PT99232A

PT99232A - Processo de preparacao de compostos de indeno-indolo de composicoes farmaceuticas, e de estabilizacao de compostos susceptiveis de deterioracao oxidadtiva

Info

Publication number: PT99232A
Application number: PT99232A
Authority: PT
Inventors: Malcolm Sainsbury; Howard Shertzer
Original assignee: Univ Bath
Priority date: 1990-10-16
Filing date: 1991-10-15
Publication date: 1992-09-30
Also published as: TNSN91088A1; IE913556A1; HUT67274A; JO1676B1; CA2094024A1; WO1992006956A1; JPH06503067A; MX9101594A; AP9100326A0; CN1061962A; YU166291A; SK34893A3; EP0481708A1; BG97633A; IL99750A0; MA22484A1; AP339A; HU9301104D0; NZ240232A; FI931702A

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do invento 0 presente invento refere-se a novos compostos de indeno-in-dolo, os quais são antioxidantes hidrofóbicos, e altamente eficazes na redução, i.e. na anulação, de radicais livres em lípidos ou bifases lipídicas, terminando assim o processo de peroxidação de lípidos e evitando condições e doenças iniciadas por este processo ou por processos relacionados. 0 invento refere-se também a composições, especialmente composições farmacêuticas, contendo pelo menos um composto do invento, ou um seu sal, especialmente um seu sal terapeuticamente aceitável, como ingrediente activo. Em aspectos adicionais, o invento refere-se a processos para a preparação destes compostos e para a utilização dos compostos ac-tivos em terapia e prevenção médica, assim como em aplicações não médicas. Será especialmente importante, nas aplicações não médicas, a utilização no controlo ou terminação de processos mediados por radicais livres.

Antecedentes do invento

Alguns processos biológicos geram intermediários mais ou menos estáveis que contêm um electrão desemparelhado, o qual tanto pode ser doado, como emparelhado com um electrão adicional da sua vizinhança. Estes intermediários são chamados radicais livres, e podem ser os produtos de várias reacções enzimáticas e não enzimáticas, alguns dos quais são vitais para funções corporais, p. ex., redução de ribonucleósido-difosfatos para a síntese de ADN e produção de prostaglandinas na reacção de prostaglandina-sintase. Esta última é essencial para a resposta inflamatória seguidamente à danificação celular e para várias outras funções. Outras reacções por radicais incluem a reacção da mieloperoxidase em neutrófilos e macrófagos que destroem bactérias e outras partículas invasoras, e o transporte de electrões na cadeia respiratória mitocondrial. A maioria dos organismos contém antioxidantes químicos tais como o a-tocoferol (vitamina E), o ácido ascórbico e radicais diferentes e enzimas de inactivação de peróxido, p. ex., superóxido-dismutase, catalase e glutationa-peroxidase. 73 216 63057 -4-

Têm-se associado, de modo crescente, radicais livres de vários tipos com uma vasta gama de condições e doenças tais como danos isquémicos ou de reperfusão, ateroesclerose, trombose e embolia, condições alérgicas/inflamatórias tais como asma bron-quica, artrite reumatóide, condições relacionadas com a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, e envelhecimento, cataratas, diabetes, neoplasmas e toxicidade de agentes antineoplásticos ou imunossupressores e químicos. Uma possível explicação para estas condições e doenças é que, por razões desconhecidas, os agentes protectores endogenos contra danos por radicais não são suficientemente activos para proteger o tecido contra danos por radicais. A peroxidação lipídica causada pela geração de radicais em excesso pode constituir uma via significativamente prejudicial nas condições e doenças anteriores. A administração de antioxidantes adicionais, que inibem reacções por radicais, p. ex., a peroxidação lipídica, proporcionaria assim uma via de prevenção ou cura das condições e doenças anteriores. O presente invento descreve novos antioxidantes do tipo indeno-indolo que preenchem tanto a necessidade de se acumularem nas membranas, i.e., são suficientemente hidrofóbicos, e eles são potentes inibidores da peroxidação lipídica. Estes novos antioxidantes comparam-se favoravelmente com outros antioxidantes, p. ex., α-tocoferol. Os compostos do presente invento podem ser também utilizados em aplicações não médicas para a estabilização de compostos susceptíveis de sofrer deterioração oxidativa, p. ex., em produtos de tratamento da pele, na conservação de alimentos, em aditivos para alimentos e para a conservação de outros produtos. O presente invento estende-se tanto a um processo de estabilização utilizando os tetra-hidro-indeno-indolos como às composições estabilizadas resultantes.

Arte anterior 0 nosso pedido de patente anterior PCT/GB90/00949, publicado como descrição internacional W090/15800 em 27 de Dezembro de 1990, refere-se a um grupo de tetra-hidro-indeno-indolos que são eficazes como inibidores do processo de peroxidação lipídica e úteis como antioxidantes.

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Descrição do invento

De acordo com o presente invento, proporcionam-se compostos fundidos na posição cis, de fórmula I

na qual R é metoxi ou etoxi, quando R é metoxi, R1 é me ti lo, e R2 e R3 são ambos hidrogénio ou ambos metilo, e quando R é etoxi, R1 é hidrogéniot e R2 e R3 são ambos metilo, e seus enantiómeros e sais.

Verificou-se que os compostos fundidos na posição cis com as estruturas de tetra-hidro-indeno-indolos de fórmula I são altamente eficazes como inibidores do processo de peroxidação lipídica e úteis como antioxidantes. Os compostos de fórmula I podem estar presentes na forma de uma mistura racémica ou na forma de enantiómeros puros ou na forma de suas combinações.

Os compostos do invento são particularmente úteis como antioxidantes em terapia médica.

As estruturas indolo do presente invento possuem a seguinte numeração nos anéis.

cis-4b/5,9b,10-tetra-hidro-indeno[1,2-b]indolo (THII)

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Os tetra-hidro-indeno-indolos possuindo a fórmula I, que estão incluídos no presente invento são os seguintes: cis-4b ,5,9b, 10-tetra-hidro-4b ,6,7,9,9b-pentametil-8-metoxi-inde-no[1,2-b]indolo cis-4b,5,9b,l0-tetra-hidro-8-etoxi-4b,7,9,9b-tetrametilindeno-[1,2-b]indolo cis-4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-metoxi-6,7,9-trimetilindeno[1,2--b]indolo

Preparações farmacêuticas

De acordo com o presente invento, os compostos fundidos na posição cis de fórmula I serão normalmente administrados oralmente, rectalmente, dermicamente ou por injecção, na forma de preparações farmaçêuticas compreendendo o ingrediente activo tanto na forma de base livre como de um sal de adição de ácido, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, p. ex., o hidrocloreto, hi-drobrometo, lactato, acetato, fosfato, sulfato, sulfamato, citrato, tartarato, oxalato e similares, numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. As preparações podem conter um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A forma de dosagem pode ser uma preparação sólida, semi--sólida ou líquida. Usualmente, a substância activa poderá constituir entre 0,1 e 99% em peso da preparação, mais especificamen-te entre 0,5 e 20% em peso para preparações destinadas a injecção e entre 0,2 e 50% em peso para preparações adequadas para administração oral. A administração dérmica poderá normalmente utilizar 0,1-5% em peso do ingrediente activo num veículo adequado.

Para produzir preparações farmacêuticas contendo um composto do invento na forma de unidades de dosagem para aplicação oral, pode-se misturar o composto seleccionado com um excipiente sólido, p. ex., lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos tais como amido de batata, amido de milho ou amilopectina, derivados de celulose, um ligante tal como gelatina ou poli-vinilpirrolido-na, e um lubrificante tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio, polietilenoglicol, ceras, parafina, e similares, e de- -7- 73 216 63057 pois comprimir em comprimidos. Se se pretenderem comprimidos revestidos , podem-se revestir os núcleos preparados como se descreveu anteriormente, com uma solução de açúcar concentrada que pode conter p. ex., goma arábica, gelatina, talco, dióxido de titânio, e similares. Alternativamente, pode-se revestir o comprimido com úm polímero conhecido pelos peritos na arte, dissolvido num solvente orgânico rapidamente volátil ou numa mistura de solventes orgânicos. Podem-se adicionar materiais corantes a estes revestimentos de modo a distinguir rapidamente entre comprimidos contendo diferentes substâncias activas ou diferentes quantidades dos compostos áctivos.

Para a preparação de cápsulas de gelatina mole pode-se misturar a substância activa com, p. ex., um óleo vegetal ou polie-tilenoglicol. As cápsulas de gelatina dura podem conter grânulos da substância activa utilizando os excipientes anteriormente mencionados para os comprimidos, p. ex. lactose, sacarose, sorbi-tol, manitol, amidos (p. ex. amido de batata, amido de milho ou amilopectina), derivados de celulose ou gelatina. Também as formas líquidas ou semi-sólidas da droga podem encher as cápsulas de gelatina dura.

As unidades de dosagem para aplicação rectal podem ser soluções ou suspensões ou podem ser preparadas na forma de supositórios compreendendo a substância activa misturada com uma base gorda neutra, ou de cápsulas rectais de gelatina compreendendo a substância activa misturada com óleo vegetal ou óleo de parafina.

As preparações líquidas para aplicação oral podem estar na forma de xaropes ou suspensões, por exemplo soluções contendo de cerca de 0,2% a cerca de 20% em peso da substância activa descrita no presente invento, sendo o resto açúcar e uma mistura de etanol, água, glicerol e propilenoglicol. Opcionalmente, estas preparações líquidas podem conter agentes corantes, agentes aromatizantes, sacarina, e carboximetilcelulose como agente espessante ou outros excipientes conhecidos pelos peritos na arte.

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As soluções para aplicações parentéricas por injfeôção jJ5dem ser preparadas numa solução aquosa de um sal farmaceuticamente aceitável/ solúvel em água, da substância activa, preferivelmente numa concentração de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso. Estas soluções podem também conter agentes estabilizantes e/ou agentes tampão e podem ser convenientemente proporcionados em várias ampolas de dosagem unitária.

As doses diárias adequadas dos compostos do invento no tratamento terapêutico de humanos são de cerca de 0,01-100 mg/kg de peso corporal em administração perorai e 0,001-100 mg/kg de peso corporal em administração parentérica.

Processo de preparação

Os compostos do presente invento podem ser preparados como se resumiu abaixo, no entanto, o invento não está limitado a estes processos, os compostos podem ser preparados por processos descritos na arte conhecida. a. 0 4b,5,9b,10-tetra-hidro-indeno[l,2-b]indolo (IA) no qual R2 e R3 são ambos hidrogénio, pode ser preparado por redução do correspondente 5,10-di-hidro-indeno[l,2-b]indolo (DHII)

nas quais R e R1 são definidos como na fórmula I.

Reduz-se o material inicial DHII por reacção com um redutor à base de boro tal como o cianoboro-hidreto de sódio num solvente, frequentemente ácido acético, ou BH3 em tetra-hidrofurano. Alternativamente, pode-se utilizar morfolinoborano num solvente, frequentemente tetra-hidrofurano ou dioxano, e na presença de um 73 216 63057 9-

ácido forte, p. ex. ácido clorídrico. Alternativamente, pode-se utilizar um trialquilsilano. No final da reacção isola-se o produto por diluição da mistura reaccional com água, neutralização, e, filtração ou extracção por solventes. Alternativamente, consegue-se a redução por hidrogenação sobre um catalisador tal como paládio, neste caso disssolve-se o composto DHII num solvente adequado, por exemplo etanol, ácido acético, ou acetato de etilo. Neste caso isola-se o produto por remoção do catalisador e evaporação do solvente sob pressão reduzida. Pode-se purificar o composto THII por cristalização num solvente adequado, ou por cromatografia em coluna utilizando sílica. b. Os 4b,9b-dimetil-4b,5,9b,10-tetra-hidro-indeno[l,2-b]in-dolos (IB) podem ser preparado directamente por reacção das indoleninas de fórmula III com metil-litio (CH3Li) num solvente aprótico tal como o tetra-hidrofurano seco.

III IB

nas quais R e R1 são definidos como para a fórmula I. c. Os 4b,9b-dimetil-4b,5,9b,10-tetra-hidro-indeno[l,2-b]in-dolos (IB) podem ser preparados, alternativamente, a partir dos correspondentes análogos não substituídos na posição 4b, por uma sequência de metalação, p. ex. utilizando butil-lítio, carbonação com dióxido de carbono, e uma segunda metalação dirigida, p. ex. utilizando butil-lítio, e uma alquilação com halogeneto de metilo ou metil-sulfato seguida por uma hidrólise final dos intermediários N-carboxilados resultantes.

Preparação dos materiais de partida

Podem-se sintetizar os materiais de partida DHII de fórmula

73 216 63057 -10- II pela indolização de Fischer da fenil-hidrazina de fórmula IV com 1-indanona de fórmula V (sendo R4 hidrogénio).

Os materiais de partida indolenina de fórmula III podem ser sintetizados por reacção de uma fenil-hidrazina de fórmula IV com 2-metil-l-indanona de fórmula V (sendo R4 metilo).

nas quais R e R1 são definidos como para a fórmula I e R4 é hidrogénio ou metilo, respectivamente.

Podem-se fazer reagir as 1- ou 2-metil-l-indanonas de fórmula V com as fenil-hidrazinas de fórmula IV, na forma de base livre, ou na forma de um sal, frequentemente o hidrocloreto. Normalmente dissolvem-se os reagentes num solvente, preferivelmente um solvente alcoólico tal como etanol ou propanol. Em alguns casos não é necessário calor, enquanto que em outros é necessário aquecer a mistura reaccional em refluxo durante até 1 hora ou mais.

A reacção do composto de fórmula V e das fenil-hidrazinas de fórmula IV para formar um composto de fórmula II ou III prossegue através de um intermediário fenil-hidrazona de fórmula VI

-11- 73 216 63057 onde R e R1 são definidos como para a fórmula I e R4 é hidrogénio ou metilo. 0 intermediário fenil-hidrazona pode, por vezes, ser isolado por diluição da mistura reaccional com água e separado por filtração, ou por extracção com um solvente adequado. Consegue-se uma purificação adicional por cristalização ou por cromatografia. No último caso, a cromatografia em coluna sobre sílica é satisfa tória e pode- se utilizar uma gama de solventes para a eluição. A ciclização das fenil-hidrazonas na DHII de fórmula II ou nas indoleninas de fórmula III pode ser conseguida redissolvendo-as num solvente adequado, preferivelmente um álcool tal como etaiíol ou propanol, e tratando a solução com um ácido, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ou ácido trifluoroacético. Pode ou não ser necessário calor. Outros agentes de ciclização incluem ácidos de Lewis tais como o cloreto de zinco, ou reagentes contendo um átomo de fósforo, por exemplo podem ser também usados o tricloreto de fósforo, o oxitricloreto de fósforo, o ácido polifosfórico, ou polifosfonatos.

Devem-se utilizar os sais das fenil-hidrazinas em vez das fenil-hidraz|.nas nas reacções com as indanonas podendo então a ciclização das fenil-hidrazonas intermediárias no DHII ou nas indoleninas ocorrer espontaneamente.

Os análogos não substituídos na posição 4b dos compostos de fórmula IB, í.e., os compostos de fórmula VII

VII podem ser sintetizados pela indolização de Fischer de uma fenil-hidrazina de fórmula IV e a 2-metil-l-indanona de fórmula V (sendo R4 metilo) seguida pela redução da indolenina 73 216 63057 -12

intermediária de fórmula III. A redução das indoleninas de fórmula III nos derivados THII substituídos em C-9b consegue-se utilizando agentes redutores comuns tais como o boro-hidreto de sódio num solvente apropriado tal como o etanol. Os produtos são então isolados e purificados da maneira usual.

Os processos de preparação de materiais de partida tais como o 5,10-di-hidro-indeno[l,2-b]indolo (DHII) e análogos contendo grupos funcionais estão descritos no nosso pedido de patente EP-A-0 404 536. O que se segue ilustra o princípio e a adaptação do invento, no entanto, sem o limitar ao descrito. A temperatura é dada em graus Celcius.

Exemplos de trabalho

Exemplo 1 cis-4b.5.9b.10-tetra-hidro-4b.6.7.9.9b-pentametil-8-metoxi-inde-no Γ1.2-b1indolo i) 2,3,6-trimetilanisolo

Aqueceu^se em refluxo, durante a noite, uma mistura de 50 g (0,367 mol) de 2,3,6-trimetilfenol, 55 g (0,4 mol) de carbonato de potássio e 36 ml (0,38 mol) de sulfato de dimetilo em 500 ml de acetonitrilo. Adicionou-se então 35 ml de amoníaco aquoso conc., e manteve-se a mistura em refluxo durante 1 hora. Após filtração e evaporação, retomou-se o resíduo em éter e lavou-se duas vezes com solução de NaOH e duas vezes com solução de NaHC03. A secagem (MgS04) e a evaporação deram 50,8 g (92%) do produto. ii) 4-nitro-2,3,6-trimetilanisolo A uma solução agitada e aquecida (70-80°C) de 20,3 g (0,135 mol) de 2,3,6-trimetilanisolo em 200 ml de ácido acético adicionou-se, gota a gota, 9,65 ml de HN03 aquoso conc. em 20 ml de 73 216 63057 -13-

ácido acético. Após a adição verteu-se a mistura para gelo, e ex-tractou-se a mistura resultante 3 vezes com cloreto de metileno. Evaporou-se a fase orgânica para remover o ácido acético e o cloreto de metileno, e dissolveu-se o resíduo em éter e lavou-se duas vezes com solução de NaOH e duas vezes com solução de NaHC03. A secagem (MgS04) e a evaporação deram 19,0 g (72%) do produto, o qual se utilizou no passo seguinte sem purificação adicional. iii) 4-amino-2,3,6-trimetilanisolo

Hidrogenou-se uma mistura de 19,0 g (0,097 mol) de 4-nitro--2,3,6-trimetilanisolo e 2 colheres pequenas de Pd/C (5%) em 200 ml de etanol, durante 4 horas num aparelho de Parr. Removeu-se então o catalisador por filtração e evaporou-se o solvente. Dissolveu-se o Resíduo avermelhado concentrado em éter e extractou--se com HC1 aquoso (2 M).

Alcalinizaram-se então as fases aquosas combinadas com solução de NaoH até pH 14. Extractou-se a solução básica resultante com éter. Após a secagem (MgS04), precipitou-se o produto na forma do seu sal de HC1 por adição de uma solução de HC1 (g) em éter. A filtração deu 10,1 g (63%) do produto. iv) 4-hidrazino-2,3,6-trimetilanisolo

Aqueceu-se (80eC) uma suspensão de 5,17 g (0,0256 mol) de hidrocloreto de 4-amino-2,3,6-trimetilanisolo em 30 ml de HC1 aquoso conc. e 35 ml de água, até o hidrocloreto se dissolver. 0 arrefecimento a -5°C resultou numa reprecipitação do hidrocloreto na forma de pequenos cristais finos. A esta mistura adicionou--se 1,77 g (0,0256 mol) de NaN02 em 15 ml de água durante 30 minutos, ao mesmo tempo que se manteve a temperatura da mistura re-accional entre -5°C e 0°C. Após agitação a esta temperatura durante mais 15 minutos, adicionou-se, gota a gota, uma solução de 14,46 g (0,064 mol) de SnCl2.2H20 em 12 ml de HC1 aquoso conc., durante 15 minutos, ao mesmo tempo que se manteve a temperatura a 0°C. Permitiu-se então que a mistura reaccional atingisse lentamente a temperatura ambiente e depois alcalinizou-se com solução de NaOH até pH 14. Extractou-se a mistura resultante com éter, e após secagem (MgS04) precipitou-se o produto na forma do seu hi- 73 216 63057 -14-

drocloreto por adição de HC1 (g) em éter. A filtração deu 3,8 g (69%) do produto. v) 9b,10-di-hidro-6,7,9,9b-tetrametil-8-metoxi-indeno[1,2-b]indo-lo

Manteve-se em refluxo uma mistura de 2,2 g (0,012 mol) de 4--hidrazino-2,3,6-trimetilanisolo, 1,9 g (0,013 mol) de 2-metil-l-indanona e 2 ml de HC1 aquoso conc. em 20 ml de etanol, sob árgon durante 1 hora. Após arrefecimento, removeu-se o solvente por evaporação e submeteu-se o resíduo a partição numa mistura de água e cloreto de metileno. Neutralizou-se a fase aquosa por adição de NaHC03 aquoso e separaram-se as fases. Após secagem (MgS04) e evaporação da fase orgânica, purificou-se o produto brutg restante por cromatografia sobre sílica utilizando cloreto de metileno como eluente. Isto deu 1,1 g (31%) do produto que se utilizou directamente no passo seguinte. vi) cis-4b,5,9b,10-tetra-hidro-4b,6,7,9,9b-pentametil-8-metoxi--indeno[1,2-b]indolo A uma solução fria (-80°C) de 1,1 g (0,0038 mol) de 9b,10-di-hidro-6,7,9,9b-tetrametil-8-metoxi-indeno[1,2-b]indolo em 20 ml de THF seco adicionou-se 4 ml de metil-lítio 1,6 M em éter sob árgon. Agitou-se a mistura a -78°C durante lhe depois a -20eC durante 1 h. Após atingir 0°C, adicionou-se NH4C1 aquoso e éter. Separaram-se as fases, e lavou-se a fase orgânica uma vez com água, seçou-se (MgS04) e evaporou-se. Purificou-se o produto bruto resultante por cromatografia sobre sílica utilizando acetato de etilo/iso-octano (2/10) como eluente. Isto deu 0,3 g (25%) do produto esperado. 1H RMN (CDC13): 1,41 (3H,s), 1,43 (3H,s), 1,96 (3H,S), 2,07 (3H,s), 2,35 (3H,s), 3,0 (lH,d), 3,55 (3H,s), 3,65 (lH,d), 7,1 (3H,m), 7,25 (lH,m).

Exemplo 2 cis-4b,5.9b.10-tetra-hidro-8-etoxi-4b.7.9.9b-tetrametilindeno-fl.2-b1indolo 1 4-nitro-2;6-dimetil-l-etoxibenzeno

Manteve-se ao refluxo uma mistura de 10 g (0,0598 mol) de 4- 73 216 63057 -15-

nitro-2,6-diHietilfenol, 16,5 g (0,1196 mol) de K2C03 e 18,6 g (0,1196 mol) de iodeto de etilo em 100 ml de acetonitrilo, durante 2,5 horas. Removeu-se o material sólido por filtração a quente e depois lavou-se com acetonitrilo quente. Evaporou-se a fase orgânica combinada e dissolveu-se o resíduo resultante em éter. La-vou-se a fasé de éter com água, secou-se (Na2so4) e evaporou-se obtendo-se 11,4 g (98%) do produto, p.f. 56°C. ii) 3,5-dimetil-4-etoxianilina

Hidrogenou-se uma solução de 11,4 g (0,058 mol) de 4-nitro--2,6-metil-l-etoxibenzeno em 115 ml de etanol (95%), utilizando Pd/C como catalisador, durante a noite. Após a remoção do catalisador por filtração, removeu-se o solvente por evaporação obtendo-se 9,2 g (96%) do produto, p.f. 74 °C. iii) 3,5-dimetil-4-etoxifenil-hidrazina A uma suspensão arrefecida (+5eC) e agitada, de 9,2 g (0,0557 mol) de 3,5-dimetil-4-etoxianilina em 50 ml de HC1 6N (aq.), adicionou-se 3,8 g (0,0557 mol) de NaN02 em 15 ml de água durante 30 minutos. Após agitação a +5°C durante mais 30 minutos, adicionou-se a mistura resultante, sob árgon e com agitação, a 29,1 g (0,167 mol) de ditionito de sódio dissolvido em 150 ml de água. Após agitação durante 20 minutos a +5°C, adicionou-se 250 ml de éter seguido por alcalinização até pH 9 com solução de hidróxido de sódio 10 N. Separou-se a fase orgânica e lavou-se com solução de cloreto de sódio. Após secagem (Na2S04) precipitou-sê o produto na forma de hidrocloreto por adição de HC1 (g)/éter (a pH 3). A filtração e a lavagem com éter deram 9,4 g (78%) do produto. iv) 9b,10-di-hidro-8-etoxi-7,9,9b-trimetilindeno[1,2-b]indolo

Agitou-Se uma solução de 2,16 g (0,01 mol) de hidrocloreto de 3,5-dimetil-4-etoxifenil-hidrazina e 1,46 g (0,01 mol) de 2--metil-l-indanona em 20 ml de ácido acético, durante a noite à temperatura ambiente, e depois manteve-se ao refluxo durante 3 horas. Diluiu-se a mistura com água, alcalinizou-se com solução de hidróxido de sódio 10 N e extractou-se três vezes com cloreto de metileno. Lavou-se a fase orgânica combinada com água, secou- 73 216 63057 -16-

-se (Na2S04) e evaporou-se dando 2,8 g do produto bruto que foi recristalizado em petróleo leve/acetato de etilo (5/1). Rendimento d© 2,1 g (72%). p.f. 164°C. v) cis-4b/5,9b,10-tetra-hidro-8-etoxi-4b,7,9,9b-tetrametilindeno-[1,2-b]indolo A uma solução arrefecida (-78°C) de 2,0 g (0,0063 mol) de 9b,10-di-hidro-8-etoxi-7,9,9b-trimetilindeno[l,2-b]indolo em 20 ml de tetra-hidrofurano seco, adicionou-se, gota a gota, 10 ml de metil-lítio (1,6 N) em éter, com agitação e sob árgon. Após se completar a adição, continuou-se a agitação durante 1 hora a -20°C e depois durante 1 hora à temperatura ambiente. Interrompeu-se a mistura reaccional por adição de 20 ml de solução saturada de cloreto de amónio. Após adição de 100 ml de éter, separou-se a fase orgânica e lavou-se duas vezes com solução de cloreto de amónio. A secagem (Na2S04) e a evaporação deram 2,0 g (96%) do produto. 1H RMN (CDCI3): 1,35 (3H,t), 1,4 (6H,d), 2,1 (3H,S), 2,35 (3H,S), 2,95-3,05 (lH,d), 3,55-3,75 (3H,m), 6,1 (1H,S), 7,0-7,3 (4H,m).

Exemplo 3 cis-4b,5,9b.10-tetra-hidro-8-metoxi-6.7.9-trimetilindeno f1,2--blindolo i) 5,10-di-hidro-8-metoxi-6,7,9-trimetilindeno[1,2-b]indolo

Manteve^-se ao refluxo durante 1 hora uma mistura de 1,95 g (0,009 mol) de hidrocloreto de 4-hidrazino-2,3,6-trimetilanisolo (preparado como se descreveu no exemplo 1) e 1,06 g (0,008 mol) de 1-indanona em 20 ml de etanol e 2 ml de ácido clorídrico concentrado. Relnoveu-se o solvente por evaporação e submeteu-se o resíduo a partição entre éter e água. Tornou-se a fase aquosa alcalina com solução de hidróxido de sódio. Separou-se a fase orgânica e lavou-se com água. A secagem (Na2S04) e a evaporação deram o produto bruto que foi purificado por cromatografia utilizando cloreto de metileno/petróleo leve (20/80) como eluente. Uma recristalização final deu 1,08 g (49%) do produto. 73 216 63057 -17-

ii) cis-4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-metoxi-6,7,9-trimetilindeno[1,2--b]indolo A uma solução de 0,65 g (0,00234 mol) de 5,10-di-hidro-8-me-toxi-6,7,9-trimetilindeno[ 1,2-b]indolo e 0,95 g (0,00957 mol) de morfolinoborano em 4 ml de dioxano adicionou-se, gota a gota, 1 ml de ácido clorídrico concentrado. Manteve-se a mistura ao refluxo durante 30 minutos, arrefeceu-se à temperatura ambiente, após o que se adicionou 3 ml de ácido clorídrico 6 N. Manteve-se então a mistura ao refluxo durante mais 30 minutos. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, submeteu-se a mistura em bruto a partição entre éter e hidróxido de sódio aquoso. Separou-se a fase orgânica e lavou-se com hidróxido de sódio aquoso e água. A secagem (MgS04) e a evaporação deram o produto bruto que foi recristalizado em acetato de etilo/petróleo leve. Rendimento de 0,46 g (70%). 1H RMN (CDCI3): 2,0 (3H,s), 2,14 (3H,s), 2,28 (3H,s), 3,17 (1H,dd), 3,55 (lH,dd), 3,64 (lH,s), 4,28 (lH,ddd), 5,38 (lH,d), 7,20-7,27 (3H,m), 7,39 (lH,d).

Propriedades farmacológicas

Os indeno-indolos de acordo com o presente invento são estruturas hidrofóbicas e estáveis que formam catiões, radicais catiónicos estáveis ou radicais por oxidação. Eles constituem potentes antioxidantes quando medido pela inibição da peroxidação lipídica in vitro induzida pelo Fe2+-ascorbato, com um valor de ICgQ tão baixo quanto 10 nM. Os compostos de fórmula I evitam eficazmente a oxidação de lipoproteínas no plasma humano na presença de células do músculo liso de coelhos ou de macrofagos peritoneais de ratinho. Evitam também o dano de isquemia/re-perfusão no coração de ratazana perfundido isolado, e protegem contra os danos no fígado de ratinhos induzidos por tetracloreto de carbono, acetaminofeno, sulfonato de metilmetano, menadiona, hidroperóxido de t-butilo, e N-metil-N^—nitro-N-nitrosoguanidina, ou em hepatócitos de ratazana isolados.

Estas propriedades sugerem que os compostos do invento possuem um potencial uso na protecção ou tratamento de danos is-quémicos ou de reperfusão, particularmente isquémia/enfarte cardíaco e cerebral, ateroesclerose, trombose, embolia, doença de -18- 73 216 63057

Parkinson, envelhecimento, doença de Alzheimer, neoplasmas e toxicidade de drogas antineoplásticas, agentes imunossupressores e inflamação incluindo condições alérgicas/inflamatórias como asma bronquíca e artrite reumatóide. Outras potenciais aplicações são a quimioprevenção contra toxicidade química ou danos por radiação. Os compostos indeno-indolo não são apreciavelmente ac-tivados pela luz UV tornando-os candidatos para se utilizarem em produtos de tratamento da pele. Outro aspecto, interessante e importante dos compostos indeno-indolo do presente invento é a sua capacidade para estabilizar membranas.

Testes farmacológicos 0 aspecto mais notável dos compostos do invento é a sua eficácia como depuradores de radicais livres ou antioxidantes. Utilizou-se um sistema de ensaio para a medição da concentração dos compostos de fórmula I necessária para inibir a peroxidação lipídica em 50% (IC50). O ensaio de peroxidação lipídica está se-guidamente déscrito em l. e os dados estão apresentados na tabela 1. Adicionalmente, descreve-se um teste de inibição da peroxidação de LDL^induzida por macrófagos em 2, e os dados estão apresentados na tabela 2. 1. Peroxidação lipidica dependente de ascorbato/Fe2+

Para o sistema de peroxidação lipídica ião ferroso/ascorba-to, adicionoU-se 6,25 ml de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (KP^), pH 7,4, a 12,5 mg de fosfolípidos de soja secos. Após irrigação com árgon durante 2 min., selou-se a suspensão com cinco camadas de Parafilm e sonicou-se até a solução ficar translúcida*. A mistura reaccional final era composta de fosfolípido â 200 /ig/ml, FeNH4(S04)2 a 10 μΜ ou Fe(NH4)2(so4)2, e ácido ascórbico a 100 μΜ em KPj_ 0,1 M (pH 7,4), e o antioxidante a ser testado, em acetona ou DMSO. O volume de veículo nunca excedeu 1% do volume total. Iniciou-se a reacção por adição de ácido ascórbico mais ferro. Continuou-se a reacção à temperatura ambiente num* banho de água com agitação durante 30 min. e depois parou-se por adição de 10 μΜ de hidroxitolueno butilado 0,5 M em DMSO. 0 prodedimento anterior e a subsequente determinação de ácido 2-tiobarbitúrico-material reactivo está descrito em: -19- 73 216 63057

Shertzer, H.G. et al# Biochem. Pharmacol. 37, 333 (1988). A tabela 1 mostra os efeitos de indeno-indolos e α-tocoferol sobre a peroxidação lipídica dependente do ascorbato/Fe2+.

Tabela 1 PIC50

Compostos

Cis-8-metoxi-6,7,9-trimetil-THII 8,0 Cis-8-etoxi-4b,7,9,9b-tetrametil-THII 7,9 Cis-8-metoxi-4b,6,7,9,9b-pentametil-THII 7,6 2. Inibição da peroxidação de LDL induzida por macrofagos

Incubaram-se macrofagos peritoneais de ratinho num meio FIO de Ham na presença de 25 μg de lipoproteinas de baixa densidade (LDL) humanas/ml de meio de macrofago. Dissolveram-se os compostos do invento em etanol e adicionaram-se até uma concentração final de 10-5 a 10_10M. Incubaram-se então as células em triplicado durante 24 horas. Removeu-se então o meio celular e ensaiou--se a peroxidação lipídica medindo a formação de substâncias re-activas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) utilizando tun processo descrito por Steinbrecher et al em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 3883 (1984). Os resultados são dados na tabela 2 na forma de -log da concentração necessária para reduzir a peroxidação lipídica em 50% comparado com o controlo (pIC50).

Tabela 2 PIC50

Compostos

Cis-8-metoxi-4b,6,7,9,9b-pentametil-THII 7,9 Cis-8-etoxi-4b,7,9,9b-tetrametil-THII 7,8 Cis-8-metoxi-6,7,9-trimetil-THII 7,9

Claims

73 216 63057 ’ -20- REIVINDICACfiES 1 - Processo de preparação de um composto fundido na posição cis, de fórmula I

na qual R é metoxi ou etoxi, quando R é metoxi, R1 é metilo e R2 e R3 são ambos hidrogénio ou ambos metilo, e quando R é etoxi, R1 é hidrogénio e R2 e R3 são ambos metilo, ou de um seu enantiómero ou sal, processo caracterizado por compreender: a. a redução do 5,10-di-hidro-indeno[l,2-b]indolo (DHII)

II na qual R e R1 são definidos como anteriormente, b. a reãcção de uma indolenina de fórmula III com metil--lítio (CH3Li)

na qual R e R1 são definidos como para a fórmula I,

73 216 63057 -21- c. para compostos 4b,9b-dimetilo, uma sequência de metalação do correspondente análogo não substituído na posição 4b, de

seguida por carbonação com dióxido de carbono, metalação e alquilação com um metil-halogeneto ou metil-sulfato e uma hidrólise final.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o cis-4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-etoxi-4b,7,9,9b--tetrametilindeno[l,2-b]indolo, um seu enantiómero ou um seu sal.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o cis-4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-metoxi-6,7,9--trimetilindeno[1,2-b]indolo, um seu enantiómero ou um seu sal.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o cis-4b,5/9b/l0-tetra-hidro-8-metoxi-4b/6,7,9, 9b-pentametilindeno[l,2-b]indolo, um seu enantiómero ou um seu sal.
5 - Proçesso de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a formulação de um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável com um composto fundido na posição cis, de fórmula I

I -22- 73 216 63057 na qual R é metoxi ou etoxi# quando R é metoxi, R1 é metilo e R2 e R3 são ambos hidrogénio ou ambos metilo, e quando R é etoxi, R1 é hidrogénio e R2 e R3 são ambos metilo, ou com um seu enantió-mero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o composto fundido na posição cis de fórmula I ser cis--4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-etoxi-4b,7,9,9b-tetrametilindeno[1,2--b]indolo.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o composto fundido na posição cis de fórmula I ser cis--4b,5,9b,10-tetra-hidro-8-metoxi-6,7,9-trimetilindeno[1,2-b]indo-lo.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o compos.to fundido na posição cis de fórmula I ser cis--4b ,5,9b, l0-tetra-hidro-8-metoxi-4b ,6,7,9,9b-pentametilindeno- [ 1, 2-b]indolo. .
9 - Processo de estabilização de um composto susceptível de sofrer deterioração oxidativa caracterizado por se pôr em contacto o composto susceptível com um composto definido de acordo com as reivindicações de 1 a 7 ou com um seu enantiómero ou um seu sal. Lisboa, ,J' OUT 199^or UNIVERSITY 0F BATH e university OF CINCINNATI =0 AGENTE 0FICIAL=