PT98917A - Processo para sialilacao de glicoproteinas por tecnica genetica - Google Patents

Description

Descriç3o da patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESEL- ' LSCHAFT, alem3, industrial e co- j mercial, com sede em D-3550 Mar-burg, República Federal Alema, (inventores: Dr. Gerd Zettlmeis-sl, Dr. Ulrich Grundmann, Achim BecKer e Dr. Peter Hermentin, residentes na República Federal j Alema), para "PROCESSO PARA SIA- j LILAÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS POR j

TÉCNICA GENETICA" I DESCRIÇÃO ; t

I A presente invenção refere-se a um proces so para sialilaç3o de glicoproteinas por técnica genética, bem como a novas glicoproteinas sialiladas (glicoproteinas sobressialiladas).

Una série de glicoproteinas utilizáveis para fins terapêuticos, como p.e. factor VIII.C, factor IX, eritropoietina, antitrombina III e anticorpos monoclonais, podem ser sintetizadas por processos conhecidos em células de mamíferos, capazes de produzir cadeias laterais complexas de hidratos de carbono (Kaufman et al., J. Biol. Chem. Vol. 263 (1988), 6352-6362; Kaufman et al., J. Biol. Chem. Vol. 261 (1986), 9622-9628; Lin. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 82 (1985), 7580-7584; Zettlmeipl et al., Bio/Technology, 1

··· 1

Vol. 5 (1987), 720-725, Kohler e Milstein, Nature 256 (1975), 495-497). Quando da caracterização bioqiimica das cadeias laterais dos hidratos de carbono das glicoproteínas recombinantes assim produzidas, verificou-se que em função do sistema de expressão utilizado, as glicoproteinas re-combinantes apresentam em comparação com as glicoproteinas naturais, diferenças no que se refere ao padrão de glicosila-ção (Pfeiffer et al., Eur. J. Biochem., Vol. 186 (1989), 273-286; Zettlmeipl et al., J. Biol. Chem. Vol. 264 (1989), 21153-21159). Assim, nas células Chinese Hamster Ovary (CHO) observa-se frequentemente durante a sintese de glicoproteinas recombinantes, que o áciéo sialinico terminal é exclusivamentje ligado na posição a-2,3 ás cadeias laterais dos hidratos de carbono de p.e. eritropoietina recombinada (Takeuchi et al., : J. Biol. Chem. Vol. 263 (1988), 3657-3663) ou de antitrombina j III recombinada (Zettlmeipl et al., J. Biol. Chem. Vol. 264 (1989), 21153-21159). Pelo contrário, nas formas naturais ! observa-se preferencialmente o ácido sialinico ligado na i posição a-2, 6. j

Para além disso, observou-se em proteínas complexas glicosadas, isoladas de produtos naturais £ p.e. urina humana ou plasma humano_7(Pranzen et al., J. Biol.

Chem. Vol. 255, 5090-5093), ou obtidas através de expressão em células de mamífero (Sasaki et al., J. Biol. Chem. Vol. 862 (1987), 12059-12076), uma sialilação incompleta das cadeia laterais dos hidratos de carbono. Sabe-se que diferentes glicoproteinas, como p.e. a eritropoietina ou a antitrombina III, apresentam in vivo tempos de semi-vida mais reduzidos guando incompletamente sialiladas. Sabe-se para além disso, que as chamadas "asialo-glicoproteinas", que apresentam nas suas cadeias laterais de glucídeos galactose terminal em vez de ácido sialinico terminal, possuem in vivo um tempo de se-mivida particularmente reduzido. É que tais estruturas glicosadas sialiladas são recombinadas por receptores no fígado, e mais rapidamente eliminadas da circulação sanguínea. 2

Assim# para uma aplicação in vivo das jlic oprotaínas é muito desejável e vantajosa# ter â disposição glicoproteínas mais ou completamente sialiladas# pois e^tas apresentam in vivo um tempo de semi-vida mais prolongado, e possuem uma melhor eficácia relativamente âs glicoproteínas nativas. rsg processos conhecidos para a sialila-ção encimática in vitro da glicoproteninas purificadas# através de siaiil-transformase puríssimas solúvel ou imobilizadas# apresentam limitaçães tecnológicas e económicas devido à reduzida disponibilidade dos respectivos enzimas e à complexa síntese do substracto (ácido CPM-neuromínico) para a 1-t rans ferase. Λ presente invenção tem corro objectivo apresentar glicoproteínas mais ou completanente sialiladas para rins terapêuticos# que deverão ser produzidas através de métodos de técnica genética. Tal objectivo é conseguido por um prncesso, caracterizado por se levar â expressão numa célula aucariótica uma sequência de DMA codificada de uma sia-lil-transferase em conjunto com uma sequência de DNA codificada de uma glicoproteína a sialilar# e se isolar a glico-protelna sialilada assim obtida.

As sequências do cDMA para a β-galactosi-deo a-2#G-sialil-transferase (Cal c-2#6-ST) do fígado do rato (Weinstein et al.# J. Biol. Chem. Vol. 262 (1987)# 17735-17743) e da placenta humana (Grundmann et al., Nucl. Acids. Res. Vol. 18 (1990), 667) foram isolados e caracte- rizadas. A Gal a-2#6-ST de fígado do rato pode ser expressa numa forma funcional em células GHO. Consequentemente# as proteínas celulares CHO sintetizadas nas células CHO apresentavam, para além do ácido sialinico ligado na posição a--2,3-usual para esta linha celular# também sialinico ácido ligado na posição a-2#6 (Lee et al., J. Biol. Chem. Vol. 264 (1989), 13848-13855). - 3 - 3

I bad origina â

Surpreendentemente, de acordo com a presente invenção, pode modificar-se uma glicoprotelna hete-róloga de interesse terapêutico através de co-expressâo com uma sialil-transferase heteróloga numa célula eucariótica, tanto no que diz respeito ao padrão de ligação (p.e. a-2, 3 ou a-2, 6) do acido sailinico terminal), como sobretudo no que se refere a um maior grau de sialilação, i.e. á saturação tanto quanto possível total dos radicais termiinais de galactose com o ácido sialíflico. As glicoproteínas su-persialiladas obtidas de acordo com a presente invenção ca-caracterizam-se em especial por taxas séricas prolongadas, e portanto por uma melhor eficácia terapêutica· Utna outra vantagem deste processo reside na sua grande aplicabilidade à escala industrial, o que conduz a produtos mais uniformes ("sialilação homogénea"). Para a realização do processo a que se refere a presente invenção, a sequência do DNA codificadora para uma sialil-transferase é clonada pelos processos já conhecidos,a jusante de um forte promotor sucario-nico (p.e. SV40 early-promotor, ver Fig. 2), e introduzida em conjunto com a unidade de transcrição para o marcador genético seleccionável (p.e. dihidrofolato-reductase, amino-glicosídeo 3' fosfotransferese, puromicina N-acetil-transfè-rese, Wirth et al·. Gene Vol. 73 (1988). 419-426; Glutamina-ynthetase, Bebbington and MenTshel, Cloning Vol. III DNA (1987), Glover. ed., IRL Press) numa célula eucariética adequada para preparação da glicoproteína a sialilar, sendo levada â expressão nesta célula de produto. As células eu-cariétidas seleccionadas, que podem exprimir a sialili-transeucarióticas seleccionadas. que podem exprimir a sialil-transferase em conjunto com a glicoproteína a sialilar, podem ser utilizadas para a sintese das glicoproteínas snpersialiladas à escala industrial. Da-se especial preferência aos marcadores genéticos que permitem uma co--amplicação da sequência de DNA codificadora para a sia-li-transferase, como p.e. o dCNAs para dihidrofolato-re-ductase ou glutamin-sintetase. - 4

Exemplos típicos de sequências de DNS que coai ficam as sàaliltransferases, sSo as sequências para a galactosido a-2,3-sialiltransferase, para a galactosido .-2,t-sialil-transferase e para a N-acetilgalactosamida - _ ? -1 cia de ferase sialil-transferase. DMA codificadora p (Weinstein et al.,

Da-se especial preferência à sequer ara galactosido a-2, 6-sialil-trans-ver acima; Grundmann et al., ver acima).

Exemplos típicos e preferenciais para a jlicoproteína recombinante a sialilar s3o: a antotrombína III h imana (Dock et al., Nuc. Acids. Res., Voi. 10 (1982). 3113-8125), a eritropoietina humana (Jacobs et al., Nature, Vol. 313 (1985), 806-809), o factor VII humano (;iagen et al., Froc. Natl. Acad. Sei. USA. Vol. 33 (1986), 2412-2416; o factor I. c humano (Toole et al., Nature, Vol. 212 (1984). j 342-347), o factor IR humano (Choo et al., x Nucl. Acids Res.| Vol. 15 (1987), 871-884), as moléculas receptoras humanas glicosiladas, como p.e. o factor tecidular (Eeiber et al., Thronp, Aes. Vol. 48 (1987), 39-99). O receptor de inter-leucina-1 (Sims et al., Pr-oc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.86 (1989) 8946-89506, o receptor de interleucina-4 (ΞΡ-Α-0367 566), o receptor de interleucina-7 (Goodwin et al., Cell.

Vol. 60 (1990). 941-951). O receptor do factor da necrose tu-t mural (Schall et al., Cell. Vol. 61 (1990), 361-370), CD4 j (Maddon et al., Cell. Vol. 42 (1985). 93-104). ; O processo a gue se refere a presente invenção pode ser realizada de acordo com diferentes variantes 1) em primeiro lugar é introduzida na célula eucariótica a sequência de DMA codificadora da sialil-transferase, em conjunto com um marcador genético, e depois a sequência de DMA codificadora da glicoproteína a sialilar, em conjunto com um outro marcador genético 2). Em primeiro lugar é introduzida na célula eucariótica a sequência de DNA codificadora da glicoprotenia a sialilar, em conjunto com um marcador genético, e depois a sequência de DMA codificadora da sialil-transferase, em conjunto com um outro marcador -<^ C a

BAD ORIGINAL

cequvncia de DMA codificadora de sialil-transferase e a sequência .la DMA codificadora de glicoproteína a sialilar, são introduzidas em conjunto com um marcador genético na célula eucariót Loa.

Exemplos típicos de células eucarioticas sSc as leveduras, fungos, células vegetais ou células animais. -3:1 o processo a que se refere a presente invenção dá--se preferência as células permanentes de mamíferos. Da-se especialmente preferência a células de mamíferos,tais como 3HX, C-nC, Dl27, que são comercializadas.

Muma outra forma de realização da presente invenção, a sequência de DMA codificadora da sialil--transfu;: isu pode ser introduzida, em conjunto com ura marca-lor genético, numa linha celular que naturalmente produza _rxco-protemas· ..este caso na— se precerâncra as células de hibrídona, que formam anticorpos monoclonais (kohler e Milstein, ver acima), ou a células utilizadas para a repli-

Dl í·* , CÍ 1' ^ m

As proteínas sialililadas obtidas de ac©*-dc com a presente invenção podem ser purificadas pelos métodos usuais,e ser analizadas quanto ao seu teor de ácido sia-líiico úiermantin e 3eidat,GBF Workshop "Protein Glycosylaticn; Celular, Siotechnological and Analytical Aspects", Junho 2G-30, 1990, 3raunschweig, Abstracts of Papera, p. 49). A presente invenção é mais pormenorizadamente ilustrada através da Figura e das Tabelas: A Tabela 1 representa a sequência completa de cDNA do clono 14 codificador da galactosido a-2,6--sialil-transferase humana, com os seus componentes marginais EcoRI-Linker. A Figura apresenta o plasmídeo de expressão para a galactosido a-2, 6-sialil-transferase humana pA9 Sial.

BAD ORIGINAL - 6 i

Na Tabela 2 sSo apresentados os resultados da ligaçSo por sialilação da antitrombina III humana purificada a partir do sobrenadante de culturas celulares de células BHK, antes e depois da transfecçSo com o plasmi-deo pAB Sial. i ) Ά presente invençSo é ilustrada pelos seguintes exemplos. Estes nâo devem ser considerados como restritivos. Outras indicações relativas aos processos de biologia molecular aqui utilizados poderSo ser encontrados in Sambrock et al., Molecular Cloning, 2» ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold. Spring Harbor, N.Y., USA. ΕΧΕΜΡΐϋ) 1 ; Cionação do cDNA para £-galactosido 2, 6-sialil--transferase humana (Gal a-2,6-ST) i

Um banco de cDNA descrito na EP-A-0236 978, de placenta humana foi pesquisado no vector de fagos lambida gtlO através de hibridizaçSo com sondas de oligo-nu-cleotidos sintético, quanto á presença de clonos portadores de um cDNA codificador para Gal a-2.6-ST. Ag duas sondas de oligo-nucleotidos utilizados £oram derivados da sequência de cDNA de Gal a-2,6-ST do rato (Weinstein et al., ver acima), tendo em consideraçSo o consumo de codon nas sequências codificadoras humanas (lathe, J. Mol. Biol., Vol. 183 (1985), 1-12), e tinham as seguintes sequências: A) 5'CTC CTG GCT CTT GGG CAT CTG GAA CTC CTT GGC CTG CAG GGT CAG GGC CTC ATA GTC 3' (57 mer) B) 5'ATG ATG AOC CTG TGT GAC CAG GTG GAC ATC TAT GAG TTC CTG OCA TCC AAG 3' (5imer)

Ambas as sequências de oligo-nucleotidos foram marcadas no termnal 5· com T4 polinucleotido-quinase, 3 2 utilizando (gama- P) ATP; 3000 Ci/mol, 10 ^uCi/^μΙ, sendo utilizados 5 ul/50 uL por toma de reaoção). Ag sondas tinham

/ / g A uma actividade especifica de 2 x IO Bq/ jig ou 4 x 10 Bq/ /pMol. - 7 -

Para a pesquisa do banco de cDNA de placenta com as sondas de oligo-nucleotidos acima descritas foram semeadas 3 x 10^ pfu (plaque forming units) com células de estirpe de E. coli K 12 C 600 hfl, em caixas de Petri de 13,5 cm com agar-agar semi-sólido, e incubadas durante 6 h a 37°C. No fim deste período de tempo não se verificava ainda qualquer lise total. As placas foram incubadas durante a noite no frigorífico e os fagos foram transferidos para filtros de nitrocelulose (Scheleicher & Schull, BA 85, Ref· 401124) (em duplicado). Os filtros de nitrocelulose e as caixas de Petri foram marcadas com uma cânula de injecção, a fim de possibilitar um posterior agrupamento. Durante o posterior tratamento dos filtros de nitrocelulose, as caixas de Petri foram guardadas no frigorífico. O DNA que se encon- j trava nos filtros de celulose foi desnaturado, colocando os filtros durante 5 minutos sobre um papel de filtro (What-man-3149 humedecido em NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Em seguida, os filtros foram renaturados da mesma forma com NaCl 1,5M,

Tris 0, 5M (pH 8,0), e lavados 2 x com SSPE (NaCl 0,36 M,

NaOH 16 mM, NaH2P04 20 mM, EDYA 2 mM). Os filtros foram depois aquecidos durante 2 h a 80°C, sob pressão reduzida. Os filtros foram pré-hibridizados durante 4 h a 65°C (solução de pré-hibridizaçSo* NaCl 0,6 M, Tris 0,06 M (pH 8,3), EDTA 6 mM, polímero de sacarose sintético não iónico 0,2 % (FicollR), polivinil-pirrolidona 40 0, 2%, BSA 0, 2%, SDS 0,1, DNA de esperma de arenque desnaturado 50 ^ig/ml). P0r fim, os filtros foram incubados durante a noite, com adição de 100 000 - 200 OOO bq do oligo-nucleotido marcado/ml de solução de hibriâização (como a solução de pré-hibridização, mas sem DNA de esperma de arenque), em copinhos ou saquetas de poli-etileno herméticos, sob agitação ligeira. A temperatura de hibridização era de 65°C. Os filtros de nitro-celulose foram lavados com 6 x SSC, pirofosfato de sódio 0,05 M, duj-rante 1 h á temperatura ambiente, e depois durante mais 1 h à temperatura de hibridização. Os filtros foram secos e auto--radiografados durante a noite. Os sinais na placa de RX, surgindo na mesma posição em ambos os duplicados, foram agru- - 8 - | i Ί

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pados com as respectivas caixas de Petri e aquela região (cerca da 30 placas) removida com a ponta larga de pipetas i de Pasteur, e os fagos foram resuspensos em 1 ml de tampão j I SM. As misturas de fagos contendo fagos cDNA hibridizados j com a sonda, foram isolados em três voltas, até se conseguir j identificar um único clono positivo. j | i Ao todo foram pesquisados 10^ pfu do ! banco de cDNA de placenta, e dois fagos que forneciam sinais positivos foram analisados em mais pormenor (clonos nss 14 e 15). Ambos os clonos de fagos 14 e 15 foram multipli-^ cados e os seus DNAs extraídos. Os DNAs foram parcialmente fragmentados com EcoRI, isolados e ligados à zona de frag- 1 mentação de restrição EcoRI do vector Bluescript M13 (Stra-tagene, 3an Diego, CA USR) para analise de restrição e se-quencias. Os plasmideos recombinantes assim formados são denominados pSIall4 (L ou R) e pSIall5 (L ou R), consoante a | orientação do fragmento EcoRI. Todos eles continham a sequên- | cia codificador total. Na Tabela 1 é apresentada toda a se- ; quência do cDNA do clono 14 (2188 bp) com os seus componentes marginais EcoRI-Linker (5*AG 'AATTCT)· A sequência revela um rastreio aberto de leitura e codifica uma proteína de 406 aminoacidos. EXEMPLO 2j Co-expressão de Gal a-2,6-ST humana em células 21 de rim de Hmster bebé (BHK), que exprime antitrombina III humana (AT III) a) Preparação de uma linha celular BHK21, que exprime AT III humano A preparação do clono misto BHK utilizado para os ensaios posteriores, que secreta AT III humano no meio de cultura, é descrito no exemplo ib) da EP-A-0330 977. Com este clono misto 3MK1 (400 jig/ml β418* 10 | metotrexato (MTX); ver Quadro 2 da EP-A-0330 977 ( j i procedeu-se a um isolamento de clonos através de di- 9

I 'i b) Μ «¥!| c)

luição limitativa. Um clone isolado assim obtido, J 3MK1-3-311 foi multiplicado em meio de cultura (meio j DMS, contendo 10% de soro de feto de vitelo (FKS), 400 ug/ml G418 e 10 uM MTX) (linha celular 3MK1--3-311)- Construção de um vector de expressão para Gal a-2,6--ST. Obteve-se um fragmento de cDNA codificador de Gal <x_2,6-tíT (2,2 kb) do vector pSiall4L (exemplo 1), através de fragmentação com os enzimas de restrição Hind III e Xbal, que foi clonado no vector pAB3-l j aberto com o HindIII/iCbal (Ζβ^ΐιηβΐβΐ et al., ! Behring Inst. Mitt. Vol. 82 (1988); 127-143). O pias-! mídeo resultante, que transporta o Gal α-2, 6-3T cDNA na orientação desejada para jusante do promotor j SV40 early, foi denominado pABSial (Figuua ). j Cotrasfecção da linha celular 3MK1-3-B11 com um plas-j mídeo de expressão para Gal a-2,6-ST (pAB Sial) e j um plasmídeo de expressão para glutamina-sintetase j (pSVLGSl) . A linha celular 3MK1-B11 obtida em a) foi acertada com 8 passagens, para a multiplicação em meio GMEM (Bebbington and Hentschel (1987), ver acima), contendo 10% de FKS, 400 pq/ml G418 e 10 juM MTX (meio GS). Ag células assim obtidas exprimem 11 + 2 jyq AT 40 III/10^ celulas/24 h, e foram sobretrans-feridas com o auxílio da técnica do fosfato de cálcio descrita na EP-A-0330 977, com os plasmldeos pAB Sial (20 jug) e pSVLGSl (5 ^g; Bebbington e Hentschel (1987), ver acima). Ag células sobretrans-feridas foram seleccionadas em meio GS contendo 15 pM de metionina-sulfomiina (MSX). Passadas cerca de 4 semanas foram isolados os clonos individuais resistentes ao 9 MSK. De três destes clonos (42-A3, 42-All, 42-C1) foi isolado RNA pelos processos nor- 10

EXEMPLO a) malizados, e hibridizado como sonda no "Northernblofij com um fragmento marcado radioactivamente da Gal a-2, 6-3T humana.

Ao contrário do clono de partida (3MK1-3-B11), todos os 3 clonos continham uma mRNA específica para Gal α-2, 6-5T. 0 sinal específico para Gal oc-2, 6-5T presente nos clonos 42-A3 e 42-C1 era comparável quanto à intensidade, com o sinal da mRNA específica para AT III, que após sobretransferência com os vec-tores pABSial/ppSVLGSl, se manteve inalterado em to-

I dos os 3-clonos analisados 42-A3, 42-A11 e 42-Cl, em comparação com o clono de partida 3MK1-3-B11.

I

Também as taxas de expressão para antitrombina III foram para todas as linhas celulares analisadas que exprimiam Gal a-2,6-3T, idênticas em comparação com o clono de partida (11 + 2 ug/10^ células/ /24 h). i

I _3* Purificação e caracterização de AT III humana de uma linha celular BHK, que co-exprime Gal a-2,6— -ST humana i

Multiplicação celular e purificação de AT III

As linhas celulares BHK 3MK1-3-B11 (AT III) e 42-Cl (AT III + Gal a-2, 6-ST) foram cultivadas em meio GS, em frascos rotativos de 1750 cm , ate à confluência. Depois de remover o meio GS e de lavar uma vez (4 horas) com 100 ml de meio de Iskove isento de soro (Behringwerke AG, Marburg, RFA), as células foram incubadas 4 x durante respectivamente 48-72 horas em 500 ml de meio de Iskove isento de soro. Para ambas au linhas celulares atingiranv-se no meio de cultura con-cehtraçSes de AT II superiores a 12 mg/1. A purificação da AT III humana recooíbinanada do sobrenadante 11

da cultura foi efectuada por meio de um processo normalizado (Zettlmenfjl et al. (1989), \er acima).

b) Determinação do ácido sialinico por meio de HPAE-PAD A determinação do teor de ácido sialinico nas diferentes amostras de r-AT III foi feita por processos em si já conhecidos (Hermentin e Seidat, ver acima), através de libertação bidrolítica (0.1 N 1 h, 80°C) separação ("high-pH anion-exchange chromato-graphy", HPAE) e determinação do teor de ácido siali-nico através de "pulsed amperometric detection" (PAD), Na linha celular 42-C1 transferida com Gal a-2, 6--ST, o teor de ácido sialinico revelou-se aumentado em aprox. 40%, relativamente à linha celular 3MK13--Bll não transferida. c) Diferenciação dos glicanos A linha celular 42-cl transferida com Gal a-2, 6--ST e a linha celular 3MK13-B11 não transferida foram analisadas quanto à ligação do ácido sialinico no radical galactose terminal dos N-glicanos presentes na AT III, por processo em si já conhecido, com o auxilio dos "Glycan-Diferentiation Kit" da firma Boehringer Mannheim (Ref· 1142 372). Neste ensaio, o ácido sialinico ligado na forma a-2,3 é reconhecido com o auxílio da lactina de MAA (Maackia amurensis agglutinin) portadora de digoxigenina, e o ácido sialinico ligado na forma a-2,6 é reconhecido com o atfcí-lio da lectina de SNA (Sambucus nigra agglutinin) portadora de digoxigenina, procedendo-se ao chamado "Dot Blor Assay", e num "Sandwich-Assay" é identificado através de uma reaoção corada, com anti-digo-xinina de ovelha, conjugada com o enzima fosfatase alcalina. 12 -

Como controles foram utilizados as seguintes glico--proteínas padrão do "Glycan Differentiation Kit"?

Fetaina: positiva para as lectinas de MAA, SNA e DSA?

Asialofetuina: negativa para a lactina de SNA? Transferrina: (controlo negativo) A aplicação foi feita respectivamente em séries de diluição de 1.01 0.5 e 0.2 ug de glicoproteína por depressão.

Na AT III isolada da linha celular 3MK1-3-B11 não transferrida foi detectada apenas ácido sialínico com ligação a-2.3. Na AT III isolado da linha celular 42-C1 transferida com Gal a-2, 6-ST foi detectado, para além do ácido sialínico com ligação normal a-2, 3, também ácido sialínico com ligação a-2, 6 (Quadro 2) .

Os resultados comprovam que a a-2, 6-sialil-trans-ferase humana, após transfecção da sequência de DNA a restruturar, se mantém activa na linha celular 42--Cl, possibilitanto para além da sialilação normal da antitrombina III humana na posição a-2,3, também uma sialilação na posição a-2.6.

EXEMPLO 4 : Em analogia com os exemplos 1-3 pode obter-se uma sializaçâo melhorada da eritropoietina recombi-nante de diferentes linhas celulares eucarióticas recombinantes. Para tal, dá-se especial preferência às seguintes linhas celulares: BHK, Cl27, CHO. 13 ι·ητΧ*ι5. lfU***~ • .Γ*ν'τν^—rt~l.

Tab .

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ôâztCLjLv^ 3 >j C ^ T TAA C AAA G G G A G C C GATAC CGACCGGCGTGGGCGCGGAGu GuGCG 70 90 110

GCCGCCACCGAGC37GCTGAGCAACCGCAGCCTCCGCGGCCGAGAGTGCAGCGAGCAAGG 130 150 170

GGAGAGCGAGTTGCGCAGAGCCCTGCAACCAGCAGTCCAGGGAGAAGTGGTGAATGTCAT 190 210 230

jGGAGCCCAGCTGAAATGGACTGGCCCCCTTGAGCCTGTCCCAAGCCCTGGTGCCAGGTGT í I 250 270 290

CGATCCGGGTGCGGAGATGAGTTTTGATCATCCTGAGAAAAATGGGCCTTGGCCTGCAGA 310 330 350

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j AGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAA LVTTEKRFLKDSLYNEGILI 1210 1230 1250 :ttgtatgggacccatctgtataccactcagatatcccaaagtggtaccagaatccggatt

VWDPSVYHSDI PKWYQNPDY 1270 1290 1310

ATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACA ‘ÍFFNNYKTYRKLHPNQPFYI 1330 Í350 1370

TCCTCAAGCGCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAG

P W E L W

LQEISPEE 1390 1410 1430

AGATTCAGCCAAACCGCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGT I QPNPPSSGMLGI IIMMTLC 1450 1470 1490

G7GAC CAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAAGACTGACGTGTGCTACT 1 ' D Q V D I Y Ξ FLP S KR KTDVCYY 1510 1530 1550

ACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTATG YQKFFDSACTMGAYHPLLYE i| 1570 1590 1610

i AGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAA

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M ii 1630 1650 1670

jiAAGCGACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTAAGCACAGGCTCCTCACTCTTCTC !'ATLPGFRTIHC 1690 1710 1730

iCATCAGGCATTAAATGAATGGTCTCTTGGCCACCCCAGCCTGGGAAGAACATTTTCCTGA | 1750 1770 1790

iACAATTCCAGCCTGCTCCTTTTACTCTAGGGGCCTCTGTCAGCAAGACCATGGGACTTCA 1 BI 0 1830 1850

AGAGCCTGTGGTCAGGAAATCAGGTCCAGCCTTCCCTGTAGCCAGACAGTTTATGAGCCC 1870 1890 1910

AGAGCCTCCTGCCACACACATGCACACATATCTAGCATTCTTTCCAAGACAGCATCCTCC l - 15 -

1930 1950 1970

CCGCCTTCCACCTTGTAGATGCAAGGTCTATCTCTCCCATCAGGGCTGCCAAAGCTGGGC 1990 2010 2030

TTTGTTTTTCCCAGCAGAATGATGCCATTCTCACAAACCAATGCTCTATATTGCTTGAAG 2050 2070 2090

TCTGCATCTAAATATTGATTTCACGTTTTAAAGAAATTCTCTTAAATTACAATTGTGCCC 2110 2130 2150

AATGCAGGGTGGCTCTGGGGGGCAAGTAGGTGGTACAGGGGATTGGAAACAATCGTCCGC 2170 2188 GCCTCCAGAGAAAAGTTGCTCCCGAGag 16

Tabela 2; Determinação da ligação do ácido sialínico por meio do "glycan Diferentation Kit (Boehringer Mannheim) (Ό C •rH 4J t)3 O (0 o CQ. 0) + + + + + + + + +

• Ό (M • % G O • Ό LO • % C O • Ό O • • G rH rH Q) 3 \ σ A σ m g -P ip 3 <

è < 0 Q 1 rH • rH T 1 Ό CM 0J f0 Ό 1 + + • * 3 G + 1 + G 1 O X CM | σι -P 1 1 0 < 1 *— <u 2 1 • P <! t + + LO σ 2 1 + 1 + • * (0 —' 1 + + C 1 O G 1 -P < 1 IP 2 I 3 m i • < l + + Ό o 1 + 1 t • • 1 » + + C 1 rH (0 c •H15 3 1 ,^-S. 1 rH —, | • rH t 1 Ό CM <u m i + • • 3 % 1 I | + 1 G O \ CM | σ 1 1 A < 1 • ν' 2 | Ό C i —. + • IO σ 3 1 + + + C • f0 s—' 1’ + O G 1 • P + Ό O 4H I + | · • 3 <| 1 + + + G rH <

\ 1 < < d) rl ço çn i—1 0} d d) d o rH O rH G rH 0. o 0 d) •P m G c ,—. 1 Φ <ç P irf o < <n rH C s o 2 rH 1 O co 0 2 W υ rH g O 1 P < —- <0 3 <0 m CM s- G G C G c fO 0 2 <0 CO •H 3 •H o G Ά 3 α d) 0) 0) (0 •H P 0 Ό Ό G G O 0) 0 G (0 fd G > HH > ft H H G 0. d) Η O Ή O H H •H m P rH P o H H 3 o cu 3 0J 3 •H •P > *0 σ> •H Di rH u Eh 0) Ή G o CQ d) O < < p c < G

Auftrag" * aplicação (0 Ό 17

Claims (1)

1. \

   REIVINDICAÇÕES _ lã _ Processo para a sialilação de glicopro-teínes, caracterizado por se levar à expressão numa célula eucariótica uma sequência de DNA codificadora de uma sia-lil-transferase em conjunto com uma sequência de DNA codificadora de uma glicoprotelna a sialialilar, e se isolar a glicoprotdína sialilada assim obtida. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codificador de uma galactosideo alfa-2, 3-sialil-transferase. - 3* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codifi cadora de uma galactosideo alfa-2, 6-sialil-transferase. - 4fl - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codificadora de N-acetilgalactosaminósio alfa-2, 6-sialil--transferase. 18 -

   - 5· - Processo de acordo com a reivindicação 1/ caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codificadora de uma galactosideo alfa-2,3-sialil-transferase humana. - 6» - processo de acordo com a reivindicação 1/ caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codificadora de uma galactosideo alfa-2,6-sialil-transferase humana. - 7a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma sequência de DNA codificadora de uma N-acetilgalactosaminósio alfa-2, 6-sialil--transferase humano. - 8* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se introduzir primeiro na célula euca-riótica a sequência de DNA codificadora da sialil—transfera se em conjunto com um gene marcador* e depois a sequência do DNA codificadora da glicoproteína a sialilar em conjunto com um outro gene marcador. 9* - Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por se introduzir primeiro na célula euca- 19 -

   riótica e sequência dfe DNA codificadora da glicoproteína a sialiar em conjunto com um gene marcador, e depois a sequên cia de DNA codificadora da sialil-transferase em conjunto com um outro gene marcador. - 10· - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se introduzir a sequência de DNA codificadora da sialil-transferase e a sequência de DNA codificadora da glicoproteína a sialilar simultaneamente na célula eucariótica em conjunto com um gene marcador. - 11« - Processo de acordo com uma das reivindicações 11-13, caracterizado por se utilizar como marcador genético as sequências codificadoras da dihidrofolatoreduc-tase, glutamina-sintetase, adenosina-desaminase, timidina-quinase- purcomicina N-acetil-transferase, aminoglicósido 3'-fosfo-transferase. 12· - Processo de adordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem como células eucariéticas células da mamífero. - 13« - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem como células eucariéticas células BHK, Cl27, CHD, células de mieloma do ratinho, células Vero ou células Mela. 20 - I - 14β - Processo para a sialilação de glicopro-teinas, caracterizado por se introduzir uma sequência de DNA codificadora de sialiltransferase numa célula que naturalmente forma uma glicoproteína, e se isolar a glicoproteína sialilada assim obtida. - 15« - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por se utilizar como célula eucariótica células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais. A requerente reivindica a prioridade do pedido alem3o apresentado em 11 de Setembro de 1990, sob o N« P 40 28 800.5. Lisboa, 10 de Setembro de 1991 0 <Jí'i·. íaíj íía INl· L JiJUAii

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