PT99965B

PT99965B - Microparticulas sol de ouro revestidas seu processo de revestimento e processo de fixacao de uma porcao de ligacao a microparticulas de sol de ouro

Info

Publication number: PT99965B
Application number: PT9996592A
Authority: PT
Inventors: Brian Layne Shigekewa; Yung-Ao Hsieh
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1992-01-02
Filing date: 1992-01-02
Publication date: 1999-06-30
Also published as: PT99965A

Description

Antecedentes

O presente invento refere-se a um sol de ouro revestido com alcanotióis e com derivados de alcanotiol para proporcionar grupos sobre o sol disponíveis para ligação ou união de moléculas de ligação tais como anticorpos, antigénios ou ligandos. Adicionalmente, o uso de compostos de di- e tri-tiol ligados ao sol de ouro facilita a adsorção passiva destas moléculas de ligação. 0 presente invento refere-se também a um sol de ouro revestido com moléculas de ligação tioladas, incluindo antigénios, anticorpos ou moléculas de transportador, que podem estar ligadas a ligandos relevantes. Está também incluído o processo para revestimento dos sóis de ouro com estes compostos de tiol, o uso dos sóis de ouro em testes, e em conjuntos de teste, imunológicos e imunocitológicos, incorporando estes sóis de ouro revestidos.

Os métodos de teste para o diagnóstico de várias doenças estão constantemente a ser melhoradas. Actualmente, os métodos imunológicos estão entre os métodos mais sensíveis usados para detectar a presença de antigénios ou de anticorpos em amostras. Estes ensaios são bem conhecidos dos peritos na arte dos imunodiagnósticos. De um modo geral, um ensaio imunológico consiste num ensaio no qual se usa um anticorpo monoclonal ou policlonal, para capturar um antigénio, na amostra e um segundo anticorpo, contendo um marcador, tal como um composto fluorescente ou uma enzima, que reage imuno-quimicamente com o complexo antigénio-anticorpo. 0 complexo resultante anticorpo marcado-antigénio-anticorpo é detectado. São comuns variações deste ensaio básico, tais como o uso de apenas um anticorpo reactivo no teste, o método da inibição competitiva ou o uso de partículas como marcadores que permitem a leitura de uma reacção de aglutinação. Uma outra variante é o uso de micropartícuias revestidas, com um antigénio ou com um anticorpo, que após formação de um complexo com o analito e com um segundo parceiro de ligação apropriadamente marcado, dá uma reacção positiva.

426

Τ/4172-654

-3As microparticulas de sol de ouro são usadas num método de ensaio conhecido como imunoensaio de partícula de sol (SPIA). Neste ensaio, faz-se reagir uma solução, contendo o sol de ouro revestido, com um parceiro de ligação apropriado, um anticorpo ou um antigénio, com uma amostra para se ligar ao seu parceiro de ligação. Neste processo, formam-se complexos gue podem ser detectados, usualmente, devido à sua mudança de cor.

As partículas de sol de ouro não revestidas e outros colóides, sofrerão uma aglomeração, guando expostos a baixas concentrações de sal, e precipitam rapidamente separando-se da solução. Deste modo, o revestimento do sol de ouro com um parceiro de ligação apropriado serve as duas funções. A primeira é proporcionar a actividade de ligação imunológica apropriada e a segunda é conferir protecção contra a aglomeração que, necessariamente, ocorreria em tampões concebidos para optimizar as reacções imunológicas. Uma vez que nem todas as proteínas ou polímeros protegerão completamente o sol de ouro da aglomeração induzido pelo sal, realiza-se usualmente um passo de sobre-revestimento com uma proteína ou polímero que se sabe ser capaz de proteger completamente o sol de ouro da aglomeração induzida por sal. Este passo de sobre-revestimento é uma prática bem conhecida na adsorção de anticorpos e de antigénios a substratos de plástico e mostrou-se que esta prática aumenta a estabilidade do material revestido.

O sobre-revestimento serve também para reduzir a interacção não específica do sol de ouro com componentes da amostra. Esta interacção não específica é um problema significativo quando se usam partículas de látex revestidas com anticorpo em ensaios de diagnóstico e é, provavelmente, uma manifestação da interferência do soro, não específica, observada em muitos, se não em todos, os imunoensaios, independentemente do formato. Em alguns casos é permitido modificar a proteína ou o polímero de revestimento para minimizar a interferência em sistemas específicos. São úteis aditivos ao meio de sol, tais como hidrocloreto de guanidina ou ureia. Ocasionalmente, a interferência não específica pode ser atribuída à actividade de heterófilo do soro e é eliminada pela

426

Τ/4172-654

-4 — adição de soro animal inteiro.

Um grave inconveniente na adsorção passiva, do parceiro de ligação desejado ao colóide de ouro, tem sido o de este revestimento directo ser, muitas vezes, mal sucedido. Os mecanismos fisico-quimicos da adsorção passiva de polímero a colóides, de um modo geral, são processos muito pouco compreendidos. A adsorção passiva de anticorpos ao sol de ouro pode resultar num sol que está muito pouco protegido da aglomeração induzida por sal e que não pode ser protegido adicionalmente por sobre-revestimento. Pode também resultar num sol revestido com uma pobre actividade imunológica, presumivelmente, devido à orientação incorrecta do anticorpo adsorvido, ou pode resultar na aglomeração induzida por anticorpo do próprio sol. Finalmente, o parceiro de ligação escolhido pode simplesmente não se ligar ao sol de ouro. 0 resultado final destes problemas é o de que poucos reagentes biológicos, úteis em outros formatos de diagnóstico, podem ser usados na produção de reagentes de colóide de ouro com qualidade para diagnóstico.

que é necessário na arte é um método para ligar covalentemente parceiros de ligação proteínas, hidratos de carbono ou ligandos, ao sol de ouro de modo a se poderem eliminar as incertezes das características de adsorção passiva ou a necessidade de fazer conjugados de ligando parceiro e de transportador de bom revestimento para a adsorção passiva. Em particular, este sol seria significativamente mais útil se fosse refractivo em relação à aglomeração induzida por sal, mesmo na ausência de um parceiro de ligação. A capacidade para modificar as propriedades fisico-guímicas da superfície do sol tornaria, ao mesmo tempo, possível minimizar as interacções amostra-sol, por vezes indefinidas, responsáveis pela interferência não específica em ensaios de diagnóstico imunoquímico e por problemas de fundo em ensaios imunocitoquímicos.

que é também necessário é a capacidade para facilitar a adsorção passiva de polímeros biológicos a sóis de ouro. A tiolação de anticorpos e de polímeros pode aumentar a sua

426

Τ/4172-654

capacidade para se ligarem a sóis de ouro tal como é evidenciado pela resistência aumentada à aglomeração induzida por sal. Uma tal capacidade pode provar ser útil para aqueles anticorpos que se ligam bem a sóis de ouro, mas que perdem quantidades significativas da sua actividade em o fazer, bem como para anticorpos que simplesmente não se ligam ao sol de ouro num estado não derivatizado. Um método alternativo de modificar as características fisico-quimicas da superfície do sol, de modo a facilitar a ligação de anticorpo, consiste no revestimento do sol com compostos de di-tiol ou de tri-tiol. Este revestimento intermediário pode modificar significativamente as propriedades de adsorção passiva de anticorpos ao sol revestido.

Sumário do Invento

O presente invento refere-se a um processo para o revestimento de micropartículas de sol de ouro com alcanotióis, com derivados de alcanotiol e com compostos de di- e tri-tiol. Os sóis de ouro, revestidos com alcanotióis ou com seus derivados, são resistentes à aglomeração induzida por sal e contêm porções químicas para a ligação de polímeros covalentes ou de ligandos. Um equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico particular da superfície do sol é obtido e as interacções não específicas do sol com as proteínas são, de um modo geral, minimizadas. Em particular, os grupos químicos distai da molécula de n-alcanotiol, tais como metilo, hidroxilo, carboxilo, amino, sulfidrilo ou carbonilo, são expostas a solventes e servem como sítios de ligação covalente, e podem ser sítios de equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico.

revestimento do sol de ouro, com compostos de di- e de tri-tiol de baixa massa molecular não protege o sol da aglomeração induzida por sal, mas modifica a natureza fisicoquímica da superfície do sol revestido e facilita a adsorção passiva das moléculas de anticorpo.

No presente invento inclui-se também o sol de ouro revestido. 0 invento inclui também as partículas de sol de ouro revestido ligadas, adicionalmente, a moléculas de ligação, tais

426

Τ/4172-654

como anticorpos ou antigênios, e conjuntos de diagnóstico contendo as referidas partículas de sol de ouro.

Por último, o invento inclui sóis de ouro revestidos aos quais estão ligadas moléculas de ligação, por adsorção, e a sóis de ouro não revestidos cuja adsorção é facilitada pela tiolação da molécula de ligação.

Descrição dos Desenhos

A Figura 1 demostra a resistência relativa à aglomeração do sol de ouro, induzida por sal, conferido pelo revestimento do sol de ouro com anticorpo anti-gpl60 (GC-143) para várias concentrações e valores de pH.

A Figura 2 demonstra a resistência relativa à aglomeração do sol de ouro induzida por sal, conferida pelo revestimento, de um sol de ouro revestido, com anticorpo anti-gpl60 (GC-143) para várias concentrações e valores de pH.

A Figura 3 demonstra a capacidade do GC-143 em provocar a aglomeração espontânea de um sol de ouro na ausência de qualquer sal adicionado, para várias concentrações e níveis de pH.

A Figura 4 demonstra a capacidade do GC-143 em provocar a aglomeração espontânea de um sol de ouro, revestido com TTC, na ausência de qualquer sal adicionado, para várias concentrações e níveis de pH.

A Figura 5 mostra a actividade imunológica e a especificidade do GC-143 adsorvido sobre um sol de ouro, num ensaio SPIA.

A Figura 6 mostra a actividade imunológica e a especificidade do GC-143 adsorvido sobre um sol de ouro, revestido com TTC, num ensaio SPIA.

A Figura 7 demonstra a capacidade de um anticorpo monoclonal

426

Τ/4172-654 anti-HIV p24, não derivatizado, adsorvido ao sol de ouro, em proteger o sol de ouro da aglomeração induzida por sal.

A Figura 8 demonstra a capacidade de um anticorpo monoclonal anti-HIV p24, tiolado, adsorvido ao sol de ouro, em proteger o sol da aglomeração induzida por sal.

Descrição Detalhada do Invento processo de revestimento de micropartículas consistindo em sol de ouro para proporcionar grupos químicos de ligação, para facilitar a ligação adicional de outros grupos, é a base do presente invento. No invento, micropartículas são definidas, de um modo geral, como sol de ouro coloidal com um tamanho na gama de cerca de 20 nm a cerca de 200 nm ou mais. A gama preferida de tamanho da miçropartícula é de cerca de 60 a cerca de 80 nm. 0 tamanho mais preferido é de cerca de 65 a 75 nm. Alguns, dos químicos de revestimento usados, tais como os alcanotióis e seus derivados e suas misturas protegem também os sóis de ouro da aglomeração induzida por sal e podem produzir um equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico particular da superfície do sol de modo que as interacções, não especificas, da superfície com proteínas estranhas, são minimizadas.

sol de ouro foi produzido por redução, mediada por hidroxilamina, de ácido cloroaurico em água, sobre partículas de ouro de semente. Este procedimento está descrito na literatura. (Turkevich, J. et al., Discussions of the Faraday Society, no. 11, p. 55-74 (1951)). De um modo geral, adiciona-se ácido cloroaurico tri-hidratado, dissolvido em água, a água desionizada, à qual se adiciona depois hidrocloreto de hidroxilamina. Adicionam-se partículas de ouro de semente e agita-se. Adiciona-se uma pequena quantidade de acetona e agita-se a mistura. Adiciona-se K₂CO₃ até o pH atingir 7,0. 0 sol de ouro tem um tamanho na gama de cerca de 20 nm a cerca de 150 nm de diâmetro, dependendo das quantidades de partícula de ouro adicionadas e da quantidade de ácido cloroaurico usada, e está agora pronto para ser revestido com alcanotióis ou com derivados

426

Τ/4172-654

-8de tiol.

Os alcanotióis, os seus derivados e os compostos de di- e de tri-tiol são os compostos preferidos usados para revestir a partícula de sol de ouro e para proporcionar porções químicas ou grupos de ligação para a ligação covalente de polímero ou de ligando ao sol de ouro, ou para a modificação do equilíbrio hidrofílico/hidrofóbico. Os compostos mais preferidos são os n-alcanotióis, enquanto que os compostos mais preferidos são os alcanotióis com a fórmula CH₃(CH₂)_nSH, onde n é igual a 9 - 23. De um modo geral, os derivados dos alcanotióis têm a fórmula RCH₂(CH₂)_nSH, na qual R é OH, COOH, CHO, SH e NH₂, e n é 9 a 23. De um modo geral, os compostos de di- e de tri-tiol são compostos de baixa massa molecular. Alguns deles têm sido reconhecidos como quelantes de metais pesados. Dois exemplos são o ácido 2,3-dimercaptossuccínico e o ácido tritiocianúrico.

Para revestir um sol com um n-alcanotiol, prepara-se imediatamente antes do uso uma solução 0,10 M do alcanotiol e com 0,1% de Tween-20^R (marca registada da ICI America, mono-laurato de polioxietileno-sorbitano) em álcool, preferivelmente metanol. Adiciona-se cerca de 1 ml desta mistura a cerca de 100 ml do sol de ouro preparado e agita-se. Deixa-se a mistura resultante em repouso à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas. Concentrações mais baixas do composto de revestimento revestirão eficazmente o sol de ouro, mas os tempos de revestimento óptimos têm de ser determinados empiricamente para cada caso.

Lava-se a mistura de sol em tampão aproximadamente 1 mM em ácido 3-[N-morfolino]-2-hidroxipropanossulfónico (MOPSO), pH 7, por centrifugação a 2000 x g durante cerca de 15 minutos à temperatura ambiente, e pode ser armazenada a 4°C até à utilização.

procedimento anterior é um exemplo de revestimento de sol de ouro com um composto de n-alcanotiol. Este procedimento de revestimento é modificado para a ligação de misturas de nalcanotióis e de derivados de n-alcanotiol contendo grupos de

426

Τ/4172-654

-9ligação, para a conjugação química de ligandos ou de compostos poliméricos. Por exemplo, a inclusão de um hidroxi-n-alcanotiol na mistura de revestimento aumenta a hidrofilicidade da superfície do sol e diminui a interacção não específica do sol com proteínas de soro. A inclusão de um carboxil-n-alcanotiol num teor de 10%, em relação ao total de compostos de tiol presentes, é suficiente para produzir um sol com a densidade desejada de moléculas de conjugação. 0 comprimento da cadeia de carbono do n-alcanotiol nestas misturas pode ter 2-4 carbonos menos do que o comprimento da cadeia de carbono dos derivados de n-alcanotiol, de modo a expor melhor as moléculas de conjugação para reduzir o impedimento estereoquímico associado com a reacção de macromoléculas com a superfície do sol.

A solução de revestimento de n-alcanotiol, de derivados de n-alcanotiol ou de misturas dos dois grupos e, de um modo geral, preparada em álcool, preferivelmente, metanol, com 1% de Tween-2(@. A concentração total de todos os compostos de tiol não é, de um modo geral, maior do que 0,10 M. Em alguns casos, o pH óptimo para os compostos de tiol de revestimento não é 7. Por exemplo, no caso de sóis revestidos com ácido tritiocianúrico, o sol é ajustado até pH 6, antes da adição do composto de tiol, para optimizar o grau de resistência à aglomeração, induzida por sal, conferida por uma mistura particular de composto de tiol.

Geralmente, deixam-se os sóis revestir, na presença da mistura de tio, durante 2 horas, mas os tempos de incubação óptimos são determinados empiricamente para cada caso. Isto é realizado testando os sóis para determinar a sua resistência à aglomeração induzida por sal após períodos de incubação de duração variada, usando um ensaio espectrofotométrico. Os sóis de ouro têm uma cor violeta característica que é extremamente sensível ao diâmetro das partículas de sol. Se se verifica a aglomeração das partículas de sol, aumenta-se grandemente o tamanho’’ efectivo do sol e o máximo de absorção desloca-se dos 540 nm, que é violeta, para comprimentos de onda mais elevados, ficando o sol com uma cor de azul para incolor.

426

Τ/4172-654

-10Na prática, coloca-se 1 ml da alíquota de sol revestido num tubo de vidro. Adicionou-se 100 microlitros de NaCl a 10% à alíquota de sol, com agitação. Deixa-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 10 minutos e compara-se a sua absorvância a 540 nm com a de uma alíquota de sol idêntica à qual se adicionaram 100 microlitros de água. Uma alíquota de teste que mantém 90% ou mais da absorvância da alíquota de controlo é considerada resistente à aglomeração induzida por sal.

TABELA 1

Grau relativo de protecção contra a aglomeração induComposto(s) zida por sal* n-hexadecanotiol 97% n-dodecanotiol 93% n-hexadecano 25% ácido 1-hexadecanoíco 26% ácido 12-mercapto-l-dodecanoíco 46%

11-mercapto-l-undecanol l ácido 2,3-dimercaptossuccínico 41%

2,5-dimercapto-l,3,4-tiadiazole 94%²

3-amino-5-mercapto-l,2,4-triazole <30% ácido tritiocianúrico <30% n-dodecanotiol:

ácido 12-mercaptododecanoíco (1:1)³ 74% (4:1) 76% (9:1) 90% n-decanotiol:11-mercapto-l-undecanol:

: ácido 12-mercaptododecanoíco (8:1:1) 100% (6:3:1) 83% * expressa como a densidade óptica em % a 540 nm da alíquota de sol de controlo sem sal adicionado.

¹ o sol foi aglomerado espontaneamente na presença do composto de

426

Τ/4172-654

-11revestimento.

² se bem que o sol estivesse protegido da aglomeração induzida por sal, após colheita por centrifugação, o sol já não estava protegido.

² proporções molares de compostos usados em misturas de revestimento.

Os compostos que se verificou serem os mais bem sucedidos no revestimento do sol de ouro, e na sua protecção contra a aglomeração induzida por sal, foram os n-alcanotióis. Os derivados de N-alcanotiol, tais como o ácido 12-mercapto-l-dodecanóico, foram ineficazes, por si só, em conferir resistência à aglomeração induzida por sal, mas os sóis revestidos com misturas de n-alcanotióis e os seus derivados conferiram de facto uma protecção total contra a aglomeração induzida por sal e contribuíram para as outras propriedades que anteriormente se descreveram.

sol de ouro revestido, contendo grupos conjugáveis quimicamente, é depois ligado a moléculas de ligação tais como proteínas, hidratos de carbono, anticorpos, antigênios, polímeros, monómeros ou ligandos, usando a química da carbodiimida por métodos bem conhecidos. As moléculas de ligação incluem quaisquer grupos que são capazes de serem adsorvidos ou ligados covalentemente ao sol de ouro revestido. Em alguns casos, a quimica da carbodiimida é também usada para conjugar uma molécula de ligador, tal como o ácido 6-aminocapróico, ao sol, antes da conjugação indirecta do parceiro de ligação, de modo a atenuar os constrangimentos estereoquímicos sobre o parceiro de ligação e auxiliar o seu reconhecimento pelo seu parceiro de ligação complementar e o próprio parceiro. Para conjugar o parceiro de ligação ou a molécula de ligador ao sol revestido, o sol é incubado à temperatura ambiente na presença da substância a ser acoplada, de hidrocloreto de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e de N-hidroxissulfossuccinimida (SNHS), num tampão 10-25 mM, a pH 7,0, durante 2 horas. Em alguns casos, adicionam-se alíquotas sequenciais de EDC durante a reacção de conjugação de modo a compensar a hidrólise deste composto em meios aquosos.

426

Τ/4172-654

-12A escolha das químicas de conjugação potencialmente úteis é determinada pela porção química sobre o sol revestido bem como pelo tipo de molécula introduzido sobre qualquer molécula de ligador. Por exemplo, grupos amino sobre os derivados de alcanotiol ligados ao sol ou sobre as moléculas de ligador ligadas, podem ser conjugadas a polímeros usando agentes de reticulação, homo- ou hetero-bifuncionais, de éster de N-hidroxissuccinimida. Do mesmo modo, grupos sulfidrilo sobre os derivados de alcanotiol ligados ao sol ou sobre as moléculas de ligador, podem ser conjugados a polímeros usando agentes de reticulação homo ou hetero-bif uncionais de maleiimida. A gama de esquemas de conjugações possíveis é muito similar, se não idêntica, à gama de esquemas químicos normalmente usada na preparação de imuno-conjugados de diagnóstico. Os reagentes de reticulação clássicos, compatíveis com os grupos sobre o sol, os derivados de alcanotiol ou os agentes químicos de reticulação, são necessários para ligar o parceiro de ligação apropriado ao sol.

Os imunoensaios, usando o método de imunoensaio de partícula de sol (SPIA), são realizados como se descreveu na Patente dos E.U.A. n^a 4 313 734 de J. Leuvering. Resumidamente, incuba-se o sol de ouro, revestido com uma molécula de ligação, na presença de uma amostra de teste contendo o parceiro de ligação oposto. Se o parceiro de ligação oposto está presente na amostra, verificar-se-á a reticulação do sol revestido e a absorvância, no máximo de absorção, das partículas de sol de ouro simples diminuirá dramaticamente. As propriedades de adsorção dos compostos poliméricos aos sóis de ouro podem ser melhoradas pela tiolação do parceiro de ligação.

Tiolaram-se anticorpos policlonais e monoclonais por reacção com S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA). Os grupos sulfidrilo protegidos resultantes foram expostos por reacção das proteínas com hidrocloreto de hidroxilamina. Este é um procedimento químico bem conhecido para a introdução de grupos sulfidrilo em proteínas. As proteínas tioladas foram depois adsorvidas nos sóis de ouro a pH 6, 7, 8 e 9 para concentrações

426

Τ/4172-654

-13de proteína compreendidas entre 5 gg/ml e 100 gg/ml. 0 grau de resistência à aglomeração induzida por sal foi determinado como anteriormente se descreveu. A tiolação de anticorpos por este método melhorou significativamente a sua capacidade em proteger o sol de ouro da aglomeração induzida por sal, em relação a anticorpos não tiolados, tal como se mostra nas Figuras 7 e 8, e como se descreve no Exemplo 12.

Um método alternativo para facilitar a adsorção de anticorpos ao sol de ouro consiste na inclusão de um revestimento intermediário entre o sol de ourto e o parceiro de ligação, de modo a modificar as propriedades fisico-químicas da superfície do sol, por forma a aumentar a adsorção dos anticorpos. Para este propósito usam-se di- e tri-tióis. 0 ácido tritiocianúrico (TTC) é um exemplo de um destes compostos. 0 sol de ouro foi revestido com TTC usando um procedimento, similar ao que anteriormente se descreveu para os compostos de n-alcanotiol, mas com concentrações diferentes de TTC e de Tween-20^. Estas concentrações foram determinadas empiricamente. A capacidade do anticorpo para conferir, ao sol lavado, resistência à aglomeração induzida por sal foi determinada após incubação do anticorpo e do sol revestido, para vários pH e concentrações de proteína descritos no parágrafo anterior.

As micropartículas revestidas do presente invento podem ser ligadas covalentemente a antigénios ou a anticorpos e vendidas num conjunto de teste para uso em imunodiagnósticos. O antigénio ou o anticorpo serão específicos para o parceiro de ligação aposto que se pretende detectar, e os outros componentes do conjunto podem incluir diluentes, tampões, agentes marcadores e equipamento de laboratório, que também serão específicos de um teste particular a realizar.

Os exemplos seguintes são apresentados para explicar com mais pormenor, e não para limitar, o invento. As modificações do invento serão óbvias para os peritos na arte e são também consideradas como parte do presente invento.

426

Τ/4172-654

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparação do Sol de Ouro.

Para a preparação do sol de sementeira usado na preparação do sol de ouro final, adicionaram-se 10 ml de solução a 1% de HAuC1₄ tri-hidratado a 900 ml de água e agitou-se bem. Adicionaram-se 10 ml de solução de citrato de sódio a 1% à mistura e agitou-se bem. Com agitação vigorosa, adicionaram-se 10 ml de solução de boro-hidreto de sódio a 0,075% (preparada por dissolução de boro-hidreto de sódio na solução de citrato de sódio) e agitou-se bem durante 5 minutos. Filtrou-se a mistura através de um filtro de 0,22 /xm e armazenou-se a 4^eC. 0 sol deverá envelhecer pelo menos 24 horas antes do uso.

Para preparação do sol de ouro final, adicionaram-se 8 ml de solução de HAuCl₄ tri-hidratado a 2% (em água) a 900 ml de água. Com agitação contínua, adicionaram-se 4 ml de solução de hidrocloreto de hidroxilamina a 5% recentemente preparada (em água). Imediatamente depois, adicionaram-se 22,33 microlitros de sol de sementeira e agitou-se vigorosamente durante 30 minutos. Para cada mililitro de sol produzido adicionou-se 1 microlitro de acetona e continuou-se a agitação durante 10 minutos. Adicionou-se solução de K₂CC>3 0,2 M até se obter o pH desejado.

volume apropriado de sol de sementeira foi determinado pela relação seguinte: Volume de semente requerido para o tamanho de sol desejado = Volume de semente requerido para o sol de um dado tamanho vezes a raiz cúbica do (Diâmetro de sol obtido a partir de uma dada quantidade de sol de semente dividido pelo diâmetro da partícula desejado).

Exemplo 2. Revestimento de Sol de Ouro com n-alcanotiol.

sol de ouro foi preparado como no Exemplo 1. Preparou-se, imediatamente antes do uso, uma solução 0,1 M de 1-dodecanotiol em metanol e de 1% de Tween-2C®. Para cada 100 ml de sol de ouro a ser revestido, adicionou-se ao sol de ouro, gota a gota, com

426

Τ/4172-654

-15agitação, 1 ml da solução de tiol-metanol. Deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente, durante 2 horas, com uma agitação ocasional. 0 sol de ouro revestido foi recuperado por centrifugação a 2000 x g durante 15 minutos, à temperatura ambiente, com ressuspensão subsequente em solução de MOPSO 1 mM, pH 7,0. Este procedimento de centrifugação e de ressuspensão foi repetido 3 vezes. Ressuspendeu-se o sol resultante no mesmo tampão e armazenou-se a 4°C antes do uso.

Exemplo 3. Um Sol de Ouro Revestido com Mistura de n-Alcanotiol e de derivado de n-Alcanotiol.

sol de ouro foi preparado como no Exemplo 1. Preparou-se, imediatamente antes do uso, uma solução 0,09 M de 1-dodecanotiol, 0,01 M de ácido 12-mercapto-l-dodecanóico em metanol e de 1% de Tween-2 Ó®. Para cada 100 ml de sol de ouro a ser revestido, adicionou-se ao sol de ouro, gota a gota, com agitação, 1 ml da solução de mistura de tiol-metanol. Deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente, durante 2 horas, com uma agitação ocasional. 0 sol de ouro revestido foi recuperado de um modo idêntico ao que se descreveu no exemplo anterior.

Exemplo 4. Revestimento do Sol de Ouro com Derivado de n-Alcanotiol e Falta de Protecção Subsequente contra a Aglomeração Induzida por Sal.

O sol de ouro foi preparado como no Exemplo 1 e ajustou-se o pH a 7 com K₂CO₃. Preparou-se, imediatamente antes do uso, uma solução 0,10 M de ácido 12-mercapto-l-dodecanóico e de 1% de Tween-20®em metanol. Para cada 100 ml de sol de ouro a ser revestido, adicionou-se ao sol de ouro, gota a gota, com agitação, l ml da solução de tiol-metanol. Deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente, durante 1 hora, com agitação ocasional. A alíquotas de l ml, em duplicado, do sol revestido adicionaram-se 100 μΐ de água ou 100 μΐ de solução de NaCl a 10%. Como controlo considerou-se a alíquota à qual se tinha adicionado água. A alíquota à qual se tinha adicionado solução de NaCl a 10% tinha perdido 54% da sua actividade óptica após 10 minutos. Este

426

Τ/4172-654

-16facto é interpretado como evidência de que o sol de ouro não estava protegido da aglomeração induzida por sal por estar revestido com o ácido 12-mercapto-l-dodecanóico.

Exemplo 5. Preparação de um Sol de Ouro Revestido com uma Mistura de n-Alcanotiol e de Derivados de n-Alcanotiol.

sol de ouro foi preparado como no Exemplo 1 e ajustou-se o pH 7 com K2CO3. Preparou-se, imediatamente antes do uso, uma solução 0,004 M de N-decanotiol, 0,0005 M de 11-mercapto-l-undecanol, 0,0005 M de ácido 12-mercapto-l-dodecanoíco, 0,08 M de NaCl e 1% de Tween-20® em metanol. Para cada 100 ml de sol de ouro a ser revestido, adicionou-se, gota a gota, com agitação, 1 ml da solução de tiol-derivado de tiol e deixou-se a mistura em repouso, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, o sol revestido foi testado quanto à protecção contra a aglomeração induzida por sal tal como no Exemplo 4.

O sol revestido mantinha 100% da sua densidade óptica a 540 nm após a adição de solução de NaCl a 10%. Crê-se que este facto mostra que o sol revestido está totalmente protegido da aglomeração induzida por sal.

Exemplo 6. Conjugação de Albumina de Soro de Bovino com Sol de

Ouro Revestido.

Misturaram-se 4 ml do sol de ouro revestido descrito no Exemplo 3, com uma densidade óptica a 540 nm de 25,0, com 4,3 ml de MOPSO 10 mM, pH 7,0. A esta mistura adicionaram-se, sequencialmente, com agitação, 0,2 ml de solução de BSA de 25 mg/ml, 1,0 ml de solução de SNHS 30 nM, e 0,5 ml de solução de EDC 0,1 M. As soluções de BSA, SNHS e EDS foram preparadas em solução de MOPSO 10 mM, pH 7,0. Agitou-se a mistura reaccional durante 2 horas à temperatura ambiente. A reacção foi extinta por uma hora de agitação adicional após a adição de 1 ml de solução de etanolamina 1,0 M (ajustada a pH 7,0 com HCl), pH 7,0, em solução de MOPSO 10 mM. Adicionou-se igual volume de solução de MOPSO 10 mM, NaCl 0,15 M, 0,5% de Tween-20®, 1,0 mg/ml de

426

Τ/4172-654

caseína, a pH 7,0, à mistura reaccional e deixou-se a mistura em repouso durante 1 hora. Este bloqueamento ou passo de sobre-revestimento protege as áreas nuas não reagidas da superfície do sol de ouro, da interação não específica com outros biopolímeros. 0 sol revestido conjugado com BSA foi recuperado por centrifugação a 2000 x g, à temperatura ambiente durante 15 minutos, e ressuspensão subsequente no mesmo tampão. Este procedimento de centrifugação e lavagem foi repetido 3 vezes. 0 sol foi centrifugado como anteriormente e ressuspendido em solução de MOPSO 10 mM, pH 7,0. Este passo foi repetido duas vezes. 0 sol revestido conjugado com BSA foi armazenado a 4°C antes do uso.

Exemplo 7. SPIA de Sol de Ouro Conjugado com BSA.

O sol de ouro conjugado com BSA do Exemplo 5 foi diluído em solução de MOPSO 0,1 M, NaCl 0,15 M, 1% de polietilenoglicol 8000, pH 7,0, para se obter uma densidade óptica a 540 nm de 1,0. Diluiram-se anticorpo policlonal anti-BSA e imunoglobulina (IgG) de coelho normal até 12 microlitros/ml em solução de MOPSO 10 mM, pH 7,0. A alíquota de 1 ml, em separado, de sol conjugado com BSA, adicionaram-se 100 microlitros de anti-BSA diluído, de IgG de coelho normal ou de tampão MOPSO 10 mM, com agitação. Transferiram-se as misturas para cuvettes” e mediram-se as densidades ópticas a 540 nm ao longo do tempo, cujos valores se mostram na Tabela 2.

Os resultados que se mostram na Tabela 2 demonstram que existe BSA, reconhecível imunologicamente, sobre a superfície do sol e que a diminuição na densidade óptica não é devida à interacção não específica do soro de coelho com o sol.

Exemplo 8, SPIA de Sol de Ouro Conjugado com Controlo Negativo de

BSA

Preparou-se um sol revestido conjugado com controlo negativo de BSA, exactamente tal como no Exemplo 5 anterior, com a excepção de não se ter adicionado EDC à mistura reaccional de

426

Τ/4172-654

-18«>' // ta conjugação. Em vez disso incluiu-se um volume idêntico de tampão de MOPSO 10 mM, pH 7,0. 0 propósito deste sol foi demonstrar que, em ensaios SPIA, a actividade da BSA observada tinha uma natureza covalente. A comparação dos resultados das tabelas 2 e 3 demonstra que, se bem que uma porção significativa da actividade de BSA destes sóis possa estar adsorvida passivamente, uma porção igualmente significativa está ligada covalentemente.

TABELA 2

Sol revestido conjugado com BSA Amostra Diminuição na D.O. a 540 nm em 60'

Anti-BSA 0,401 IgG de Coelho 0,029 Tampão 0,031

TABELA 3

Sol de Ouro Conjugado com controlo negativo de BSA

Amostra Diminuição na D.O. a 540 nm em 60'

Anti-BSA 0,238 IgG de Coelho 0,063 Tampão 0,050

Exemplo 9. Melhoria nas Propriedades de Revestimento de Anticorpo sobre o Sol de Ouro revestido com TTC.

sol de ouro foi preparado como se descreveu no Exemplo 1, com a excepção de o seu pH ter sido ajustado a 6,0 com K2CO3. Preparou-se, imediatamente antes do uso, uma solução saturada de TTC em metanol. Adicionou-se uma solução de 10% de Tween-2 d® em metanol até uma concentração final de Tween-2 d© de 2,5%.

426

Τ/4172-654 —19—

Adicionaram-se 4 ml desta solução a 200 ml do sol anterior, com agitação, e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas, com agitação ocasional. Colheu-se o sol revestido tal como no Exemplo 2. Diluíram-se alíquotas em separado do sol revestido até uma densidade óptica de 2,0 e, simultaneamente, ajustaram-se até pH 6, 7, 8 e 9, respectivamente, com ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico (MES) 10 mM, MOPSO 10 mM, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N-(ácido 3propanossulfónico) (EPPS) 10 mM e ácido 2-(N-ciclo-hexilamino)etanossulfónico (CHES) 10 mM. Em paralelo, preparou-se um sol de ouro tal como no Exemplo 1 e ajustou-se o pH de alíquotas em separado a 6, 7, 8 e 9 com K₂CO₃. Diluiu-se anticorpo policlonal purificado anti-HIV humano até 1,0, 0,5, 0,25, 0,10 e 0,05 mg/ml em cada um dos tampões anteriores. A alíquotas de 1,0 ml em paralelo, de cada um dos sóis anteriores e a cada pH, adicionaram-se 100 μΐ de solução de anticorpo com o pH correspondente, com agitação. Deixaram-se as misturas em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos. A cada mistura de sol adicionaram-se, com agitação, 100 μΐ de solução de NaCl a 10%. Após mais 10 minutos, mediu-se a densidade óptica a 540 nm de cada mistura, tal como se mostra nas Figuras 1-4.

A adorção do anticorpo sobre o sol revestido com TTC resultou numa gama de pH mais larga para a qual se verifica a protecção contra a aglomeração induzida por sal. Também, sobre o sol revestido com TTC se verificou a protecção contra a aglomeração induzida por sal para concentrações de anticorpo mais baixas. Na ausência da adição de NaCl, o anticorpo provocou a aglomeração espontânea do sol não revestido. A aglomeração espontânea induzida por anticorpo foi muito menos evidente no sol revestido com TTC.

Colectivamente, estas observações mostram que a adsorção deste anticorpo sobre sol de ouro revestido com TTC é maior do que a que se observa com sol não revestido.

426

Τ/4172-654

Exemplo 10. Melhoria na Actividade SPIA de Anticorpo Adsorvido sobre Sol de Ouro Revestido com TTC.

-20Prepararam-se 100 ml de sol de ouro tal como no Exemplo 1 e ajustou-se o pH a 9,0. Adicionaram-se 2,5 mililitros de solução 2 mg/ml de anti-HIV humano (GC-143) em CHES 10 mM, a pH 9,0, com agitação, e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas com agitação ocasional. À mistura adicionaram-se, com agitação, 5 ml de leite em pó magro com 1 mg/ml, e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante mais 1 hora. O sol revestido foi centrifugado a 2000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente e ressuspendido em solução de CHES 10 mM, 0,5% de BSA, manitol 300 mM, 0,01% de azida de sódio, a pH 9,0. Repetiu-se a centrifugação e o passo de ressuspensão 3 vezes. Finalmente, ressuspendeu-se o sol no mesmo tampão e armazenou-se a 4°C antes do uso. Diluiu-se um sol revestido com TTC, preparado tal como no Exemplo 9, com solução de CHES 10 mM, a pH 9,0, para se obterem 60 ml de sol com uma densidade óptica de 2,0, que é a mesma densidade óptica aproximada do sol de ouro preparado no Exemplo 1. Adicionaram-se 6 ml de solução de 0,5 mg/ml de anti-HIV humano dissolvido em CHES 10 mM, a pH 9,0, com agitação, e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora e, depois, de um dia para o outro a 4°C. Adicionaram-se, com agitação, 6 ml de leite em pó magro com 1 mg/ml e deixou-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Colheu-se o sol revestido como anteriormente e armazenou-se de um modo idêntico.

Diluiram-se alíquotas de cada sol até uma densidade óptica a 540 nm de 2,0 com solução de MOPSO 0,1 M, NaCl 0,15 M, 1% de PEG 8000, 0,25% de BSA, a pH 7,0. A réplicas de alíquotas de cada sol diluído adicionaram-se a) 100 μΐ de tampão, b) 100 μΐ de solução de gpl60 de HIV 10 gg/ml ou c) 100 μΐ de uma mistura de solução de gpl60 de HIV 5 gg/ml e de solução de anti-HIV humano 5 pg/ml, que tinha sido pré-incubada durante 90 minutos à temperatura ambiente, tal como se mostra nas Figuras 5 e 6.

É evidente que o sol, revestido com TTC, de GC-143 é mais

426

Τ/4172-654

-21/Ά-- jS5ãS£SS3®í' í-~ ^-'5 '· ' ' it activo imunologicamente do que a sua réplica de sol não revestido e que o seu uso no ensaio SPIA resulta num ensaio mais sensível. Deste modo, também por critérios funcionais, o sol, revestido com TTC, de GC-143 é também melhor do que a réplica de sol não revestido.

Exemplo 11. Tiolação de Anticorpo Monoclonal Anti-HIV p24 usando

S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA).

Misturou-se l ml de solução de anticorpo monoclonal anti-HIV p24 1,46 mg/ml em NaPO₄ 50 mM, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), pH 7,5, com 0,02 ml de solução de SATA 5 mg/ml em dimetilsulfóxido (DMSO) e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Separou-se o anticorpo reagido dos componentes da mistura reaccional por filtração em gel, através de uma coluna de dessalinização, no mesmo tampão. Diluiram-se 0,25 mg do anticorpo reagido, filtrado através de gel, até 1 ml com o mesmo tampão e adicionaram-se, com agitação 100 μΐ de solução de NaPO₄0,05 M, EDTA 25 mM, NH₂OH*HC1 0,5 M, a pH 7,5. Deixou-se a mistura reaccional em repouso durante 1,5 horas à temperatura ambiente. O anticorpo desprotegido foi submetido a uma filtração em gel, através de uma coluna de dessalinização, para o tampão original, para remover os reagentes não reagidos.

Exemplo. 12 Melhoria das Propriedades de Revestimento de

Anticorpo Monoclonal Anti-HIV p24 Tiolado.

sol de ouro foi preparado tal como se descreveu no Exemplo 1 com a excepção de se ter ajustado o pH de alíquotas em separado, a 6, 7, 8 e 9, com K₂CO₃. Em paralelo, ajustaram-se alíquotas em separado de anticorpo monoclonal anti-HIV p24, não derivatizado e derivatizado (ver o Exemplo 11) a concentrações de 250, 200, 150, 100 e 50 μg/ml. Para cada uma das concentrações anteriores, determinou-se a capacidade relativa do anticorpo, derivatizado e não derivatizado, em proteger o sol de ouro da aglomeração induzida por sal, exactamente como se descreveu no Exemplo 9 (ver Figuras 7 e 8).

426

Τ/4172-654

-22Das Figuras 7 e 8 é evidente que a tiolação deste anticorpo monoclonal resultou em características de revestimento melhoradas, tal como é avaliado a) pelo facto de o anticorpo derivatizado não aglomerar espontaneamente o sol, b) pela menor dependência da protecção do anticorpo contra a aglomeração do sol, do pH e c) pelas quantidades relativas menores de anticorpo derivatizado, requeridas para proteger o sol da aglomeração induzida por sal, na presença de sal, quando comparadas com as de sol de anticorpo não derivatizado.

Claims

1 - Microparticulas caracterizadas por compreenderem sol de ouro revestido com, pelo menos, um composto seleccionado de entre o grupo consistindo de alcanotiol, derivados de alcanotiol, compostos de ditiol e de tritiol.

2 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido composto ser, pelo menos, um alcanotiol.

3 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido composto ser uma mistura de, pelo menos, um alcanotiol e, pelo menos, um derivado de alcanotiol.

4 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido alcanotiol ser um n-alcanotiol com a fórmula CH₃(CH2)_nSH, onde n é um número inteiro de 9 a 23 inclusivé.

5 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido derivado de alcanotiol ter a fórmula RCH2(CH₂)_nSH, onde R é seleccionado de entre o grupo consistindo em OH, COOH, CHO, SH e NH₂, e n é 9 a 23.

6 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido composto ser um composto de ditiol.

7 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido composto ser um composto de tritiol.

8 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido sol de ouro ter um diâmetro compreendido entre cerca de 10 nm e cerca de 150 nm.

9 - Microparticulas de acordo com a reivindicação 1 que são resistentes à aglomeração induzida por sal, caracterizadas por não se perder mais do que 10% da densidade óptica a 540 nm, de uma suspensão do referido sol, após 10 minutos na presença de c

73 426

Τ/4172-654

-241,0% de NaCl.

10 - Micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por as referidas micropartículas estarem ligadas covalentemente a uma porção de ligação.

11 - Micropartículas de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas por a porção de ligação ser seleccionada de entre o grupo consistindo em proteínas, hidratos de carbono, antigénios, anticorpos, ligandos, polímeros e monómeros.

12 - Micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por compreenderem adicionalmente um composto de ponte que está ligado covalentemente ao referido composto e ao qual está ligada covalentemente uma porção de ligação.

13 - Micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas adicionalmente por estar adsorvida passivamente uma porção de ligação.

14 - Micropartículas caracterizadas por compreenderem sol de ouro ligado a uma porção de ligação contendo, pelo menos, um grupo sulfidrilo.

15 - Processo de revestimento de micropartículas de sol de ouro, caracterizado por compreender;

a) a mistura de micropartículas de sol de ouro com uma solução alcoólica de, pelo menos, um composto seleccionado de entre o grupo consistindo em alcanotiol, derivados de alcanotiol, compostos de ditiol e de tritiol, produzindo-se deste modo micropartículas de sol de ouro revestidas;

b) a centrifugação do referido sol de ouro revestido; e

c) a ressuspensão do sol de ouro revestido em tampão.

16 - Processo de revestimento de micropartículas de sol de ouro, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida solução alcoólica conter adicionalmente um surfactante.

if

J

73 426

Τ/4172-654

17 - Processo de revestimento de microparticulas de sol de ouro, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido composto ser uma mistura de alcanotiol e de derivados de alcanotiol.

18 - Processo de fixação de uma porção de ligação a microparticulas de sol de ouro, caracterizado por compreender:

a) o revestimento do referido sol de ouro de acordo com a reivindicação 15, para produzir um sol de ouro revestido;

b) a incubação do referido sol de ouro revestido e da porção de ligação, para fixar a porção de ligação ao referido sol revestido;

c) o bloqueio dos sítios não específicos no sol de ouro revestido do passo b);

d) a centrifugação do referido sol de ouro revestido do passo c); e

e) a ressuspensão do sol de ouro revestido do passo d) em tampão.

19 - Processo de fixação de uma porção de ligação a micropartículas de sol de ouro, caracterizado por compreender:

a) o revestimento de sol de ouro de acordo com o processo da reivindicação 16;

b) a incubação de uma mistura do sol de ouro, dos agentes de reticulaçâo químicos apropriados e da porção de ligação, para fixar a porção de ligação ao sol de ouro revestido;

c) a extinção da referida mistura;

d) o bloqueio dos sítios não específicos no sol de ouro revestido do passo b);

e) a centrifugação do sol de ouro revestido do passo d); e

f) a ressuspensão em tampão.

20 - Processo de fixação de uma porção de ligação a micropartículas de sol de ouro, caracterizado por compreender:

a) o revestimento de microparticulas de sol de ouro de acordo com o processo da reivindicação 17;

b) a incubação de uma mistura do referido sol de ouro revestido, dos agentes de reticulaçâo químicos apropriados e da

73 426

Τ/4172-654

JSBSHKÍ0GS⁵

-26.ίί¹'· t

porção de ligação, para fixar a porção de ligação ao sol de ouro revestido;

c) a extinção da referida mistura;

d) o bloqueio dos sítios não específicos sobre o referido sol de ouro do passo b);

e) a centrifugação do referido sol de ouro do passo d); e

f) a ressuspensão em tampão.

21 - Processo de fixação de uma porção de ligação a micropartículas de sol de ouro, caracterizado por compreender:

a) o revestimento de microparticulas de sol de ouro de acordo com o processo da reivindicação 16;

b) a incubação do referido sol de ouro revestido com uma porção de ligação;

c) o bloqueio dos sítios não específicos sobre o referido sol de ouro revestido do passo b);

d) a centrifugação do referido sol de ouro revestido do passo c);

e) a ressuspensão do referido sol de ouro do passo d) em tampão.

22 - Processo de fixação de uma porção de ligação a micropartículas de sol de ouro, caracterizado por compreender:

a) a modificação da referida porção de ligação por tiolação química;

b) a incubação da porção de ligação tiolada do passo a) com microparticulas de sol de ouro;

c) o bloqueio dos sítios não específicos no sol de ouro do passo b);

d) a centrifugação do sol de ouro do passo c); e

e) a ressuspensão do sol de ouro do passo d) em tampão.

23 - Conjunto de diagnóstico para uso em imuno-ensaios caracterizado por compreender microparticulas de acordo com a reivindicação l e uma solução tampão.