RO138123A2 - O metodă eficientă de purificare a lentivirusurilor utilizate ca vectori de livrare a genelor sau a altor fragmente de acizi nucleici - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de purificare a preparatelor lentivirale non-replicative, pentru utilizare în terapia genică în modele in vitro sau pentru experimente pre-clinice. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele: (i) precipitarea particulelor lentivirale cu sulfat de amoniu urmată de solubilizarea lor şi (ii) sedimentarea particulelor lentivirale prin ultracentrifugare pe strat de sucroză, rezultând un preparat lentiviral care este capabil să infecteze celule în cultură şi să producă proteina care a fost inserată în vectorul viral.

Description

OFICIUL DE STAT PENTRU INVENȚII ?· MĂRCI Ccro.-e de brevet de Invenție

Nr........¾...........

Data depozit

REZUMATUL INVENȚIEI

Prezenta invenție se referă la un procedeu de purificare a preparatelor lentivirale nonreplicative înalt purificate, pentru ultilizarea acestora in terapia genica in modele in vitro sau modele preclinice. Procedeul de purificare a lentivirusului din mediul de cultura in care a fost secretat de către celulele de împachetare consta in 2 etape: (i) precipitarea particulelor lentivirale cu sulfat amoniu urmata de solubilizarea lor si (ii) sedimentarea particulelor lentivirale prin ultracentrifugare pe strat de sucroza. După purificare, lentivirusul este capabil sa infecteze celule in cultura si sa producă proteina care a fost inserata in vectorul viral.

DESCRIEREA INVENȚIEI

Prezenta invenție se referă la un procedeu de preparare si purificare a lentivirusurilor nonreplicative, obtinandu-se un preparat lentiviral cu o puritate mare, care se poate folosi in experimentele preclinice, in vivo si in vitro.

Domeniul tehnic în care poate fî folosită invenția

Invenția care consta in metoda de purificare a lentivirusurilor are aplicații in domeniul biomedical pentru a transfera:

- gene de interes sub promotori puternici (de ex. CMV) pentru supraexpresia unor proteine

- gene de interes sub anumiți promotori pentru expresia condiționată a unor proteine

- fragmente de RNA precum RNA de interferența, pentru silențierea unor gene

- gene de interes pentru obținerea celulelor CAR-T

Lentivirusurile astfel purificate pot fi folosite; in vitro si in vivo.

Transferul de gene sau RNA se poate face in celule care se divid cat si in celule care nu se divid.

Descrierea stadiului actual al tehnicii

Vectorii lentivirali (LV) au un diametru de aproximativ 80-100 nm iar genomul lor constă din două copii monocatenare de ARN (in sens pozitiv) în interiorul unei capside conice, înconjurată de un dublu strat lipidic [1], Vectorii lentivirali conferă posibilitatea de modificare a celulelor eucariote, prin inserarea unei gene in genomul celulei gazda. In prezent exista si lentivirusuri defective pentru integraza, care pot induce expresia genei de interes fara integrare in genomul celulei gazda [21 [3].

In scopul cercetării sau in scop terapeutic, lentivirusurile pot transduce o gama larga de celule, de exemplu neuroni [8], celule hematopoietice stern ai celule progenitoar [6], celule dendritice [9] cardiomiocite adulte si neonatale [7].

In prezent, lentivirusurile non-replicative si auto-inactivante sunt folosite în cercetare pentru studiul diferitelor procese celulare si moleculare, cât și pentru aplicațiile biomedicale. Aplicațiile biomedicale includ transferul de gene in terapia genica [10,11], tratamente bazate introducerea unor gene în celulele T pentru tehnologia CAR-T [12], cat si vaccinuri realizate prin modificarea celulelor dendritice [13]. Au fost înregistrate succese la infectarea cu lentivirusuri a celulelor stern hematopoietice pentru a corecta imunodeficiențe primare [14] și hemoglobinopatii [15] [16]. Terapiile cu celule T CAR concepute folosind vectori lentivirali au demonstrat un succes clinic remarcabil la pacienții cu tumori maligne cu celule B, ducând la aprobarea de reglementare a primei terapii celulare modificate genetic folosind vectori lentivirali.

Cei mai utilizați vectorii lentivirali folosiți pana in prezent sunt cei derivați din virusul imunodeficienței umane (HIV). Asamblarea structurii acestora a fost investigata pe larg și optimizata în ultimele două decenii. Astfel s-au realizat vectorii lentivirali de a treia generație, non-replicativi, auto-inactivați.

Deși sunt utilizați in diferite scopuri, prepararea acestor lentivirusuri non-replicative pe scară largă este limitativa [17]. Producția de lentivirus în cantități și concentrații necesare pentru livrarea in vivo este laborioasa si necesita concentrarea virusului din cantități mari de medii lichide in care acesta este secretat.

Producția de vectori lentivirali se realizează prin cotransfectia unor celule imortalizate din linia celulară HEK293T, utilizate ca celule de împachetare. Plasmidele folosite pentru transfectie codifică proteinele necesare pentru producerea vectorul lentiviral dar si ADN care conține gena de interes. Separarea genelor care asamblează componentele virale in plasmide diferite creste gradul de securitate biologica. Plasmide de împachetare codifica o proteina prin care virusul sa intre in celulele eucariote, (cel mai frecvent VSV-G), gena pentru gag și gena pol dar si gene pentru proteine accesorii HIV, cum ar fi Rev. Cotransfecția acestor plasmide cu vectorul lentiviral (care conține gena de interes) oferă toate componentele necesare pentru ca linia celulară să producă particule virale funcționale. După cotransfectie, celulele de împachetare produc particule de lentivirus non-replicativ, care sunt secretate in mediul de cultură. Pana in prezent, pentru purificarea lentivirusurilor non-replicative s-au folosind diverse metode precum ultracentrifugarea mediului, concentrarea prin filtrare, cromatografie, precipitare cu PEG [18].

Brevetele identificate in prezent cu privire la purificarea si concentrarea lentivirusurilor:

- Brevetul US9169491B2 „Virus purification” descrie metoda de concentrare a vectorului retroviral printr-o etapă de ultrafiltrare;

- Brevetul US20210009966A1 „Method for large-scale preparation of purified preparation of recombinant lentiviral vector at gmp grade” propune cromatografia ca metoda de purificare

- CN107384877B „Method for purifying lentivirus” - propune o metoda combinata de filtrare, ultracentrifugare si cromatografie

- W02022036048A1 „Methods for producing clinical-grade lentiviral vector” propune o metoda de concentrare utilizând PEG or LENTI-X CONCENTRATOR

Puritatea produsului lentiviral este critică, mai ales pentru utilizarea acestuia in vivo. Resturi de la celulele de împachetare colectate împreună cu lentivirusul produs pot provoca răspunsuri inflamatorii in vitro și mai ales in vivo [19]. Odată purificate, stocurile lentivirale sunt stabile până la 9 ani daca sunt crioconservate la -80 °C [20].

Problema tehnică

Metode consacrate pentru purificarea lenti virusului:

1. Ultracentrifugarea - la viteze de peste 38000 x g, pentru durate diferite (de la 2 la 18 ore).

O problema tehnica este ca volumul mare de mediu in care a fost secretat virusul este dificil de centrifugat: cu cat mai mari sunt cupele rotorului de ultracentrifuga, cu atat viteza de ultracentrifugare este mai mica si timpul de centrifugare este mai mare.

2. Concentrarea prin filtrare si cromatografie

O problema tehnica este ca volumul mare de mediu care conține virusul produs de celule este dificil de filtrat sau de trecut pe coloana cromatografîca.

3. Precipitarea cu o soluție de PEG.

O problema tehnica este ca precipitarea cu PEG nu are un randament foarte mare si, in plus pentru unele aplicații (de exemplu pentru transductia in vivo) nu este convenabil ca PEG sa rămână in preparatul viral.

Soluția tehnică propusa de noi pentru aceasta problema este ca precipitarea sa se realizeze cu ajutorul unor substanțe care:

1. Sa nu afecteze structura moleculara a virusului, si acesta sa rămână capabil de transducție.

2. Sa poată fi ușor îndepărtata după precipitare.

Soluția tehnică *

Soluția tehnica identificata aici se refera la precipitarea particulelor lentivirale din mediu de cultura, cu sulfat de amoniu.

Adăugarea unor concentrații mari de ioni ai sulfatului de amoniu in mediul in care se găsesc particulele lentivirale concurează cu proteinele lentivirale pentru a se lega de moleculele de apă. Acest lucru elimină moleculele de apă din proteinele virale și scade solubilitatea acestora, rezultând precipitarea particulelor virale. Avantajul metodei propuse este că proteinele virale se pot rehidrata prin diluarea sau îndepărtarea ionilor de sulfat de amoniu prin dializa, iar particulele virale își recapătă proprietățile inițiale.

După rehidratarea lentivirusului într-o cantitate mica de tampon fosfat, urmează a doua etapa a purificării, prin ultracentrifugare pe strat de sucroză, la 100.000 x g, 3h, 4°C. Sedimentul format este solubilizat într-o soluție de tampon fosfat salin la care se adaugă 4% sucroză pentru crioprotecție.

Particulele lentivirale astfel obținute pot fi folosite pentru transducție in vitro sau in vivo.

•îv

Exerotal 1

Efiderita preparatului lenti viral de a induce- gena pe care o poarta, in cazul de fete gena pentru GFP a fost testata prin traasdudia celulelor IiIÎK.93 eu I imitate de transdocde / celuia. Rezultatele arata ca preparatul ieriiivira.1 obtinut transduce eficient seimele, fura a induce si moartea celulelor transdiise {Figura 6g Microscopia de fluorescenta arata o huna rata de traoaductie a ce iul elen

Fig,6, Metodologia de purificare poate aplica loutivimsurilur.de generația 2 sms 3, Datele arata ca precipitarea cu srifui de amonm este eficienta aiat pentru lentîvîrusmi ic uiipammuiiu ca p-asimPe ac generat-a a. z. a cur si cu ptasmme de ge-ientria a .>a. namrosușmie in cmilrust de faza (Siarigag miemscopie de llimrcscenm. (Dreapta! - pentru detenriiriareu sxpreslri genei de nneres- greva num'eecum presuri riPFPțBam: 1 diguri·

REVENDICĂRI

I. Tehnologia de purificate a leniivIrisurilor num replicări ve prin precipitare cu sudat de amoniu. cu. pasirarea capacității de trarisdimțm in vitro si in vlvo.

2. Precipitarea paniculeior ientiviraie de generația aza si a3a. cu ajutorul unei sșiuțîî de sudat de amoniu.

3. Utilizarea preparatului kmtiviral purificat prin tehnica precipitării cu sulfat de amoniu pentru experimente precilnice in vitro sau in vivo. pentru inducerea supraexpresiei sau pentru siientierea. unor gene.

Referințe:

1. Chen, Y.H.; Keiser, M.S.; Davidson, B.L. Viral Vectors for Gene Transfer. Curr Protoc Mouse Biol 2018, 8, e58, doi:10.1002/cpmo.58.

2. Gurumoorthy, N.; Nordin, F.; Tye, G.J.; Wan Kamarul Zaman, W.S.; Ng, M.H. NonIntegrating Lentiviral Vectors in Clinical Applications: A Glance Through. Biomedicines 2022, 10, doi:10.3390/biomedicinesl0010107.

3. Sengupta, R.; Mukherjee, C.; Sarkar, N.; Sun, Z.; Lesnik, J.; Huang, J.; Lu, B. An Optimized Protocol for Packaging Pseudotyped Integrase Defective Lentivirus. Biol Proced Online 2016, 18, 14, doi:10.1186/sl2575-016-0044-z.

4. Cockrell, A.S.; Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol 2007, 36, 184-204, doi: 10.1007/s 12033-007-0010-8.

5. Li, M.; Rossi, J.J. Lentiviral vector delivery of siRNA and shRNA encoding genes into cultured and primary hematopoietic cells. Methods Mol Biol 2008, 433, 287-299, doi: 10.1007/978-1 -59745-23 7-3_ 18.

6. Christopher, A.C.; Venkatesan, V.; Karuppusamy, K.V.; Srinivasan, S.; Babu, P.; Azhagiri, M.K.K.; Chambayil, K.; Bagchi, A.; Rajendiran, V.; Ravi, N.S., et al. Preferențial Expansion of Human CD34(+)CD133(+)CD90(+) Hematopoietic Stern Cells Enhances GeneModified Cell Frequency for Gene Therapy. Hum Gene Ther 2022, 33, 188-201, doi:10.1089/hum.2021.089.

7. Zhao, J.; Pettigrew, G.J.; Thomas, J.; Vandenberg, J.I.; Delriviere, L.; Bolton, E.M.; Carmichael, A.; Martin, J.L.; Marber, M.S.; Lever, A.M. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res Cardiol 2002, 97, 348-358, doi:10.1007/s00395-002-0360-0.

8. Bellizzi, A.; Ahye, N.; Wollebo, H.S. Lentiviral Transduction of Neuronal Cells. Methods Mol Biol 2021, 2311, 155-160, doi:10.1007/978-l-0716-1437-2_ll.

9. Sadat Larijani, M.; Ramezani, A.; Mashhadi Abolghasem Shirazi, M.; Bolhassani, A.; Pouriayevali, M.H.; Shahbazi, S.; Sadat, S.M. Evaluation of transduced dendritic cells expressing HIV-1 p24-Nef antigens in HlV-specific cytotoxic T cells induction as a therapeutic candidate vaccine. Virus Res 2021, 298, 198403, doi: 10.1016/j. virusres.2021.198403.

10. Privolizzi, R.; Chu, W.S.; Tijani, M.; Ng, J. Viral gene therapy for paediatric neurological diseases: progress to clinical reality. Dev Med Child Neurol 2021, 63, 10191029, doi: 10.111 l/dmcn.14885.

11. Page, A.; Fusil, F.; Cosset, F.L. Toward Tightly Tuned Gene Expression Following Lentiviral Vector Transduction. Viruses 2020, 12, doi:10.3390/vl2121427.

12. Okuma, A. Generation of CAR-T Cells by Lentiviral Transduction. Methods Mol Biol 2021, 2312, 3-14, doi: 10.1007/978-1-0716-1441-9_1.

13. Ku, M.W.; Chameau, P.; Majlessi, L. Use of lentiviral vectors in vaccination. Expert Rev Vaccines 2021, 20, 1571-1586, doi:10.1080/14760584.2021.1988854.

14. Houghton, B.C.; Booth, C. Gene Therapy for Primary Immunodeficiency. Hemasphere 2021, 5, e509, doi:10.1097/hs9.0000000000000509.

15. Ouyang, W.; Dong, G.; Zhao, W.; Li, J.; Zhou, Z.; Yang, G.; Liu, R.; Li, Y.; Zhang, Q.; Du, X., et al. Restoration of β-Globin Expression with Optimally Designed Lentiviral Vector for β-Thalassemia Treatment in Chinese Patients. Hum Gene Ther 2021, 32, 481-494, doi:10.1089/hum.2020.204.

16. Drysdale, C.M.; Nassehi, T.; Gamer, J.; Yapundich, M.; Tisdale, J.F.; Uchida, N. Hematopoietic-Stem-Cell-Targeted Gene-Addition and Gene-Editing Strategies for βhemoglobinopathies. Cell Stern Cell 2021, 28, 191-208, doi:10.1016/j.stem.2021.01.001.

17. Milone, M.C.; O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia 2018, 32, 1529-1541, doi: 10.1038/s41375-018-0106-0.

18. Gouvarchin Ghaleh, H.E.; Bolandian, M.; Dorostkar, R.; Jafari, A.; Pour, M.F. Concise review on optimized methods in production and transduction of lentiviral vectors in order to facilitate immunotherapy and gene therapy. Biomed Pharmacother 2020, 128, 110276, doi:10.1016/j.biopha.2020.110276.

19. Baekelandt, V.; Eggermont, K.; Michiels, M.; Nuttin, B.; Debyser, Z. Optimized lentiviral vector production and purification procedure prevents immune response after transduction of mouse brain. Gene Ther 2003, 10, 1933-1940, doi:10.1038/sj.gt.3302094.

20. Wang, X.; Olszewska, M.; Qu, J.; Wasielewska, T.; Bartido, S.; Hermetet, G.; Sadelain, M.; Riviere, I. Large-scale clinical-grade retroviral vector production in a fixed-bed bioreactor. J Immunother 2015, 38, 127-135, doi:10.1097/CJL0000000000000072.

21. Adenovirus containing murine FasL mini-gene for induction of the funcțional FasL expression in transduced cells - M.Dumitrescu, V.G.Truscă, A. Burlacu, M.Simionescu, N. Askenasy, A.V. Gafencu - brevet OSIM A/00512/26.08.2019

22. Dumitrescu M, Trusca VG, Savu L, Stancu IG, Ratiu AC, Simionescu M, Gafencu AV. Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potențial. Int JMol Sci. 2020 Aug20;21(17):6011. doi: 10.3390/ijms21176011.

23. Dumitrescu M, Trusca VG, Fenyo IM, Gafencu AV. An Efficient Method for Adenovirus Production. J Vis Exp. 2021 Jun 10;(172). doi: 10.3791/61691.

Claims (3)

1. REVENDICĂRI

   1. Tehnologia de purificare a lentivirusurilor non-replicative prin precipitare cu sulfat de amoniu, cu păstrarea capacității de transducție in vitro si in vivo.
2. 2. Precipitarea particulelor lentivirale de generația a2a si a3a cu ajutorul unei soluții de sulfat de amoniu.
3. 3. Utilizarea preparatului lentiviral purificat prin tehnica precipitării cu sulfat de amoniu pentru experimente preclinice in vitro sau in vivo, pentru inducerea supraexpresiei sau pentru silentierea unor pene.