PT99382A

PT99382A - Produto absorvente contendo monoesteres e diesteres de alcoois alifaticos polihidricos e tampao catamental que o contem

Info

Publication number: PT99382A
Application number: PT99382A
Authority: PT
Inventors: Susan Brown-Skrobot
Original assignee: Mcneil Ppc Inc
Priority date: 1990-10-30
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1992-09-30
Also published as: JPH04269955A; JP3219807B2; US5753252A; PT99382B; NZ264247A; NO914238L; MX9101807A; SG78261A1; GR1002084B; ES2090208T3; NO914238D0; GR910100439A; CA2054464A1; IE75721B1; TW302279B; MY110561A; EP0483812B1; HK16797A; CA2054464C; ZW14891A1

Description

Descrição referente ã patente de invenção de McNeil-PPC, Inc., nor te-americana, industrial e comercial, estabelecida em Van Liew Ave, Millttown, NJ 08850, Estados Unidos da América, (inventor: Su-san Brown-Skrobot, residentes nos Estados Unidos da América), para "PRODUTO ABSORVENTE CONTENDO MONO-ÉSTERES E DIÉSTERES DE ÁLCOOIS ALIFATICOS POLIHIDRICOS E TAMPÃO CATAMENIAL QUE O CONTEM".

DESCRIgÃO Âmbito da Invenção A presente invenção refere-se a produtos absorventes e especialmente a produtos absorventes tais como tam pões, pensos higiénicos, revestimentos de feridas, pensos nasais e análogos que são adaptados para absorverem fluídos corporais tais como fluídos menstruais, sangue e exsudados de feridas.

Mais particularmente, a presente invenção refere-se ã adição de compostos activos, que quando expostos a bactérias nos produtos absorventes reduzem a quantidade de toxinas produzidas pelas bac térias que contactam com eles.

Antecedentes da Invenção

As enterotoxinas de estafilococos são

proteínas extracelulares compostas de cadeias de polipeptídeos sinulares com aproximadamente 30 kd que caracteristicamente pos^ suem um anel dissulfureto próximo do meio da molécula. São cla£ sificadas em cinco grupos serológicos, designadas enterotoxina A de Estafilococos (SEA), enterotoxinas B de Estafilococos (SEB) enterotoxina C de Estafilococos (SEC), enterotoxina D de Estafi^ lococos (SED) e enterotoxina E de Estafilococos (SEE). Com base nas diferenças nos epítopos menores, a SEC é ainda subdividida em três tipos designados por SEC^, SEC2, SEC^. Um sexto grupo, SEF, foi também descrito e implicado como o agente causal de síndromas de choque tóxico. Deixou assim de ser considerada como uma enterotoxina e foi renomeada como toxina de síndroma de choque tõxico-1 (TSST-1), como referido por J. J. Iandolo em Ann. Rev. of Micro. Vol. 43, págs. 275-402, 1989. 0 síndroma de choque tóxico que ocorre na menstruação é uma doença multi-sistema grave e muitas vezes fatal associada com infecção ou colonização por bactérias Sta-phylococcus aureus 05. aureus) e tem sido associada ã utilização de tampões durante a menstruação. No síndroma de choque tóxico (TSS) associado com menstruação ou não, os síndromas inclu em febre, hipertensão, erupção da pele e escamação da pele. O TSST-1 está muito associado com casos menstruais e foi menos frequentemente isolado a partir de estirpes Staphylococcus aureus em casos não menstruais da doença. Uma vez que a TSST-1 po de induzir muitos aspectos clínicos de TSS em coelhos ou outras espécies pensa-se em geral ser a toxina causal em TSS (Schlie-vert, "Staphylococcal Enterotoxin B and Toxic Shock Syndrome To xin-1 Are Significantly Associated With Non-menstrual TSS", The lancet, Vol. 1(8490), 17 de Maio, 1986, pll49). Contudo, Garbe (Garbe PL, Arko RJ, Reingold AL, et al. "Staphylococcus aureus isolates from patientes with non-menstrual toxic shock syndrome: Evidence for additional toxins", JAMA 1985; Vol 253; páginas 2538-42) notou que muitos isolados de TSS a partir de casos não menstruais não expressavam TSST-1 apesar de eles causarem sinto mas semelhantes a TSS no modelo de coelho. Das toxinas formadas por isolados menstruais de S. aureus produziu-se TSST-1 em 40% dos casos referidos por Schlievert, 1986. Além disso, a enterotoxina B foi produzida em 38% de todas as estripes TSS não mens; 2

truais. Além disso, Schlievert refere que aproximadamente 78% de TSS não menstrual ou prováveis isolados TSS expressam TSST-1 ou enterotoxina B em comparação com 20% de isolados não menstruais não TSS (p<0,001). Os isolados de 30 pacientes que sofriam de síndroma de choque tóxico condirmado ou provável foram também examinados para enterotoxinas e toxinas exfoliativas. Ve rificou-se que se produziu a enterotoxina B em 38% de todas as estripes TSS não menstruais. Crass and Bergdoll, 1986 referiu um total de 46 (83,6%) de 55 isolados S. aureus produzidos por TSST-1: 12 (25,5%) sõzinhos, 21 (46,8%) com Enterotoxina A de Estafilococos e 13 (27,7%) com Enterotoxina C de Estafilococos. Oito dos isolados de £5. aureus que não produziram TSST-1 produziram Enterotoxina B de Estafilococos.

Humphreys (1989) referiu os estudos de isolados de S. aureus obtidos de casos de septicemia em que 33 (63%) produziram enterotoxinas A, B, C ou D sozinhas ou em combinação . A toxina do síndroma de choque tóxico 1 (TSST-1) é classificada como um elemento do grupo exotoxina pi-rogénica-enterotoxina de estafilococos de toxinas com base nos sintomas de um paciente. Contudo, o TSST-1 e o seu anti-soro idêntico não reage reticularmente com qualquer um dos soros ou proteinas de outros elementos desta família de toxinas. Além disso, a TSST-1 não possui o anel de cisteína presente nos elementos remanescentes da família de toxinas, um aspecto estrutural importante desta família de toxinas. A TSST-1 possui uma ho mologia aminoácido muito pequena com outros elementos desta família de toxinas. A falta de uma relação de sequência fechada entre TSST-1 e outras toxinas pode sugerir que está mais relacionada com o progenitor ancestral desta família ou, alternativamente, está erradamente incluída neste grupo de toxinas (Ian-dolo, 1989) . Além disso, o TSST-1 suporta uma pequena relação es trutural com outros elementos do grupo exotoxina pirogénica-ente rotoxina de estafilococos (Iandolo, 1989).

Subsequente ã publicação de relatórios associando o síndroma de choque tóxico com utilização de tampões, vários investigadores efectuaram estudos concebidos para avaliar o efeito dos tampões no crescimento da bactéria S. aure- 3

- us assim como o efeito de tampões na produção de TSST-1 por essa bactéria. Os esforços mals recentes para elucidar o papei dos tampões no TSS produziu dados contraditórios. Schlievert et al (Obstet. Gynecol., Vol. 64, páginas 666-670, Novembro 1984) estudou o efeito de tampões em S. aureus para avaliar se ou não os componentes do tampão aumentavam o crescimento de S. aureus e a produção da toxina de síndroma tóxico-1. Concluiu-se que, sob estas condições do seu estudo, os componentes do tampão não proporcionam nutrientes para o crescimento do S. aureus do síndroma de choque tóxico nem factores que induzam produção da toxina de síndroma de choque tõxico-1 superiores aos níveis de controlo. Depois de incubação durante 6 horas, alguns dos tampões comercialmente disponíveis que foram ensaiados eram inibi-dores do crescimento da bactéria e eliminavam a produção da toxina. Outros eliminavam a produção da tóxina mas não inibiam o crescimento de células. Um tampão inibia o crescimento das célu las mas aumentava a quantidade da tóxina produzida. Por outro lado, Tierno and Hanna (Contraception, Vol. 31, páginas 185-194, 1985) referiram que os seus tampões experimentais não estimularam S^. aureus a produzir TSST-1.

Reiser et al. (J. Clin. Microbiol., Vol. 25, NO. 8, páginas 1450-1452, Agosto 1987) referiu depois os're sultados de ensaios que efectuou para determinar o efeito de quatro marca de tampões na produção da toxina de síndroma de choque tõxico-1. A quantidade de ar disponível para os tampões que foram ensaiados foi limitada ã contida em sacos (feitos de invólucros de celulose com um peso molecular inferior a 10000) nos quais se colocaram os tampões durante o ensaio. Pensa-se que este método possui vantagens uma vez que a quantidade limitada de ar disponível foi pensada para imitar mais aproximada-mente do que os métodos anteriormente utilizado a condição in vivo na vagina durante a menstruação com um tampão no lugar e uma vez que os tampões que foram ensaiados não foram alterados antes do ensaio. Os resultados dos ensaios efectuados por Reiser et al. indicam que os tampões proporcionam uma área superficial aumentada para a bactéria £3. aureus crescer e oxigénio adequado ' para a produção de toxina. Não se verificou qualquer inibição • significativa do crescimento da bactéria de estafilococos ou 4

produção de TSST-1 por qualquer um dos tampões.

Robbins et al. publicação em J. Clinicai Microbiol., Vol. 25, NQ. 8, páginas 1446-1449, Agosto 1987 ao mesmo tempo que Reiser et al. referiram o efeito de 17 tampões comercialmente disponíveis na produção de toxinas TSST-1 utilizando um método-de disco-membrana-agar (DMA) com incubação a 37Q C durante 19 horas sob 5% de C02 no ar. Inocularam-se por asper são membranas de filtro que revestiam o meio agar (com ou sem sangue) em pequenas placas petri com uma TSST-1 produzida por uma estirpe de £3. aureus. Robbins et al concluiu que o principal papel dos tampões em TSS pode ser de proporcionar uma superfície fibrosa para uma colonização forte e ar suficiente para a produ ção de TSST-1. Em adição, verificaram a evidência da inibição da produção de TSST-1 por aditivos tais como desodorizantes/agen tes tensio-activos utilizados num tampão desodorizado comercia_l mente disponível e uma diminuição na produção de TSST-1 por ini bição do crescimento de £3. aureus como foi observado no caso de um tampão comercialmente disponível diferente. Ê de considerar que a inibição da produção de TSST-1 e a inibição do crescimento de £>. aureus pode mostrar-se importante na redução do risco de TSS. A Patente Norte Americana nQ. 4405323 de Auerbach descreve um tampão concebido para eliminar os riscos de síndroma de choque tóxico e a dismenorreia. Incorporou-se num tampão um agente anti-bacteriano que é referido como se di£ persando em contacto com fluídos corporais e evitando o desenvolvimento dos organismos que produzem as toxinas que provocam o síndroma de choque tóxico. Entre os materiais anti-bacterianos descritos para utilização são os compostos de povidona-iodo, mer cúrio, zinco, penicilina, eritromicina e nitrofurazona. 0 tratado de cooperação de patente publicação nQ. WO 86/05388 (publicado em 25 de Setembro de 1986) de Kass ensina que a inclusão de um sal de um catião bivalente não tóxico em enchimentos absorsivos, por exemplo, tampões cata meniais inibem a produção da toxina do síndroma de choque tóxi-co-1 e outros produtos de estafilococos durante a utilização do referido penso absorsivo. Os sais adequados incluem os de magné sio, bário, cálcio ou estrôncio (preferido) ou de outros catiões 5

bivalentes tais como zinco, manganês, cobre, ferro, níquel e análogos. A parte aniónica do sal não é crítica. 0 estearato de magnésio e o acetato de magnésio são os sais particularmente preferidos para utilização nesta invenção. A Patente Norte Americana nô. 4374522 de Olevsky estabelece que nos esquemas de utilização de tampões catameniais parecem indicar que elevada capacidade de absorção com concomitante período prolongado de utilização de determinados tampões são factores que contribuem para a formação do síndroma de choque tóxico. Esta invenção teoriza que tampões possuindo uma capacidade de absorção limitada e exigindo mudanças relativamente mais frequentes podem ser desejáveis. A Patente de Olesvsky proporciona um tampão feito de material celulósico convencional tais como fibras de rayon que foram comprimidos nu ma forma de bala com uma superfície inferior aberta vedada por uma folha impermeável aos fluídos. A parte inferior impermeável ao fluído e a forma em bala tradicional define uma área de reservatório central de núcleo oco que serve como um reservatório para o excesso de fluído menstrual. A Patente Norte Americana nõ. 4431427 de Lefren at al. descreve tampões menstruais que incluem ácidos fisiológicamente seguros solúveis em água nas suas formas mono-méricas, oligoméricas ou poliméricas. Os ácidos cítrico, glicõ-lico, málico, tartãrico e láctico são descritos como sendo adequados na prática desta invenção. A presença de um ou vários dos ácidos anteriormente referidos num tampão ê referido como inibindo o crescimento da bactéria responsável pelo choque tõxi^ co. Quando um ácido é utilizado na sua forma polimérica, o tampão pode adicionalmente incluir uma enzima para hidrolisar o ácido polimérico â sua forma monomérica. A Patente Canadiana no. 1123155 de Sipos descreve um tampão catamenial para evitar o síndroma de choque tóxico durante o fluxo menstrual. O corpo do tampão, que é aber to na extremidade de inserção e fechado na extremidade de extrac ção é envolvido de forma apertada na sua condição expandida por uma membrana impermeável a fluídos, fina e flexível. Esta membrana que pode ser feita de folha de polietileno, ê inclinada contra a parede vaginal durante a utilização do tampão, é neutra 6

para a mucosa vaginal e é completamente impermeável a bactérias, vírus e produtos de decomposição tóxica do fluxo menstrual. A Patente Canadiana ηθ. 1192701 de Bar-dhan descreve um tampão para a absorção de fluído menstrual e incluindo uma camada interior de material absorvente de líquido e uma camada exterior que envolve e encerra a camada interior. A descarga menstrual pode fluir para o interior da camada interior mas a camada exterior é impermeável ã passagem do fluído menstrual para fora da camada interior. Uma diversidade de canais absorventes de líquido prolongam-se da camada interior atra vés de aberturas formadas na camada exterior e servem como condutas para o fluxo de descarga menstrual do exterior do tampão para a sua camada interior. A estrutura descrita é referida como minimizando a disponibilidade da descarga exterior do tampão com uma redução resultante na probabilidade de crescimento de £>. aureus e consequentemente a sua produção de toxina. Esta patente descreve também que se pode incluir na camada interior um composto anti-microbiano que é bactericida ou bacterostãtico pa ra £3. aureus. O agente anti-microbiano pode tomar a forma de um antibiótico (tal como penicilina, eritromicina, tetraciclina ou neomicina), um agente quimitoterápico (tal como uma sulfonamida) ou um desinfectante (tal como fenol). A patente estabelece que uma vez que o tampão está protegido pela sua camada· exterior do contacto com a parede vaginal, o risco de uma reacção alérgica ou outra reacção adversa ao agente anti-microbiano é minimizada e uma vez que o agente anti-microbiano é também protegido pela camada exterior do contacto com a descarga menstrual, existe um risco pequeno da destruição de organismos comensais na vagina ou desenvolvimento de um agente resistente ao agente anti-micro biano por £5. aureus em qualquer descarga menstrual fora da vag_i na. S. Notermans et al. (Journal of Food sa fety, vol. 3 (1981), páginas 83-88) refere que um monolaureato de glicerilo quando utilizado na proporção de 5 g por quilo de pasta fluída (pH 6,0 a 6,2) inibe a produção de toxinas por Clostridium botulinum tipo A, tipo B e tipo E. Este artigo não menciona a Staphylococos aureus nem qualquer toxina produzida por ela e não menciona produtos absorventes ou o síndroma de 7

choque tóxico. A Patente Norte Americana nQ. 4585792 de Jacob et al. descreve que o ácido L-ascórbico quando aplicado topicamente ã area vaginal da mulher, a menstruação inactiva as toxinas conhecidas como contribuindo para o síndroma de choque tóxico. O composto ácido ascórbico pode ser transportado por um tampão vaginal. A descrição da Patente Norte Americana nQ. 4722937 é no mesmo sentido. A Patente Norte Americana nQ. 4413986 de Jacobs descreve um conjunto tampão embalado para inserção es téril de um tampão na vagina possuindo um tubo guia tipo telescópio ã volta de um tubo de inserção e uma camada flexível liga da ã extremidade inferior do tubo guia e enfiada na extremidade interior do tubo de inserção. Na utilização, quando o tubo de inserção é empurrado através do tubo guia e na vagina, a camada flexível é puxada sobre a extremidade interior do tubo de inser ção e prolonga-se ao longo do seu exterior. A porção do tubo de inserção que é inserida na vagina está sempre completamente revestida pela camada flexível.

Nos casos de síndromas de choque tóxico associados com tampões, a toxina predominante produzida por £3. aureus é a toxina de síndroma de choque tóxico-1 (TSST-1), embo ra em menor extensão, se possam produzir outras enterotoxinas. Estas enterotoxinas não TSST-1 estão principalmente associadas com síndromas de choque tóxico não menstruais. São conhecidos compostos que afectam a produção de enterotoxinas. J.L. Smith, Μ. M. Bencievengo, R.L. Buchanan, and C.A. Kunsch referiu, num artigo intitulado "Effect of Glucose Analogs on the Synthesis of Staphylococcal Enteroto-xin A", Journal of Food Safety 8 (198) páginas 139-146 que a gli cose, 2-desoxiglicose e alfa-metil-glicose inibem a síntese da enterotoxina A de estafilococos por Staphylococcus aureus 196E, ao passo que a beta-metil-glicose e 3-0-metil-glicose não inibem a síntese mesmo a concentrações elevadas. A formação da entero-tòxina A e B é inibida por glicose sendo a extensão da inibição fortemente influenciada pelo pré-crescimento da bactéria num \ meio contendo glicose como citado por Smith et al. • Iandolo and Shafer referiram o efeito da 8 glicose e análogos de glicose, 2-deSOxiglicose e alfa-metil-gli^ cosido na síntese e regulação da produção de enterotoxinas B de estafilococos (Iandolo and Shafer, "Regulation of Staphylococcal Enterotoxin B", Infection and Immunity, Maio de 1977, páginas 610-615). Foi observado um efeito atenuante da glicose na ente-rotoxina de estafilococos B. Contudo, quando se examinou este efeito com análogos de glicose veri£icou-se a existência de res postas contraditórias. A produção de ácido devido ao metabolismo da glicose mostrou que reduzia a produção de toxinas.

Ibrahim, Radford, Baldock and Ireland relataram dados que indicam que, no queijo sem actividade iniciadora, a inibição do crescimento de S. aureus e produção de enterotoxinas pode ser obtida durante a produção,, não curando o soro de leite no fim do tratamento pelo processo de Chedar, evi tando a compressão ã temperatura ambiente e a temperaturas elevadas e minimizando o tempo de compressão do soro de leite (Ibrahim,"“et al., "Inhibition of Growth os Staphylococcus aureus and Enterotoxin-A Production in Cheddar Cheese Produced with Starter Failure", Journal of Food Protection, Vol. 44, nQ. 3, p. 189-193, March, 1981). Os autores referem também que a armazena gem de queijo curado a 11QC parece ser um risco potencial devido ao aumento significativo em £3. aureus e concentração de ente rotoxinas-. Surpreendentemente, os autores referem que o número de £3. aureus diminui sem haver variação na concentração de ent£ rotoxinas em queijo não curado a 11QC.

Num outro estudo foi referido por J. L. Smith, Μ. M. Bencivengo and C. A. Kunsch que o crescimento ante rior de Staphylococos aureus 196E em glicerol ou maltose origina células com capacidade reprimida para produzir a enterotoxi-na A de estafilococos (J. L. Smith et al., "Enterotoxin A Synthe sis in Staphylococcus aureus: Inhibition by Glicerol and Maltose"; Journal of general Microbiology, Vol. 132, páginas 3375--3380, 1986). Foi também referido o cloranfenicol como inibindo totalmente a produção de enterotoxinas B de estafilococos (Ro-bert A. Altenbern, "Protease Inhibitors Supress Enterotoxin B Formation by Stapylococcus aureus", FEMS Microbiology Letters, Vol. 3 páginas 199-202, 1978). A produção de TSST-1 por £. aureus tem 9

sido predominantemente associada com o síndroma de choque tóxico mentrual que por seu turno tem sido relacionado com a utilização de tampões. Inesperadamente foi identificado um grupo de compostos que são eficazes para reduzir essencialmente a produção da toxina de síndroma de choque tóxico-1 por S. aureus in vitro e in vivo. Estes compostos e processos e sua utilização em produtos absorventes estão descritos nos pedidos de patentes Norte Americanos co-pendentes série nõ. 343965 publicado em 27 de Abril de 1989 e série ns. 316742 publicado em 27 de Abril de 1990.

Contudo, apesar da eficácia dos compostos na inibição da produção de toxinas TSST-1 não existem bases para prever se tais compostos são eficazes quanto ã produção de SEA, SEB e SEC devido ãs diferenças estruturais e químicas entre a toxina TSST-1 e outras enterotoxinas de estafilococos.

Sumário da Invenção

Verificou-se, inesperadamente, que um produto absorvente contendo um composto seleccionado do grupo constituído por: a) um monoéster de álcool alifático poli-hídrico e um ácido gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono e em que o re ferido monoéster possui pelo menos um grupo hidroxilo associado com o seu radical álcool alifático; b) diésteres de um álcool alifático poli-hídrico e um ácido gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono e em que o re ferido diéster possui pelo menos um grupo hidroxilo associa do com o seu radical álcool alifático; e c) misturas dos referidos monoésteres e diésteres reduzem a quantidade de enterotoxinas A, B, Ce TSST-1 com enterotoxi^ na A produzida in vitro quando o referido produto absorvente é exposto ã bactéria Staphylococcus aureus. A porção ácido gordo dos monoésteres e diésteres anteriormente referidos pode ser derivada de ácido ca prílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico e esteárico, que são ácidos gordos saturados cujos comprimentos de cadeia são respectivamente Cg, C1Q, C12, C14, C16 e Clg. A porção ácido 10

gordo dos monoésteres e diésteres anteriormente referidos pode ser derivada de ácidos gordos insaturados possuindo comprimentos de cadeia de carbono variando também entre Cg e C^g, sendo um exemplo de um tal ácido gordo saturado ácido oleíco. O ácido gordo preferido para utilização na prática da presente invenção é o ácido láurico, um ácido gordo saturado cuja fórmula química é CllH23COOH.

Como utilizado nesta memória descritiva e nas reivindicações em apêndice o termo "alifãtico" possui o significado normalmente considerado na química orgânica, isto é, "alifático" refere-se a compostos orgânicos caracterizados por um arranjo de cadeia linear ou ramificada dos átomos de carbono constituintes.

Como utilizado nesta memória descritiva e reivindicações em apêndice, o termo poli-hídrico" refere-se ã presença num composto químico de pelo menos dois grupos hidroxi lo (OH). Assim, um álcool alifático poli-hídrico é um álcool que possui pelo menos 2 grupos hidroxilo e no qual a estrutura de carbono é linear ou ramificada.

Os alcoõis poli-hídricos adequados para a formação de monoésteres e/ou diésteres para utilização na prã tica da presente invenção são 1,2-etanodiol; 1,2,3-propanotriol (glicerol); 1,3-propanodiol; 1,4-butanodiol; 1,2,4-butanotriol e análogos. O álcool alifãtico poli-hídrico preferido para a formação de monoésteres e diésteres para utilização na prática da presente invenção é 1,2,3-propanotriol (comercialmente chama do glicerol) cuja fórmula é HOC^CH (OH) -CH2OH. É de notar que os ésteres que são adequa dos na presente invenção possuem pelo menos um grupo hidroxilo associado com o seu radical álcool alifático. Assim, ê de notar que o monoéster de 1,2-etanodiol e um dos ácidos gordos atrás referidos podem cvcntualmente utilizar-se na prática da presente invenção uma vez que o referido éster, cuja fórmula geral é

CnH2n+l-C-°-CH2-CH2OH possui pelo menos um grupo hidroxilo (isto é o grupo hidroxilo no lado direito mais afastado da forma estrutural atrás apresen 11

tada) na porção do éster derivada do álcool alifático 1,2-etano diol. Por outro lado, é de notar que o diéster de 1,2-etanodiol e o diéster dos ácidos gordos anteriormente referidos não se po dem utilizar na prática da presente invenção uma vez que o refe rido éster, cuja fórmula geral ê copiar C H- -C-0-CH,-CH,0-C-C .. n 2n+l λ 2 2 ^n 2n+l

^ O O não possui pelo menos um grupo hidroxilo na porção do éster derivada do 1,2-etanodiol.

Um monoéster glicerol e um dos ácidos gordos referidos podem eventualmente utilizar-se na prática da presente invenção uma vez que o éster possui 2 grupos hidroxilo associados que são derivados do glicerol. O diéster de glicerol e um dos ácidos gordos referidos podem também utilizar-se uma vez que o éster possui um grupo hidroxilo associado que ê derivado do glicerol de álcool alifático. Na verdade, como se verá adiante, verificou-se que misturas de mono-laureato de gliceri-lo e di-laureato de glicerol são úteis na prática da presente invenção. Finalmente, ê de notar que o triéster de glicerol e um dos ácidos gordos referidos não podem ser utilizados na prática da presente invenção uma vez que o éster não possui pe'lo menos um grupo hidroxilo na sua porção que é derivada do álcool alifático, isto é, glicerol.

Os ésteres preferidos para utilização na prática da presente invenção são mono-laureato de glicerilo, di-laureato de glicerilo e suas misturas.

Outros ésteres preferidos para utilização de acordo com esta invenção incluem derivados mono-laureato de alcanóis Cg, tal como laureato de 3-hidroxi-l-propilo. Os de rivados de di-laureato de alcanóis Cg tal como 1,2-dilaureato de glicerol são também considerados como reduzindo a quantidade de enterotoxinas A, B, Ce TSST-1 com enterotoxina A produzida. Os derivados de etileno-glicol tal como mono-laureato de etile-no glicol assim como laureatos de polietileno glicol, por exemplo, mono-laureato de di-etileno glicol e mono-laureato de tri--etileno glicol são também considerados como sendo activos. Determinados polímeros são também considerados como possuindo acti 12

vidade redutora de toxinas, por exemplo, mono-laureato de poli-etileno glicol (PM 200), mono-laureato de polietileno glicol (PM 400), mono-laureato de polietileno glicol (PM 10000) , e lau reatos de propileno glicol tal como mono-laureato de polipropi-leno glicol.

De acordo com esta invenção, o produto absorvente contém uma quantidade do éster anteriormente descrito que é eficaz para inibir a formação de enterotoxinas A, B, C e TSST-1 com a enterotoxina A quando o referido produto é expos^ to a S. aureus. Por exemplo, verificou-se que quantidades efica zes eram aproximadamente 0,1% e superiores do composto monopoli^ éster especificado (ou suas misturas), com base no peso do mate rial absorvente que constitui o produto absorvente. O ingrediente activo contém, de preferência, pelo menos 90% em peso de mono-laureato de glicerilo. Mais preferivelmente, o ingrediente activo contém pelo menos 9% em peso de mono-laureato de glicerilo. Ainda mais preferivelmen te, o ingrediente activo é essencialmente composto totalmente de mono-laureato de glicerilo.

Podem ser verificadas algumas semelhanças entre as toxinas. A exotoxina pirogénica de estreptococos A (SPEA) está mais relacionada com a enterotoxina de Estafiloco cos. A SPEA possui um anel de cisteína de 9 aminoácidos semelhante à da enterotoxina A de estafilococos (SEA) e é também co difiçada por um fago de conversão. Contudo, a SPEA compartilha uma semelhança de sequência de aminoácidos superior com a enterotoxina B de Estafilococos do que com SEA. Estudos imunolõgi-cos mostraram que as proteínas e anti-soro das enterotoxinas são reactivas por reticulação (Iandolo, 1989). Estas semelhanças entre enterotoxinas A e B de Estafilococos e a exotoxina A de estreptococos na estrutura e reactividade levam à hipótese que a demonstração de um eleito, tal como redução xias enterotoxinas A e B produzidas por Staphylococcus pode ser transportada para um efeito semelhante na exotoxina de estreptococos. VerifjL cou-se que o mono-laureato de glicerol é eficaz na. redução da produção de SPEA e SPEB in vitro utilizando o método do saco tampão.

Como aqui utilizado, o termo "material 13

absorvente" inclui fibras naturais ou sintéticas, películas, e£ pumas, polpa de madeira, musgo de turfa, polímeros superabsor-ventes e análogos que são capazes, inerentemente ou devido â forma como eles estão arranjados, de absorverem líquidos tais como água, urina, fluídos menstruais, sangue, exudados de feridas e análogos.

Descrição das formas de realizagão preferidas

No Exemplo 1 que se segue, esta invenção é descrita com pormenor em associação com fibras absorventes e uma quantidade de monolaureato de glicerilo que é eficaz para inibir a produção de enterotoxinas A, B, C ou uma combinação de TSST-1 e A produzidas pela bactéria S. aureus quando a referida bactéria ê colocada em contacto com fibras de algodão tais como as utilizadas em produtos catameniais tais como tampões. É de notar que os princípios desta invenção se aplicam também a outros tipos de fibras absorventes tais como produtos absorventes para revestimento de feridas, fraldas descartáveis, pensos higiénicos e outros tipos de tampões.,tais como os concebidos para utilização médica, cirúrgica, dentária e/ou nasal.

Obtiveram-se fibras de algodão de Barn-hardt Mànufacturing Company of Charlotte, Carolina do Norte. As fibras eram 100% de algodão, de tal forma que as fibras eram essencialmente isentas de todos os acabamentos e aditivos tais como agentes tensio-activos e análogos comummente utilizados na produção comercial. Colocaram-se as fibras de algodão num tamque e aqueceram-se com água a uma temperatura compreendida aproxima-damente entre 1905 e 2005 F (89 e 94°C) altura em que se adicionou mono-laureato de glicerilo e oleato de sódio (proporção de concentração 4:1) ã água para formar uma emulsão no tanque. Adicionaram-se concentrações variáveis de mono-laureato de glicerilo ãs fibras, de tal maneira que cada uma da série de fibras con tidas nas emulsões possuíam 0,22%; 0,78% 1,12% e 1,89% de mono--laureato de glicerilo, em peso. Fechou-se o tanque e pressuzi-rou-se a 10 libras (4,5 kg). O sistema decorreu em ciclos 30 minutos. Depois de se completar, centrifugaram-se as fibras húmidas de algodão dur...nte 5 minutos e secaram-se as fibras num for- 14

no a 150° F com um tempo de residência de 6,5 minutos e subsequentemente cardaram-se utilizando equipamento de cardar comercialmente disponível numa trama fibrosa pesando aproximadamente 33,6 g/m2.

Obteve-se uma amostra de mono-laureato de glicerilo disponível sob a marca registada "Monomuls 90 1-12" de Henkel Corporation da Alemanha e verificou-se que continha 96% em peso de mono-laureato de glicerilo. Não se detectou qua_l quer di-laureato de glicerilo. O mono-laureato de glicerilo é um composto GRAS listado pela FDA para utilização como um emul-sionante alimentar. Este material é sugerido para utilização em produtos anti-cárie, insecticidas, preparações cosméticas e com posições alimentares.

Os exemplos seguintes são ilustrativos dos efeitos dos produtos absorventes desta invenção na produção de enterotoxinas A, B, Ce TSST-1 com enterotoxina A. Naturalmente, estes exemplos ilustram meramente os produtos da invenção sem limitarem o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Pesaram-se em quantidades de 2,38 gramas, em duplicado, fibras de algodão uniformemente revestidas que tinham sido cardadas contendo, respectivamente, 0,22; 0,78; 1,12 e 1,89% p/p do mono-laureato de glicerilo anteriormente re ferido com base no peso da fibra. Ensaiaram-se depois as fibras tratadas com mono-laureato de glicerilo de acordo com um Tampon Sac Method referido por Reiser et al. no Journal Of Clinicai Mi-crobiology Vol. 25, Agosto de 1987, páginas 1450-1452, cuja des crição é aqui incorporada como referência. utilizou-se a staphylococcus aureus estirpe FRI-100, uma produtora conhecida de enterotoxinas A de es» tafilococos como organismo de ensaio neste exemplo. A estirpe FRI-100 foi originada como vun isolado alimentar do Food Research Institute em Madison, WI, A estirpe FRI-100 obteve-se de Dr. Pat Schievert, Dept. of Microbiology of the University of Minnesota Medicai School, Minneapolis, MN. Uma segunda estirpe de £5. aureus 15

obtida de Dr. Schievert, designada Mn Hoch, foi identificada co mo uma produtora apenas de enterotoxina B. Esta estirpe foi iso lada de um caso não menstrual de síndroma de choque tóxico. Uma terceira estirpe de S. aureus, proporcionada por Dr. Schievert como uma produtora de enterotoxina C designada Mn Don foi também isolada de um caso menstrual de síndroma de choque tóxico. Uma quarta estirpe de S. aureus proporcionada por Dr. Schievert produz TSST-1 e enterotoxina A designada Mn8. Utilizaram-se como controlos nos ensaios isolados de controlo de S. aureus que não produzem qualquer enterotoxina.

Preparam-se separadamente suspensões de S>. aureus por mistura completa de um (1) miligrama da £. aureus leofilizada com um (1,0) mililitro de caldo de infusão de tecido de coração e cérebro (BHI) (obtido de Difco laboratories, De troit, Mechigan) e transferiu-se a referida mistura para um tubo de ensaio contendo cinco (5) mililitros do caldo BHI. Misturaram-se intensamente as suspensões, de novo, e incubaram-se du rante 24 horas a 379 C antes da utilização.

Colocaram-se 100 mililitros de agar de infusão de tecido coração e cérebro (BHI) também obtido de Dif-co Laboratories em Detroit, Michigan, U.S.A.) em cada um dos 10 tubos de cultura de 3,8 cm x 20 cm. Fizeram-se sacos de diálise de celulose e esterilizaram-se da forma referida por Reiser et al. Inocularam-se os sacos de celulose estéreis com a suspensão de £. aureus anteriormente referida numa quantidade suficiente para proporcionar no início do ensaio uma concentração de 1,9 x

Q 10 CFU/ml da bactéria Staphylococcus aureus.

Inseriu-se um feixe de fibras de algodão tratado com mono-laureato de glicerilo pesando 2,38 g num saco de diálise estéril contendo a bactéria £. aureus e depois inseriu-se cada um dos sacos num tubo de cultura contendo agar BHI. Utilizaram-se dois controlos cada um em duplicado. Num eon trolo (chamado o controlo de inoculo) colocou-se um saco de diá lise inoculado (sem fibras lã dentro) em cada um dos dois tubos de cultura contendo o agar BHI. No segundo controlo colocaram--se dois feixes não tratados pesando 2,39 g cada (isto é fibras de algodão sem acabamento e exactamente semelhantes ãs fibras de ensaio mas não tratadas com mono-laureato de glicerilo) em 16

tra

Concentração final de í5. aureus (Log-^Q CFU/ml)

Concentração final de S_. auçeus (x 10d CFU/ml) de diãlise que por seu turno se colocaram em tubos de cul contendo agar BHI. Assim, utilizaram-se neste ensaio doze de cultura, contendo quatro os controlos anteriormente r£ os (dois com fibra de algodão tratada; dois sem fibra) e ndo os outros as concentrações crescentes anteriormente re as de mono-laureato de glicerilo compreendidas entre 0,22 9% p/p em fibras de algodão em duplicado. A concentração de células viáveis de S. s estirpe FRI-100 e enterotoxina A no início do ensaio (0 f) e depois de incubação durante 24 horas a 37QC apresenta-o Quadro I quadro 1 O DE FIBRAS DE ALGODÃO TRATADAS COM MONOLAUREATO DE GLICE-NA FORMAÇÃO DE ENTEROTOXINA-A POR Ξ CRESCIMENTO DE STAPHY-ÍCUS AUREUS FRI-100

Quantidade j final i

Enterotoxina A, 1 b,c (ug) 1

Eibra lirolo) 210 10.32 2.50 r não tratada frrolo) 480 10.68 3.48

Fibr E-ι tratada |l de MLG) tratada % de MLG) tratada £% de MLG) tratada )% de MLG) 18 2.0 12.8 4.0 9.25 8.30 9.10 8.60 0.029 0.075 0.052 0.005

I JQ de células viáveis de S^. aureus expressas como lOg de ba se 10. r

Eomo determinado pelo método EuISA referido por Reiser et al. in Applied and Environmental Microbiology, Dezembro de 17

1982, páginas 1349-1355. c = Determinação média de amostras em duplicado

Os dados do Quadro I mostram que o mono -laureato de glicerilo possui um impacto significativo na produ ção de enterotoxina A comparável ao seu efeito na produção de TSST-1. 0 número total de células reflecte apenas uma redução logarítmica de 1,0-2,0 no número de células de S. aureus.

Os dados no Quadro I mostram que quando S. aureus estirpe FRI-100, que produz a enterotoxina A, é expo.s ta a fibras revestidas com mono-laureto de glicerilo (0,22% p/p) existe uma redução de 99% na formação de enterotoxina A. Com fi^ bras revestidas com 0,78% p/p de mono-laureato de glicerilo observa-se uma redução de 98%. Para concentrações mais elevadas de mono-laureato de glicerilo, tais como 1,12% e 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo observam-se reduções de 99% na forma ção de enterotoxina A. No fim do período de incubação (24 horas) , o logaritmo da concentração de células S. aureus na presença de fibras de algodão de controlo era de 10,68; o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença de fibras contendo 0,22% de mono-laureato de glicerilo era de 9,25 (13% menos) ; o logaritmo da concentração de células de £3. aureus na presença de fibras de algodão contendo 0,78% de mono-laureato de glicerilo era de 8,30 (22% menos); o logaritmo da concentração de células de S^. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,12% p/p de mono-laureato de glicerilo era de 9,10 (15% menos); e o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo era de 8,60 (19% menos). Assim, embora a quantidade de toxina produzida pelas células de £. aureus fo£5 se quase inteiramente eliminada, as fibras revestidas com mono--laureato de glicerilo não reduziram essencialmente o número de células viáveis de S. aureus.

Além disso, pode notar-se um efeito do-se-resposta com mono-laureato de glicerilo relativamente â quan tidade de toxina produzida no qual quanto maior o conteúdo de mono-laureato de glicerilo menor a quantidade de toxina produzi^ da. Esta mesma tendência pode ser verificada neste íexemplo relativamente ao número de células viáveis. 18 EXEMPLO 2

Efectuou-se uma segunda experiência para avaliar o efeito do mono-laureato de glicerilo na produção de enterotoxina B por S. aureus estirpe Mn Hoch obtida -de um ca so de síndroma de choque tóxico não menstrual. Transferiram-se os microrganismos, inocularam-se e avaliaram-se utilizando o procedimento experimental descrito e apresentado no Exemplo 1. Pesaram-se em quantidades de 2,38 g fibras de algodão não trata das, fibras de algodão tratadas com 0,22%; 0,78%; 1,12% e 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo e inseriram-se em sacos de diálise préviamente inoculados com £3. aureus estirpe Mn Hoch e ensaiaram-se como descrito no Exemplo 1. Ensaiaram-se depois em duplicado as fibras de algodão tratadas, as fibras de algodão não tratadas de controlo e os controlos de inoculo duplicado co mo descrito no Exemplo 1. Os resultados do ensaio apresentam-se no Quadro 2 QUADRO 2 EFEITO DE MONOLAUREATO DE GLICERILO NA PRODUÇÃO DE ENTEROTOXINA B POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS Mn Hoch

Amostra Concentração final de S. Concentração final de S. Quantidade final aureus aureus Enterotoxina (x 108 CFU/ml) (Log^Q CFU/ml) A, b,c (ug) Sem fibra (controlo) 7.20 8.85 41.04 Fibra não tratada (controlo) 16.21 9.21 117.46 Fibra tratada (0,22% de MLG) 2.39 8.38 5.77 Fibra tratada (0,78% de MLG) 10.00 9.00 2.17 Fibra tratada (1,12% de MLG) 0.81 7.91 0.93 Fibra tratada (1,89% de MLG) 0.48 7.69 0.45 a = NS de células viáveis de í>. aureus expressas como 10 g de base 10. 19

b = Como determinado pelo método ELISA referido por Reiser et al. in Applied and Environmental Microbiology, Dezembro de 1982, páginas 1349-1355. c = Determinação média de amostras em duplicado.

Os dados no Quadro 2 mostram que a S. aureus Mn Hoch produziu significativamente menos enterotoxina B (95% menos do que o controlo não tratado) na presença de fibras de algodão revestidas com mono-laureato de glicerilo (0,22% p/p). As fibras de algodão tratadas com mono-laureato de glicerilo a concentrações de 0,78% p/p originaram uma redução de 98% na produção de enterotoxina B ao passo que se verificaram reduções superiores a 99% com fibras revestidas com 1,12 e 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo. No fim do período de incubação (24 horas), o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença das fibras de algodão de controlo era de 9,21; o logaritmo da concentração de células £3. aureus na presença de fibras contendo 0,22% de mono-laureato de glicerilo era de 8,38 (9% menos); o logaritmo da concentração de células S. aureus na presença de fibras de algodão contendo 0,78% de mo no-laureato de glicerilo era de 9,00 (2% menos); o logaritmo da concentração de células de £. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,12% de mono-laureato de glicerilo era de 7,91 (14% menos); o logaritmo da concentração de células S. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,89% p/p de mono-lau reato de glicerilo era 7,69 (16% menos). EXEMPLO 3

Efectuou-se uma terceira experiência pa ra avaliar o efeito do mono-laureato de glicerilo na produção de enterotoxina C por S. aureus MN Don que era um produtor apenas de enterotoxina C obtido de um indíviduo com síndroma de choque tóxico não menstrual. Transferiu-se o microrganismo, ino culou-se e avaliou-se utilizando o procedimento experimental descrito e apresentado no Exemplo 1. Pesaram-se em quantidades \ de 2,38 g fibras de algodão não tratadas, fibras de algodão tra * tadas com 0,22%; 0,78%; 1,12% e 1,89% p/p e inseriram-se em sa- 20

cos de diãlise inoculados com aureus estirpe Mn Don e ensaia ram-se como descrito no Exemplo 1. As fibras de algodão revest^ das, os controlos de fibra de algodão não ttratados, e os controlos de inoculo duplicado foram depois todos ensaiados em duplicado como descrito no Exemplo 1. Os resultados do ensaio apresentam-se no Quadro 3 QUADRO 3 EFEITO DE MONOLAUREATO DE GLICERILO NA PRODUÇÃO DE ENTEROTOXINA C POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS Mn DOn

Amostra Concentração final de £5. aureus Concentração final de S. aureus Quantidade final Enterotoxina (x 108 CFU/ml) (LOg10 CFU/ml) A,b,c (ug) Sem fibra (controlo) 69.18 9.84 1.55 Fibra não tratada (controlo) 17.78 9.25 32.27 Fibra tratada (0,22% de MLG) 3.80 8.58 1.52 Fibra tratada (0,78% de MLG) 10.47 9.02 0.16 Fibra tratada (1,12% de MLG) 4.16 8.62 0.02 Fibra tratada (1,89% de MLG) 0.33 7.52 0.14 a = NQ de células viáveis de £5, aureus expressas como 10 g de base 10. b = Como determinado pelo método ELISA referido por Reiser et al. in Applied ans Environmental Microbiology, Dezembro de 1982, páginas 1349-1355. c = Determinação média de amostras em duplicado.

Os dados apresentados no Quadro 3 mostram que a £>. aureus Mn Don produziu significativamente menos enterotoxina C (95% menos do que o controlo não tratado) na pre sença de fibras de algodão revestidas com mono-laureato de gli- 21 ΓτπτΛ-

cerilo (0,22% p/p)· As fibras de algodão tratadas cora mono-lau-reato de glicerilo em concentrações de 0,78% p/p e superiores originaram reduções de 99% na enterotoxina C formada relativamente à gerada pelo controlo não tratado. 0 logaritmo das concentrações de células S. aureus Mn Don na presença de fibras de algodão de controlo era de 9,25; o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença de fibras contendo 0,22% de mo no-laureato de glicerilo era de 8,58 (7% menos); o logaritmo da concentração de células S. aureus na presença de fibras de algo dão contendo 0,78% de mono-laureato de glicerilo era de 9,02 (2% menos); o logaritmo da concentração de células de £. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,12% de mono-laureato de glicerilo era de 8,62 (6% menos); e o logaritmo da concen tração de células de S. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo era de 7,52 (19% menos). EXEMPLO 4

Efectuou-se uma quarta experiência para λ avaliar o efeito do monolaureato de glicerilo na TSST-1 e enterotoxina A produzida em conjunto por S. aureus Mn8, que é uma produtora de TSST-1 conhecida que produz também enterotoxina A em menores quantidades. Obteve-se um isolado de S. aureus Mn8 a partir do estudo de três situações de um indivíduo com síndroma de choque tóxico. Transferiu-se o microrganismo, inoculou-se e avaliou-se utilizando o procedimento experimental descrito e apresentado no Exemplo 1. Pesaram-se em quantidades de 2,38 g fibras de algodão não tratadas, tratadas com 0,22%; 0,78%; 1,12 % e 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo e inseriram-se em sacos de diálise inoculados com S. aureus estirpe Mn8 e ensaia-ram-se como descrito no Exemplo 1. As fibras de algodão revestidas, os controlos de fibras de algodão não tratadas e os controlos de inóculos duplicados foram depois ensaiados em duplicado como descrito no Exemplo 1. Os resultados dos ensaios apresentam -se no Quadro 4. 22

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23

a = NQ. de células viáveis de S. aureus expressas como 10 g de base 10. b = Como determinado pelo método ELISA referido por Reiser et al. in Applied and Environmental Microbiology, Dezembro de 1982, páginas 1349-1355 c = Determinação média de amostras em duplicado.

Os dados do Quadro 4 mostram que a Í5. aureus Mn8 produzia significativamente menos TSST-1 e enteroto-xina A na presença de fibras tratadas com mono-laureato de gli-cerilo. Depois da exposição a fibras tratadas com 0,2% p/p de mono-laureato de glicerilo, a £. aureus Mn8 produziu 7,89 ug de TSST-1 que era 76% menos do que o verificado com o controlo de fibras não tratadas. Estas mesmas fibras tratadas (0,22% p/p de mono-laureato de glicerilo) originaram uma redução de 90% na formação de enterotoxina A relativamente ao observado no contro lo. As fibras de algodão tratadas com 0,78% p/p de mono-laureato de glicerilo originou uma redução de 97% na formação de TSST -1 com uma redução de 95% na formação de enterotoxina A. A fibra contendo 1,12% e 1,89% p/p de mono-laureato de glicerilo originou uma redução de 99% na formação de TSST-1 e enterotoxina A.

Ao fim do período de incubação (24 horas) o logaritmo da concen tração das células de S. aureus na presença de fibras de algodão de controlo era de 8,68; o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença de fibras contendo 0,22% p/p de mono--laureato de glicerilo era de 8,16 (6% menos); o logaritmo da concentração de células de S. aureus na presença de fibras de algodão contendo 0,78% de mono-laureato de glicerilo era de 7,79 (10% menos) ; o logaritmo da concentração de células de £3. aureus na presença de fibras de algodão contendo 1,12% p/p de mono-lau reato de glicerilo era de 8,56 (1% menos); e o logaritmo da con centração de células de £>. aureus na presença de fibras de algo dão contendo 1,89% p/p de monolaureato de glicerilo era 8,62 (1% menos).

Como se pode verificar dos Exemplos 1 a 4 anteriores, as fibras de algodão foram tratadas com níveis variáveis de mono-laureato de glicerilo, uma mistura comercialmente disponível constituída por 96% em peso de mono-laureato de 24

glicerilo e sem qualquer di-laureato de glicerilo. Os dados apresentados nas Tabelas 1 a 4 mostram que, dependendo dos níveis de mono-laureato de glicerilo nas fibras, a bactéria £3. aureus pròduz significativamente menos toxinas, por outras pala vras, são inibidas de produzirem quantidades significativas de toxinas quando comparadas com a quantidade de toxinas produzidas sob as mesmas condições experimentais pela bactéria S. aureus na presença de fibras de controlo sem mono-laureato de qliceri-lo. A eficácia do mono-laureato de glicerilo relativamente ã produção de toxina não depende do tipo de substrato de fibra ao qual se aplicou. Foi mostrado anteriormen te que a lauricidina e análogos relacionados são eficazes na re dução da produção de toxina TSST-1 em produtos absorventes quan do utilizados em vários substratos como mostrado nos pedidos de patente dos Estados Unidos co-pendentes séries nQ. 343965 publi^ cado em 27 de Abril de 1989 e série nQ 316742 publicada em 27 de Abril de 1990 que são aqui incorporados como referência. Além disso, embora nos exemplos apresentados anteriormente os produtos contenham fibras possuindo um revestimento de aproximadamen-te 0,22% p/p de mono-laureato de glicerilo, o composto activo de ve ser eficaz para evitar a formação de tóxina a concentrações inferiores, por exemplo, a concentrações aproximadamente inferiores a 0,1% p/p de composto activo. EXEMPLO 5

Foi efectuada uma experiência por Dr. Patrick Schlievert da Universidade de Minnesota para avaliar o efeito de tampões tratados com mono-laureato de glicerilo em exo toxinas pirogénicas de estreptococos tipos A e B. O microrganismo utilizado nesta experiência foi estreptococos do Grupo A estirpe C203 que produz exotoxinas pirogénicas A e B de estreptoco cos. Nesta experiência utilizou-se o Tampon Sac Method de Reiser et al. para determinar o efeito do tampão tratado na produção de toxina. Inocularam-se tubos de diãlise com colónias de 5 x 10^ unidades formadoras de colónias (CFU) da bactéria num mililitro 25

de volume (Brain Heart Infusion Broth) com ou sem tampões vaginais marca o.b.. Os tampões utilizados pesavam 3 g e continham 1 mililitro de monolaureato de glicerilo (1,0 p/p) ou os tampões não continham mono-laureato de glicerilo. Submergiram-se os tubos de diãlise inoculados em 75 ml de agar de infusão de tecido de coração e cérebro e incubaram-se durante 24 horas a 37QC e 7% de C^. Diluiram-se depois as amostras quatro vezes relativamente à quantidade do fluído absorvido durante o período de 24 horas e determinaram-se a CFU e as concentrações de to xina. Utilizaram-se contadores de placa para determinar a concentração de CFU e análises de mancha Western para medir a tõx_i na. 0 limite inferior de detecção da tóxina foi de 0,003 ug. Os dados obtidos estão apresentados no Quadro 5.

Os resultados demonstram que a produção de tóxina foi muito baixa na presença de um tampão não tratado e foi não detectãvel na presença de tampões tratados. A viabil_i dade das células foi também significativamente afectada. Determinou-se que a presença de oxigénio absorvido pelas fibras do tampão, assim como a exposição do microrganismo ao oxigénio at-modférico podem ter contribuído para os níveis baixos da produção de tóxina e para a reduzida viabilidade de células no saco de diãlise em que os tampões foram colocados. Decidiu-se propor cionar um ambiente anearóbio para o organismo nos ensaios subse quentes. QUADRO 5

EFEITO DE TAMPÕES TRATADOS COM MONOLAUREATO DE GLICERILO NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE TOXINAS POR ESTREPTOCOCOS

Tipo SPE (gq/ml)

Amostra UFCa A B Controlo (sem tampão) 6.5+2.7x108 12.0 6.0 ob 7.5+4.0x106 0.12 0.06 ob + 1% de MLG 40 N.D.b N.D aUFC/ml de fluido absorvido no saco. Na presença de um tampão foi absorvido uma média de 2,0 ml. Na ausência observaram-se me 26 nos que 0,25 ml. N.D. não detectado. EXEMPLO 6

Nesta experiência efectuada por Dr. Pa-trick Schlievert adicionou-se mono-laureato de glicerilo em con centrações variáveis a 50 ml de caldo de infusão de tecido de coração e cérebro. Estas soluções foram depois inoculadas com 1,0 x 10^ CFU de estreptococos do grupo A C203 ou Í3. aureus Mn8 um produtor conhecido de TSST-1. Incubaram-se amostras contendo C203 a 370C, durante 12 horas, sem agitação de forma a reduzir a exposição ao oxigénio na presença de 7% de CC^. Incubaram-se da mesma forma amostras contendo Mn8 mas sem agitação (a uma ve locidade de 200RPM) e num incubador padrão. Os resultados desta experiência apresentam-se no Quadro 6. - 97 -

QUADRO 6

EFEITO DO MONOLAUREATO DE GLICERILO NA VIABILIDADE DAS CÉLULAS E PRODUÇÃO DE TOXINAS POR STREPTOCOCCUS C203 E STAPHYLOCOCCUS AUREUS Mn8 C203 MN8

Tipo SPE Amostra MLG mg/100 UFC A B tsst-; 0 3.1 X 108 6.0 3.0 0.05 3.5 X 108 6.0 3.0 0.1 3.2 X 108 1.5 0.75 0.25 3.3 X 108 N.D. N.D. 0.5 3.2 X 108 N.D. N.D. 0,75 2.0 X 108 N.D. N.D. 1.0 4.0 X 107 N.D. N.D. 1.25 3.5 X lo6 N.D. N.D. 1.50 0 N.D. N.D. 1.75 0 N.D. N.D. 2.0 0 N.D. N.D. 5.0 0 N.D. N.D. 10.0 0 N.D. N.D. 0 8.4 X 109 48 0.05 9.0 X io9 48 0.1 9.4 X 109 48 0.25 6.2 X 109 12 0.5 1.8 X 10™ N.D. .75 9.7 X io9 N.D. 1.0 2.1 X 1010 N.D. 1.25 7.0 X 109 N.D. 1.5 1.4 X 10™ N.D. 1.75 1.1 X 1010 N.D. 2.0 4.0 X 105 N.D. 2.25 2.0 X 105 N.D. 2.5 2.3 X 104 N.D. 5.0 2.1 X 104 N.D. 10.0 2.9 X io4 N.D. 28 EXEMPLO 7

Neste exemplo, efectuado por Dr. Patri-ck Schlievert avaliaram-se estirpes de estreptococos do grupo A, expressando individualmente SPEA, SPEB ou SPEC e estirpes dos grupos B, F e G para o efeito do mono-laureato de glicerilo na sua produção de exotoxina. Utilizando o método descrito no Exem pio 6, expuseram-se os organismos a concentrações váriáveis de mono-laureato de glicerilo num caldo de infusão de tecido de co ração e cérebro. Utilizaram-se as estirpes 594, que produz SPEA, estirpe 86-858 que produz SPEB e estirpe T18P que produz toxinas SPEC respectivamente. Mediu-se a produção de toxinas por p£ ríodos específicos de imuno-mancha de Western durante 96 horas. Os resultados desta experiência para determinar o efeito do mono-laureato de glicerilo na produção de toxinas SPEA, SPEB e SPEC apresentam-se no Quadro 7.

Expôs-se também a S^. aureus estirpe Mn8 a mono-laureato de glicerilo. Mediu-se a quantidade de produção de TSST-1 de S. aureus estirpe Mn8. Os resultados destes ensaios apresentam-se no Quadro 8.

Mediram-se a estreptolisinas O e S também produzida pelas estirpes 594, 86-858 e T18P, assim como a he molisina de estreptococos do Grupo B, hemolisina de estreptococos do Grupo F e hemolosina de estreptococos do Grupo G por li-se de 0,1% de eritocitos de carneiro e 0,014% de 2-mercapto-eta nol como um agente redutor formado em 0,75% de agarose em solução tampão de fosfato (PBS) , 4,5 ml/lâmina. O PBS era composto por fosfato de sódio 0,005 Molar, NaCl 0,15 Molar a um pH de 7,0. Utilizou-se a hemólise induzida por 20 ul de cultura isenta de células adicionados a tubos perfurados em lâminas depois de 24 horas como uma medida da produção da hemolisina. Mediu-se a lipase da mesma forma como a hemolisina com excepção que se utilizou 0,1% de tributirina como padrão.

Os resultados de estreptolisina O e S reduzida são também apresentados no Quadro 7. Os resultados das experiências que exploram o efeito do mono-laureato de glicerilo na produção de toxinas pelos estreptococos dos Grupos B, F e G apresentam-se no Quadro 9, 10 e 11, respectivamente. Os dados 29

mostram uma redução nítida nas quantidades de toxina e/ou hemo-lisina produzida pelos estreptococos dos Grupos A, B, F e G na presença de mono-laureato de glicerilo. QUADRO 7

EFEITO DE MONOLAUREATO DE GLICERILO NOS ESTREPTOCOCOS GRUPO A

Bactéria MLG (pg/ml) Log UFC/ml SPE (pg/ml) Redução de HEMOLISE 594(SPEA) 0 8.6 3.2 7.0 2.5 8.5 0.3 4.0 10.0 8.3 0.3 0.0 20.0 6.0 0.0 0.0 86-858(SPEB) 0 8.0 0.8 4.0 2.5 7.7 0.0 2.0 10.0 7.7 0.0 0.0 20.0 5.8 0.0 0.0 T18P(SPEC) 0 7.9 0.4 8.0 2.5 7.9 0.0 8.0 10.0 6.1 0.0 0.0 a Tamanho do inoculuo entre IO"* e 10** UFC/ml b Inclui estreptolisina O e S medida em mm de diâmetro de lises 30

X \o σ> tn as I—I 0

IQ) O (Τ' O •J QUADRO 8. Efeito de MLG em Staphylococcus aureus- MN8 X oo Hf cn aS r-H 0 r-H «a; υcno (3 B ca to M íd qq 1- O 0 xi & Hf rH ε γη vcp <D o EH i—1 t7> ε 0 Eh m X! 00

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3 31

QUADRO 9 Efeito de MLG em estreptococos do Grupo B MLG (pg/ml) 8 hr Tempo 24 hr Log células/ml Hemolisina Log células/ml Hemolisina 0 8.7 2 8.5 2 2.5 8.1 0 8.4 0 10.0 4.0 0 3.0 0 5 Tamanho de inoculo 2,0 x 10 /ml

QUADRO 10 Efeito de MLG em Estreptococos do Grupo F

Tempo MLG _8 hr_24 hr_ (pg/ml) Log células/ml Hemolisina Log células/ml Hemolisina 0 00 7 8.3 7 2.5 8.5 0 00 • u> 0 10.0 104 0 103 0 5

Tamanho de inoculo 2,0 x 10 /ml

QUADRO 11 Efeito de MJX em Estreptococos do Grupo G

Tempo MLG (pg/ml) 8 hr 24 hr

Log células/ml Hemolisina Log células/ml Hemolisina 0 00 • 10 8 10.0 8 2.5 8.1 5 10.0 6 10.0 104 0 103 0 Tamanho de inoculo 2,0 x 10^/ml - 32 -

EXEMPLO 8

Com esta experiência, efectuada por Dr. Patrick Schlievert foram feitas tentativas para induzir a estir pe de estreptococos C203 e estreptocos estirpe Mn8 que cresceram em placas contendo mono-laureato de glicerilo. A concentração inibidora mínima de mono-laureato de glicerilo para a estir pe C203 era de 1 mg/100 ml em placas de agar quando se colocaram 5 x 10^ CFU. As placas com 2 mg por 100 ml não apresentaram crescimento. A concentração inibidora mínima de mono-laureato de glicerilo para a estirpe Mn8 era de 5 mg/100 ml quando se f_i zeram 7 x 10 CFU. As placas com 7,5 mg por 100 ml não apresentavam crescimento. Esta experiência foi tentada numa média de 2 vezes por semana durante um período de 6 meses. Os dados indicam que nenhum mutante foi susceptível de crescer na presença de níveis previamente inibidores de mono-laureato de glicerilo.

Exemplo 9 (Exemplo de previsão)

Nesta experiência, utilizaram-se os métodos dos Exemplos 5 a 7 para ensaiar a eficácia de mono-laurea to de glicerilo e compostos análogos relacionados. Contudo, os tampões foram submetidos a uma câmara anaeróbica para retirar todo o oxigénio absorvido pelas fibras. Os tampões com e sem mo no-laureato de glicerilo assim como as amostras de controlo foram inseridos em sacos de diálise sob condições anearóbicas e incubaram-se numa câmara anearõbica e/ou câmara de oxigénio reduzido de forma a minimizar a exposição dos organismos estrepto cocos ao oxigénio atmosférico e/ou absorvido. Avaliaram-se em vários intervalos os níveis de toxina produzidos pelos microrga nismos. É de esperar, com base nos outros exemplos que o mono--laureato de glicerilo e outros compostos análogos sejam eficazes na inibição da produção dee exotoxinas pirogénicas de estreptococos e hemolisinas ou estreptococos dos Grupos A, B, Fe G sem inibição essencial do crescimento das células. 33

Claims

Patente N° 99 382 y R E IVINDICAÇOES . - lâ - Processo para a produção de um produto absorvente caracterizado por compreender incorporar-se um composto seleccionado do grupo constituído por: a) monoésteres de vim álcool alifático poli-hldrico e um áci^ do gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono e em que o referido mono-éster possui pelo menos um grupo hi-droxilo associado com o seu radical álcool alifático; b) diésteres de um álcool alifático poli-hídrico e um ácido gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono e em que o referido diéster possui pelo menos um grupo hidroxilo associado com o seu radical álcool alifático; e c) misturas dos referidos monoésteres e diésteres, estando o referido composto presente numa quantidade que é eficaz para inibir a produção de Enterotoxina A, Enterotoxi^ na B ou Enterotoxina C pela bactéria Staphylococcus aureus quando o produto é exposto à referida bactéria. - 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto estar presente numa quan tidade de pelo menos 0,01% com base no peso do referido mate rial absorvente.

3â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto estar presente numa quantidade de pelo menos 0,5% com base no peso do refe rido material absorvente. - 4§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto estar presente numa quantidade de pelo menos 1,0% com base no peso do refe rido material absorvente. - 5a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ácido gordo ser ácido láurico. — 6 ã — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o álcool poli-hídrico ser glicerol. - 73 - Processo de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizado por o referido composto ser mono-laura-to de glicerilo. - 83 - Processo de acordo com a reivindica-gão 7, caracterizado por o mono-laurato de glicerilo estar presente numa guantidade de pelo menos 0,1% em peso com base no peso do material absorvente. - ?§ - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido mono-laurato de gliceri^ lo estar presente numa quantidade de pelo menos 0,5% em peso com base no peso do material absorvente. - 103 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto incorporar uma mistura de mono-laurato de glicerilo e di-laurato de glicerilo. - 113 - Processo de acordo com a reivindicarão 10, caracterizado por a referida mistura estar presente

numa quantidade de pelo menos 0,1% com base no peso do mate rial absorvente. - 123 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 90% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 133 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 95% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 143 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a mistura estar presente numa quantidade de pelo menos 0,5% com base no peso do material absorvente. - 153 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 90% em peso de mono-laurato de glicerilo. c-TT;; ' .esrassserasraseEií»

- 16§ - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 95% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 17â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto incorporar mono-caprila to de glicerilo. - 18§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto incluir capra-to de glicerilo. - 19§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto incorporar uma mistura de mono-caprllato de glicerilo e caprato de gliceri^ lo. - 20i - Processo de acordo com a reivindica-

ção 1, caracterizado por o referido composto incorporar mono -miristato de glicerilo. - 213 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto incluir mono--palmitato de glicerilo. - 223 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto incorporar mo-no-estearato de glicerilo. - 233 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto incorporar mono-oleato de glicerilo. - 243 - Processo para a preparação de um tam pão catamenial caracterizado por se incorporar um material absorvente e um composto seleccionado do grupo constituído por: a) monoésteres de um álcool alifático poli-hídrico e um ácido gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono em que o referido monoêster possui pelo menos um grupo hi-droxilo associado com o seu radical álcool alifático; b) diésteres de um álcool alifático poli-hídrico e um ácido gordo contendo entre 8 e 18 átomos de carbono e em que o referido diéster possui pelo menos um grupo hidro xilo associado com o seu radical álcool alifático; e c) mistura dos referidos monoésteres e diésteres, estando o composto presente numa quantidade que ê eficaz para inibir a produção de Enterotoxina A, Enterotoxina B ou Enterotoxina C pela bactéria Staphylococcus aureus quan do o referido produto é exposto ã bactéria. - 253 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto estar presente numa quantidade de pelo menos 0,1% com base no peso do referido material absorvente. - 263 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto estar presente numa quantidade de pelo menos 0,5% com base no peso do referido material absorvente.

- 27ã - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto estar presente numa quantidade de pelo menos de 1,0% com base no peso do referi do material absorvente. - 28s - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o ácido gordo ser ácido lãurico. - 29â - ção 24, rol. Processo de acordo com a reivindica-caracterizado por o álcool poli-hídrico ser glice- - 30â - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto ser mono-laurato de glicerilo. - 313 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o mono-laurato de glicerilo estar

presente numa quantidade pelo menos de 0,1% em peso com base no peso do referido material absorvente. - 32§ _ Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o mono-laurato de glicerilo estar presente numa quantidade de pelo menos 0,5% em peso com base no peso do referido material absorvente. - 339 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar uma mistura de mono-laurato de glicerilo e di-laurato de glicerilo. - 349 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a mistura estar presente numa quantidade pelo menos de 0,1% com base no peso do referido material absorvente. - 359 - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 90% em peso do mono-laurato de glicerilo. 363 Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 95% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 373 - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a mistura estar presente numa quantidade pelo menos de 0,5% com base no peso referido material absorvente. - 38ã - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 90% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 393 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a mistura incorporar pelo menos 95% em peso de mono-laurato de glicerilo. - 403 - Processo de acordo com a reivindica-

ção 24, caracterizado por o composto incluir mono-caprilato de glicerilo. - 41â - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar caprato de glicerilo. - 42a - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar uma mistura de mono-caprilato de glicerilo e caprato de glicerilo. - 43a - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar monomirista to de glicerilo. - 44â - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar monopalmita to de glicerilo. - 45® 459 Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar mono-estea-rato de glicerilo. - 469 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto incorporar mono-oleato de glicerilo. Lisboa, 28 de Maio de 1993. 0 AUEMIE OfiCiAL BA Ι’ΚΟΕί.ϋΚΑΒΕ ANBTJSTKIAt

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