RS50629B - Amidni prolek gemcitabina, kompozicije i njihova primena - Google Patents

Abstract

Jedinjenje formulePrijava sadrži još 10 patentnih zahteva.

Description

Stanje tehnike

Premdetni pronalazak se odnosi na novi prolek gemcitabina, koji se može dati oralno, ostavljajući intestinalni trakt gotovi netaknut prelazeći direktno u glavni krvotok sa manje gastrointestinalne toskičnosti i boljom biodostupnosti nego osnovni lek i održavajući efikasnost osnovnog leka pri nižim dozama.

Gemcitabin hidrohlorid (2',2'-difluoro-2'-dezoksicitidin hidrohlorid) je anti-tumorski

agens, sa poznatim antiviralnim dejstvom, koji se trenutno proizvodi i na tržištu nalazi pod imenom Gemzar®; liofilizovana, praškasta formulacija za lečenje različitih kancera. Gemzar®, postupak za njegovo dobijanje i metode njegove primene opisani su u US

Patent No. 5,464, 826 i US Patent No 4, 808, 614. Gemzar® je trenutno odobren za

lečenje kancera pankreasa, raka dojke i karcinoma nemalih ćelija pluća (NSCLC) i procenjen je za raj jajnika. Dodatno, Gemzar® se može upotrebiti za lečenje HCV kao modulator imune funkcije (videti US Patent No 6,555,518). Gemzar® se trenutno administrira intraveniznom infuzijom u dozi od približno 1000 do 1250 mg/m<2>tokom 30 minuta, jednom nedeljno do 7 nedelja, nakon čega sledi pauza od lečenja u trajanju od nedelju dana.

Oralna upotreba gemcitabina može biti ograničena njegovom malom biostupnošću koja je rezultat metabolizma prvog prolaska, Shiplev LA. Et. a!., "Metabolism and disposition of gemcitabine, and oncolvtic dezoksicitidin analog, in mice, rats, and dogs". Drug Metabolism & Disposition. 20(6):849-55, 1992. Dodatno, kada je doziran oralno, gemcitabin umešan u izazivanje štetnih dozom-ograničenih intestinalnih lezija okarakterisanih umerenim do značajnih gubitaka mukoznog epitela (atrofična enteropatija) ćelom dužinom intestinalnog trakta kod miševa kojima je data jedna oralna (gavaž) doza gemcitabina od 167, 333, ili 500 mg/kg. Horton ND et.al., "Toxicity of single-dose oral gemcitabine in mice", American Association for Cancer Research, Poster Presentation, Orlando, FL, March 27-31,2004. Izlaganja putem intravenoznog doziranjakoja se mogu porediti, u prethodnim ispitivanjima miševa nije dovela do smrti ili gastrointestinalnoj toksičnosti.

Postupci dobijanja proleka i formulacija gemcitabina sa kontinuiranim oslobađanjem ssu dobro poznate u tehnici. Primeri ovih prolekova i formulacija sa kontinuiranim oslobađanjem mogu se naći u WO 04/0412303 "Gemcitabine Prodrugs, Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof, Gallop et. al.; WO 98/32762 "Gemcitabine Derivati," Myhren, Finn, et al.; WO 02/09768 "Therapeutic polyesters and polyamides," Uhrich, Kathryn E.; WO 02/76476 "Prodrugs of anticancer agents based on substituted aromatic acids," Greenwald, Richard B., et al.; WO 02/65988, "Terminally- branched polymeric linkers and polymeric conjugates as prodrug," Choe, Yun Hwang, et al.

Amidni derivati gemcitabina su opisani u tehnici kao korisni intermedijeri u sintezi gemcitabina, videti npr. Britton, et al., U.S. Pat. No. 5,420,266 and Grindey, et al., U.S. Pat. No. 5,464,826, a takođe korisni kao grupe proleka za administraciju gemcitabina, videti e.g. Gallop, etal, WO 04/041203.

Postoji stalna uptoreba za prolekom gemcitabina koji će omogućiti oralnu distribuciju, koji će proći intaktan kroz intestinalni trakt bez značajnije degradacije i distribuirati gemcitabin deo pogođen bolećšcu, uz prihvatljivu bezbednost i efikasnost.

Neočekivano smo pronašli superiorni, novi amidni derivat gemcitabina, koji prolaze kroz enterocite i ostavljaju ih u suštini intaktnim; je hidrolizovan u gemcitabin bez značanije akumulacije dezoksidifluorouridina (dFdU), predominantnog metabolita gemcitabina u jetri, a ima manju toskičnost nego oralni gemcitabin, i održava odgovarajuće profile efikanosti i bezbednosti kada se administerira oralno.

Kratak opis pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I

Sledeći aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje nove farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedinjenje of formula I i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih eksipijenasa.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I za lečenje susceptiblnih neoplazmi kod sisara kojima je takvo lečenj potrebno.

Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I za lečenje susceptiblnih viralnih infekcija kod sisarakojima je takvo lečenje potrebno.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I za proizvodnju leka za lečenje susceptiblnih neoplazmi ili viralnih infekcija.

Dodatno, predemtni pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje jedinjenja formule I.

Detaljan opis pronalaska

Kao što je ovde upotrebljeno, izrazi imaju naznačena značenja.

Izraz "sisar" se odnosi na različite toplokrvne vertebrate iz klaseMammalia,najpoželjnije ljude, gde su vertebrate okarakterisane time što im je koža prekrivena dlakama, gde ženke imaju mlečne žlezde koje u datom trenutku proizvode mleko naenjeno ishrani mladih.

Izraz "farmaceutski prihvatljiv eksipijens" odnosi se na farmaceutski prihvatljive formulacije nosača, rastvora, ili aditiva da poboljša osobine formulacije. Dati eksipijensi moraju biti kompatibilni sa drugim sastojcima dormulacije i da nisu štetni za primaoca i da su dobro poznati prosečnom stručnjaku, videti e.g. Remingtons Pharmaceutical Sciences, 191 Edition, Mack Publishing Company, 1995.

Izraz "ko-kristal" označava fizičku asocijaciju jednog ili viSe molekula koji svoju stabilnost duguju ne-kovalentnim interacijama. Jedna ili više komponenti ovo molekulskog kompleka obezbeđuje stabilan okvir u kristalnoj rešetci. U određenim slučajevima, gostujući molekuli su inkorporirani u kristalnu rešetku kao anhidridi ili solvati, videti npr. "Kristal Engineering of the Composition of Pharmaceutical Phases. Do Pharmaceutical Co-crystals Represent a Nevv Path to Improved Medicines?" Almarasson, O., et. al., The Royal Society of Chemistry, 1889-1896, 2004. Preferentni co-kristali su p-toluenesulfonska kiselina i benzenesulfonska kiselina.

Izraz 'farmaceutski prihvatljivi ko-kristal" označava kristal koji je kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije i nije štetan za primaoca.

Izraz "susceptiblna neoplazma" odnosi se na nekontrolisan rast tkiva kod sisara koji se može tretirati (lečiti) oralnom administracijom jedinjenja formule I. Budući da će ovaj protek da hidrolizuje u gemcitabin, očekuje se da administracija proleka ima širok spektar aktivnost na različite vrste tumora, čvrste i disemenirane. Preferentno, susceptiblne neoplazme obuhvataju limfom T-ćelija, sarkom mekog tkiva, kancer pankreasa, rak dojke, Hodgkin's-ov limfom, ne-Hodgkin's-ov limfom, rak ne-malih ćelija pluća, rak jajnika i rak bešike.

Jedinjenja pronalaska su korisna u lečenju viralnih infekcija, posebno HCV.

Izraz "terapeutski efikasna količina" označava količinu jedinjenja /kompozicije koja će podići željeni biološki ili medicinski odgovor tkiva, sistema ili sisara koji su istraživači, doktori ili kliničar zahtevali.

Gemcitabin sadrži tri funkcionalne grupe koje se mogu derivatizovati, 3' i 5' hidroksilne grupe i N4-amino grupu. Jedinjenje formule I se može pripremiti upotrebom odgovarajućih zaštitnih grupa za bolkadu 3' i 5' hidroksilnih funkcionalnih grupa , nakon čega sledi acilovanje N4-amino grupe. Tipične zaštitne grupe su takođe poznatei priznate u tehnici Protecting Groups in Organic Svnthesis. 3rd edition Theodora Greene, Peter Wuts

(Wiley-Interscience) 1999. Acilovanje N4-amino grupe može se postići reakcijom sa hloridom kiseline ili anhidridom ili rekacijom sa karboksilnom kiselinom u prisustvu reagensaza kuplovanje, kao Stoje N,N-dicikloheksilkarbodiimid (DCC), N-etil- N'-{3-dimetilaminopropil>karbodiimid (EDC), 1,1-kabonildiimidazol (CDI) ili drugih sličnih reagenasa koji su poznati prosečnom stručnjaku iz oblasti organske hernije. Alternativno, jedinjenje formule I se može pripremiti bez upotrebe zaštitnih grupa. U tom slučaju, dobiće se smeše mono-, di- i tri-adukata (proizvoda vezivanja) i željeni proizvod se može odvojiti iz smeše.

Sledeći primeri ilustruju sintezu jedinjenja pronalaska. Svi polazni materijali ireagensi su poznati i priznati u tehnici i dostupni su ili su dobijeni opisanim postupcima. Postupak za dobijanje gemcitabina (2',2'-difluoro-2,-dezoksicitidina), na primer, je objavljen u US

Patent No. 4,808,614.

Primer 1

1 -(2,2-difluoro-2-dezoksi-P-D-ribofuranozil)-4-(2 -propil-1 -oksopentil)aminopirimidin-2-on

Rastvoriti 2',2'-difluoro-2'-dezoksicitidin (10.0 g, 38.0 mmol) u anhidrovanom piridinu (100 mL) i ohladiti na 0°C uz mešanje u atomsferi azota. Dodati u kapima hlorotrimetilsilan (24.0 mL, 190.0 mmol), održavajući unutrašnju temepraturu < 5°C. nastaviti mešanje na 0°C još 2 sata. U odovjenom sudu, rastvoriti 2- propilpentansku kiselinu (6.0 g, 41.8 mmol) u anhidruvanom acetonitrilu (100 mL). U malim poricjama dodati 1,1 -kabonildiimidazol (6.8 g, 41.8 mmol) tokom 30 minuta i mešati još 2 sata. Dodati ovaj rastvor acetonitrila u kapima u rastvor piridina na 0°C i ostaviti reakcionu smešu da dostigne sobnu temperaturu. Zagrevati reakcijonu smeš preko noći na 45°C zatim ohladiti na 30-35°C i dodati 100 mL apsolutnog etanola i zagrevati na 45°C tokom 30 minuta. Dodati 50 mL vode i zagrevati na 45°C tokom 5 sat, zatim ohladiti do sobne temperature i koncentovati u vakuumu. Sirovom ostatku dodati etil acetat i vodu. Zakiseliti na pH~2 pomoću fosforne kiseline i odvojiti organski sloj. Ponovo ekstrahovani vodeni sloj sa još etil acetata. Spojiti organske rastvore i isprati ih zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i zasićenim rastvorom natrijum hlorida, osušiti pomoću magnezijum sulfata i koncentrovati u vakuumu. Prečisititi hromatografijom na silika gelu (120 g) eluiranjem sa gradijentom od 30% do 60% etil acetata u metilen hloridu. Izolovati željeni proizvod kao belu penu (11.2 g, 77% vield). MS (ES): m/z 390.3 - [M+H]+ MS (ES): m/z 388.3 - [M-H]+

1HNMR (400 MHz, 5 0.83 (t, 6H), 1.15-1.36 (m, 6H), 1.46-1.55 (m, 2H), 2.60 (dddd, IH, J=14.4, 9.6, 5.6, 5.6 Hz), (ddd, IH, J=12.6, 6.2, 3.6 Hz), 3,77-3.81 (m, IH), 3,87 (dt, IH, J=8.4, 3.0 Hz), 4.12-4.22 (m, IH), 5.27 (t, IH, J=5.6 Hz), 6.15 (t, IH, J=7.4 Hz), 6.29 (d, IH, J=6.4 Hz), 7.31 (d, IH, J=7.2 Hz), 8.23 (d, IH, J=8.0 Hz), 11.03 (s, IH).

Primer 2

l-(2,2-difluoro-2-dezoksi-P-D-ribofuranozil)-4-(2 -propii-l-oksopentil)aminopirimidin-2-on p-toluenesulfonska kiselina hidrat ko-kristal (2:1:1)

Rastvoriti 0.709 g (1.82 mmol) jedinjenja iz Primera 1 u 9 mL metanola. U odvojenom sudu. Pripremiti 0.25 M osnovnog vodenog rastvora p-toluenesulfonske kiseline. Dodati u kapima 3.6 mL (0.9 mmol) vodenog rastvora. Dodati~5 mL vode i ostaviti smešu da se meša na sobnoj tepmeraturi (~30 min) do stvaranja taloga. Sakupiti staloženu čvrstu suptancu vakuum filtracijom i ostaviti da se osuši na vazduhu.

Analitička analiza ko- kristala:

Pripremiti rastvo poznate koncentracije p-toluenesulfonske kiseline, gemcitabina i jedinjenja iz Primera 1. Analizirati uzorak ko-kristal p-toluenesulfonske kisleine iz Primera 1 u cilju određivanja komponenti kompozicije.

Za 2:1 :1 odnos N-(2-propil-pentanoil)]-2',2'-difluoro-2'-dezoksi-citidin /p-toluenesulfonska kiselina/voda, određenje % toluenesulfonke kiseline:

Teorijski 17.8% p-toluenesulfonske kisleine

Nađeno 19.1% p-toluenesulfonske kiseline

HPLC:

Kolona: Waters Atlantis dC18, 3.0 um, 4.6 i.d. x 150 mm

Temperatuer kolone. 50°C

UV talasna dužina: 248 nm

1. Mobilna faza

A. 5/95 acetonitril/voda + 0.1% TFA

B. 50/50 acetonitrii/voda+ 0.1 % TFA

2. Gradijent

Primer 3

1 -(2,2-difluoro-2-dezoksi-P-D-ribofuranosyl)-4-(2 -propil-1 -oksopentil)aminopirimidin-2-one benzensulfonska kisleina ko-kristal (1:1)

U 5mL etil acetata, dodatoje 550 mg jedinjenja iy Primera 1. Smeša je zagrejana na približno 55 °C. Dodat je jedan molski ekvivalent benzensulfonske kiseline dostavljene kao osnovni rastvor. Dodatoje još~1 OmL etil acetata uz sonikaciju, po potrebi, da bi se rastvorio talog. Suspenzija je ostavljena da se ohladi do sobne temperature i izolovana je vakuum filtracijom. Izolovana čvrsta supstanca je ostaviljena da se osuši na vazduhu.

T.t.:171 0°C

Jedinjenje Formule I i njegovi solvati su dostupni u oralnom obliku, i obično se oralno administriraju, tako da je oralna administracija preferentna.

Farmaceutske kompozicije su dobijene način koji je dobro poznat u tehnici. Nosač ili eksipijens može da bude čvrst, polu-čvrst, ili tečan materijal koji može da posluži kao nosač ili sredina (podloga) za aktivan sastojak. Adekvatni nosači ili eksipijensi su dobro poznati u tehnici. Farmaceutske kompozicije se mogu prilagodit za oralno, inhalaciju, parenteralnu,.ili topikalnu upotrebu i može se administerirati pacijentu obliku tableta, kapsula, aerosola, inhalanata, supozitorija, rastvora, suspenzija i si. Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu administrirati oralno, na primer, sa inertnim diluentom ili kapsulama ili komprimovan u tablete. Za potrebe oralne terapeutske administracije, jedinjenja se mogu inkorporirati sa eksipijensima i uptrebiti u obliku tableta, vrećica, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafera, guma za žvakanje i si. Ovi preparati preferentno sadrže najmanje 1% jedinjenja predmetnog pronalask, aktivni sastojak, čiji sadržaj može da varira u zavisnosti od datog oblika i može da iznosi od 1% do oko 90% težine jedinice. Količina jedinjenja prisutna u kompoziciji je takva da će se dobiti odgovarajuća doza. Preferente kompozicije i preparati predmetnog pronalaska mogu se odrediti pomoću metoda koje supoznate prosečnom sgtručnjaku.

Tablete, pilule, kapsule, kesice, i slično mogu takođe da sadrže jedan ili više adjvanasa: vezivna sredstva, kao što je povidon, hidroksipropil celuloza, mikrokristalna celuloza, ili želatin; eksipijense ili razblaživače kao što je: škrob, laktoza, mikrokristalna celuloza ili dikalcijum fosfat, reagensiza dezintegraciju kao što je: croskarmeloza, krospovidon, škrobni natrijum glikolat, kukuruzni škrob i si.; lubrikante poput: magnezijum stearata, stearinske kiseline, talka ili hidrogenizovanog biljnog ulja; glidante kao što je kolodialni cilicijum dioksid; okvašivače poput: natrijum lauril sulfat i polisorbat 80; i mogu se dodati i zaslađivači kao štoje: sukroza, aspartam ili saharin ili agensi za aromu kao što je: pepermint, metil salicilat ili aroma pomorandže. Kada je dozna jedinica u obliku kapsule, može da sadrži, pored prethodno navedenih materijala i tečni noas kao štoje polietilen glikol ili masno ulje. Drugi oblici dozne jedinice mogu da sadrže druge rayli;ite materijale koji modifikuju fizički oblik dozne jedinice, na primer, kao obloga. Preferentni dozni oblik je gastrorezistentni -obložen. Tako , tablete ili pilule mogu da budu obložene šećerom, hidroksipropil metilcelulozom, polimetacriiatima, ili drugim agensima za oblaganje. Sirupi mogu da sadrže, pored prisutnih jedinjenja, i sukrozu kaozaslađivač i određene konzervanse, pigmente i boje i arome. Materijali upotrebljeni zadobijanje ovih različitih kompozicija trebalo bi da budu farmaceutski čisti i netoksični u upotrebljenim količinama.

Jedinjenja Formule F su generalno efikasna (delotvorna) u širokom opsegu doza. Na primer, dnevne doze, kao jedna ili podeljene na više doza, obično se kreću uopsegu od oko 15 mg/dan do oko 200 mg/dan, preferentnije oko 85 mg/dan. U nekim slučajevima nivo doza koji je ispod donje granice prethodno datog opsega može biti više nego adekvatan, dok u drugim slučajevima mogu se primeniti veće doze a da ne dođe do ispoljavanja štetnih sporednih efekata, tako da prethodno dati opseg ne ograničava obim pronalaska ni na koji način..Treba napomenuti da količinu jedinjenja koja će se adminsitrati određuje lekar, uzimajući u obzir relevantne podatke, uključujući stanje koje se leći, odabran način administracije, dato jedinjenje ili data jedinjenja koja se administriraju, starost, težinu, i odgovor (reakciju) pacijenta, kao i ozbiljnost simptoma koje ispoljava pacijent.

Analiza pH hemiiske stabilnosti

Hemijska pH cstabilnost je određena pomoću polu-automatske HPLC tehnike. Uzorci jedinjenja formule I su pripremljeni u koncentraciji od 100 mcg/mL u pet pufera koji predstavlju opseg pH kroz gastrointestinalni trakt (pHl-pH8). Uzorci su nanaeti na HPLC autosampler inkubiran na 40°C. Uzorci su u više navrata injektirani na HPLC kolonu u jednosatnim intervalima u toku 24 sata, koja odvaja jedinjenje formule I od gemcitabin. Oblast pika jedinjenja formule I je praćena UV detekcijom tokom određenog perioda i poređenaje sa oblastima početnih pikova u cilju određivanja stabilnosti. Manje od 25% jedinjenja iz Primera 1 je degradirano u gemcitabin pri opsegu pH 1 do 8 posle četiri sata.

Farmakokinetička analiza

Farmakokinetike kod miševa

Farmakokinetički profili gemcitabina i jedinjenja formule I, su određeni kod mužjaka CD-1 miša nakon oralne administracije doza odabranih tako da sadrže približno 10 mg/kg gemcitabina. Naznačene životinje (n = 3/vremenske tačke/jedinjenje ) su ubijane na 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, i 6 sati posle doziranja, i sistemski uzorci krvi su uzeti u EDTA-tretirane epruvete koje sadrže tetrahidrouridin (0.5mM krajnja koncentracija u krvi) ya inhibiciju daljeeg metaboličkog razlaganja gemcitabina. Ubijene su još 3 životinje na 0.08 sati za sakupljanje hepatične arterijske (portalne) krvi. Plazma je izolovana centriguiranjem i zamrznuta pre analize. Koncentracijr gemcitabina i prolekova u plazmi su određene LC/MS/MS analizom. Farmakokinetički parameteri su izračunati pomoćuWinNonlin software(Pharsight Corp., Mountain View, CA). Farmakokinetički parametri svakog proleka su poređeni sa onim đobijenim oral administracijom gemcitabin hidrohlorida u slično izvedenim ispitivanjima.

Jedinjenje iz Primera 1 je duže hidrolizovanoin vivoda bi se oslobodio gemcitabin kada je oralno administriran CD-1 mišu. Izlaganje plazme gemcitabinu je povećano kod CD-1 miša kada je adminsitrirano jedinjenje iz Primera 1, u poređenju sa direktnom oralnom administracijom gemcitabin hidrohlorida. Absorpcija intaktnog ieka je dokazana relativno visokim koncentracijama jedinjenja iz Primera 1 u hepatičnoj portalnoj plazmi na 0.08 sati posle oralnog doziranja.

Farmakokinetika kod majmuna

Farmakokinetički profili gemcitabina i jedinjenja formule I, su određeni na makaki (cvnomolgus) majmunima posle oralne i intravenovne administracije u unakrsnom ispitivanju. Jedinjenja su administrirana u dozama odabranim tako da sadrže približno 10 mg/kg gemcitabina. Sakupljeni su uzorci krvi u EDTA-tretirane epruvete koje sadrže tetrahidrouridin (0.5mM krajnja koncentracija u krvi) u naznačenim intervalima tokom 48 sati. Životinje su prethodno tretirane ranitidinom (intravenozno, 5 mg/kg) u periodima oralnog doziranja. Plazma je izolovana centrifugiranjem i yamrynuta pre analize. Koncentracije gemcitabina i jedinjenja formule I u plazmi su određene LC/MS/MS analizom. Farmakokinetički parametri su određeni pomoćuWinNonlin software(Pharsight Corp., Mountain View, CA).

Jedinjenje iz Primera 1 je duže hidrolizovano in vivo da bi se oslobodio gemcitabin kada je intravenozno administriran makaki majmunima. Oralno iylaganje gemcitabina je povećano kod makaki majmuna, približno 5-puta kada je adminsitrirano jedinjenje iz Primera 1, u poređenju sa direktnom oralnom administracijom gemcitabin hidrohlorida.

Hidroliza

Analiza homogenata tankog creva

Za određivanje stabilnosti jedinjenja formule I na enzimatsku hidrolizu u crevima, pripremljeni su homogenati epitelnih ćelija tankog creva i to gornjeg dela tankog creva CD-1 miševa,beaglepasa, makaki majmuna i čoveka. Homogenati od miša i psa su pripremljeni od sveže prikupljenog tkiva, dok su homogenati od majmuna i čoveka pripremljeni od prethodno zamrznutih tkiva. Ćelije su pažljivo sastrugane sa intestinalnih segmenata, sakupljene,!homogenizovane u 50 roM acetatnom puferu pomoću Polvtron (PT- 10-85). Koncentracije proteina su određene standardnim spektrofotometrijskim tehnikama. Pripremljeni homogenati su čuvani na -70°C pre upotrebe.

Brzina hidrolize jedinjenja formule I u homogenatima tankih creva (SIH) je određena inkubiranjem jedinjenja formule I (100 uM) sa SIH (2.5 - 5 mg/mL ukupnih proteina) u acetatu na pH 7.5 tokom 6 sati. Koncentracije gemcitabina oslobođenog hidroliziom je određena LC/MS analizom nakon štoj e reakcija prekunuta dodatkom acetonitrila. Brzine hidrolize su izračunate na 30 minuta u skrining eksperimentima i iz nagiba linearnog dela krivih hidroliza vs. vreme u ispitivanjima karakteizacije jedinjenja formule I.

Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje sporu hidrolizu u analizi homogenata taknog creva. Najsporija hidroliza je u homogenatu majmuna i čoveka, sa manje od 3% od ukupnog jedinjenja konvertovanog u gemcitabin u periodu inkubacije od 6 sati.

Analiza hidrolize u jetri S9

Hidroliza jedinjenja formule I pomoću enzima jetre određena je analizom hidolize u jetri. Homogenati jetre su pripremljeni od jetre CD-1 miševa,beaglepsa, makaki majmuna, i čoveka. Tkivo jetre je isečeno na manje parčiće pomoću makaza, zatim je homogenizovano u 50 mM acetatnom puferu pomoću Polvtron (PT-10-85) tokom 1 min. Post-mitohondrijalne (S 9) frakcije su pripremljene od svakog uzorka ultracentrifugiranjem na 9,000 x g na 4°C tokom 10 min. S9 frakcije jetre miša, psa i majmuna su pripremljene od sveže sakupljenih tkiva, dok je uzorak jetre S9 čoveka pripremljen od prethodno zamrznutog tkiva. Posle centrifugiranja, sakupljen je supernatant i određene su koncentracije proteina standardnim spektrofotometrijskim tehnikama. Pripremljene S9 frakcije su čuvane na -70°C pre upotrebe.

Brzina hidrolize jedinjenja formule I u jetri S9 je određena inkubacijom jedinjenjea (10 uM) sa S9 (2 mg/mL ukupnog proteina) u fosfatnom puferu soli na pH 8.0 do 6 sati. Koncetracije gemcitabina osobođenog hidrolizom su određene LC/MS analizom nakon što je reakcija prekinuta dodatkom acetonitrila. Brzine hidrolize su izračunate na 30 minuta u skrining ekspreimentima i iz nagiba linearnog dela krivih hidroliza vs. vreme u ispitivanjima karakterivacije jedinjenja formule I.

Jedinjenje iz Primera 1 je hidrolizovano u jetri S9 svih opisanih vrsta. Hidroliza je najbrža u homogneatima majmuna i čoveka, sa približno 35% od ukupnog jedinjenja konvertovanog u gemcitabin u periodu inkubacije od 6 sati.

Toksikološka analiza

4-Dnevni skrining miševa

Za određivanje toskičnosti nastale oralnom administracijom jedinjenja formule I kada je adminsitrirano dnevno ženkama CD-a miševa tokom 4 dana, profil gastrointestinalne tokičnosti jedinjenja formule I jepoređen sa isptijskim rezultatima za gastrointestinalnu tokičnost kada je gemcitabin administriran oralno kao 8 mg/kg u 4-dnevnim isiptivanjima na miševima.

Ženke CD-1 miševa starosti 5-8 nedelja su dozirane jedinjenjem formule I oralnim gavažom. Nivo doze je odabran tako da približno iznosi molski equivalent od 8-mg/kg gemcitabina. Pripremljena je zapremina doze od 10 mL/kg i doze su administrirane jednom dnevno tokom 4 uzastopna dana. Nekropsija je izvedena oko 5-8 sati nakon četvrte doze.

Određeni su klinički simptomi, klinička hernija, gruba patologija i ograničena histopatologija (ileum, jejunum, i jetra). Postoji značajno smanjenje atrofičnih intestinalnih promena ili enteropatie uočene posle doziranja miševa ekvivalentnom dozom jedinjenja iz Primera l u odnosu na gemcitabin HCI.

14 -dnevno ispitivanje na miševima

14-dnevno isptivanje na miševima je sprovedeno da bi se procenilo da li jedinjenje formule I proizvodi štente efekte kod miševa posle 14 dnevnog doziranja oralnim gavažom i da bi se odredile koncentracije jedinjenja formule I imetabolita gemcitabina HCI i dezoksidifluorouridina u plazmi posle 1 ili 14 doza.

Mužjaci i ženke CD-1 miševa starosti 9-12 nedelja su dozirani jedinjenjem formule I oralnim gavažom. Opseg doza je odabran da bi se odredila maksimalna dozvoljena doza (koja se može tolerisati) i granična doza toksičnosti. Upotrebljena je zapremina doze od lOmL/kg i doze su administrirane jednom dnevno.

Određeni su klinički znaci, telesna težina, konzumiranje (potrošnja) hrane, hematologija, klinička hernija, koncentracije jedinjenja formule I i metabolita gemcitabina HCI i dezoksidifluorouridina, u plazmi i patologija (uključujući grubu patologiju, odmeravanje težine organa i histopatologiju).

Na osnovu molskog ekvivalenta, jedinjenje iz Primera 1 je povezano sa manje enteropatije od gemcitabin HCI-, dok u isto vreme rezultuje u približno dvostrukom sistemskom izlaganju gemcitabin HCl-u.

7-dnevno isptivanje na psima

Za određivanje profila toksičnosti jedinjenja formule I kada je administrirano psima raseBeagletokom 7 dana, i za određivanje koncentracija jedinjenja formule I i metabolita gemcitabin HCl-a i dezoksidifluorouridina u plazmi posle 1 ili 7 doza, izvedeno je 7-dnevno isptivanje na psima.

Mužjaci i ženke rase pasaBeaglestarosti 6-48 meseci su oralno dozirani kapsulama sa jedinjenjem formule I. Opseg doza je odabran tako da bi se odredila maksimalna dozvoljena doza i granična doza toksičnosti. Pripremljena je zapremina doze od 1 mL/kg i doze su administrirane jednom dnevno.

Određeni su klinički znaci, telesna težina, telesna temperatura, hematologija (uključujući koagulaciju), klini;ka hernija, urinaliza, koncentracije jedinjenja iz Primera I i metaboliti gemcitabin HCI i dezoksidifiuorouridin u plazmi, i pathologija(uključujući grubu patologiju, odmeravanje težine organa i histopatologiju). Hematotosičnost i druge toksičnosti, uključujući GI toksičnost, su konzistente sa onim vrednostima koje su prethodno opisane za parenteralni gemcitabin. Prema tome, ni jedna od ovih toksičnosti nije posebna za oralno doziranje.

In Vivoanaliza

Tumorske ćelije debelog creva HCT-116 sugajenein vitropod standardnim uslvima gajenja kulture, prikupljene, isprane, i 5 x IO<6>ćelija (1:1 suspenzija u Matrigel, Collaborative Biomedical Products, Ine) je subkutano injektirano u zadnji bok ženkenudemiša (Charles River, CDI nu/nu, 24-27 g, ozračene sa 450 Rads tokom 24 h implantacije). Tumori su ostavljeni da rastu do~100 mm<3>pre početka terapije. Kontrola sa nosačem, jedinjenje formule I ili gemcitabin-HCl pri različitim nivoima doze su administrirani miševima oralnim gavažom (10 ml/kg zapremine) u vreme naznečno u individualnim eksperimentima . Jedinjenja su administrirana ili dnevno tokom četrnaest danadav, svaki drugi dan sa ukupno sedam doza, ili svaki treći dan sa ukupno četiri doze. Za svaki dan planiranog doziranja, jedinjenje formule I je formulisano u 100 mM natrijum fosfatnom puferu, pH 6.0, i formulisano je u 1% natrijum karoksimetilcelulozi, 0.5% natrijum lauril sulfatu,0. 05% Antifoam 150i 0.085% povidonu svaki drugi dan i svaki treći dan planioranog doziranja. Gemcitabin-HCl je pripremljen u fiziološkom rastvoru za oralnu administraciju. Veličina tumora je određena nonijusom i zapremina tumora (mm<3>) je procenjena pomoću formule / xw<2>x 0.536, gde su / najveći ,awnajmanji vertikularni prečnik. Svi podaci (merenja tumora i težine životinja) uzimani dva puta nedeljno počevši sa startom terapije i analizirani pomoću računarskog sistema za merenje tumora.

Antitumorska efikasnost uočena kod jedinjenja iz Primera 1 je poređena sa efikasnošću dobijenom sa ekvivalentnim dozama gemcitabin-HCl. Međutim, tretman jedinjenjem iz Primera 1 je doveo do smanjenja ukupne toksičnosti u poređenju sa životinjama koje su primale ekvivalentnu količinu gemcitabin-HCl.

Claims (11)

1. Jedinjenje formule

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, štoje to: ko-kristal l-(2,2-difluoro-2-dezoksi-P-D-ribofuranozil)-4-{2- propil-1 -oksopentil)aminopirimidin-2-on p-toluenesulfonske kiseline (1:1).

3. Jedinjenje, naznačeno time, što je to:ko-kristal 1 -(2,2-difluoro-2-dezoksi-p-D-ribofuranozil)- 4-(2-propil-l-oksopentil)aminopirimidtn-2-on p-toluenesulfonske kiseline.

4. Jedinjenje prema zahtevu 3, naznačeno time, štoje ko-kristal hidrat 1 -(2,2-difluoro-2-dezoksi-p-D-ribofuranozil)- 4-(2-propil-1 -oksopentil)aminopirimidin-2-on p-toluenesulfonske kiseline (2:1:1).

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje iz zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv eksipijens.

6. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 5,naznačena time, što je gastrorezistentno obložena.

7. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 4 za upotrebu kao lek.

8. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju susceptibilnih neoplazmi.

9. Jedinjenje prema jednom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju limfoma T-ćelija, sarkoma mekog tkiva, raka pankreasa; Hodgkin's ovog limfoma, ne-Hodgkin'sovog limfoma, rak ne-malih ćelija pluća, raka jajnika ili raka bešike.

10. Upotreba jedinjenja prema jednom od zahteva 1 do 4 za proizvodnju leka za lečenje susceptiblnih neoplazmi.

11. Upotreba jedinjenje prema jednom od zahteva l do 4 za dobijanje leka za lečenje limfoma T-ćelija, sarkoma mekog tkiva, raka pankreasa; Hodgkin's ovog limfoma, ne-Hodgkin'sovog limfoma, rak ne-malih ćelija pluća, raka jajnika ili raka bešike.