenga a Prussofa (Cheng and Prusoff, 1973) s použitím hodnoty Kd 4,21 nmol.F1 a koncentrace radioligandu byla 0,1 nmol.l·1 (Maixnerová et al., 2011).
Pro statistické vyhodnocení statisticky významné odpovědi u buněčné signalizace byla využita metoda jednocestného testu ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Data byla statisticky významná při P < 0,05.
Tab. 3
Afinita lipidovaných analogů potkaního a lidského PrRP k potkanímu receptoru v buňkách RC-4B/C
Vytěsnění potkaního a lidského 125I-PrRP31 lipidovanými analogy lidského PrRP
| Analog | l25I-potkaní PrRP31 Ki (nM) | l25I-lidský PrRP31 Ki (nM) |
| hPrRP31 | 1.54 ±0,42 | 3.01 ±0.70 |
| 11 | 2.28 ±1.30 | 2.00 ± 1.26 |
| 12 | 4.13 ±2.57 | 3.16 ±0.83 |
| 13 | 0.41 ±0.13 | 0.66 ±0.14 |
Tab. 2 a 3: Hodnoty inhibiční konstanty neznačené látky KÍ5 byly vypočítané dosazením IC5o do rovnice Chenga a Prusoffa (za Ka byla dosazena hodnota 4,21 nmol.l1 zjištěná při saturačních vazebných experimentech a koncentrace radioligandu byla 0,1 nmol.l ) s příslušnými hodnotami S.E.M.
Příklad 3: Test příjmu potravy po SC nebo ICV podání lipidovaných analogů PrRP
Myší samci kmene C57BL/6 (An Lab, Praha 4) byli chováni v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2°C a měli volný přístup k potravě i k pití. Rytmus světlo/tma byl 12/12 hodin (začátek světla 6.00). Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon ě. 246/1992 Sb.). Samci byli krmeni standardní dietou St-1 (Mlýn Kocanda, Praha, ČR), která obsahovala 66 % sacharidů, 25 % proteinů a 9 % tuků a jejíž energetická hodnota byla 3,4 kcal/g.
* * β » S i « á *4 1 -· *· * · ».
* e · ’-· * » ·«
.. ..· :
hodin před injektováním lipidovaného peptidů byla myším odebrána potrava, ale zůstal volný přístup k pití. Injektování fyziologického roztoku a PrRP i lipidovaných analogů PrRP po rozpuštění ve fyziologickém roztoku bylo prováděno SC, v dávkách 1-10 mg/kg (objem 0,2 ml/myš), nebo ICV pomocí infuzní pumpy (kanyly byly myším zavedeny do 3. mozkové komory 4 dny před pokusem podle postupů Maixnerové a kol. (Maixnerová et al., 2011) a jednotlivá dávka peptidů činila 4 nmol/myš (5 μΐ/myš).
minut po injektování lipidovaného peptidů byla myším podána předem zvážená potrava. Potrava pak byla vážena každých 30 minut po dobu 5-10 hodin. Podání každé dávky lipidovaného analogu PrRP bylo prováděno nejméně dvakrát a jedna skupina myší čítala minimálně 6 myší. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech příjmu potravy ve srovnání s kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem.
Pro statistické vyhodnocení byl použit program Graph-Pad Prism Software (San Diego, CA, USA), metoda one-way ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Rozdíly v příjmu potravy mezi jedinci, jimž byl injektován fyziologický roztok, a jedinci, kterým byl injektován hodnocený peptid, byly považovány za statisticky významné při P < 0,05.
Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4 a v obrázcích 1-6.
Tab. 4 Biologická aktivita lipidovaných peptidů - analogů potkaního PrRP in vivo
Příjem potravy u hladových myší C57BL po SC injekci (5 nebo 10mg/kg) nebo ICV injekci (4nmol/myš, odpovídá dávce 0.6 mg/kg).
| Analog | SC podání | ICV podání | ||||||
| 45 minut | 300 minut | 45 minut | 300 minut | |||||
| přijatá potrava (g) | % kontrol | přijatá potrava (g) | % kontrol | přijatá potrava (g) | % kontrol | přijatá potrava (g) | % kontrol | |
| PrRP31 | 0,32 | 100 | 1,15 | 105 | 0,42 | 75 | 1,37 | 104 |
| 1 | 0,38 | 117 | 1,05 | 97 | 0,39 | 70 | 0,71 | 53 |
| 3 | 0,12 | 50 | 0,61 | 60 | NT | |||
| 4 | 0,07 | 30 | 1,04 | 101 | 0,38 | 71 | 1,4 | 105 |
| 5 | 0,05 | 25 | 0,18 | 21 | 0,35 | 62 | 0,96 | 73 |
| 17 | * ♦ · • * « * * * · • · · · · · · | • * · · · · ·' · · * · » « » “ * ' « ·. » » · »: ·» · ·*····· | |
| 6 | 0 0 0,14 14 0,38 71 | 1,3 | 100 |
| 7 | 0,16 49 0,88 81 | NT | |
| 8 | 0,17 76 0,78 90 0,34 60 | 1,05 | 79 |
| 9 | 0,01 2 0,22 25 0,28 51 | 1,03 | 78 |
| PrRP20 | 0,32 100 1,1 100 0,32 68 | 1,29 | 100 |
| 10 | 0,11 32 44 44 0,28 51 | 1,1 | 86 |
| Příjem potravy byl sledován 300 min po injekci látky. Ve 45 min | po podání je maximální | ||
| účinek látky. Látky 1, 2, 5, 7, 8, 9 v dávce 10 mg/kg, látky 3, 4, 6, | 10 v dávce 5 mg/kg (SC | ||
| podání). Fyz - fyziologický roztok (kontrola). NT - netestováno. |
Lipidované analogy potkaního PrRP31 i PrRP20 snižovaly příjem potravy u hladových myší po ICV podání v podobné míře jako u PrRP31 (viz obr. 1 a publikaci (Maixnerová et al., 2011), ale jejich účinek byl ve srovnání sPrRP31 prodloužený (příklady na obr. 2). Účinek lipidovaných analogů PrRP po ICV podání nebyl závislý na délce či existenci mastné kyseliny.
Lipidované analogy potkaního PrRP31 a PrRP20 s navázanou kyselinou myristovou nebo palmitovou (příklad analogů PrRP31 na obr. 3) snižovaly velmi významně a dlouhodobě příjem potravy u hladových myší po SC podání. U analogu s kyselinou tridekanovou došlo k částečnému snížení příjmu potravy, avšak účinek byl výrazně nižší než u výše jmenovaných analogů. Analogy bez mastné kyseliny nebo obsahující oktanoyl nebo dodekanoyl snižovaly příjem potravy, ale nikoli statisticky významně - pravděpodobně v důsledku špatného průstupu hematoencefalickou bariérou.
Myristoylované analogy lidského PrRP31 a PrRP20 snižovaly velmi významně příjem potravy u hladových myší, srovnatelně s účinkem příslušných potkaních analogů (obr. 4).
Snížení příjmu potravy u myší po SC podání lipidovaných analogů PrRP bylo závislé na podané dávce (obr. 5 ukazuje účinek látky 5 a obr 6 účinek látky 9). Dávky 2-10 mg/kg významně snižovaly příjem potravy.
Průmyslová využitelnost
Potenciální antiobezitika po subkutánním podání.
• · * · » ···· ·: « » • * * * * ¢- · · « « f. «
IQ * * «
Ιο ······· ·· · ·······
Literatura:
Bechtold D and Luckman S (2006); Endocrinology 147:4723-4729.
Bjursell M, Lennerás M, Goransson M, Elmgren A and Bohlooly-Y M (2007); Biochem Biophys Res Commun 363:633-638.
Boyle R, Downham R, Ganguly T, Humphries J, Smith J and Travers S (2005); J Pept Sci 11:161-165.
Cheng Y and Prusoff WH (1973); Biochem Pharmacol 22:3099-3108.
Ellacott K, Lawrence C, Pritchard L and Luckman S (2003); Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 285:R1005-1010.
Ellacott K, Lawrence C, Rothwell N and Luckman S (2002); Endocrinology 143:368-374.
Fukusumi S, Fujii R and Hinuma S (2006); Peptides 27:1073-1086.
Gu W, Geddes B, Zhang C, Foley K and Stricker-Krongrad A (2004); J Mol Neurosci 22:93103.
Heal DJ, Gosden J and Smith SL (2012); Neuropharmacology 63:132-146.
Hinuma S, Habata Y, Fujii R, Kawamata Y, Hosoya M, Fukusumi S, Kitada C, Masuo Y, Asano T, Matsumoto H, Sekiguchi M, Kurokawa T, Nishimura O, Onda H and Fujino M (1998); Nature 393:272-276.
Jarry H, Heuer H, Schomburg L and Bauer K (2000); Neuroendocrinology 71:262-267.
Langmead C, Szekeres P, Chambers J, Ratcliffe S, Jones D, Hirst W, Price G and Herdon H (2000); Br J Pharmacol 131:683-688.
Lawrence C, Celsi F, Brennand J and Luckman S (2000); Nat Neurosci 3:645-646.
Lawrence C, Ellacott K and Luckman S (2002); Endocrinology 143:360-367.
Lawrence C, Liu Y, Stock M and Luckman S (2004); Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286:R101-107.
Maixnerová J, Hlaváček J, Blokesová D, Kowalczyk W, Elbert T, Sanda M, Blechová M, Železná B, Slaninová J and Maletínská L (2007); Peptides 28:1945-1953.
Maixnerová J, Špolcová A, Pýchová M, Blechová M, Elbert T, Řezáčova M, Železná B and Maletínská L (2011); Peptides 32:811-817.
Maletínská L, Pýchová M, Holubová M, Blechová M, Demianová Z, Elbert T and Železná B (2012); J Pharmacol Exp Ther 340:781-786.
Maletínská L, Špolcová A, Maixnerová J, Blechová M and Železná B (2011); Peptides
32:1887-1892.
* · ft ·· ··· · ft ·· • * · ft « * * * * ft ft — ft < -ft ft 9 ft « ft * * t » · ř ft ft»» ft · ft ft ft ft · · ft · ft ft ft ft ft ft ft
Mochiduki A, Takeda T, Kaga S and Inoue K (2010); J Neuroendocrinal 22:576-584.
Motulsky H and Neubig R (2002); Curr Protoč Neurosci Chapter 7:Unit 7.5.
Onaka T, Takayanagi Y and Leng G (2010); Trends Endocrinol Metab 21:287-293.
Roland B, Sutton S, Wilson S, Luo L, Pyati J, Huvar R, Erlander M and Lovenberg T (1999);
Endocrinology 140:5736-5745.
Satoh F, Smith D, Gardiner J, Mahmoodi M, Murphy K, Ghatei M and Bloom S (2000); Br J Pharmacol 129:1787-1793.
Strader A and Woods S (2005); Gastroenterology 128:175-191.
Takayanagi Y, Matsumoto H, Nakata M, Mera T, Fukusumi S, Hinuma S, Ueta Y, Yada T, Leng G and Onaka T (2008); J Clin Invest 118:4014-4024.
pV 7o/|2-- • ·· ···*·· ft.
• · · ♦ « *> ft «ι ·. ft * # - » « « * · · τ » ft · ,.
....... ’··’ i
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Lipidované peptidy tvořené 20 nebo 31 aminokyselinami, přičemž jejich C-konec tvoří sekvence IRPVGRF-NH2, v níž isoleucin může být nahrazen fenylglycinem či alaninem a valin může být nahrazen fenylglycinem, koncový fenylalanin může být nahrazen aminokyselinou s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, přičemž na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, která je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující serin, kyselina diaminopropionová a threonin, je amidovou vazbou navázána C6 až Cl 8 mastná kyselina, nebo je N-koncovou aminokyselinou samotná kyselina diaminopropionová.
- 2. Lipidované peptidy podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:X-TPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, aX-SRmHnHSqETRTPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, kde m je T, A nebo methylalanin, o je G nebo S, n je Q nebo R, p je G, A, P nebo S, q je M nebo norleucin, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina C6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
- 3. Lipidované peptidy podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:X-TPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, aX-SRmHnHSMETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina 6 až C18 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
- 4. Lipidované peptidy podle nároku 1,2 nebo 3, vyznačující se tím, že C-koncová aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující naftylalanin, benzylcystein, benzylhistidin, pentafluorofenylalanin, nitro fenylalanin.
- 5. Peptidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že mastná kyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující mastné kyseliny o 6 až 18, s výhodou 13 až 18 uhlíkových atomech.
- 6. Peptidy podle nároku 1, vyznačené tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:(Dpr(oct))RmHnHSNZeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSNZeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-Ya/-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSMeETRTPDINPA\VYmoRGrRPsGR /-AW-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-AaZ-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDWAWYmoRGrRPsGR7-W-NH2 (Dpr(pahn))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-W-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGR Z-M/Z-NH, (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGR Z-M/Z-NH2 kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1-Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidu k receptorů GPR10 nad Kj 10'6 mol.I’1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.• ·· ·»··«.· Λ * * * * · · w r ’ * · * *«·»*< * * * Λ « β β ζζ ···*··· ·· · ·»·.*.
- 7. Peptidy podle nároku 1, vyznačené tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:(Dpr(oct))RmHnHSWeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSWeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-AGZ-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-W-NH2 (Dpr(tndec))RmHnHSMtETRTPDINTAWYmoRGIRPVGR Z-AW-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-7VízZ-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-AaZ-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-A«Z-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-A«Z-NH2 kde kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, Dpr je kyselina diaminopropionová, 7Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidů k receptoru GPR10 nad Kj 10 6 mol.l1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
- 8. Použití lipidovaných peptidů podle kteréhokoliv z nároku 1 až 7 jako anorexigenních látek snižujících příjem potravy po periferním podání.
- 9. Použití lipidovaných peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 k výrobě léčiva pro léčení obezity.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | Lipidované peptidy jako antiobezitika |
| EP13767072.5A EP2872124B1 (en) | 2012-07-12 | 2013-07-11 | Lipidated peptides as anti-obesity agents |
| AU2013288383A AU2013288383B2 (en) | 2012-07-12 | 2013-07-11 | Popelova, AndreaLipidated peptides as anti-obesity agents |
| US14/414,034 US9937235B2 (en) | 2012-07-12 | 2013-07-11 | Lipidated peptides as anti-obesity agents |
| PCT/IB2013/001837 WO2014009808A2 (en) | 2012-07-12 | 2013-07-11 | Lipidated peptides as anti-obesity agents |
| CA2877594A CA2877594C (en) | 2012-07-12 | 2013-07-11 | Lipidated peptides as anti-obesity agents |
| IL236264A IL236264A (en) | 2012-07-12 | 2014-12-15 | Fatty residue peptides as anti-obesity agents |
| US15/094,390 US20160331812A1 (en) | 2012-07-12 | 2016-04-08 | Lipidated peptides as anti-obesity agents |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | Lipidované peptidy jako antiobezitika |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2012476A3 true CZ2012476A3 (cs) | 2014-01-22 |
Family
ID=49253347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) | 2012-07-12 | 2012-07-12 | Lipidované peptidy jako antiobezitika |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9937235B2 (cs) |
| EP (1) | EP2872124B1 (cs) |
| AU (1) | AU2013288383B2 (cs) |
| CA (1) | CA2877594C (cs) |
| CZ (1) | CZ2012476A3 (cs) |
| IL (1) | IL236264A (cs) |
| WO (1) | WO2014009808A2 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ309217B6 (cs) * | 2014-05-27 | 2022-06-01 | Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I. | Lipidované peptidy jako neuroprotektiva |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2012476A3 (cs) | 2012-07-12 | 2014-01-22 | Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i. | Lipidované peptidy jako antiobezitika |
| EP3094643B1 (en) * | 2014-01-15 | 2018-10-17 | Fyziologicky ustav Akademie ved Ceske republiky, v.v.i. | Lipidated peptides for lowering blood glucose |
| KR20170069997A (ko) * | 2014-08-11 | 2017-06-21 | 알바니 메디칼 칼리지 | 미리스토일화된 렙틴-관련된 펩티드 및 이들의 용도 |
| US20220153782A1 (en) * | 2019-03-27 | 2022-05-19 | Memoryplus Ltd. | Compounds, compositions and methods for treating a neurological condition |
| CZ2022499A3 (cs) | 2022-11-29 | 2024-06-05 | Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v. v. i. | Palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin určený pro intranasální podání |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6383764B1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-05-07 | The Regents Of The University Of California | Methods of identifying compounds for controlling absence seizures in a mammal relating to prolactin-releasing peptide(PrRP) |
| WO2006066258A2 (en) * | 2004-12-17 | 2006-06-22 | Neose Technologies, Inc. | Lipoconjugation of peptides |
| US20100292132A1 (en) * | 2007-09-11 | 2010-11-18 | Dorian Bevec | Use of insulin c-peptide, alone or in combination with glp-1, as a therapeutic agent |
| WO2009126132A1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-10-15 | Mark Rosenberg | Formulations and methods for modulating satiety |
| CA2839630A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Nono Inc. | Combination therapy for ischemia |
| CZ2012476A3 (cs) | 2012-07-12 | 2014-01-22 | Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i. | Lipidované peptidy jako antiobezitika |
-
2012
- 2012-07-12 CZ CZ2012-476A patent/CZ2012476A3/cs unknown
-
2013
- 2013-07-11 EP EP13767072.5A patent/EP2872124B1/en active Active
- 2013-07-11 AU AU2013288383A patent/AU2013288383B2/en active Active
- 2013-07-11 US US14/414,034 patent/US9937235B2/en active Active
- 2013-07-11 WO PCT/IB2013/001837 patent/WO2014009808A2/en not_active Ceased
- 2013-07-11 CA CA2877594A patent/CA2877594C/en active Active
-
2014
- 2014-12-15 IL IL236264A patent/IL236264A/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-04-08 US US15/094,390 patent/US20160331812A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ309217B6 (cs) * | 2014-05-27 | 2022-06-01 | Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I. | Lipidované peptidy jako neuroprotektiva |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2877594C (en) | 2018-01-02 |
| EP2872124A2 (en) | 2015-05-20 |
| US20150175674A1 (en) | 2015-06-25 |
| US20160331812A1 (en) | 2016-11-17 |
| EP2872124B1 (en) | 2017-11-08 |
| AU2013288383B2 (en) | 2015-12-10 |
| WO2014009808A2 (en) | 2014-01-16 |
| AU2013288383A8 (en) | 2015-03-19 |
| IL236264A (en) | 2017-10-31 |
| WO2014009808A3 (en) | 2014-03-06 |
| CA2877594A1 (en) | 2014-01-16 |
| US9937235B2 (en) | 2018-04-10 |
| IL236264A0 (en) | 2015-02-26 |
| AU2013288383A1 (en) | 2015-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210206817A1 (en) | Metabolically Stable Apelin Analogs in the Treatment of Disease Mediated by the Apelin Receptor | |
| Katafuchi et al. | Calcitonin receptor-stimulating peptide, a new member of the calcitonin gene-related peptide family: its isolation from porcine brain, structure, tissue distribution, and biological activity | |
| CZ2012476A3 (cs) | Lipidované peptidy jako antiobezitika | |
| Pittner et al. | Molecular physiology of amylin | |
| TW201143793A (en) | Oxyntomodulin peptide analogue | |
| Sánchez-Margalet et al. | Reprint of: Metabolic effects and mechanism of action of the chromogranin A-derived peptide pancreastatin | |
| EP2855517A1 (en) | Pancreatic polypeptide compounds and use | |
| Audinot et al. | [125I]‐S36057: a new and highly potent radioligand for the melanin‐concentrating hormone receptor | |
| Ohinata et al. | Albutensin A and complement C3a decrease food intake in mice | |
| Chatenet et al. | Urocontrin, a novel UT receptor ligand with a unique pharmacological profile | |
| Ögren et al. | Differential effects of the putative galanin receptor antagonists M15 and M35 on striatal acetylcholine release | |
| Aloyz et al. | Processing of the L5–67 precursor peptide and characterization of LUQIN in the LUQ neurons of Aplysia californica | |
| CA2602127A1 (en) | Human leptin-derived polypeptides and uses thereof | |
| Conklin et al. | Pharmacological characterization of arginine vasotocin vascular smooth muscle receptors in the trout (Oncorhynchus mykiss) in vitro | |
| Champion et al. | Structure–activity relationships of adrenomedullin in the circulation and adrenal gland | |
| Maletínská et al. | Biological properties of prolactin-releasing peptide analogs with a modified aromatic ring of a C-terminal phenylalanine amide | |
| AU2014366425A1 (en) | Novel compound for treatment of severe hypoglycemia | |
| AU759203B2 (en) | Peptide having preptin functionality | |
| US8946142B2 (en) | Beta-arrestin effectors and compositions and methods of use thereof | |
| AU2014366424A1 (en) | Novel compound for treatment of severe hypoglycemia | |
| Ohinata et al. | Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP) inhibits food intake and gastric emptying in mice | |
| US9340575B2 (en) | Agonists and antagonists of the urotensinergic system | |
| Holá | Interplay between ghrelin and its novel endogenous antagonist LEAP2: possible role in the pathology of obesity | |
| Audinot et al. | Structure-activity relationship studies of MCH-related peptide ligands of SLC-1, the human melanin-concentrating hormone receptor | |
| EP1233776A1 (en) | Urotensin-ii cyclic analogs |