PT98738B - Processo para a producao de um sinal de densidade celular (cds) proteico substancialmente purificado - Google Patents

Description

Titular: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA

Epígrafe: PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM SINAL DE DENSIDADE

CELULAR (CDS) PROTEICO, SUBSTÃNCIALMENTE PURIFICADO

MEMÓRIA DESCRITIVA

Antecedentes da Invenção

Campo Técnico

Esta invenção relaciona-se com a terapêutica e com a regulação do crescimento celular e de funções diferenciadas. Mais especificamente, relaciona-se com moléculas sinal de densidade células produzidas por células fibroblásticas (por exemplo, células de tendão), com os anticorpos que as reconhecem, e com a utilização destas moléculas no tratamento e na reparação de doenças causadoras de danos no tecido conjuntivo, e com a regulação da proliferação celular.

Descrição de Técnicas Relacionadas

A expressão do nivel de colagénio, uma função diferenciada de algumas células fibroblásticas em cultura, está sob a regulação de diversos factores ambientais, um dos quais consiste na densidade celular. No inicio dos anos 60 investigadores observaram que um aumento da produção de colagénio estava dependente de um aumento de densidade celular; mas,

apesar da sua longa história, pouco se sabe sobre o mecanismo de sinalização que permite à célula reconhecer a presença das suas vizinhas e traduzir esta informação numa síntese aumentada de colagénio.

A maioria dos tipos celulares que expressam naturalmente o procolagênio in vivo perdem esta capacidade ao longo do tempo quando colocados em culturas celulares. No entanto, células primárias de tendão de ave (PAT), quando cultivadas num ambiente de cultura celular que permite uma elevada expressão de procolagênio, retêm o potencial de expressão de elevados niveis de colagénio, e, sob este aspecto, demonstram uma sensibilidade à densidade da cultura celular. As células PAT aumentam a sua produção de procolagênio, numa relação directa com a densidade celular, de menos de 10% até cerca de 50% da síntese total de proteínas. Ver, por exemplo, Schwarz, R.I. e M.J. Bissel, Proc. Nat. Acad. Sei. (1977) 74:4453-4457.

A capacidade proliferativa das células em cultura é também consequência da densidade celular. No entanto, tem sido difícil obter uma correlação definitiva uma vez que a proliferação celular é afectada por muitos parâmetros de cultura celular, dos quais a densidade celular é apenas um.

Por exemplo, é dificil distinguir o efeito da densidade per se da possibilidade de as variações de densidade celular serem um subconjunto das necessidades nutricionais da célula. De uma forma semelhante, um acesso diminuído aos factores de crescimento, enquanto as células depositam uma matriz extracelular, pode explicar o efeito da densidade celular. A mudança de meio tem-se revelado suficiente para estimular a divisão celular. Mesmo a simples agitação do meio acima das células pode estimular as células a dividirem-se (Stoker, M. e D. Piggott, Cell (1974) 3:207-215).

contacto celular pode também desempenhar um papel importante, como se demonstra pelo facto de os componentes de membrana, adicionados ao meio, agirem como inibidores da proliferação celular.

Consequentemente, a relação entre a densidade celular por um lado, e a proliferação celular e a expressão de funçOes diferenciadas (expressão do gene do procolagénio no caso das células PAT) por outro lado, tem sido um problema complexo para o qual tem sido particularmente dificil conceber experiências definitivas.

Apesar destes problemas, várias publicações descrevem proteínas que são tidas como capazes de efectuar o desenvolvimento celular dependente da densidade. Por exemplo, um inibidor de crescimento de 40-45 kD dependente da densidade (designado IDF-45), isolado das células de rato 3T3, foi descrito em Harel, L., et al., J. Cell Physiol. (1984) 119:101-106; Harel, L., et al., J. Cell. Physiol. (1985) 123:139-143; e Blat, C., et al., J. Cell. Physiol. (1987) 130:416-419.

Lipkin, G., et al. (Câncer Res. (1978) 38:635-643), e Fass, E., et al. (J. Invest. Dermitol. (1986) 87:309-312) revelam um factor inibitório por contacto, isolado a partir de células melanoclticas de hamster, que recupera o crescimento dependente da densidade para as células do melanoma.

Yaoi, Y. e K. Motohashi (GANN Monograph on Câncer Res. (1980) 25:29-39 revelam um factor de inibição do crescimento de baixo peso molecular (6-8 kD) das células de superfície dos fibroblastos embrionários de pinto.

A invenção em questão revela uma molécula sinal de densidade celular, de natureza proteica, exibindo um peso molecular de, pelo menos, cerca de 25 kD até, pelo menos, cerca de 35 kD, preferencialmente, cerca de 30 kD, que: 1) primeiro se associa com a matriz extracelular das células PAT em cultura; 2) transitoriamente estimula a proliferação destas células; e 3) subsequentemente estimula a expressão do gene do procolagénio.

Sumário da Invenção

Descobriu-se agora uma molécula sinal da densidade celular de natureza proteica (CDS). A CDS é capaz de estimular temporariamente a proliferação de células fibroblásticas em cultura e a partir dai promover a expressão diferenciada de genes. A CDS é segregada por células fibroblásticas, por exemplo, células de tendão, e pode ser obtida livre destas células. Se se desejar, ela pode ser substancialmente purificada.

Este novo polipéptido é segregado por células fibroblásticas, como as células do tendão, e fornece um método através do qual as células auto-regulam a sua proliferação e a expressão de funçOes diferenciadas. A CDS e os anticorpos que a reconhecem, são importantes para o desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos de lesões e doenças envolvendo o tecido conjuntivo, particularmente o tendão.

Mais particularmente, a CDS naturalmente existente nas aves é um polipéptido estimulante do crescimento de 25 a 35 kD, expresso por células tendinosas primárias de ave (galinha) em

cultura, que se crê ser rapidamente ligável à matriz extracelular (ECM) produzida por estas células. Crê-se que esta rápida ligação limita a difusão de CDS e, consequentemente, limita, de uma forma proximal, o efeito proliferativo desta molécula.

Algum tempo após a ligação da CDS à ECM, dá-se um acontecimento subsequente - que não é presentemente compreendido de modo que a actividade da CDS é alterada e torna-se estimulatória para a expressão do procolagénio, uma função diferenciada das células tendinosas das aves.

A CDS pode ser colhida das culturas de células tendinosas por suave agitação. Este tratamento remove uma fracção substancial da CDS da camada celular, e as células que sofreram este tratamento apresentam uma expressão reduzida de procolagénio. A CDS assim recolhida exibe uma actividade estimulatória do crescimento quando voltada a adicionar a culturas de células tendinosas em repouso. Esta caracteristica surpreendente e única da CDS - de que, quer a sua remoção a, quer a sua adição a culturas de células tendinosas é estimulatória do crescimento - é um facto que distingue este polipéptido.

A CDS colhida descrita acima, é encontrada no meio como um complexo multi-molecular com, aparentemente, uma dimensão molecular que é, pelo menos, maior que 30 kD, mais vulgarmente maior que 60 kD e mais geralmente, maior que 100 kD. Após tratamento com um agente destruidor das ligações sulfidrilo, como o DTT, um monómero da molécula de CDS de aproximadamente 30 kD, pode ser identificado.

Um aspecto da invenção é dirigido á CDS isolada, purificada e de ocorrência natural e a fragmentos, mutações e >

suas modificações que retêm as caracteristicas biológicas da CDS.

Ainda outro aspecto da invenção são os métodos de obtenção, isolamento e purificação da CDS.

No entanto, outro aspecto da invenção são os métodos de utilização de CDS para tratamento terapêutico de lesões e doenças do tecido conjunctivo, especialmente do tendão.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um gráfico que apresenta a separação cromatográfica de proteínas isoladas de células de tendão primário de ave. As setas continuas marcam o intervalo de actividade da CDS antes do tratamento com DTT e as setas a tracejado marcam o intervalo de actividade após redução com DTT.

A Figura 2 é uma imagem radiográfica de um SDS-PAGE das fracções de elevado e baixo peso molecular de células marcadas por 12 horas com aminoácidos radioactivos. A coluna A corresponde à fracção >30 kD após tratamento com DTT, a coluna B corresponde à fracção de <30 kD. 0 gel foi exposto a um filme radiosensivel durante um mês, demonstrando assim que não havia mais nenhuma banda marcada na coluna B.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Definições

Autogênico significa derivado do mesmo indivíduo; de uma cultura celular derivada de um individuo; de múltiplos indivíduos consanguíneos; ou de culturas derivadas de múltiplos indivíduos consaguineos.

Expressão diferenciada de genes ou a expressão de função diferenciada é a transcrição e translacção de genes estruturais, outros, para além dos associados com a divisão ou a viabilidade celular . Os polipéptidos expressos deste modo são aqueles que caracterizam células diferenciadas por oposição a células imaturas ou blastos.

A matriz extra-celular (ECM) refere-se a uma rede de macromoléculas sobre, ou no interior das quais, as células subsistem. A matriz extracelular é constituída por, mas não está limitada a, colagénio, laminin, fibronectin, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, etc. In vivo a ECM ê produzida por células da matriz ou por células periféricas e é uma parte integral do tecido do estroma. Em cultura, vários tipos de células necessitam de uma ECM para a expressão de características próprias diferenciadas.

Moléculas proteináceas funcionalmente homólogas exibem as mesmas características funcionais. Por exemplo, uma enzima de uma espécie é funcionalmente homóloga com uma enzima de outra espécie se ambas catalizam a mesma reacção. Assim, as moléculas proteináceas de CDS de diferentes espécies seriam funcionalmente homólogas se exibissem a mesma regulação anfipática de crescimento e função diferenciada para as correspondentes células fibroblásticas autogénicas em cultura.

Um polipéptido inclui o polipéptido de ocorrência natural e todos os fragmentos, delecções, adições, substituições, mutações e modificações do polipéptido natural, que retém as actívidades biológicas do polipéptido de ocorrência natural. Um polipéptido glicosilado, ou com outra modificação, está incluído no âmbito do termo, como é aqui utilizado, e pode também ser mais

especificamente referido como proteoglicano, glicopéptido ou glicoproteina. Uma molécula proteinácea compreende um polipéptido.

Uma cultura primária de células é derivada de tecido In vivo e não de passagens. As culturas primárias podem distinguir-se de linhas celulares e culturas establecidas, principalmente, pela retenção de um cariotipo que é substancialmente idêntico ao cariotipo encontrado no tecido a partir do qual a cultura é derivada, e pelas respostas celulares às manipulações do ambiente, respostas que são substancialmente similares à resposta in vivo.

Meio de crescimento basal não suplementado é um meio de crescimento definido para culturas celulares sem a adição de soro ou outros suplementos de crescimento.

II. Métodos de Realização da Invenção

Sabe-se que células normais em cultura respondem à densidade celular por alteração dos niveis de proliferação e do seu padrão de expressão proteica. Células primárias de tendão de ave (PAT), derivadas de embrião de pinto, são um exemplo desta situação, com uma elevada densidade celular, a produção de procolagénio aumenta cerca de 10 vezes enquanto os niveis de proliferação se aproximam de zero. Na presente invenção, o mecanismo de sinalização, quer para a proliferação quer para a expressão do procolagénio, apresenta-se com características de uma molécula proteinácea de ligações não muito fortes, exibindo uma dimensão de migração em gel SDS de cerca de 25 kD até cerca de 35 kD.

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.. |---------------Esta molécula, que designa o sinal de densidade celular (CDS), é produzida por células fibroblásticas e pode ser isolada do meio de culturas dessas células. Assim, em termos gerais, a molécula de CDS pode ser obtida pelos seguintes processos:

a) preparação de culturas fibroblásticas de células, incluindo células de tendão, derivadas de animais como aves ou mamíferos, e incluindo células embrionârias derivadas dessas fontes;

b) manutenção das culturas num meio de cultura de tecidos como o F-12 sob condições ambientais de crescimento apropriadas, como 37-42°C, elevado grau de humidade, meio suplementado com ascorbato e soro, e niveis elevados de CO2, suficientes para um intervalo de 1-5 dias, de modo a fornecer uma elevada densidade na cultura primária;

c) remoção do meio de crescimento celular das células cultivadas, e sua substituição por um meio adequado para manutenção das células com elevada densidade;

d) agitação das células cultivadas e adição de meio durante um periodo de, pelo menos, um dia e, preferencialmente 2 a 6 dias de modo a facilitar a libertação de CDS das células para o meio;

e) separação do meio e libertação de CDS das células;

f) concentração de CDS e outras proteínas no meio como por precipitação e centrifugação, filtração em gel, ultrafiltraçâo de membrana, e outros semelhantes;

g) fraccionamento da CDS e outras proteínas para remover contaminantes de baixo peso molecular e reter a CDS numa forma complexa de elevado peso molecular que é retida por um filtro de exclusão de 30 kD;

h) tratamento do complexo retido com um agente redutor para libertar a CDS como um material de 25-35 kD; e

i) isolamento da CDS como o material de 25-35 kD tal como por passagem por um filtro de 30 kD nominal ou outros semelhantes.

A CDS assim isolada é formada por um polipéptido e é definida pelo seu tamanho - cerca de 25 a 35 kD e, especialmente, cerca de 30 kD, como se mede por comparação em SDS-PAGE com padrões proteinâceos conhecidos. Caracteriza-se também pela sua actividade biológica - a capacidade de estimular inicialmente a proliferação de células de tendão embrionário em cultura e, a partir dai, promover a expressão de uma função diferenciada, nomeadamente, a expressão do gene do procolagénio. E ainda caracterizada pela sua estabilidade ao calor a 90°C, a sua estabilidade no que respeita ao pH e DTT, tratamento com tripsina, a sua instabilidade aos iões de Tris e sensibilidade à pronase e proteinase K.

Após secreção por células em cultura, a CDS associa-se com a matriz extracelular. No entanto, como se descreve acima, pode ser deslocada da ECM para o meio de cultura por agitação das culturas celulares. Esta acção estimula a proliferação celular apenas sob condições onde havia uma elevada razão meio-paracélula (presumivelmente porque sob estas condições a reassociaçâo é minimizada). Em contraste, sob condições onde havia células suficientes para contribuir para uma elevada concentração de CDS para o meio, a agitação teve pouco efeito, presumivelmente devido a uma elevada frequência de reassociaçâo. Isto sugere que a CDS actua como um inibidor de crescimento.

Por outro lado, a actividade do meio que foi condicionado por agitação sobre culturas convergentes foi estimulatória quando adicionada a uma população de células com uma elevada razão meio-para-célula. Além disso, as células PAT não crescem numa área desprovida de outras células mas dividirse-iam para encher uma área de moderada densidade celular. Esta observação conduz à conclusão oposta de que a CDS é um estimulador de crescimento. Utilizando a actividade promotora do crescimento do meio condicionado como base para a selecção, sabe-se que a CDS apresenta caracteristicas físicas únicas. 0 polipéptido é estável ao calor, pH, e DTT (retenção de mais de 75% da actividade original) mas é sensivel à inactivaçâo por iões Tris (menos de 40% da actividade original). A CDS é resistente à inactivaçâo pela tripsina, mas é sensivel à pronase e à proteinase K. Por cromatografia de exclusão em gel é maior do que 100 kD; mas após tratamento com DTT a sua mobilidade altera-se para aproximadamente 30 kD enquanto retém a sua actividade biológica. A marcação durante a noite, seguida de um simples fraccionamento com base nesta alteração de mobilidade, resultou numa única banda radio-marcada, correspondendo a um peso molecular de, aproximadamente, 30 kD quando sujeito a electroforese em gel SDS-poliacrilamida (análise em gel SDS).

O facto de adicionar CDS ou de a remover (agitação continua para um grade volume de meio) dá as mesmas respostas celulares estimulatórias do crescimento, e crê-se que isto é devido ao facto de a CDS possuir diferentes actividades dependendo da sua apresentação à célula. A CDS em meio condicionado é um agregado que se pode ligar à matriz celular e, nesta forma, actua como um estimulador de crescimento. No entanto, uma vez ligado à matriz extracelular, a CDS pode formar um complexo consigo própria ou com um factor até ao momento desconhecido, de tal modo que nessa altura actua como uma inibidora do crescimento e indutora da produção de procolagénio.

A. Crescimento de Células Primárias de Tendão de Ave em Cultura

As células PAT foram isoladas a partir de embriões de pinto com 16 dias de idade por uma modificação do método de Dehm,

P e D.J. Prockop (Biochem. Biophys. Acta. (1971) 240;358-369), aqui incorporado por referência. Salvo especificações em contrário, as células foram semeadas em frascos de cultura de 2 tecidos de 25 cm e postas a crescer em meio F12 suplementado com 0,2% de soro bovino fetal e 50 microgramas/ml de ascorbato (Schwarz et al., 1979).

Quando era requerida uma elevada razão meio-para4 célula, as células (10 ) em meio sem soro eram semeadas dentro de um anel de clonagem de vidro (6 mm diâmetro interno), que foi colocado dentro de um prato de cultura de tecidos Standard (60 mm de diâmetro). 0 meio foi colocado no exterior do anel de clonagem para igualar a pressão hidrostática. Após 1 hora, quando as células já haviam aderido, o anel de clonagem foi removido. O meio foi alterado para meio F12 (5 ml) suplementado com 0,2% de soro bovino fetal (Gibco) e 50 microgramas/ml de ascorbato. Sob estas condições descobriu-se que as culturas correspondiam melhor às espectativas para uma concentração mais elevada de C02 (3 X bicarbonato, 15% de CO2). Consequentemente, todas as células cresceram a uma concentração mais elevada. Células que cresceram em meios em que a razão meio-para-célula era normal nao foram afectadas pela concentração mais elevada de CO2·

B. Purificação da CDS meio de crescimento com 0,2% de soro foi substituído 2 por meio basal (6 ml de F12 para frascos de 150 cm ) em culturas celulares de densidade mais elevada tendo sido suavemente

I agitadas (60 rpm num agitador de rotaçao) a cerca de 39°C durante 1 h. Este procedimento efectuou-se duas vezes por dia durante 4 dias. 0 meio condicionado isento de células foi guardado a 4°C (é estável durante meses).

O sulfato de amónio foi adicionado para obtenção de uma solução saturada a 40-60 %, preferencialmente a 50% (4°C) e deixado em contacto durante a noite. A mistura foi centrifugada a aproximadamente 35.000 rpm durante 30 minutos (rotor 45 Ti, Beckman). 0 precipitado foi resuspenso em solução salina fosfato tamponada (PBS) e concentrado por ultrafiltraçâo (filtro de exclusão 30 kD, CX-30; Milipore). 0 produto assim obtido foi de novo diluido e reconcentrado para reduzir ainda mais a concentração de ião amónio que é tóxico para as células . A concentração final foi ajustada a uma concentração de 100 X quando comparada com o volume de meio original. A diluição para 1 X a concentração deu uma actividade estimulatória do crescimento aproximadamente igual às do meio condicionado original.

O concentrado foi tratado com DTT 10 mM (ditiotreitol) durante 30 minutos a 37°C. 0 produto assim tratado foi, de novo, passado por um ultrafiltro de 30 kD (PF-30, Milipore). O ultrafiltrado reteve cerca de metade da actividade biológica do meio original.

Para marcar a CDS, as células (frascos de 25 cm , 5 ml) foram marcadas com 1 mCi de aminoácido radioactivo no meio de crescimento durante a noite. 0 meio marcado foi removido e o meio basal (1 ml) foi adicionado e condicionado por agitação (como acima). O passo de precipitação com amónio não foi necessário e o meio foi concentrado e diluido várias vezes com PBS para reduzir ) os niveis de marcador não incorporado. Finalmente, a mistura sofreu uma concentração para 100 microlitros e tratada com DTT, como se refere acima. Após uma ultrafiltraçâo de 30 kD tanto o filtrado como o retido foram aplicados num gel de PAGE SDS (3% depósito, 15% resolução). 0 gel foi impregnado com Enhance (incrementador) (NEN) e exposto a um filme de raios-X a -70°C.

C. Avaliação da Expressão do Gene do Procolagénio A hibridação in situ é frequentemente utilizada como um método de distinção de certas células numa população mista baseada na presença de um RNAm especifico. Esta técnica pode ser utilizada quantitativamente para demonstrar o efeito das alterações das densidades celulares nas quantidades de RNAm do procolagénio em células individuais. Esta técnica permite as medições mais directas e menos ambiguas das relações entre a densidade celular e expressão diferenciada de genes - para as células PAT, a expressão de procolagénio.

As células PAT foram fixadas com paraformaldeido a 4% em PBS (10 min.) seguido de lavagem em glicina 0,1 M em PBS. Após fixaçao, as células foram cobertas com 2 ml de solução de hibridaçâo (formamida desionizada a 60%, PIPES 0,1 M pH 6,4, NaCl

0,4 M, RNA poli A a 5% [2,5 mg/ml]). Após pré-hibridaçâo durante várias horas a 55°C, a solução de hibridaçâo foi alterada, foi -lhe adicionada uma sonda marcada, e as células foram hibridadas por 48 h. Exceptuando referências em contrario, foi utilizada uma sonda marcada de 2 X 10^ cpm com uma actividade especifica de 3,3 7

X 10 cpm/micrograma.

Após hibridaçâo, as células foram lavadas duas vezes durante uma hora em Triton X-100 em 2X SSC a 55 °C e depois 2X durante 1 hora en Triton X-100 a 0,1% em SSC a 0,1% a 60°C. As células foram desidratadas com lavagens com álcool graduado e depois cobertas com uma emulsão fotográfica (NBT2, Kodak). Os tempos de revelação variaram dependendo da actividade especifica da sonda. Com a actividade Standard especifica referida acima, o tempo de exposição foi de duas semanas. Várias experiências anteriores utilizaram uma sonda de actividade especifica duas 3 3 vezes maior (por marcação com H-ATP e H-UTP) e o tempo de exposição foi, correspondentemente, encurtado para uma semana. As células foram coradas com Wrights.

Em experiências quantificando a quantidade de sonda HRNA hibridada, a camada celular foi solubilizada utilizando SDS a 1% e o nivel de radioactividade medido por contagem de cintilaçOes.

As células fixadas foram tratadas do mesmo modo que na hibridaçâo dot-blot (um procedimento conhecido dos especialistas neste campo): o volume de solução de hibridaçâo foi da ordem dos mis; não foram utilizados outros pré-tratamentos para além da pré-hibridaçâo; e apenas soluçOes de sais e detergentes foram usadas nas lavagens de pós-hibridaçâo.

Utilizando técnicas de hibridaçâo dot-blot no RNAm extraído, já foi anteriormente revelado por Rowe, L.B. e R.I. Schwarz, (Mol. and Cell. Biol. (1983) 3:241-249) que o tratamento com ascorbato pode aumentar a produção de RNAm para o procolagénio cerca de 5 vezes em culturas de células PAT. Utilizando uma técnica de dot-bolt in situ para células induzidas e n3o induzidas pelo ascorbato, manteve-se a observação de um

I aumento aproximado de 5 vezes para o RNA.

A cinética da reacção foi muito mais lenta do que outros referiram, sendo cerca de duas ordens de magnitude mais lenta do que uma hibridaçâo dot equivalente, mas seguindo uma função exponencialmente decrescente indicativa de uma reacção de pseudo primeira ordem. No caso das células induzidas pelo ascorbato, os niveis iniciais de uma sonda não homóloga com um número igual de contagens teve inicio (1,5 h) a 13% e terminou (42 h) a 3% do sinal especifico. Os grandes volumes de solução e a falta de desidratação celular anteriormente à hibridaçâo, >

contribuem, provavelmente, para uma cinética mais lenta sob estas condições, por entrada lenta da sonda na célula. Esta diferença não parece ser devida às dimensões da sonda, uma vez que sondas de diferentes tamanhos (0,2 a 2 kB) hibridaram igualmente bem com as células PAT. Os dados são consistentes com o passo limitante da velocidade na reacção de hibridaçâo in situ uma vez que a entrada de sonda na célula se faz através de um número limitado de portas.

De maior importância, utilizando condições de concentração de sonda relativamente elevada, com longos tempos de incubação, a quantidade de sonda hibridada in situ reflecte o nivel de RNAm na célula. Nos exemplos descritos abaixo, a detecção foi por autoradiografia e a concentração relativa de RNAm do procolagénio reflectiu-se nas densidades de grão de prata expostas sobre células individuais e isto variou na ordem de magnitude com a densidade celular.

Esta técnica é muito mais especifica, precisa e sensivel que outras técnicas previamente utilizadas para medir efeitos nas culturas de expressão de genes do procolagénio. Mais ainda, ela permite a observação de diferentes efeitos de diferentes densidades celulares no mesmo prato de cultura.

D. Sequenciação da CDS

A CDS purificada, recuperada e isolada a partir do filtrado da ultrafiltração, é sequenciada sujeitando cerca de 100 pmoles (estimadas a partir da intensidade de coloração em gel de acrilamida) a um aparelho automatizado de degradação, Edman, utilizando um propulsor Applied Biosystems 477A sequenciador de proteínas em fase liquida.

A sequenciação N-terminal pode não ser adequada para suportar esforços para clonar os cDNAs da CDS. Por exemplo, a CDS pode ser bloqueada ou modificada na extremidade N-terminal ou, alternativamente, a sequência N-terminal pode não apresentar regiões favoráveis para a geração de sondas oligonucleotidicas. Neste caso, a CDS é digerida com uma protease (e.g., V8— Ver Harlow, E, & Lane, D. Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989) e os fragmentos peptidicos são purificados

com vista a gerar sequências adicionais de informação. Nestes casos, a proteína é concentrada para um volume de 5 microlitros por centrifugação no vácuo e é depois digerida. Os fragmentos de protease são purificados para sequenciação por HPLC em fase reversa utilizando uma coluna de diâmetro estreito, Brownlee RP 18 e um cromatógrafo liquido, Applied Biosystems 130A, desenhado especificamente para purificação de amostras de pmoles.

As sequências de dados assim obtidas são comparadas com sequências proteicas conhecidas por pesquisas computorizadas da Protein Identification Resource da NBRF, e do banco de dados Suiço de proteínas, de modo a determinar a sua novidade ou qual a sua relação com outras sequências proteicas.

E. Pesquisa de Patrimónios de cDNA e a Clonagem Molecular do DNA Codificante para a CDS

Culturas primárias de células de tendão de aves podem ser utilizadas para preparar um património de cDNA no qual é então pesquisada a presença de sequências particulares de DNA que codificam polipéptidos especificos de CDS. As técnicas para a preparação de um património de cDNA são vulgarmente utilizadas, descritas em manuais de laboratório e do conhecimento dos peritos nestes assuntos. A preparação destes patrimónios de cDNA é descrita em detalhe em Maniatis, T. et al, Molecular Cloning, (1982) CSHL Press. Uma tentativa conveniente é a inserção de fragmentos de cDNA num vector fago lambda e. g. lambda gtlO ou lambda gtll como foi descrito por Maniatis, supra.

Os métodos de pesquisa de patrimónios de cDNA são também bem conhecidos daqueles que trabalham nestas áreas. A sequência aminoacidica da CDS é analizada utilizando programas da

DNAstar (Madison WI) com vista à identificação de regiões óptimas para a construção de sondas oligonucleotidicas. Sondas oligonucleotidicas redundantes são sintetizadas com um sintetizador de DNA (380A: Applied Biosystems Inc. Foster City

CA) pelo método da fosforamidite. Os oligonucleótidos são purificados em colunas de Sephadex G-50 e guardados a -20°C. As 32 sondas redundantes são 5'- marcada com τ-[ P]ATP (E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Boston, MA) utilizando a polinucleótido quinase T4. Os patrimónios são pesquisados utilizando até 10® placas individuais por património, com as sondas oligonucleotidicas redundantes. Membranas de nylon duplas contendo o fago são preparadas e pré-hibridadas em 5 X SSPE (NaCl 0,9 Μ, NH2PO4 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4), SDS 0,2% e DNA de esperma de salmão desnaturado 0,005% durante 2 horas a 50°C com 8 filtros por cada 50 ml de fluido de pré-hibridização por saco. As membranas são hibridadas com aproximadamente 1 ng de sonda marcada por ml, em fluido de hibridação fresco, durante a noite, a temperatura apropriada para a mistura de sonda redundante. As membranas são então lavadas à temperatura ambiente durante 45 min. num litro de 5 X SSPE por 40 filtros, seguida de uma lavagem de 1 minuto em tampão fresco a 50°C, levemente seco ao ar e exposto a um filme Kodak XAR-5, com filtros de intensificação, durante 72 horas a -70°C.

Após as análises, os filtros são privados do marcador de hibridação por incubação em 5 X SSPE a 70°C durante 10 minutos e subsequentemente hibridados com uma segunda sonda sob as mesmas condições. Este procedimento é repetido para cada sonda. Os clones recombinantes que se hibridam com sondas vão ser seleccionados dos patrimónios e purificados em placas.

DNA fágico recombinante ê então purificado e digerido com uma endonuclease de restrição apropriada para libertar a inserção de cDNA amplificada. As inserçOes são então ligadas em séries de fagos M13mp e sequenciadas utilizando o método dideoxi descrito por Sanger (Biggin, M.D. et al, Proc Nat Acad Sei (1983) 80:3963). Dependendo das dimensões do cDNA, pode ser necessário limitar o clone, e subclonar os fragmentos em M13. Se os clones de cDNA não estão completos, seria necessária uma repetição da pesquisa do património com o cDNA parcial.

A sequência completa do cDNA da CDS é então comparada com sequências conhecidas do banco de dados GenBank. 0 DNAstar é utilizado para análises de nucleótidos e polipéptidos e comparações da sequência.

Inserções de cDNA seleccionadas que codificam para a CDS podem então ser incorporadas num sistema de expressão. 0 cDNA está operacionalmente ligado a sequências de controlo heterólogas para formar um vector de expressão. As sequências de controlo são escolhidas para ser funcionalmente compatíveis com a célula hospedeira recombinante na qual o vector de expressão é introduzido. Estes procedimentos são do conhecimento dos peritos nestas técnicas e descritos em Maniatis, supra.

A expressão pode ser em sistemas procariotas ou eucariotas. Os procariotas, mais frequentemente, são representados por várias estirpes de E. coli. No entanto, outras estirpes microbianas podem também ser usadas, como a bacillus ou (e.g. Bacillus subtilis), várias espécies de Pseudomonas, outras estirpes bacterianas. Nestes sistemas procariotas, são utilizados vectores plasmidicos que contêm sites de replicação e sequências de controlo derivadas de uma espécie compatível com o hospedeiro. Por exemplo, a E. coli é tipicamente transformada utilizando derivativas de pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli por Bolivar et al., Gene (1977) 2i95.

Sequências procarióticas de controlo vulgarmente utilizadas, que sâo aqui definidas para incluir operons com promotores para a iniciação da transcrição, opcionalmente com um operador, juntamente com sequências que constituem sites de ligação para os ribossomas, incluem promotores vulgarmente utilizados, como o promotor beta-lactamase (penicilinase), o sistema promotor lactose (lac) (Chang et al., Nature (1977) 198;1056), o sistema promotor triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res (1980) Í3:4057), o promotor PL derivado de lambda e o site N-gene de ligação do ribossoma (Shimatake et al., Nature (1981)

292:128). Qualquer sistema promotor disponível, compatível com os procariotas, pode ser utilizado.

Os sistemas de expressão úteis em hospedeiros eucariotas compreendem promotores derivados de genes eucariotas apropriados. Uma classe de promotores úteis nas leveduras, por exemplo, inclui promotores para a sintese de enzimas glicoliticas, incluindo aquelas para a 3-fosfoglicerato quinase (Hhitzeman et al., J Biol Chem (1980) 255:207). Outros promotores incluem os do gene da enolase (Holland, M.J., et al. J Biol Chem (1981) 256:1385) ou o gene Leu2 obtido a partir de YEpl3 (Broach, J., et al., gene (1978) 8:121).

Promotores de mamiferos adequados incluem a metalotionina, os primeiros promotores e os posteriores de SV40 (Fiers et al., Nature (1978) 273:113), ou outros promotores virais como os derivados do polioma, adenovirus II, papilloma virus bovino ou retroviroses. Podem também ser utilizados intensificadores de origem virai ou provenientes de mamiferos. Neste caso, as células vegetais são utilizadas como um sistema de expressão e é apropriado o promotor de sintese nopalino (Depicker, A., et al., J Mol Appl Gen (1982) 1:561).

i 0 sistema de expressão é construído a partir dos elementos de controlo referidos que estão operacionalmente ligados às sequências de CDS por utilização de técnicas Standard de ligação e restrição que são bem conhecidas dos peritos nestes assuntos. Os plasmídeos isolados, sequências de DNA, ou oligonucleótidos sintetizados, são clivados, talhados e voltados a ligar sob a forma desejada.

Outros sistemas para a expressão dos cDNAs codificantes para a CDS incluem células de insectos e vectores adequados para utilização nessas células. Estes sistemas são do conhecimento dos peritos nestes assuntos, e incluem, por exemplo, vectores de transferência de expressão de insectos derivados do virus de núcleo poliédrico (AcNPV) do baculovirus Autographa californica, que è um ajudante independente e um vector de expressão virai. Vectores de expressão derivados deste sistema geralmente utilizam o promotor virai forte do gene da poliedrina para conduzir a expressão de genes heterólogos. Correntemente, o vector de transferência mais comum para a introdução de genes estranhos no AcNPV é o pAc373 (Fig. 70). Muitos outros vectores, do conhecimento dos peritos nestas técnicas, foram também desenhados para melhorar a sua expressão. Estes incluem, por exemplo, pVL985 (ver Luckow e Summers (1989)).

Os métodos para introdução de DNA heterólogo no site desejado no virus baculovirus são do conhecimento geral (ver Summer e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555; Ju et al. (1987); Smith et al. (1983); e Luckow e Summers (1989)). Por exemplo, a inserção pode ser num gene como o gene da poliedrina, por recombinação homóloga; a inserção pode l também ser no site de uma enzima de restrição criado no desejado gene do baculovirus. As sequências inseridas podem ser aquelas que codificam todos, ou vários segmentos, da poliproteina.

Os sinais para as modificações pos-translacionais, como o sinal para a clivagem peptidica, clivagem proteolltica e fosforilaçâo, parecem ser reconhecidos pelas células dos insectos. Os sinais requeridos para a secreção e acumulação nuclear também parecem estar conservados entre as células dos invertebrados e dos vertebrados. Exemplos das sequências de sinais de células de vertebrados que também são eficazes em células de invertebrados são do conhecimento dos peritos, por exemplo, o sinal da interleucina humana 2 (IL2_S) que é um sinal para transporte para fora da célula, é reconhecido e correctamente removido em células de insectos.

F. Análise das Sequências Genómicas do DNA da CDS em Mamíferos

Os genes codificantes para a CDS são obtidos a partir de patrimónios genómicos de galinhas (disponíveis da Clontech, Paio Alto, Califórnia) ou vários mamíferos (geralmente disponíveis, em fago, a partir da ATCC ou fontes comerciais). Por exemplo, um património genómico humano ou células de figado fetal no fago Charon 4A está disponível (ATCC 37333). 0 património g

contém 10 recombinantes independentes com uma dimensão de inserção de 15-20 kb e é essencialmente pesquisado com o cDNA, como se descreveu previamente.

Os fagos são sequencialmente adsorvidos em filtros duplos de membrana de nylon de 8X8 cm. Os filtros são préhibridados em 5 X SSPE, formamida a 50%, 5 X solução de Denhardt, SDS a 0,5% e DNA de esperma de salmão desnaturado a 0,005% durante 2 horas a 42°C com 8 filtros por 50 ml de fluido de préhibridação. Os filtros são hibridados com, aproximadamente, 1,0 ng de cDNA de ave, marcado, por ml de fluido de pré-hibridaçâo fresco, contendo 10% de sulfato de dextrano e 2 X solução de Denhardt, durante a noite a 42°C.

rigor de emparelhamento da solução de hibridaçâo pode ser ajustado considerando a não homologia entre os polipéptidos de CDS das aves e dos mamíferos. O rigor de emparelhamento pode ser diminuída para aumentar a tolerância para a falta de emparelhamento na hibridaçâo por aumento da concentração salina e/ou diminuindo a temperatura de hibridaçâo. 0 grau de não homologia vai variar dentro das diferentes regiões dos polipéptidos homólogos funcionais. Geralmente, os sites de actividade homóloga funcional vão demonstrar o maior grau de homologia. Estes sites são previsíveis baseados em análises da estrutura do polipéptido de CDS das aves. Várias sondas codificantes para várias regiões do polipéptido CDS vão ser usadas para optimizar a localização de regiões de elevada conservação.

cDNA da CDS proveniente das aves é marcado com 32 alfa P dCTP e purificado por cromatografia em Sephadex G-50. Os filtros são então lavados duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em 1 litro de 2 X SSPE e SDS a 0,2% por 40 filtros, seguido de duas lavagens a 50°C, de 15 minutos cada, em 0,1 X SSPE e 0,2% SDS, levemente secos ao ar e expostos a um filme kodak XAR-5 com filtros de aumento de intensidade, durante horas a -70°C.

Os clones positivos são seleccionados do património e purificados em placa. Várias sondas derivadas do cDNA são utilizadas para determinar se existe ou não uma cópia completa do gene contida no clone genómico. 0 DNA fágico recombinante é então extraído, purificado e sujeito a uma digestão de restrição todos estes processos são bem conhecidos dos peritos nestas áreas. Os Southern blots dos fragmentos de restrição são hibridados com o cDNA da CDS para identificar fragmentos contendo o gene da CDS. Estes fragmentos são então isolados e sequenciados. A partir desta informação constroi-se um mapa de restrição e os introns do gene são identificados.

G. Preparação de Anticorpos para a CDS

Duas tentativas são utilizadas para conseguir anticorpos para a CDS e ambas podem ser usadas para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais. Numa das tentativas o CDS purificado e desnaturado é obtido em quantidades até 75 microgramas, e utilizado para imunizar ratos utilizando protocolos Standard; cerca de 25 microgramas são adequados para a

......__________ imunização. Para pesquisa dos hibridomas, a CDS desnaturada, que é solúvel em 0,1% de TFA e acetonitrilo, pode ser radioiodinada e utilizada para pesquisa de hibridomas de células B de murino para aquelas que produzem anticorpos. Este procedimento requer apenas pequenas quantidades de CDS de modo que 20 microgramas é suficiente para a marcação e pesquisa de vários milhares de clones.

Na segunda tentativa, a sequência aminoacidica da CDS, como se deduz do gene, é analizada para determinar regiOes de elevada imunogenicidade. Os polipéptidos correspondentes são sintetizados e são utilizados em protocolos de imunização adequados para criar anticorpos. A análise para seleccionar epitopos apropriados está descrita em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Vol. 2, Sec. IV, ppll.14.1, 1989). As selecções óptimas são geralmente o terminal-C, o terminal-N e as regiOes internas do polipéptido que mais provavelmente estarão expostas ao ambiente externo quando a molécula se encontra na sua conformação natural (esta determinação é baseada no caracter hidrofilico dos sites). Tipicamente, os péptidos seleccionados, cerca de 15 residuos de comprimento, são sintetizados utilizando um Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 43IA utilizando a quimica-fmoc e acoplado à abertura fixa da hemocianina (KLH; Sigma) por reacção com o éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) (ver Ausubel et al, supra at pp 11.15.1). Uma cisteina é introduzida na extremidade N-terminal do péptido para permitir a acoplagem à KLH. Os coelhos também são imunizados com o complexo péptido-KLH em adjuvante completo de Freund e o antisoro resultante testado ' 'HSSf· para actividade antipeptidica, por exemplo, por ligação do péptido ao plástico, bloqueado com BSA a 0,1% reagindo com o antisoro, lavando e reagindo com IgG de afinidade especifica, radioiodinada e purificada, proveniente de uma cabra e anticoelho.

Os hibridomas podem também ser preparados e pesquisados utilizando técnicas Standard. Os hibridos são pesquisados utilizando CDS radioiodinada para identificar aqueles que produzem anticorpos monoclonais. Num protocolo típico, pontas de placas (FAST, Becton-Dickinson, Paio Alto, CA), são revestidas com anticorpos purificados de afinidade especifica provenientes de coelhos e com actividade anti-rato (ou imunoglobulinas especificas anti-espécie) a 10 microgramas/ml. As pontas revestidas são bloqueadas com 0,1% de BSA, lavadas e expostas aos sobrenadantes dos hibridomas. Após incubação as pontas são expostas a proteínas marcadas radioactivamente, 1 ng/ml. Os clones produtores de anticorpos vão estar ligados a uma certa quantidade de radioactividade que é detectável acima do ruido de fundo. Estes clones são expandidos e sujeitos a dois ciclos de clonagem de 0,3 células/cúpula. Os hibridomas clonados são injectados em ratos tratados com pristina para produzir ascites e o anticorpo monoclonal é purificado a partir do fluido ascitico por cromatografia de afinidade em proteína A.

EXEMPLOS

Exemplo 1; Caracteristicas do Crescimento em Cultura das Células PAT

As células PAT adaptam-se rapidamente ao ambiente de culturas celulares e, como culturas primárias, apresentam o fenótipo normal esperado para os fibroblastos em cultura. As células PAT apresentam dois efeitos de densidade celular comuns na proliferação celular: uma necessidade minima de densidade celular com vista ao crescimento e uma inibição de crescimento a densidades celulares mais elevadas.

Ambas as respostas às densidades celulares podem ser observadas ao mesmo tempo por estabelecimento de um gradiente de densidade celular dentro de uma cultura de células PAT. Isto foi efectuado inicialmente por sementeira de células num anel de clonagem (6 mm de diâmetro num prato de 60 mm) e remoção do anel depois de as células se lhe colarem. Uma vantagem desta tentativa foi o facto de a razão meio para célula ser grande (minimizando assim efeitos de condicionamento) enquanto que ao mesmo tempo se criou no interior do prato, um gradiente de densidade celular.

As células PAT apresentaram uma resposta única para esta situação. Apresentaram uma capacidade limitada de crescimento numa área desprovida de células - apenas expandindo a área inicial num diâmetro de 6-7 mm. Em contraste, as células dentro da área inicialmente semeada cresceram rapidamente até à confluência. Nesta altura, as células situadas na orla de baixa densidade começaram a morrer. Isto tornou-se evidente pela morfologia arredondada destas células e foi também confirmado por coloração com azul de tripano.

Este efeito não foi devido a uma toxicidade do meio. Se se utilizar um instrumento capaz de raspar e remover metade do circulo de células, as células da nova orla cresceriam para fora e formariam uma nova orla de baixa densidade mesmo enquanto as células que permaneceram na orla inicial morriam. Similarmente, se apenas uma estreita estria fosse removida do circulo de células, as células eram capazes de encher a estria excepto na juntura das nova e velha orlas. Este ponto de mais baixa densidade celular possuiam um recorte distinto no sentido do centro do circulo. Isto demonstrou que as células PAT podem condicionar um micro-ambiente, localizado dentro de uma cultura celular, para o crescimento desde que esteja presente uma densidade de células minima.

Exemplo 2: 0 Efeito da Densidade Celular na Expressão do Gene do Procolagénio

Previamente, a insensibilidade dos ensaios empregues 5 requeria que um valor médio de cerca de 10 células fosse utilizado para analizar as alterações de densidades celulares no precurso do colagénio. Com um ensaio de hibridaçâo in situ para niveis de RNAm para o procolagénio, os efeitos da densidade celular podem ser analizados numa célula numa base celular e pode ser observado o efeito de diferentes densidades celulares dentro da mesma cultura.

As células PAT foram inicialmente semeadas no interior de um anel de clonagem de 6 mm de diâmetro colocado no centro de um disco Standard de cultura tecidular de 60 mm como se descreve no Exemplo 1. Após uma hora, quando as células já haviam aderido

I ao disco, o anel de clonagem foi removido. As células foram cultivadas durante 5 dias, periodo de tempo após o qual se haviam tornado confluentes no centro do anel original. As células PAT revelaram apenas uma capacidade limitada para crescerem para fora, para o espaço à periferia do anel desprovido de células, de modo que, pelo fim dos 5 dias, o circulo de células se havia apenas expandido para 7 mm. Esta expansão foi suficiente para estabelecer um bordo de células de baixa densidade enquanto as células no interior do circulo possuiam uma elevada densidade celular.

A distribuição de densidades celulares causou uma grande variação nos niveis de RNAm do procolagénio. Estas células numa densidade confluente no centro do anel, continham niveis elevados de RNAm do procolagénio como é evidenciado pela grande quantidade de grãos de prata expostos sobre elas. Em contraste, as células do bordo de baixa densidade possuiam baixos niveis de RNAm do procolagénio. Foram obtidos resultados muito similares quando foi criado o gradiente de densidade celular por cultura de células num frasco de cultura celular em rampa.

Nas experiências em que as células foram inicialmente restringidas por aneis de clonagem havia uma elevada relação de volume do meio para número de células, no entanto, as células continuaram a responder à densidade celular. Isto seria incompatível com modelos simples onde a CDS age como um factor estável que se acumula no meio e onde se pensa que a CDS é prontamente difundida uma vez que o seu efeito teria sido diluido.

Exemplo 3ϊ Células Confluentes Expressam Funções Diferenciadas mas Retêm a Capacidade da Divisão Celular

Apesar da uniformidade morfológica das culturas celulares PAT, é possível que células que se encontram à periferia de um aglomerado confluente sejam um subgrupo único da população. Neste caso, parte do gradiente de expressão de procolagênio descrito acima pode resultar da selecçâo de um tipo de célula proliferativa que produz quantidades menores de procolagênio.

Para testar isto, as células PAT foram inicialmente semeadas em aneis de clonagem, como se descreveu acima e permitese o seu crescimento num circulo confluente de células. 0 bordo de um raspador de células foi utilizado para remover duas faixas prependiculares de 1,7 mm, atrvês da área circular de células (~6mm) formando uma cruz. Esta distância era suficientemente pequena de modo que, as células crescendo para fora de ambos os lados juntar-se-iam no meio e preencheriam completamente o espaço. A hibridação in situ revelou que as células que faziam parte da frente de migração produziam elevados niveis de procolagênio à medida que a densidade celular aumentava. Em contraste, quando metade do circulo celular foi retirado por raspagem, as células PAT da zona de migração para um espaço livre apresentavam baixos niveis de expressão de procolagênio no bordo constituído por células de baixa densidade.

Assim, alterações nos niveis de RNAm do procolagênio, em células individuais, na frente de crescimento, não são devidas a selecçâo celular, mas devidas ao efeito da densidade celular.

Exemplo 4: Acumulação da CDS na Camada Celular facto de a CDS não ser alterada pelo volume do meio sugere que o sinal molecular se acumula na camada celular, possivelmente na matriz extracelular (ECM). Uma previsão desta hipótese é o facto de que uma vez que o sinal se acumula, a sua concentração na camada celular ou na ECM deve ser independente da presença continuada de células.

Um modo de testar este conceito é raspar uma porção de um aglomerado celular de modo que se iniba a migração celular i para uma área da qual foi removida a ECM.

Para conseguir isto, as células foram inicialmente colocadas em aneis de clonagem em pratos e foi-lhes permitido o crescimento em circulos confluentes. Metade do circulo celular foi raspado com uma lâmina de raspagem. Isto tornou rugosa a superfície do disco de plástico e impediu as células de migrarem para fora. Após 48 h (um pouco mais de duas semi-vidas para o

RNAm do procolagénio), as células retiveram elevados niveis de

RNAm para o procolagénio no bordo rugoso. 0 próprio bordo enrugado não estimulou a sintese de RNAm do procolagénio como se I evidencia pelo facto de as células localizadas na junção do bordo enrugado e o bordo natural do circulo (onde se provou que a sintese do RNAm do procolagénio é baixa) apresentou niveis muito baixos de sintese de RNAm para o procolagénio.

As células do bordo sujeito a raspagem, continuaram a manter niveis elevados de RNAm para o procolagénio embora apenas metade das células estivesse na sua imediata vizinhança. Isto é consistente com a ligação de um factor à ECM.

5,

Exemplo 5: Agitação Suave Remove a CDS da ECM

Pode demonstrar-se, por agitação do meio acima da monocamada de células PAT e monitorizando os efeitos na expressão do colagénio e proliferação celular, que a CDS é um componente liberto de ligaçao à ECM. Outros demonstraram que os factores de crescimento podem ser influenciados pelo fluxo laminar do meio sobre células em cultura (Dunn, G.A. & G.W. Ireland, Nature (1984) 312:63-65).

Na observação dos efeitos na expressão do colagénio, foram usadas duas situaçOes: uma quando as células foram inicialmente semeadas num anel de clonagem e a segunda quando as células foram semeadas regularmente sobre toda a placa. A diferença essencial entre estas duas situaçOes está na razão de volume do meio para o número de células. As culturas celulares cresceram a 39°C até à confluência e depois colocadas numa plataforma de apoio durante dois dias (as placas controle foram deixadas sem agitação).

efeito da agitação estava dependente da razão meio para células. No caso das células semeadas regularmente sobre a placa, a agitação de culturas confluentes não teve qualquer efeito. Em contraste, com células inicialmente semeadas em aneis de clonagem, a agitação de culturas confluentes causou uma diminuição no nivel de RNAm para o procolagénio e a quebra da dependência em relação à densidade celular.

Isto é consistente com um modelo onde a CDS é um componente de ligação liberto do ambiente extracelular da célula e a agitação liberta a CDS para um grande volume de meio, essencialmente removendo-a das células por diluição e inibindo a expressão do RNAm para o procolagénio. Por outro lado, a agitação de discos confluentes num volume relativamente pequeno de meio poderia evitar a diluição da CDS (uma alteração de cerca de 2 ordens de magnitude na razão), resultando num elevado nivel de reassociação da CDS com a camada celular e um pequeno ou nenhum efeito celular.

Estas experiências foram repetidas, mas ao invés de procurar o efeito da razão meio para células na sintese de procolagénio, as células foram ensaiadas para proliferação utilizando um pulso de H-timidina, uma técnica de medida de crescimento do conhecimento dos peritos neste assunto. Obteve-se um resultado similar. No caso de células semeadas em aneis de clonagem e agitadas durante 24 horas, houve um aumento dramático no número de núcleos marcados quer no bordo quer no centro de confluência. Em apertado contraste, pratos de cultura que foram semeados regularmente apresentaram um pequeno efeito resultante da agitação do meio.

No estado de não agitadas, uma célula numa densidade de confluência desconhece se esta densidade celular existe em apenas alguns mm ou sobre todo o prato. A resposta das células no centro de confluência do anel é para reduzir o crescimento e aumentar a expressão do procolagénio, inalterado pelo grande volume de meio. Como se mostrou atrás, com a produção de procolagénio, o que interessa é a densidade celular bidimensional numa distância de cerca de 1 mm.

A agitação converte o ambiente eficaz num espaço 3dimensional. A observação de que a agitação do meio não altera o efeito da CDS se estiverem presentes células em quantidade

3 suficiente (5 X 10 /ml comparado com 5 X 10 /ml), indica que o meio pode ser saturado com a CDS até ao ponto em que a frequência de reassociaçâo da CDS com a camada celular previne a diluição do efeito biológico.

Exemplo 6¾ Actividade Biológica da CDS Libertada no Meio

Baseados somente nos resultados apresentados no exemplo 5, pode esperar-se que a actividade biológica da CDS é a de um inibidor da proliferação das células PAT e um promotor da expressão do gene do procolagénio. No entanto, a actividade biológica da CDS recuperada do meio de células PAT agitadas era estimulatória do crescimento das células PAT.

Foram agitadas culturas confluentes de céluls PAT na minima quantidade de meio capaz de cobrir o disco (1 ml), libertando deste modo a CDS para o meio. Este meio foi aplicado a células inicialmente semeadas, em aneis de clonagem. Depois, 5 ml deste meio condicionado foram utilizados nas células teste. Daqui resultou um aumento de cerca de 500 vezes na quantidade de CDS disponível para cada célula. As células teste cresceram durante 5 dias antes de lhes ser adicionado o meio condicionado, e 2 dias depois desta adição. As céluas PAT receptoras do meio condicionado não sofreram inibição do crescimento, ao invés, foram dramaticamente estimuladas a dividir-se. Em concentrações mais elevadas, mesmo as células de uma densidade confluente podem ser induzidas a dividir-se (ver abaixo). Em contraste, as placas controle revelaram um elevado Índice de morte celular na orla do circulo de células.

Assim, no caso de uma cultura uniformemente confluente.

a agitação liberta um factor que é estimulador da proliferação de uma cultura homóloga, mas a presença do factor na cultura original inibe o crescimento.

Pode-se pressupor que o inibidor de crescimento está ainda na camada celular contrariando o efeito do estimulador de crescimento. Isto, no entanto, não é consistente com os resultados obtidos agitando o meio sobre uma ilha de células no meio do prato, e. g. onde existe uma elevada relação meio-paracélulas. Neste caso, a agitação do meio provocou o crescimento ) das células. Pelo contrário, estas experiências suportam o conceito de que a actividade biológica da CDS na camada celular pode ser diferente da actividade da CDS observada no meio. 0 mecanismo pelo qual a actividade biológica da CDS na camada celular muda à medida que a densidade celular aumenta, é ainda desconhecido nesta altura.

Exemplo 7: Caracteristicas Físicas da CDS A actividade da CDS como um estimulador de crescimento foi utilizada para ensaiar a sua presença e permitir a sua caracterização e purificação. Descobriu-se que a CDS é estável à precipitação pelo sulfato de amónio e isto permitiu uma concentração >100 vezes. Foi testada uma pequena quantidade a esta concentração sob diversas situações e depois diluída no meio para testar a retenção de actividade a uma concentração de IX.

A CDS reteve pelo menos 75% da sua actividade biológica após exposição a um pH baixo (50 mM de acetato de sódio, pH 5,2 por 60 minutos), disulfito redutor de ligações (10 mM de DTT, durante 30 minutos), e calor (90°C durante 10 minutos). Era também estável em meio ou PBS durante meses a 4°C. Por outro lado, a exposição ao ião Tris (50 mM Tris pH 7,5 durante 60 minutos) resultou na perda de mais de 90% da actividade biológica da CDS, enquanto a base Tris (50 mM Tris pH 8,8 durante 60 minutos) teve pouco efeito (retenção de mais de 90% da actividade biológica).

Exemplo 8: Sensibilidade Proteolitica da CDS

A CDS foi testada em relação à sua sensibilidade à digestão proteolitica com a proteinase K (P9290 - Sigma) e pronase (P4531 - Sigma) e tripsina (Τ-8386-Sigma). A ligação da enzima à agarose ou acrilamida foi utilizada para facilitar a remoção da enzima após a reacção. A enzima ligada (1 unidade) foi lavada 2 X em meio basal (30 minutos numa plataforma oscilante). Então, meio contendo 1 X CDS foi tratado durante 2 horas a 39°C com agitação, centrifugado numa centrífuga de topo de bancada e esterilizado por filtração. 0 meio basal foi tratado similarmente e utilizado como controle. 0 soro e ascorbato foram então adicionados a cada amostra e a CDS asssim tratada era então testada para determinação da actividade como se descreve acima.

A molécula da CDS era insensível à tripsina (mais de 75% da actividade biológica retida) mas era sensível a ambas as enzimas protease (menos de 10% de retenção da actividade biológica). A digestão da CDS com a protease também resultou numa resposta tóxica para todas as células testadas. Uma toxicidade similar foi desenvolvida nas amostras de CDS que foram repetidamente congeladas e descongeladas.

'Ν

Exemplo 9; Purificação da CDS

Uma vez que a CDS é estável quando sujeita a diversos tratamentos que destruidores da agregação, estes tratamentos (calor, pH e tratamento com DTT) foram testados para determinar se alteravam as propriedades cromatográficas da CDS numa coluna

Bio-Gel P-30.

Apenas a adição de DTT teve um efeito significativo. Após tratamento, a maior parte da actividade da CDS foi eluida, não durante a passagem do fluxo, mas nas fracçOes que se seguiram imediatamente ao pico de volume vazio, revelando alguma penetração da CDS nos poros do gel (Fig. 1). Na Fig. 1, as setas continuas denotam fracçOes contendo actividade da CDS anterior ao tratamento com DTT, e as setas a tracejado denotam fracçOes contendo a actividade da CDS após tratamento com DTT. Isto demonstrou que o componente activo da CDS é uma molécula entre os 25-30 kD que é encontrada numa forma de agregado, possivelmente multimérico, num meio de culturas celulares agitadas. Após tratamento com DTT, a molécula monomérica de 25-35 kD retém a actividade da CDS. Esta informação foi utilizada para desenvolver o protocolo de purificação. O meio de culturas agitadas foi concentrado por precipitação com sulfato de amónio (este passo foi ultrapassado quando os volumes eram muito pequenos, por exemplo, recuperação de CDS marcada radioactivamente) e o concentrado era ultrafiltrado utilizando uma membrana de exclusão de 30 kD. Toda a actividade foi retida na fracção >30 kD. A fase retida foi tratada com DTT 10 mM durante 30 minutos e de novo ultrafiltrada utilizando uma membrana de 30 kD. Agora, cerca de metade da actividade passou através do filtro. A actividade

proveniente do fluxo de passagem (equivalente a 50 ml de meio condicionado) não revelou bandas em SDS-PAGE após marcação com prata. No entanto, este material reteve a sua actividade biológica.

Quando o meio condicionado foi utilizado a partir de células marcadas durante a noite com elevados niveis de aminoácidos radiomarcados, sujeito ao mesmo processo de fraccionaménto descrito acima, corrido em SDS-PAGE e fluorografado, foi observada uma única banda difusa com um peso

I molecular de aproximadamente 30 kD (Fig. 2). Na Figura 2 a mancha da esquerda corresponde a uma aplicação da porção retida após o procedimento de tratamento com DTT e ultrafiltração com 30 kD e a mancha da direita corresponde a uma aplicação do fluxo de passagem.

Claims (3)

1 - Um processo para a produção de um sinal de densidade celular (CDS) proteico, substancialmente purificado, caracterizado pelo facto de:

a) serem fornecidas células primárias de tendão, em células de cultura de alta densidade;

b) serem fornecidas condições, incluindo um meio não suplementado, no qual as células segregam polipéptidos que incluem o sinal de densidade celular (CDS);

I c) ser agitada a cultura para aumentar a quantidade de sinal de densidade celular (CDS) no meio;

d) recuperar o meio não suplementado contendo o sinal de densidade celular (CDS);

e) purificar o sinal de densidade celular (CDS).

2 - Processo para a produção de um sinal de densidade celular (CDS), proteico, substancialmente purificado, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da dita purificação ser acompanhada por:

a) uma primeira ultrafiltração do dito sinal de densidade celular (CDS), contendo um meio com um ultrafiltro de 30 kD para produzir um retentato contendo actividade biológica de sinal de densidade celular (CDS), num complexo molecular, de forma a que o dito complexo tenha uma dimensão molecular aparente maior que 30 kD;

b) desnaturar o retentato da alinea a) com um agente de rotura de ligação sufidril, através do qual rompe o dito complexo para produzir um sinal de densidade celular (CDS), tendo o dito sinal de densidade celular (CDS) um tamanho molecular desde cerca de 25kD a cerca de 35kD;

c) uma segunda ultrafiltração do produto da alínea b) com um ultrafiltro de 30 kD; e

d) recolher o filtrado que contém o sinal de densidade celular (CDS) purificado.

3 - Processo para a produção de um sinal de densidade celular (CDS) proteico substancialmente purificado, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto das células serem derivadas de tendões de galinha embriónicos.