RO134677A0 - Metodă de testare a infecţiei urinare cu escherichia coli şi sistem in vitro pentru aplicarea acesteia - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un sistem in vitro pentru testarea infecţiei urinare cu Escherichia coli şi la o metodă de testare. Sistemul conform invenţiei este constituit dintr-un vas (1) Duran cu volumul de minim 1 litru, prevăzut cu două orificii, care conţine urină artificială sterilizată, o pompă (2) peristaltică, pentru administrarea regulată de urină din vasul (1) cu un debit de 0,4 ml/min controlat printr-o priză cu temporizare, un punct (3) de inoculare cu tulpina testată realizat dintr-un sept din silicon, cultura stoc având o viabilitate minimă de 1 x 105 UFC/mL, în NaCl 0,9% steril, un furtun (4) din silicon cu diametrul de 0,45 μm terminat într-un filtru Millipore, un vas (5) de simulare in vitro a vezicii urinare, cu un volum de minim 250 mL, în care se află amestecul (6) de reacţie format din urină simulată, produsul testat şi tulpina microbiană, un sistem (7) de menţinere a temperaturii la 37°C, un cateter (8) urinar şi un vas (9) Duram steril prevăzut cu două orificii pentru colectarea probelor. Metoda conform invenţiei are o etapă iniţială de inoculare a mediului din vasul (5) de simulare, după care se adaugă produsul de testat prin septul (3) păstrând temperatura constantă la 37°C, asigurându-se un debit şi un timp de interacţiune constant odată cu colectarea probelor în vasul (9) şi cu determinarea viabilităţii.

Description

Metodă de testare a infecției urinare cu Escherichia coli și sistem in vitro pentru aplicarea acesteia

Sistemul propus, bazat pe o metodă in vitro, își propune brevetarea unui simulator al vezicii urinare destinat testării unor produse împotriva infecțiilor recurente cu Escherichia coli. Metoda presupune utilizarea unei tulpini control ca agent biologic pentru simularea infecției de la nivelul vezicii urinare umane. Efectul antimicrobian va exprima eficiența clinică a produsului testat in vitro, in vederea validării preclinice de la nivel de laborator.

Diverse modele in vitro sunt utilizate pentru a determina efectul unor suplimente funcționale sau medicamente asupra infecțiilor recurente cu tulpini uropatogene {Escherichia coli, Candida sp., Proteus mirabilis'). Cu toate acestea, formarea biofîlmului microbian in vivo este dificil de determinat și caracterizat. Pentru a elimina acest obstacol se utilizează modele in vitro care pot oferi o imagine a structurii biofîlmului ce se formează, dar și a eficienței produsului testat. Pentru a putea corela datele in vitro, cu cele in vivo, modelele cu o curgere constantă sau regulată sunt acceptate în literatura de specialitate [1].

Pentru astfel de studii se utilizează urină artificială sau poate fi utilizată și urină recoltată de la pacienți, sterilizată. A doua variantă poate fi destinată studiului personalizat, în situația în care se urmărește evoluția infecțiilor bacteriene la grupuri țintă de populație. Infecțiile urinare fac parte din categoria celor nosocomiale din cauza frecvenței ridicate din spitale. Ambele variante de mediu utilizat în simulare susține creșterea bacteriilor deoarece respectă toate cerințele unui mediu de cultură clasic [2].

Astfel, metoda și sistemul in vitro au un caracter inovativ prin introducerea unei noi modalități practice de evaluare a potențialului antimicrobian al unor produse biofarmaceutice. Această cerere de brevet propune o modalitate ușor de aplicat la nivel de laborator, în faza de concepere și testare a unui produs din industria biofarmaceutică. Sistemul in vitro elimină o problemă majoră, aceea a caracterizării efectului unui produs de tipul suplimentelor funcționale. Se va determina o imagine a eficacității și rolului unor produse noi, cu efect antimicrobian, cu rol în diminuarea formării biofîlmului de la nivel urinar.

Necesitatea dezvoltării unor sisteme in vitro pentru studiul infecțiilor recurente cu E. coli rezultă din interpretarea unor factori relevanți pentru evaluarea riscului de infecție prin folosirea unui cateter urinar și din evaluarea noilor strategii terapeutice împotriva creșterii _z Rector USAMV Sorin Mihai Gmpeanu

Ir·, -,·· „·..,· .·. ·ύ XV*\

Ț--Τ''rr 1

RO 134677 AO rezistenței la antibiotice. Aceste sisteme respectă condițiile fizico-chimice de la nivelul vezicii urinare și trebuie să simuleze, cât mai exact, interacțiunea cu epiteliul uman, dar să și faciliteze posibilitatea colonizării microbiene. Modelul propus se dorește a fi unul dinamic, care permite o eliminare fiziologică a cantității de urină în 24 de ore [3]. Metoda și sistemul in vitro de simulare se bazează pe determinarea viabilității, dar pot fi luate în calcul și alte mecanisme ce pot să influențeze efectul biologic (de exemplu, stresul oxidativ). Acestă metodă poate fi utilizată, în funcție de scopul cercetărilor efectuate, și pentru alte tulpini microbiene, de exemplu microorganisme eucariote - Candida albicans.

Figura 1. Reprezentarea schematică a modelului in vitro dezvoltat prin cererea de brevet

In plus, aceste sisteme in vitro pot realiza și o testare a unor catetere inovative care să prevină formarea biofilmului, având în compoziția lor materiale cu proprietăți antimicrobiene (de exemplu, nanoparticule). La ora actuală nu există biomateriale utilizate pentru catetere urinare care să fie în totalitate biocompatibile cu epiteliul uman. Proprietățile materialului vor imprima și valoarea biologică. Acest aspect este important și în realizarea simulatorului care va trebui să permită colonizarea. Un alt aspect îl reprezintăjDăstrarea temperaturii fiziologice

CC/.Îc. - UU-U. /

Rector Dr. Sorin Mihai Qmpeanu

RO 134677 AO deoarece aceasta influențează dinamica microbiană, dar și efectul moleculelor de interes farmaceutic.

Punctul critic îl reprezintă montarea cateterului deoarece orice suprainfecție schimbă structura biofilmului, dar și răspunsul pe care îl vom avea la produsul administrat. Consumul resurselor disponibile nu va permite înțelegerea dinamicii tulpinii țintă in vivo, determinarea factorilor cheie, dar și a concentrației optime din produsul testat. Soluția tehnică propusă prin acest procedeu presupune activități uzuale de laborator și permite o cultivare în condiții de laborator. Nu implică materii prime dăunătoare pentru mediu și crește gradul de valorificare a unor molecule valoroase, provenite din surse naturale.

în Figura 1, este prezentată schema noului sistem in vitro. Etapele metodei și realizarea sistemului in vitro au următoarea succesiune:

1. Vas Duran (volum minim ÎL) prevăzut cu 2 orificii ce conține urină artificială sterilizată;

2. Pompă peristaltică pentru administrarea regulată de urină din vasul de punctul 1, debit

0.4 mL/min controlat printr-o priză cu temporizare;

3. Punctul de inoculare cu tulpina testată - sept din silicon (cultură stoc cu o viabilitate minimă 1 χ 10⁵ UFC/mL, în NaCl 0.9% steril);

4. Furtul din silicon terminat într-un filtru Millipore, diametru 0.45 pm;

5. Vasul de simulare in vitro a vezicii urinare (volum minim 250 mL);

6. Amestecul de reacție (urină simulată, produsul testat, tulpina microbiană);

7. Sistem de menținere a temperaturii - 37°C;

8. Cateter urinar;

9. Vas steril de colectare probe -vas Duram prevăzut cu două orificii).

Sistemul de încălzire este bazat pe recircularea apei printr-un circuit ce înconjoară vasul principal de simulare. Sistemul cuprinde o plită cu încălzire și senzor de temperatură, o pompă peristaltică ce asigură un debit constant de 1 mL/min și un vas de adaos prevăzut cu un capac, cu trei orificii.

Sistemul propus spre brevetare are următoarele avantaje:

Poate fi utilizat și pentru teste ce folosesc tulpini patogene, deoarece poate fi coîhplef. sterilizat după fiecare utilizare; . ^Λ * Μ.'χ ? ?

< i .. S ···»,

Rector USAMV București Prof. Univ. Dr. Sorin Mihai Cîmpeanu /

Conf dr. Vam'anu Emanuel

RO 134677 AO

Determinare in vitro a capacității antimicrobiene a unui produs fără utilizarea de teste in vivo;

Parametrii simulării pot fi modificați fără a afecta structura sistemului;

Inițierea unor studii interdisciplinare și multidisciplinare ce vizează microbiota de la nivelul tractului urinar.

Experiment 1.

S-a utilizat ciprofloxacină (în ser fiziologic steril), care a reprezentat proba martor pentru verificarea inițială a funcționalității sistemului. Viabilitatea determinată la 24 de ore de funcționare a fost de 8.20±0.03 UFC/mL. Pe ansamblu, scăderea determinată în 24 de ore de funcționare a fost de ~ 1.00 UFC/mL. Nu s-a observat formarea de biofilm, celulele bacteriene fiind eliminate treptat odată cu urina artificială.

Experiment 2.

S-a utilizat un extract realizat din petale de crizantemă (în alcool etilic 50%), a reprezentat proba test pentru stabilirea parametrilor de funcționare generală în cazul testării unor produse naturale. Viabilitatea determinată la 24 de ore de funcționare a fost de 8.20±0.05 UFC/mL. Pe ansamblu, scăderea determinată în 24 de ore de funcționare a fost de ~ 0.40 UFC/mL. In schimb, s-a observat formarea parțială de biofilm, celulele bacteriene nefiind complet eliminate. Diferențele au fost interpretate și prin existența unor compuși ce stimulează proliferarea celulară. Prezența lor este determinată de compoziția eterogenă a unui extract natural.

. * ·’ ... -Sj ^f,, \ \ ί ,i .·' ’ ' ·.· ·’ ·- L V '

Rector USAMV București Prof. Univ. Dr. Sorin Mihai Cîmpeanii X .

Conf dr. Var^snu Emanuel

RO 134677 AO

Revendicare:

Metoda și sistemul in vitro de aplicare, conform revendicării 1, utilizează o biomasă de Escherichia coli în NaCl 0.9% steril. Utilizarea sistemului in vitro presupune: realizarea urinei artificiale, realizarea sistemului de alimentare cu urină artifială, realizarea vasului de simulare a vezicii urinare, realizarea sistemului bazat pe recircularea apei pentru menținerea temperaturii constante pe durata simulării.

Rector USAMV București Prof. Univ. Dr. Sorin Mihai Cîmpeanu

Conf dr. Vamanâ Emanuel

RO 134677 AO

DESCRIERE MODIFICATĂ

Sistem in vitro pentru testarea infecției urinare cu Escherichia coli și metodă de testare

Sistemul propus, bazat pe o metodă in vitro, își propune brevetarea unui simulator al vezicii urinare destinat testării unor produse împotriva infecțiilor recurente cu Escherichia coli. Metoda presupune utilizarea unei tulpini control ca agent biologic pentru simularea infecției de la nivelul vezicii urinare umane. Efectul antimicrobian va exprima eficiența clinică a produsului testat in vitro, in vederea validării preclinice de la nivel de laborator.

Diverse modele in vitro sunt utilizate pentru a determina efectul unor suplimente funcționale sau medicamente asupra infecțiilor recurente cu tulpini uropatogene {Escherichia coli, Candida sp., Proteus mirabilis'). Cu toate acestea, formarea biofilmului microbian in vivo este dificil de determinat și caracterizat. Pentru a elimina acest obstacol se utilizează modele in vitro care pot oferi o imagine a structurii biofilmului ce se formează, dar și a eficienței produsului testat. Pentru a putea corela datele in vitro, cu cele in vivo, modelele cu o curgere constantă sau regulată sunt acceptate în literatura de specialitate [1],

Pentru astfel de studii se utilizează urină artificială sau poate fi utilizată și urină recoltată de la pacienți, sterilizată. A doua variantă poate fi destinată studiului personalizat, în situația în care se urmărește evoluția infecțiilor bacteriene la grupuri țintă de populație. Infecțiile urinare fac parte din categoria celor nosocomiale din cauza frecvenței ridicate din spitale. Ambele variante de mediu utilizat în simulare susține creșterea bacteriilor deoarece respectă toate cerințele unui mediu de cultură clasic [2].

Astfel, metoda și sistemul in vitro au un caracter inovativ prin introducerea unei noi modalități practice de evaluare a potențialului antimicrobian al unor produse biofarmaceutice. Această cerere de brevet propune o modalitate ușor de aplicat la nivel de laborator, în faza de concepere și testare a unui produs din industria biofarmaceutică. Sistemul in vitro elimină o problemă majoră, aceea a caracterizării efectului unui produs de tipul suplimentelor funcționale. Se va determina o imagine a eficacității și rolului unor produse noi, cu efect antimicrobian, cu rol în diminuarea formării biofilmului de la nivel urinar.

Necesitatea dezvoltării unor sisteme in vitro pentru studiul infecțiilor recurente cu E. coli rezultă din interpretarea unor factori relevanți pentru evaluarea riscului de infecție prin folosirea unui cateter urinar și din evaluarea noilor strategii terapeutice împotriva creșterii rezistenței la antibiotice. Aceste sisteme respectă condițiile fizico-chimice de la nivelul vezicii

Rector USAMV București PrafCUniv. Dn ȘdnnșMihai Cîmpeanu

Conf dr, Vi mănu Emanuel

RO 134677 AO

DESCRIERE MODIFICATĂ urinare și trebuie să simuleze, cât mai exact, interacțiunea cu epiteliul uman, dar să și faciliteze posibilitatea colonizării microbiene. Modelul propus se dorește a fi unul dinamic, care permite o eliminare fiziologică a cantității de urină în 24 de ore [3]. Metoda și sistemul in vitro de simulare se bazează pe determinarea viabilității, dar pot fi luate în calcul și alte mecanisme ce pot să influențeze efectul biologic (de exemplu, stresul oxidativ). Acestă metodă poate fi utilizată, în funcție de scopul cercetărilor efectuate, și pentru alte tulpini microbiene, de exemplu microorganisme eucariote - Candida albicans.

în plus, aceste sisteme in vitro pot realiza și o testare a unor catetere inovative care să prevină formarea biofilmului, având în compoziția lor materiale cu proprietăți antimicrobiene (de exemplu, nanoparticule). La ora actuală nu există biomateriale utilizate pentru catetere urinare care să fie în totalitate biocompatibile cu epiteliul uman. Proprietățile materialului vor imprima și valoarea biologică. Acest aspect este important și în realizarea simulatorului care va trebui să permită colonizarea. Un alt aspect îl reprezintă păstrarea temperaturii fiziologice deoarece aceasta influențează dinamica microbiană, dar și efectul moleculelor de interes farmaceutic.

Punctul critic îl reprezintă montarea cateterului deoarece orice suprainfecție schimbă structura biofilmului, dar și răspunsul pe care îl vom avea la produsul administrat. Consumul resurselor disponibile nu va permite înțelegerea dinamicii tulpinii țintă in vivo, determinarea factorilor cheie, dar și a concentrației optime din produsul testat. Soluția tehnică propusă prin acest procedeu presupune activități uzuale de laborator și permite o cultivare în condiții de laborator. Nu implică materii prime dăunătoare pentru mediu și crește gradul de valorificare a unor molecule valoroase, provenite din surse naturale.

în Figura 1, este prezentată schema figurativă a noului sistem in vitro, în care: la 1 este un vas Duran (volum minim ÎL) prevăzut cu 2 orificii ce conține urină artificială sterilizată, la 2 o pompă peristaltică pentru administrarea regulată de urină din vasul de punctul 1, debit 0.4 mL/min controlat printr-o priză cu temporizare, la 3 punctul de inoculare cu tulpina testată - sept din silicon (cultură stoc cu o viabilitate minimă IxlO⁵ UFC/mL, în NaCl 0.9% steril), la 4 un furtul din silicon terminat într-un filtru Millipore, diametru 0.45 pm, la 5 este vasul de simulare in vitro a vezicii urinare (volum minim 250 mL), 6 reprezintă amestecul de reacție (urină simulată, produsul testat, tulpina microbiană); la 7 se află sistemul

Rector USAMV București Prof. Univ. Dri Sprin Mihai Cîmpeanu

Confdr, lanu Emanuel

RO 134677 AO

DESCRIERE MODIFICATĂ de menținere a temperaturii - 37°C, 8 este cateterul urinar, iar 9 este vasul steril de colectare probe -vas Duram prevăzut cu două orificii).

Sistemul de încălzire 7 este bazat pe recircularea apei printr-un circuit ce înconjoară vasul principal de simulare 5, format dintr-o plită cu încălzire și senzor de temperatură, o pompă peristaltică ce asigură un debit constant de 1 mL/min și un vas de adaos prevăzut cu un capac, cu trei orificii.

Sistemul propus spre brevetare are următoarele avantaje:

- Poate fi utilizat și pentru teste ce folosesc tulpini patogene, deoarece poate fi complet sterilizat după fiecare utilizare;

- Determinare in vitro a capacității antimicrobiene a unui produs fără utilizarea de teste in vivo;

Parametrii simulării pot fi modificați fără a afecta structura sistemului;

- Inițierea unor studii interdisciplinare și multidisciplinare ce vizează microbiota de la nivelul tractului urinar.

Metoda de testare a infecției cu E. coli, în vederea testării unor suplimente funcționale, conform invenției, constă în inocularea vasului de simulare 5 prin intermediul punctului de inoculare 3 cu o seringă sterilă, în raport de 1% cultură microbiană (viabilitate minimă D10⁵ UFC/mL), temperatura se păstrează constantă la 37°C, cu ajutorul sistemului de încălzire 7, iar produsul de testat (extract funcțional sau antibiotic - martor) se adaugă tot prin punctul de inoculare 3 cu o seringă sterilă în raport de 1 mg/mL la 12 ore. Probele se recoltează în timp real, atunci când nivelul amestecul de reacție 6 trece peste nivelul balonului cateterului urinar 8, iar probele se recoltează în vasul steril de colectare 9 și se analizează după minim 24 de ore. Pentru analiză se determină viabilitatea și se utilizează mediu McConkey turnat în plăci Petri. Plăcile inoculate se introduc la 32°C, timp de 24 - 48 de ore și se determină viabilitatea (UFC/mL).

RO 134677 AO

DESCRIERE MODIFICATĂ

Experiment 1.

S-a utilizat ciprofloxacină (în ser fiziologic steril), care a reprezentat proba martor pentru verificarea inițială a funcționalității sistemului. Viabilitatea determinată la 24 de ore de funcționare a fost de 8.20±0.03 UFC/mL. Pe ansamblu, scăderea determinată în 24 de ore de funcționare a fost de ~ 1.00 UFC/mL. Nu s-a observat formarea de biofilm, celulele bacteriene fiind eliminate treptat odată cu urina artificială.

Experiment 2.

S-a utilizat un extract realizat din petale de crizantemă (în alcool etilic 50%), a reprezentat proba test pentru stabilirea parametrilor de funcționare generală în cazul testării unor produse naturale. Viabilitatea determinată la 24 de ore de funcționare a fost de 8.20±0.05 UFC/mL. Pe ansamblu, scăderea determinată în 24 de ore de funcționare a fost de ~ 0.40 UFC/mL. în schimb, s-a observat formarea parțială de biofilm, celulele bacteriene nefiind complet eliminate. Diferențele au fost interpretate și prin existența unor compuși ce stimulează proliferarea celulară. Prezența lor este determinată de compoziția eterogenă a unui extract natural.

RO 134677 AO

DESCRIERE MODIFICATĂ

Bibliografie

1. M. NEGRI, S. SILVA, M. HENRIQUES, J. AZEREDO, T. SVIDZINSKI, R. OLIVEIRA. Candida tropicalis biofilms: artificial urine, urinary catheters and flow model. Medical Mycology 2011, 49, 739-747.

2. T. Brooks, C.W. Keevil A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Letters in Applied Microbiology 1997, 24, 203-206.

3. M. Maierl, M. Jorger, P. Rosker, A. Reisner In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio-protocol 2015, 5, 2.

Rector USAMV Bucuresti\Prof. Univ. Dr. Sorin Minai Cîmpeanu

Conf dr. Vamanu Emanuel

Claims (2)

Revendicare: Sistemul in vitro și metode de testare propusă reprezintă o modalitate practică de evaluare în cadrul unui laborator a unor produse. Utilizarea sistemului in vitro presupune:

1. Sistem in vitro pentru testarea infecției urinare cu Escherichia coli, caracterizat prin aceea că, este constituit dintr-un vas (1) Duran cu volumul minim ÎL, prevăzut cu 2 orificii, care conține urină artificială sterilizată, o pompă (2) peristaltică pentru administrarea regulată de urină din (1), debit 0.4 mL/min controlat printr-o priză cu temporizare, un punctul de inoculare (3) cu tulpina testată - sept din silicon (cultură stoc cu o viabilitate minimă lxlO⁵ UFC/mL, în NaCl 0.9% steril), un furtul (4) din silicon terminat într-un filtru Millipore, diametru 0.45 pm, un vas (5) de simulare in vitro a vezicii urinare (volum minim 250 mL), unde se află amestecul de reacție (6 - urină simulată, produsul testat, tulpina microbiană), Sistem (7) de menținere a temperaturii - 37°C, Cateter urinar (8), Vas steril (9) de colectare probe -vas Duram prevăzut cu două orificii).

2. Metoda conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, în etapa inițială se inoculează mediul din vasul de simulare (5), se adaugă produsul de testat prin septul (3) și se păstrează temperatura constantă la 37°C, asigurându-se un debit și un timp de interacțiune constant, odată cu colectarea probelor în vasul (9) și determinarea viabilității.