HUT69145A - Identifyng cell density signal molecules - Google Patents

Description

A találmány tárgyát gyógyászati anyagok valamint a sejtek növekedésének és diferenciálódásának a szabályozása képezik. Konkrétabban a fibroblaszt sejtek (pl. a ín sejtek) által, az őket felismerő ellenanyagok hatására termelt, a sejtek sűrűségét jelző molekulák és ezen molekulák alkalmazása a kezelésban és a kötőszöveti sérülések gyógyításában valamint a sejt proliferáció szabályozása.

A kapcsolatos szakirodalmi háttér leírása

A kollagén expresszió szintje, amely tenyészetben a fibroblaszt sejt egy differenciálódott funkciója, néhány környezeti faktor szabályozása alatt áll, amelyek közül az egyik a sejtsűrűség. Az 1960-as évek elején a kutatók megfigyelték, hogy a kollagén termelés függ a sejtek sűrűségének a növekedésétől. A hosszú történet ellenére keveset tudunk, azokról a jelző mechanizmusokról, amelyek lehetővé teszik, hogy a sejtek felismerjék szomszédaik jelenlétét és ezt lefordítsák a kollagén szintézis • a · * · · · ··· · • · ·· növekedésére.

A legtöbb sejt típus, amely természetes körülmények között in vivő expresszál prokollagént, sejttenyészetbe helyezve egy idő után elveszíti ezt a képességét. Az elsődleges madár ínsejtek (PAT) a prokollagén expresszióját lehetővé tevő sejttenyészetben megtartják a magas szintű kollagén expressziós képességüket és ebben a közegben a sejttenyészet sűrűségével szemben mutatnak érzékenységet. A PAT sejtek az összes fehérjére vonatkoztatva 10%-ról 50%-ra növelik prokollagén termelésüket egyenes arányban a sejtsűrűséggel. Ezt írják le például Schwarz, R.I és Bissell, M.J. a Proc. Nat. Acad. Sci (1977) 74.:4453-4457 közleményükben .

A sejtek osztódási kapacitására sejttenyészetben hatással van a sejtek sűrűsége is. Bár erről határozott összefüggést nehéz megállapítani, mert a sejtek osztódását számos paraméter befolyásolja a tenyészetben, amelyek közül csak az egyik a sejtsűrűség .

Nehéz különbséget tenni például a sűrűség hatása és aközött a lehetőség között, hogy a sejtsűrűség változásai a sejt tápanyag szükségletének változását okozzák. Hasonló módon, az ülepedó sejteknél a növekedési faktorok csökkent bejutását egy sejten kívüli mátrixszal magyarázhatjuk a sejtsűrűség hatását. Kimutatták, hogy a táptalaj cseréje elegendő volt a sejt osztódás stimulálására. Sőt még a fenti táptalaj rázatása is beindíthatja a sejtek osztódását, amint azt Stoker, M. és Piggot, D. Cell (1974) 2:207-215 leírták.

A sejtek érintkezése is játszhat szerepet, amint azt demonstrálja az a tény, hogy a membrán komponensek, beleöntve a táptalajba gátolják a sejtosztódást.

Ezek alapján, egyrészt a sejtek sűrűsége, másrészt a sejtosztódás és a differenciálódott funkció kifejeződése (a PAT sejtek esetében a prokollagén gén expressziója) közötti összefüggés egy összetett probléma volt, amelynek megoldására különösen nehéz volt megfelelő kísérleteket tervezni.

A komplikációk ellenére néhány publikációban leírtak fehérjéket, amelyekről azt állították, hogy hatással vannak a sűrűség-függő sejtosztódásra. Például leírtak egy 40 - 45 kD méretű sűrűség-függő, növekedést gátló (IDF-45) faktort, melyet egér 3T3 sejtek tenyészetéből izoláltak és az alábbi közleményekben szerepelnek: Harel, L. és munkatársai, J. Cell Phvsiol. (1984) 119:101 -106; Harel, L. és munkatársai, J. Cell Phvsiol. (1985) 123:139143; Blat, C. és munkatársai, J. Cell Phvsiol. (1987) 130:416419 .

Lipkin, G. és munkatársai (Cancer Rés. (1978) 38:635643) és Fass, E. és munkatársai (J, Invest. Permitől. (1986) 87: 309-312) közzétettek egy hörcsög melanocita sejtekből izolált kontakt gátló faktort, amely helyreállítja a melanoma sejtek sűrűség-függő növekedését.

Yaoi, Y. és Motohashi, K. (GANN Monocrraoh on Cancer

Rés. (1980) 25:29-39) közétettek egy alacsony molekulatömegű (6 8 kD) növekedést gátló faktort, amelyet csirke embrió fibroblasztjainak felszínéről izoláltak.

Találmányunkban közzéteszünk egy fehérje jellegű sejtsűrűség jelző molekulát, amelynek mérete legalább 25 kD, és nem nagyobb kb. 35 kD-nál, de leginkább 30 kD körüli méretű, és amely 1, sejttenyészetében asszociál a PAT sejtek extracelluláris mátrixával, 2, tranziensen stimulálja ezen sejtek osztódását és 3, ennek következtében stimulálja a prokollagén gén expresszióját.

A találmány összefoglalása

Találtunk egy fehérje jellegű sejt sűrűséget jelző molekulát (CDS). A CDS képes időlegesen stimulálni a fibroblaszt sejtek osztódását tenyészetben és azt követően elősegíteni a differenciálódott gén expressziót. A CDS molekulát fibroblaszt sejtek választják ki (mint pl. ín sejtek) és a sejtektől mentesen kinyerhetők. Amennyiben szükséges megfelelően tisztíthatok.

Az új polipeptidet fibroblaszt sejtek választják ki, mint pl. az ín sejtek és egy újabb lehetőséget biztosít, amellyel a sejtek önmaguk szabályozzák az osztódásukat és a diferenciálódott funkcióik kifejeződését. A CDS és az őket felismerő ellenanyagok lényegesek a diagnosztikumok fejlesztésében, a sérülések kezelésében és a kötőszövet, különösen az ín betegségeinek kezelésében.

A természetben előforduló madár CDS egy 25 - 35 kD méretű, növekedést stimuláló polipeptid, amelyet elsősorban madár (csirke) ín sejtek termelnek sejttenyészetben és amelyről úgy hisszük, hogy gyorsan kötődik ezen sejtek által termelt extracelluláris mátrixhoz (ECM). Úgy gondoljuk, hogy ez a gyors kötődés »5 _Λ · *· ··««· ·· * · · ·«· • «·♦ · ·««« • · · · ·· csökkenti a CDS sejtek diffúzióját és ezáltal proximálisan behatárolja a molekula hatását az osztódásra.

Néhány esetben a CDS ECM-hez kötődése után az azt követó esemény - amely jelenleg még nem egészen értelmezett - úgy jelentkezik, hogy a CDS aktivitása megváltozik és a prokollagén expresszióját, a madár ínsejtek differenciálódott funkcióját stimulálja.

A CDS-t az ínsejtek tenyészetéből lehet összegyűjteni óvatos rázatással. Ezzel az eljárással megfelelő mennyiségű CDS frakciót távolíthatunk el a sejtrétegből és az ily módon kezelt sejtek csökkent mértékű prokollagén termelést mutatnak. Az összegyűjtött CDS növekedést stimuláló aktivitást mutat, amikor viszszaadjuk a kérdéses ínsejtek tenyészetéhez. A CDS meglepő és egyedi jellemző tulajdonsága - tudniillik, hogy a tenyészetből történő eltávolítása és hozzáadása is növekedést stimuláló hatású - megkülönbözteti ezt a polipeptidet.

A fentebb leírt, összegyűjtött CDS a táptalajban multimolekuláris komplex formájában található, amelynek mérete legalább 30 kD-nál nagyobb, vagy méginkább több mint 30 kD és leginkább megközelíti a 100 kD-t. A diszulfid hidakat megbontó kezelés után, mint pl. a DTT hozzáadása, azonosítható egy monomer CDS, amelynek mérete kb. 30 kD.

A találmámy egyik igénypontja az izolált, tisztított és a természetben előforduló CDS-re, annak fragmentjeire, mutációira és módosításaira vonatkozik, amelyek megtartják a CDS eredeti biológiaiai jellemzőit.

Egy másik igénypont a CDS-re specifikus ellenanyagokra vonatkozik.

A találmánynak ismét egy másik igénypontja vonatkozik a CDS kinyerésének, izolálásának és tisztításának módszereire.

Még egy további igénypont vonatkozik a CDS felhasználás módszereire a gyógyászatban, a sérülések kezelésében és a kötőszövetek, speciálisan az ínszövet, betegségeinek kezelésében.

A rajzok rövid leírása

Az 1. ábra grafikonja mutatja az elsődleges madár ínsejtekből izolált fehérjék kromatográfiás elválasztását. A folyamatos nyíl jelzi a CDS aktivitás tartományát a DTT kezelés előtt, a szaggatott nyilak pedig a DTT redukció után.

A 2. ábra radiaoaktív aminósavval 12 órán át jelölt sejtek nagy és kis molekula tömegű frakcióinak SDS-PAGE autoradiogramjait mutatja. Az A sávban vannak a 30 kD-nál nagyobb frakciók DTT kezelés után, a B sávban vannak a 30 kD-nál kisebbek. A gélt egy hónapig exponáltuk radioaktivitásra érzékeny filmen, amellyel kimutattuk, hogy a B sávban nem volt jelen egyéb jelölt csík.

A találmány részletes leírása

I. Definíciók

Autogénes módon származik akár ugyanazon egyedból; ugyanabból az egyedból származó sejt tenyészetéből, töbszörösen beltenyésztett egyedekból vagy többszörösen beltenyésztett egyedek sejttenyészetéből

Diferenciálódott gén expresszió vagy diferenciálódott funkció kifejeződése jelenti a sejtek osztódásához vagy életműködéséhez nem kapcsolódó struktúrgének transzkripcióját vagy transzlációját. Az ily módon expresszálódott polipeptidek azok, amelyek jellemzik a diferenciálódott sejteket szemben az éretlen vagy blasztikus sejtekkel.

Az extracelluláris mátrix (ECM) a sejtek felszínén vagy a sejtekben előforduló makromolekulák hálójára vonatkozik, amelyet a sejt termel. Az extracelluláris mátrix kollagénből, lamininből, fibronektinből, glükóz-aminoglükánokból, és proteo-glükánokból stb. áll. Az ECM-ot in vivő a mátrixon belüli vagy a perifériális sejtek termelik és a támasztószövet szerves részét képezi. Sejttenyészetben számos sejttípus igényel ECM-ot a megfelelően diferenciálódott jellemzők expressziójához.

A fehérjeszerú molekulák, amelyek funkcionálisan homológok ugyanazon funkcionális jellemzőket mutatják. Például az egyik fajból származó enzim funkcionálisan homológ egy másik faj ból származó enzimmel, amennyiben mindkettő ugyanazt a reakciót katalizálja. így a külömböző fajokból származó CDS molekulák funkcionálisan homológok lennének ha a növekedés és a megfelelő autogénes fibroblaszt sejttenyészet diferenciálódott funkciójának ugyanazon amfipatikus szabályozásában vennének részt.

A polipeptid kifejezés magában foglalja a természetben előforduló polipeptidet és annak valamennyi fragmentjét, delécióját, helyettesítését, mutációját és módosítását, amely megtartja a természetben előforduló polipeptid biológiai aktivitását. A glükozilált vagy egyéb más módon módosított polipeptid is beletartozik az itt használt kifejezés tárgykörébe, de hivatkozhatunk rájuk mint proteoglükánra, glikopeptidre vagy glükoproteinre is. Egy fehérjeszerű molekula tartalmaz egy polipeptidet.

A sejtek elsődleges tenyészete az in vivő szövetből származik és nem tovább oltott. Az elsődleges tenyészetek elkülöníthetők a sejt törzsektől és alapvetően a származási szövetben található kariotipus megtartásával képeznek tenyészeteket. A környezeti hatások manipulációjára celluláris válaszokat adnak, amelyek alapvetően hasonlóak az in vivő válaszokhoz.

Kiegészítetlen alap növekedési táptalaj egy meghatározott sejttenyészet növekedési táptalaja, amely mentes további szérumtól vagy egyéb növekedési kiegészítőtől.

II, A találmány megvalósítási módjai

Ismert, hogy a normál sejtek sejttenyészetben úgy reá gálnak a sűrűség változására, hogy megváltoztatják szaporodási rátájukat és fehérje expressziós mintázatukat. A csirke embrióból származó elsődleges madár ínsejtek (PAT) esetében magas sejtsűrűség mellett a prokollagén termelés megemelkedik kb 10-szeresére, mialatt a szaporodási ráta megközelíti a nullát. A megvalósítási példában megmutatjuk, hogy mind a sejtosztódás, mind pedig a prokollagén expresszió szignál mechanizmusára egy gyenge kötésű fehérjeszerű molekula jellemző, amely SDS gélen a kb. 25 - 35 kD mérettartományban vándorol.

Ezt a sejt sűrűség szignál molekulának (CDS) nevezett molekulát fibroblaszt sejtek termelik és ezen sejtek tenyészetének táptalajából izolálható. Általában véve, CDS molekula az alábbi módon nyerhető:

a, állatokból, mint pl. madár vagy emlős embrionális fibroblaszt (beleértve az inat) sejttenyészet készítése;

b, a sejttenyészet fenntartása szövettenyésztő táptalajban, mint pl. az F-12, a növekedés számára megfelelő környezeti körülmények között, 37-42 °C-on, magas páratartalom, a táptalajt kiegészítve aszkorbinsavval és szérummal, megemelve a CO₂ szintet 1-5 napig annak éredekében, hogy az elsődleges tenyészetben magas sejtsűrűséget kapjunk;

c, a növekedési táptalaj eltávolítása a sejttenyészetról és kicserélése a megfelelő, a magas sejtsűrűség fenntartását biztosító táptalajra;

d, a sjetek lassú rázatása és a táptalaj hozzáadása legalább egy nap alatt, de jobb ha még lassabban, 2-6 nap a-

latt, annak érdekében, hogy elősegítsük a CDS kiszabadulását a sejtekből a táptalajba;

e, a táptalaj és a kiszabadult CDS elválasztása a sejtektől ;

f, a CDS és a táptalajban található egyéb fehérjék betöményítése kicsapással és centrifugálással, gélszűréssel, membrán ultraszűréssel és egyéb ezekhez hasonló módon;

g, a CDS és egyéb fehérjék frakcionálása az alacsony molekula tömegű szennyeződések eltávolítására és a CDS visszatartására egy nagy molekula tömegű komplex formájában, amelyet egy 30 kD-os kizáró szűrő visszatart.

h, a visszatartott komplex kezelése redukáló szerrel a CDS kiszabadítására 25 - 35 kD méretű anyag formájában;

i, a CDS 25 - 35 kD méretű anyagként egy névleg 30 kDos szűrőn átnyomva vagy ehhez hasonló módon.

A fenti módon izolált CDS egy polipeptidből áll és a méretét kb. 25 - 35 kD körül határoztuk meg, ami specifikusan 30 kD SDS-PAGE gélen összehasonlítva ismert fehérje standardokkal. Jellemző a biológiai aktivitása is: képes az embrionális ínsejtek osztódásának stimulálására és azt követően egy diferenciálódott funkció, nevezetesen a prokollagén gén expressziójának kiváltására. Tovább jellemeztük 90 °C-on tapasztalt hőstabilitása alapján, pH és DTT érzékenységével, a tripszin kezelés hatásával, Tris ion instabilitásával valamint pronáz és proteináz K-val szembeni érzékenységével .

Miután a tenyészetben a sejtek kiválasztják, a CDS asz12 szociál az extracelluláris mátrixszal. Amint azt föntebb leírtuk, az ECM-ról eltávolítható a sejtkultúra rázatásával. Ez a jelenség stimulálja a sejtosztódást, de csak olyan körülmények között, ahol nagy volt a táptalaj - sejttömeg arány (feltehetően azért, mert ekkor a reasszociáció minimális). Ezzel ellentétben, amikor elegendő sejt volt jelen a CDS magas koncentrációjának fenntartására a médiumhoz képest, a rázatás alig jár hatással, feltehetően azért, mert magas a reasszociáció aránya. Ez a tény sejteti, hogy a CDS növekedés gátló szerként lép fel.

Másrészt az egyesített tenyészetek rázatásával kondicionált táptalaj aktivitása stimuláló hatású volt, amikor magas tápanyag-sejt arányú sejtpopulációhoz adtuk. Továbbá a PAT sejtek nem nőnének túl a sejtmentes területekre, de osztódnának kitöltve a csökkentett sejtsűrűségű teret. Ezek a megfigyelések a CDS növekedés stimulálló hatására vonatkozó feltételezéssel ellentétes következtetésekre vezettek. A kondicionált táptalaj növekedést serkentő aktivitását használva fel a szelektlás alapjaként, a CDS-ról egyedi fizikai jellemzőket mutattunk ki. A polipeptid hő, pH, és DTT stabilitású (az eredeti aktivitásának több mint 75 %át megtartja), de érzékeny Tris ion inaktiválására (az eredeti aktivitásnak kevesebb mint 40 %-a marad meg). A CDS ellenáll tripszin inaktiválásnak, de érzékeny pronázra és proteináz K-ra. Gél kiszorításos kromatográfiával mérete nagyobb mint 100 kD. de DTT kezelés után mobilitása kb. 30 kD méretűre változik, mialatt megtartja biológiai aktivitását. Egy éjszakán át végzett jelölést követó egyszerű mobilitáson alapuló elválasztás egyszeres radi* · · ·<· oaktív csíkot eredményezett, amely megfelel kb. 30 kD méretnek, amikor SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá.

Az a tény, hogy CDS hozzáadása vagy eltávolítása (folyamatos rázatással nagy térfogatú táptalajban) ugyanazt a növekedést stimuláló sejt választ eredményezi úgy hisszük, amiatt következik be, hogy a CDS különböző aktivitással rendelkezik, attól függően, hogy miként van jelen a sejtek számára. A kondicionált táptalajban a CDS aggregátumot képez, amely hozzá tud kötődni a sejt mátrixhoz és ebben a formájában növekedés stimulálóként viselkedik. Az extracelluláris mátrixhoz kötődve a CDS komplexet képezhet önmagával vagy egy ezidáig ismeretlen faktorral, és így azután növekedés gátlóként és a prokollagén termelés inducereként hat.

A, Az elsődleges madár ín sejtek növekedése seittenvészetben

A PAT sejteket 16 napos csirke embriókból izoláltuk a hivatkozások között megtalálható Dehm, P. és D.J. Prockop (Biochem. Bioohvs. Acta. (1971) 240:358-369 í közleményében leírt módszer módosításával. A sejteket további specifikálás nélkül 25 cm²-es szövettenyésztő edénybe tettük és 0.2% magzati borjú szérummal valamint 50 /;g/ml aszkorbáttal (Schwartz és munkatársai, 1979).

Amikor nagy táptalaj - sejt arányra volt szükségünk, a sejteket (10⁴) szérum nélküli táptalajban helyeztük egy üvegből ·♦· « t ··· • · · 4 · készült klónozó gyűrűbe (belsó átmérője 6 mm), amelyet egy standard szövettenyésztó lemezre raktunk (átmérője 60 mm). A hidrosztatikai nyomás kiegyenlítésére táptalajjal vettük körül’a klónozó gyűrűt. Egy óra után, amikor a sejtek már megtapadtak eltávolitottuk a klónozó gyűrűt. A táptalajt kicseréltük 0.2% borjú magzat szérummal (Gibco) és 50 Mg/ml aszkorbáttal kiegészített F12 médiummal (5ml). Ilyen körülmények között azt találtuk, hogy a tenyészetek egy kissé jobbak voltak magasabb C0₂ koncentrációnál (3X bikarbónát, 15% C0₂) . Ezek után valamennyi sejtet magasabb koncentrácinál növesztettük. A normál táptalaj - sejt arányoknál növesztett sejtekre nem volt hatással a magasabb CO₂ koncentráció .

B. CDS tisztítás

A nagy sejtsűrűségú tenyészeten a 0.2% szérumot tartalmazó növekesztó táptalajt kicseréltük alap táptalajra (6 ml F12 egy 150 cm² edénybe) és ezt óvatosan rázattuk (60 ford/perc egy rázó asztalon) kb. 39 °C-on egy órán át. Ezt négy napon kersztül ismételtük naponta kétszer. A sejtmentes kondicionált táptalajt 4 °C-on tároltuk (hónapokig stabil marad).

Hozzáadtunk ammónium szulfátot 40 - 60 %, de leginkább 50% -os telített oldatot készítve (4°C) és állni hagytuk egy éjszakán át. Másnap lecentrifugáltuk körülbelül 35,000 ford/ perc sebességgel 30 percig (45Ti rotor, Beckman) A csapadékot felszuszpendáltuk foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) és ultraszú- * · 4 4 4···· • · · · 4 ♦♦« * *·· · 4♦·· * « · « « » • * * • réssel betöményítettük (30 kD-os kizáró szúró, CX - 30; Millipo< re). Ezt az oldatot újra hígítottuk, majd koncentráltuk a sejtek számára mérgező ammónium ion koncentrációjának tovább csökkentése érdekében. A végső koncentrációt 100 X-osra állítottuk be az eredeti táptalaj térfogathoz képest. Az 1 X-es koncentrációra történt hígítás megközelítőleg az eredeti kondicionált táptalajjal megegyező növekedést stimuláló aktivitást eredményezett.

A koncentrátumot 10 mM-os DTT (Ditiotreitol) oldattal kezeltük 30 percig 37 °C-on. Ezután újra átnyomtuk egy 30 kD-os ultraszűrőn (PF-30, Millipore). Az ultraszűrlet az eredeti táptalaj biológiai aktivitásának kb. a felét tartotta meg.

A CDS jelöléséhez a sejteket (25 cm² edényben) jelöltük mCi radioaktív aminósavval, növesztő táptalajban egy éjszakán át. A jelölt táptalajt eltávolítottuk majd alap táptalajt adtunk (1 ml) és ezt kondicionáltuk rázatással (a fenti módon). Az ammónium kicsapási lépésre nem volt szükség, a táptalajt koncentráltuk és PBS-sel hígítottuk néhányszor a be nem épült jel mennyiségének csökkentése végett. Végül bekoncentráltuk 100 μΐ térfogatra és DTT-vel kezeltük a fenti módon. A 30 kD-os ultraszűrés után mind a szűrletet, mind pedig a visszatartott anyagot SDS-PAGE gélre vittük. A gélt Enhance-val (NEN) impregnáltuk és röntgen filmen exponáltuk -70 °C-on.

C. A prokollagén gén expressziólának becslése

Az in situ hibridizáció gyakran használt módszer bi16 zonyos sejtek megkülönböztetésére egy kevert populációban. A módszer specifikus mRNS jelenlétének kimutatásán alapul. A technika használható arra, hogy mennyiségileg kimutassuk a sejtsűrűség változásának hatását a prokollagén mRNS mennyiségére egyedi sejtekben. Lehetővé teszi a sejtsűrűség és a diferenciálódott gén expressziója (PAT sejtek esetén a prokollagén expresszió) közötti összefüggés legközvetlenebb, a legkisebb bizonytalansággal járó mérését.

A PAT sejteket PBS-ben készült 4%-os paraformaldehidben fixáltuk (10 perc), ezt követte mosás 0.1 M glicin PBS-ben készült oldatában. A fixálás után a sejteket 2 ml hibridizácis oldattal fedtük le (60% deionozált formamid, 0.1 M PIPES pH 6.4, 0.4 M NaCl, 5 % poli-A RNS [2.5 mg/ml]). Az 55 °C-on néhány órán át végzett prehibridizáció után kicseréltük a hibridizációs oldatot, hozzáadtuk a jelölt próbát és 48 órán át hibridizáltűk a sejteket. Összesen 2 x 10⁶ cpm jelölt próbát használtunk 3.3 x 10⁷ cpm/^g specifikus aktivitással. A hibridizáció után a sejteket kétszer 1 órán keresztül mostuk 0.1% Triton X-100 és 2 X SSC tartalmú oldatban 55 °C-on. A sejteket dehidráltuk fokozatosan növekvő alkoholos mosással majd fotoemulzióval fedtük le (MBT2, Kodak). Az előhívás ideje változott a próba specifikus aktivitásától függően. A fentebb megadott specifikus aktivitással az expozíciós idő 2 hét volt. Néhány korai kísérletben kétszer nagyobb specifikus aktivitású próbát használtunk (⁵H-ATP és ³HUTP jelöléssel egyaránt) és az expozíciós időt ennek megfelelően 1 hétre csökkentettük. A sejtekt Wrights-al festettük.

Azokban a kísérletekben, amelyekben a hibridizált ³HRNS próba mennyiségét határoztuk meg, a sejt réteget 1% SDS-sel oldatba vittük és a radioaktivitást szcintillációs számlálóval megmértük.

A fixált sejteket a dot-blot hibridizációnál alkalmazott módon kezeltük (a módszer ismert a szakterületen jártasak előtt): a hibridizációs oldat térfogata ml nagyságrendű; a hibridizáción kívül nem használtunk egyéb előkezelést; a hibridizációt követő mosás során csak só és detergens tartalmú oldatot használtunk .

A kivont mRNS-sel dot-blot hibridiáziós technikával Rowe, L.B, és Schwarz, R.I. (Mól, and Cell, Bioi, ( 1983) 3.:241249) kimutatták, hogy az aszkorbinsavas kezelés kb. ötszörösére növelheti a prokollagén mRNS termelést a PAT sejtek tenyészetében. Az aszkorbinsavval indukált és indukálatlan sejteken végzett in situ dot-blot hibridizáció alkalmazásával ugyanazt, a kb. ötszörös RNS növekedést figyeltük meg.

A reakció kinetikája sokkal, kb. két nagyságrenddel lassabb volt, mint ahogyan mások leírták a megegyező dót hibridizációk esetén, de ezt követően exponenciálisan csökkenő volt jelezve egy látszólagosan első rendű reakciót. Az aszkorbinsavval indukált sejtek esetében nem homológ próba háttérszíntje azonos beütésszámmal indítva kezdetben (1.5 óra) 13% a végén pedig (42 óra) 3% volt a specifikus szignálhoz képest. A nagy oldattérfogatok és a sejtek vízeltávolításának hiánya a hibridizáció előtt valószínőleg hatással van a lassabb kinetika kialakulására ilyen körülmények között, mivel lelassul a próba bejutása a sejtbe. Ez a különbség nem mutatkozik meg a próba mérete miatt azoknál a különböző méretű (0.2 - 2 kb) próbáknál, amelyek azonos módon hibridizálnak a PAT sejtekhez. Ez az adat megfelel annak, hogy az in situ hibridizációnál a sebesség meghatározó lépés a próba belépése a sejtekbe.

A legfontosabb, hogy a hibirdizáció körülményei során viszonylag magas próba koncentrációt használjunk hosszú inkubációs idővel és így az in situ hibridizált próba mennyisége tükrözi a mRNS szintet a sejtben. Az alábbiakban leírt példákban autoradiográfiával detektáltunk és a prokollagén mRNS relatív koncentrációját az egyedi sejtekben tapasztalt ezüst szemcse koncentációja tükrözte, amely a sejtsűrűség nagyságrendjével együtt változott.

Ez a technika specifikusabb, pontosabb és érzékenyebb, mint a tenyészetnek a prokollagén gén expressziójára gyakorolt hatásának mérésére szolgáló, korábban használt módszerek. Lehetővé teszi továbbá a különböző sejtsűrűségek eltérő hatásainak megfigyelését ugyanazon a mintán.

D. A CDS szekvenálása

A tisztított CDS 100 pmól-nyi mennyiségét, amelyet az ultraszűrés szűrletéből izoláltunk és nyertünk vissza, megszekvenáltuk az Applied Biosystem477A típusú, Edman roncsoláson alapuló, folyadékfázisú, automata protein szekvenáló berendezésén.

Az N-terminális szekvenálás lehet, hogy nem felel meg a CDS cDNS-ének klónozásához. Például, lehetséges, hogy a CDS blokkolva vagy módosítva van az N-terminális végén, vagy másik lehetőség, hogy az N-terminális szekvenciák lehetnek nem megfelelőek az oligonukleotid próbák készítésére. Ilyen esetben a CDS-t proteázzal emésztjük (pl. V8-cal, amint azt HarloW, E. és Lane, D. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 leírták) és a peptid fragmenteket kitisztítjuk annak érdekében, hogy további információkat kapjunk a szekvenciáról. Ezekben az esetekben a fehérjét vákumcentrifugálással betöményitjük 5 μΥ térfogatra és azután emésztjük. A szekvenáláshoz reverz fázisú HPLC (Brownlee RP 18 szűk furatú oszlop, amelyet pmólnyi minták tisztítására terveztek) Applied Biosystems 130A kromatográfiai tisztítjuk a proteáz fragmenteket.

Az ily módon kapott szekvencia adatokat számítógépes kereső programmal összehasonlítottuk ismert fehérje szekvenciákkal az NBRF Protein Identification Resource adatbankjából és a svájci fehérje adatbankkal annak érdekében, hogy meghatározzuk újszerűségét vagy hasonlóságát egyéb fehérje szekvenciákkal.

E. A cDNS klóntárak átvizsgálása és a CDS kódoló DNS molekuláris klónozása

Az elsődleges madár ínsejtek tenyészete fölhasználható cDNS klóntár készítésére, amely azután átvizsgálható adott cDNS szekvenciákkal, amelyek CDS specifikus polipeptideket kódolnak. A ·♦ · «*· »· »··· ••·· · ··»· • ♦ · * 4 · cDNS klóntár készítésre alkalmas technikák általánosan használtak, leírásuk megtalálható a laboratóriumi kézikönyvekben és a szakterületen jártasak előtt jól ismertek. A cDNS klóntárak készítésének részletes leírása megtalálható Maniati, T. és munkatársai Molecular Cloning (1982) CSHL Press laboratóriumi kézikönyvben. Egy kényelmes megközelítési mód a cDNS fragmentek beépítése lambda fág vektorba, pl. lambda gtlO vagy gtll-be, amint Maniatis a fenti kézikönyben leírta.

A cDNS klóntárak átvizsgálásának módszere szintén jól ismert a szakterületen jártasak előtt. A CDS aminosav szekvenciáját a DNAstar (Madison WI) program használatával elemeztük annak érdekében, hogy azonosítsunk oligonukleotid próbák készítésére alkalmas régiókat. Oligonukleotid próbákat egy DNS szintetizáló készülékkel szintetizáltunk (380A: Applied Biosystems Inc. Foster City CA) foszforamidites módszerrel. Az oligonukleotidokat Sephadex G-50 oszlopon tisztítottuk és -20 °C-on tároltuk. A próbák 5’ végeit γ- [³²P]ATP-vel (du Pont de Nemours & Co., Inc.

Boston MA) jelöltük T4 polinukleotid kinéz alkalmazásával. A klóntárakat 10⁶ egyedi telep/klóntár felhasználásával vizsgáltuk át nagy mennyiségű oligonukleotid próbával. A fágokat tartalmazó nylon membránokat duplán készítettük el és közülük 8 filtert előhibridizáltünk 50 ml 5X SSPE-t (0.9 M NaCl, 50 mM NH₂PO₄, 5 mM EDTA, pH 7.4), 0.2% SDS-t és 0.005% denaturált hering sperma DNSt tartalmazó pufferben előhibridizáltuk 2 órán keresztül 50 °Con. A membránokat ml-enként kb. 1 ng jelölt próbát tartalmazó, friss hibridizációs pufferben hibridizáltuk egy éjszakán át a • · · *

próba keveréknek megfelelő hőmérsékleten. A membránokat azután szobahőmérsékleten mostuk 45 percig 1 liter 5 X SSPE per 40 filter mennyiséggel, amelyet 1 perces friss pufferrel végzett mosás követ 50 °C-on, majd szárítás levegőn és exponálás következik Kodak XAR-5 filmen erősítő lemezekkel -70 °C-on 72 órán kersztül.

Az átvizsgálás után a filterekről lemostuk a jelet 70 °C-on, 10 percig, 5 X SSPE pufferben végzett inkubálással és ezt követően hibridizáltűk a második próbával ugyanazon körülmények között. Ezt az eljárást ismételtük valamennyi próba esetében. A próbával hibridizáló rekombináns kiónokat kiválogattuk a klóntárból és plakk formájában tisztítottuk.

A rekombináns fág DNS-t ezután tisztítottuk és a megfelelő restrikciós enzimmel megemésztettük, hogy megkapjuk a felszaporított inszertet. Azután az iszerteket M13mp fágsorozatba ligáltuk és a Sanger által leírt dideoxi módszerrel szekvenáltuk, amint azt Biggin, M.D. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1983) 80:3963 leírták. A cDNS méretétől függően szükség lehet a klón méretének csökkentésére és M13-ba történő szubklónozásra. Amennyiben a cDNS kiónok nem teljesek, szükség lenne a klóntár ismételt átvizsgálására a részleges cDNS-sel.

A CDS cDNS-ének teljes szekvenciáját azután összehesonlítottuk a GenBank adatbázisban található ismert szekvenciákkal.

A DNSstar programot használtuk a polipeptid analízisre és a szekvencia összehasonlításokra.

A CDS-t kódoló kiválasztott inszerteket azután egy expressziós rendszerbe építettük be. A cDNS működőképesen kap22 csolódott a heterológ kontrol szekvenciákhoz és egy expressziós vektort hozott létre. A szabályozó szekvenciákat úgy választottuk ki, hogy funkcionálisan kompatibilisek legyenek a rekombináns gazdasejttel, amelybe az expressziós rendszert bevisszük. Ezek a módszerek ismertek a szakterületen jártasak előtt és leírásuk megtalálható a fentebb leírt Maniatis, laboratóriumi kézikönyvben.

Az expresszió történhet prokarióta és eukarióta rendszerekben egyaránt. A prokariótákat legtöbbször az E. coli különböző törzsei képviselik. Egyéb mikroba törzsek is használhatók, mint pl. bacillusok (pl. Bacillus subtilis). a Pseudomonasok különböző törzsei vagy egyéb baktérium törzsek. Ilyen prokarióta rendszerekben olyan plazmid vektorokat használnak, amelyek tartalmaznak replikációs helyet és a használt gazdával kompatibilis fajból származó szabályozó szekvenciákat. Például az E.coli-t tipikusan pBR322 származékokkal transzformáljuk, amely Bolivár és munkatársai, Gene (1977) 2.:95 által leírt E. coli törzsekből származik. Az általánosan használt prokarióta szabályozó szekvencia definíció szerint magában foglalja az operonokat a transzkripció iniciálására szolgáló promóterekkel, vagy egy mindössze a riboszóma kötő szekvenciákból álló operátorral. Ilyen általánosan használt promóterek lehetnek pl. béta-laktamáz (penicillináz) promótere, laktóz (lac) promóter rendszer, melyet Chang és munkatársai, Natúré (1977) 198:1056 írtak le, a triptofán (trp) promóter rendszer, melyet Boeddel és munkatársai, Nucleic Acids Research (1980) £.: 4057 tettek közzé, a lambdából származó PL promóter .t . · ·· ♦ ··♦♦ • ··· · ···· ··· *·.* · * · és az N gén riboszóma kötő helye, melyet Shimatake és munkatársai, Natúré (1981) 292:128 publikáltak. Bármely promóter rendszer használható, amely kompatibilis a prokariótákkal.

Az eukarióta gazdákban használható expressziós rendszerek a megfelelő eukarióta génekből származó promótereket tartalmaznak. Az élesztőben használt promóterek osztálya pl. a glikolítikus enzim szintézis promótereiből áll, amelyek közé tartozik pl. a 3-foszfoglicerát kináz, melyet Hitzeman és munkatársai, J Bioi, Chem. (1980) 255:207 írtak le. Egyéb promóterek közé tartoznak az enoláz gén promótere, melyet Holland, M.J. és munkatársai J. Bioi. Chem. (1981) 256:1385 tettek közzé vagy az YEpl3-ból származó leu2 gén promótere, melyet Broach, J. és munkatársai, Gene (1978) £:121 írtak le.

A használható emlős promóterek közé tartoznak a metallotionein, az SV40-ből származó korai és késői promóterek, melyeket Fiers és munkatársai, Natűre (1978) 273:113 írtak le vagy egyéb vírus promóterek, mint apolióma, adenovirus II, borjú papillóma vírus vagy a retrovírusok promótere. Megfelelő virális vagy emlős enhancerek is használhatóak. Egy növényi sejt expressziós rendszerként történő használatakor a nopalin szintézis promótere is megfelelő, amint Depicker, A. és munkatársai, J. Mól.Appl. Gén. (1982) 1.:561 leírták.

Az expressziós rendszereket az előbb említett szabályozó elemekből állítjuk össze, amelyek működőképesen kapcsolódnak a CDS szekvenciákhoz. Módszerként a standard ligálást és restrikciós technikákat hsználjuk, amelyek jól ismertek a szakterületen.Az

I izolált plazmidokat, DNS szekvenciákat vagy szintetizált oligonukleotidokat hasítjuk, farokkal látjuk el és újra ligáljuk a kívánt formában.

A CDS-t kódoló cDNS expressziójára szolgáló egyéb rendszerek közé tartoznak a rovar sejtek és vektorok, amelyek ezen sejtekben használhatók. Ezek a rendszerek ismertek a szakterületen és közéjük tartoznak pl. a Autocrraoha californica idegrendszeri (AcNPV) baciluvírusból származó rovar expressziós transzfer vektorok. Ebből a rendszerből származó expressziós vektorok rendszerint az erős virális polihedrin gén promótert használják a heterológ gének meghajtására. Manapság idegen gének AcNPV-be történő bevitelére leginkább használatos transzfer vektor a pAc373 (70. ábra). A szaktrületen jártasak előtt ismert számos egyéb vektor, amely expresszió növelésére terveztek. Ezek közé tartozik pl. a pVL985 is, amelyet Luckow és Summers (1989) készítettek.

A heterológ DNS baculovírusban a kívánt helyre történő bejuttatásának módszerei ismertek a szakterületen. (Pl. Summer and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, Ju és munkatársai (1987); Smith és munkatársai (1983); Luckow és Summers (1989) közleményekben megtalálhatók). A beépítés történhet pl. egy génbe, mint a polihedrin gén, homológ rekombinációval vagy egy restrikciós enzim hasítási helyére a kiválasztott és kialakított baculovírus génbe. A beépített szekvenciák lehetnek az egész poliproteint vagy annak különböző darabjait kódoló DNS fragmentek.

A fehérje átíródás utáni módosítások szignáljainak, !

mint pl. peptid hasítási szignál, proteolítikus hasítás és a foszforiláció szignálja a rovar sejt által felismerhetőnek kell lennie. A kiválasztódás és a magi akkumuláció szignáljainak szintén hasonlónak kell lennie a gerinctelen sejtek és a gerinces sejtek között. A gerinctelen sejtekben hatékony, a gerinces sejtekből származó szignál szekvenciákra találunk ismert példákat a szakterületen, mint pl. az emberi interleukin-2 szignál (IL2 ), amely a sejtből történő kijutáshoz szükséges és a rovar sejt felismeri és helyesen vágja le.

F, A CDS DNS emlős genomi szekvenciájának analízise

A CDS-t kódoló géneket csirke genomi klóntárából (a Clontech forgalmazza, Palo Alto, California) vagy egyéb emlős klóntárból (általánosan elérhető fág formájában az ATCC-ből vagy kereskedelmi forgalomban) származtak. Például egy magzati májsejtből készült emberi klóntár Charon 4A fágban hozzáférhető (ATCC 37333). A klóntár 10⁶ független kiónt tartalmaz kb 15-20 kb átlagos méretű inszertekkel és az előzőekben leírt módon vizsgáljuk át cDNS-sel.

A fágot 8x8 cm-es nylon membránokra adszorbeáljuk duplán. A kész filtereket 5 x SSPE, 50% formamid, 5x Denhardt oldat, 0.5% SDS és 0.005% denaturált hering sperma DNS-t tartalmazó pufferben előhibridizáljuk 2 órán át 42 °C-on 8 filterenként 50 ml térfogatban. A filtereket megközelítőleg 1.0 ng jelölt madár CDS cDNS per 1 ml friss, 10% dextrán szulfátot és 2 x Denhardt t

oldatot tartalmazó prehibridizációs pufferben hibridizáljuk egy éjszakán át 42 °C-on.

A hibridizációs oldat erősségét be lehet állítani figyelembe véve a madár és az emlós CDS polipeptid közötti homológia eltérést. Az erősség csökkenthető, amennyiben a mismtcheket megengedjük, a sókoncentráció növeléséval és/vagy a hibridizáció hőmérsékletének csökkentésével. A homológia eltérés foka változik a funkcionálisan homológ polipeptidek különböző régióin belül. Általában, a funkcionális homológia helyeit a legnagyobb homológia helye mutatja. Ezek a helyek a madár CDS polipeptidjének szerkezeti elemzése alapján előre jelezhetők. A CDS polipeptid különböző régióit kódoló néhány próbát használtunk a nagyfokú konzerválódást mutató régió helyének optimális meghatározására.

A madár CDS cDNS-ét a³²P dCTP foszforral jelöltük és Sephadex G-50 kromatográfiával választottuk el. A filtereket azután kétszer mostuk szobahőmérsékleten 15 percig 1 liter per 40 filter 2 X SSPE és 0.2% SDS oldatban, ezt követte két 15 perces mosás 50 °C-on 0.1 x SSPE és 0.2% SDS oldatban, majd levegőn megszárítottuk a filtereket és Kodak XAR-5 röntgen filmen exponáltuk erősítő ernyőkkel 48 órán át -70 °C-on.

A klóntárból kiválasztott pozitív kiónok plakkjait kitisztítottuk. A cDNS-ből származó különböző próbákat használtunk arra, hogy meghatározzuk vajon a gént teljes egészében tartalmazza-e a genomi klón. A következő lépésben kivontuk és tisztítottuk a rekombináns fágot majd restrikciós emésztésnek vetettük alá ezen módszerek közül valamennyi jól ismert a szakterületen jár tasak előtt. A restrikciós fragmentek Southern blotjait a CDS cDNS-ével hibridizáltuk a CDS gént tartalmazó fragmentek azonosítására. Ezeket a fragmenteket azután izoláltuk és szekvenáltűk. Ebből az információból restrikciós térképet készítettünk és azonosítottuk a gén intronjait.

G. Ellenanyag készítés a CDS ellen

Két megközelítés használatos a CDS elleni ellenanyag készítésre és mindkettő alkalmas mind poliklonális mind pedig monoklonális ellenanyag előállítására. Az egyikben, tisztított, denaturált CDS 75 ^g-ját használjuk egér immunizálására a standard recept szerint. Az immunizáláshoz kb. 25 μς már megfelelő mennyiség. Hibridóma sejtek átvizsgálására használható a radioaktív jóddal jelölhető, denaturált CDS, amely oldható 0.1% TFA-ban és acetonitrilben. Ezzel vizsgáljuk át a murin B-sejt hibridómákat, annak megállapítására, hogy melyek termelnek ellenanyagot. Ez a módszer csak kis mennyiségű CDS-t igényel, mindössze 20 μς elegendő a jelölésre és ezzel néhány ezer klón átvizsgálható.

A második megközelítésnél a génből leszármaztatott aminosav szekvenciát elemezzük a magas immunogentitású régiók meghatározására. A megfelelő polipeptideket szintetizáljuk és azokat használjuk a megfelelő immunizálási protokolokban az ellenanyag termelésre. A megfelelő epitópok kiválasztásának módszerét pl. Ausubel, F. M. és munkatársai, Curerent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Vol. 2, Sec. IV, ppll.14.1, 1989, írták le. A legjobb választás rendszerint a fehérje C-terminálisa, az N-terminál!sa és a polipeptid azon belső régiói, amelyek valószínűleg a külső környezet felé fordulnak, amikor a molekula a természetes konformációjában van (ennek meghatározása a helyek hidrofil tulajdonságainak meghatározásán alapul). A kiválasztott peptid tipikusan kb. 15 aminósav származék hosszúságú, az Applied Biosystem által forgalmazott 431A típusú peptid szintetizátorral szintetizáljuk, a hemocianin és az m-maleimidobenzoil-N-hidroxiszukcinimid észter (MBS) reakciójával. (A részletek leírása megtalálható Ausubel és munkatársainak fenti közleményében a 11.15.1 oldalon.) A peptid N-terminális végére egy ciszteint építünk, hogy megakadályozzuk a KLH-val kialakuló kötést. A peptid-KLH komplexszel immunizáljuk a nyulakat komplett Freud adjuvánsban és a keletkezett antiszérum peptid ellenes aktivitását teszteljük például a következő módon: a peptidet a műanyaghoz kötöttük, 0.1% BSA-val blokkoltuk, antiszérummal reagáltattuk, mostuk és reagáltattuk radioaktív jóddal jelölt, affinitás kromatográfiával tisztított specifikus, kecske nyúl elleni IgG-vel.

Hibridómák készíthetők és átvizsgálhatok a standard technikák felhasználásával is. A hibrideket átvizsgáltuk radioaktív jóddal jelölt CDS felhasználásával a monoklonális ellenanyagot termelők azonosítása céljából. Egy tipikus protokoiban a lemezek villáit (FÁST, Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) beborítottuk affinitás kromatográfiával tisztított, specifikus, nyúlban termelt, egér elleni ellenanyaggal (vagy megfelelő fajidegen IgG* ·» vei) 10 Aig/ml koncentrációban. A beborított villákat 0.1%-os BSAval blokkoltuk, mostuk és hozzáadtuk a hibridómákról származó felülúszót. Inkubálás után a villákhoz hozzáadtuk a radioáktívan jelölt proteint 1 ng/ml koncentrációban. Az ellenanyagot termelő kiónok jelentős radioaktivitást kötnek meg, amely a háttérrel szemben jól kimutatható. Az ilyen kiónokat kiterjesztjük alávetjük 2 klónozási ciklusnak 0.3 sejt/mintahely koncentrációban. A klónozott hibridóma sejteket prisztinnel kezelt egerekbe oltjuk hasűri folyadék termelés érdekében és a monoklonális ellenanyagot affinitás kromatográfiával protein A segítségével kitisztítjuk a hasűri folyadékból.

PÉLDÁK

1. Példa A PAT sejtek növekadésének jellemzői sejttenvészetben

A PAT sejtek gyorsan alkalmazkodnak a sejttenyésztés körülményeihez és mint elsődleges tenyészetek, a fibroblaszt sejtektől elvárható normális fenotípust mutatják. A PAT sejtek az osztódásra két féle sejtsúrúség hatást mutatnak: a növekedésük érdekében szükségük van egy minimális sejtsűrűségre és magasabb sejtsűrűség gátolja a növekedésüket.

Mind a két sejtsűrűségre adott válasz megfigyelhető egyidőben a PAT sejttenyészetben kialakuló sejtsűrűség grádiens megállapításával. Ezt úgy valósítottuk meg, hogy a sejteket egy klónozó gyűrűbe tettük (6 mm átmérőjű gyűrű egy 60 mm-es edény30 ben) és miután a sejtek megtapadtak eltávolitottuk a gyűrűt. A módszernek előnye, hogy magas volt a táptalaj sejt arány (igy minimalizálódtak a kondicionáló hatások, mialatt ugyanabban az időben az edényen belül kialakult egy sejtsűrűség grádiens.

A PAT sejtek egyedi módon reagáltak erre a helyzetre. Korlátozott képességet mutattak arra, hogy túlnőj jenek a sejtmentes területre, a kezdeti területről mindössze 6-7 mm-nyire terjedtek szét. Ezzel ellentétben a sejtek a lerakás helyén gyorsan nőttek, amíg egymásba nem értek. Ezen a ponton a kis sejtsűrűségű szélen a sejtek pusztulni kezdtek. Ez nyilvánaló volt a sejtek körülnövő morfológiája miatt, és megerősítette a tripán kékes festés is.

Ezt a hatást nem a táptalajban lévő mérgek okozták. Amikor egy kaparóval eltávolítottuk a köralakú sejtek felét az újonnan keletkezett szél mentén a sejtek növekedésnek indultak és egy új, alacsony sűrűségű szél alakul ki, mialatt az eredeti szélen maradt sejtek pussztultak. Hasonló módon, amikor csak egy szűk barázdát távolítottunk el a sejt körből, a sejtek képesek voltak feltölteni azt a barázdát, kivéve a régi és az új szélek találkozásánál lévő helyet. A legalacsonyabb sűrűségnek ez a pontja egy vékony barázdát mutatott a kör közepe felé. Ez demonstrálta, hogy a PAT sejtek képesk kialakítani egy lokalizált mikrokörnyezetet a sejttenyészeten belül, annak érdekében, hogy addig növekedjenek, amíg a minimális sejtsűrűség jelen van.

.f . · *· ·»··· •· · * · ·· « • ···· • · · · ·A

2. Példa A sejt sűrűség hatása a prokollagén gén expresszióiára

Előzetesen meg kell mondanunk, hogy az alkalmazott tesztek igénylik, hogy 10⁵ fölötti sejt mennyiségből származzanak az átlagos értékek ahhoz, hogy elemezni tudjuk a sejtsúrűség változás hatását a kollagén anyagcsere útban. Egy in situ hibridizációs teszttel sejtről sejtre elemezhetjük a sejtsűrűségek hatását és a különböző sejtsűrűségek megfigyelhetők ugyanabban a sejtkultúrában .

A PAT sejteket egy 6 mm átmérőjű klónozó gyűrűbe raktuk egy standard 60 mm átmérőjű szövettenyésztő csésze közepére az 1. Példában leírt módon. 1 óra után, amikor a sejtek már megtapadtak a csészén, eltávolítottuk a klónozó gyűrűt. A sejteket 5 napig tenyésztettük, amely idő alatt összenőttek az eredeti gyűrű közepén. A PAT sejtek csak korlátozottan nőttek túl a gyűrű szélén a sejt nélküli területre, így az ötödik nap végén a sejttenyészet mindössze 7 mm-re terjedt ki. Ez a kiterjedés elegendő volt az alacsony sejtsűrűségű szél kialakításához, mialatt a kör közepén magas sejtsúrűség jött létre.

A sejtsűrűség eloszlása a prokollagén mRNS szint széles tartományú eloszlását mutatta. A gyűrű közepén lévő föltorlódott sejtek magas szinten tartalmaztak prokollagén mRNS-t, amit bizonyított az emulzióban kivált ezüst szemcsék nagy száma. Ezzel ellentétben az alacsony sűrűségű szélen alacsony volt a prokollagén mRNS szint. Nagyon hasonló eredményeket kaptunk, amikor sejtsűrűség grádienst hoztunk létre úgy, hogy a sejteket zárt szövette99 9 ···♦ • · ·· · · 999 • · ·

4·· nyésztő edénybe raktuk.

Azokban a kísérletekben ahol, a sejtek növekedését kezdetben klónozó gyűrű korlátozta nagyon magas táptalaj térfogat sejtszám aránynál a sejtek még megtartották reagáló képességüket a sejtsűrűségre. Ez nem egyeztethető össze azzal az egyszerű modellel, amely szerint a CDS egy stabil faktorként hat és felszaporodik a táptalajban, ahol a CDS-ről azt hisszük, hogy diffúzibilis_z mert a CDS hatása kihígítható az oldatból.

3. Példa A feltorlódott sejtek diferenciálódott funkciót expresszálnak, de megtartják sejtosztódási kapacitásukat

A PAT sejtek tenyészetének morfológiai azonossága ellenére lehetséges, hogy a föltorlódott rész perifériáján található sejtek a populáció egyedi alkotórészei. Ebben az esetben a fentebb leírt prokollagén expresszió grádiens egy része keletkezhet a kevesebb prokollagént termelő, osztódó sejttípusok elkülönülése miatt.

Ennek ellenőrzésére a PAT sejteket kezdetben klónozó gyűrűkbe raktuk a fent leírt módon és hagytuk növekedni a sejtek föltorlódásáig. Egy sejtkaparó élét használtuk két 1.7 mm-es függőleges darab eltávolítására a kör alakú sejttenyészetből egy (~6 mm) egy kereszt alakot létrehozva. Ez a távolság elég kicsi volt ahhoz, hogy a sejtek középre kinőve mindkét oldalról kitöltsék a keletkezett űrt. In situ hibridizáció mutatta, hogy a migrációs front részét alkotó sejtek magas szinten termelnek prokollagént, ··· amint a sejtsűrűség megnövekszik. Ezzel ellentétben, amikor a sejtkör felét lekapartuk és a PAT sejtek az üres térbe vándoroltak, az alacsony sejtsűrűségű él mentén a sejtek alacsony szintű prokollagén expressziót mutattak.

A prokollagén mRNS szintek változásai a növekedési frontben lévő egyedi sejtekben nem a sejtek közötti eltérések miatt következnek be, hanem a sejtsűrűség hatása.

4. Példa A CDS feldűsulása a sejtrétegben

Az a tény, hogy a táptalaj térfogat nem változtatja meg a CDS-t azt sugallja, hogy a szignál molekula a sejtrétegben, valószínűleg a sejten kívüli mátrixban (ECM) szaporodik fel. Az egyik jelzés a feltételezésről az, hogy ha egyszer a szignál fölszaporodik, koncentrációjának a sejtrétegben vagy az ECM-ben függetlennek kellene lennie a sejtek folyamatos jelenlététől.

A koncepció egyik ellenőrzése, hogy a sejttenyészet egy részét lekaparjuk, de úgy, hogy megakadályozzuk a sejtek vándorlását arra területre, ahonnan eltávolitottuk az ECM-et.

Ennek megvalósítására a sejteket kezdetben klónozó gyűrűkbe raktuk és hagytuk nőni a feltorlódásig. A sejtkör felét azután lekapartuk egy éles lappal. Ezzel megsértettük a műanyag edény felületét és megakadályoztuk, hogy a sejtek kivándoroljanak. 48 óra után (egy kicsivel több mint a prokollagén mRNS fél életideje) a sejtek megtartották magas prokollagén szintjüket a durva él mentén. A durva él önmaga nem stimulálja a prokollagén szintézist, amint azt bizonyítja, hogy a durva él és a kör természetes élének találkozásánál elhelyezkedő sejtek (ahol a prokollagén szintézisről kimutatták, hogy alcsony) nagyon alacsony szintű prokollagén mRNS szintézist mutattak.

A lekaparás élénél évő sejtek folyamatosan fenntartották a prokollagén mRNS magas szintjét még akkor is ha csak feleannyi sejt van a közvetlen közelükben. Ez megerősíti, hogy a faktor az ECM-hez kötött állapotba van.

5, Példa Óvatos rázatás eltávolítja a CDS-t az ECM-ből

Hogy a CDS az ECM-nek egyik gengén kötődő alkotórésze bemutatható oly módon, hogy a PAT sejteken lévő táptalajt rázatjuk és figyeljük a kollagén expresszióra és a sejtosztódásra gyakorolt hatásokat. Duun, G.A. & Ireland, G.W., Natúré (1984) 312:63-65 kimutatták, hogy a növekedési faktorokat befolyásolja a sejttenyészet fölötti közeg lamináris áramlása.

A kollagén expresszió megfigyelésekor kétféle körülményt alkalmaztunk: az egyik, amikor a sejteket kezdetben egy klónozó gyűrűbe raktuk és a második, amikor a sejteket az egész lemez felületére helyeztük. A legalapvetőbb különbség a kétféle mód között táptalaj térfogat és a sejtszám arányban található. A sejteket 39 °C-on növesztettük az egymásba torlódási fázisig és azután egy rázó tálcára tettük két napra (kontrol lemezeket nem rázattuk).

A rázatás hatása a táptalaj-sejt aránytól függött. Ab35 bán az esetben, ha a sejteket az egész lemez felületén osztottuk el a fölnövesztett tenyészetnek nem volt hatása. Ezzel ellentétben a kezdetben klónozó gyűrűbe rakott sejteknél a felnőtt tenyészet rázatása a prokollagén mRNS szint csökkenését okozta és függetlenné vált a sejtek sűrűségétől.

Ez összhangban van azzal a modellel, amely szerint a CDS a sejt extracelluláris környezetének egy gyengén kötődő komponense és rázatással kiszabadítható a nagy mennyiségű táptalajba, az eltávolításkor szükségszerűen felhígítva és gátolva a prokollagén mRNS expresszióját. Másrészt egy viszonylag kis táptalaj térfogattal rázatva az edényeket nem következik be a CDS fölhígulása (kb. két nagyságrend a változás aránya), ami azt eredményezi, hogy a CDS újra egyesülésének szintje magas és nagyon kicsi vagy egyáltalán nincs hatása a sejtekre.

A kísérleteket megismételtük annak éredében, hogy megvizsgáljuk a táptalaj-sejt arány hatását a prokollagén szintézisre. A sejtek osztódását vizsgáltuk triciált-timidin (³Htimidin) beépüléssel, amely mérési technika ismert a szakterületen jártasak előtt, ily módon is hasonló eredményeket kaptunk. A klónozó gyűrűbe rakott sejtek és 24 órás rázatás esetén drámaian növekedett a jelölt nukleotidok száma akár a tenyészet szélén, akár a belsejében. Ezzel éles ellentétben, az egész felületre ültetett sejteket tartalmazó edényekben alig volt hatása a táptalaj rázatásának.

Nem rázatott körülmények között a nagy sűrűségű részeken a sejtek nincsenek tudatában, hogy vajon ez a sűrűség min36 dössze néhány mm-es vagy az egész edényre kiterjed. A gyűrű középpontjának legsűrűbb részén a sejtek úgy reagálnak, hogy csökkentik növekedésüket és növelik a prokollagén expressziót. Amint az előzőekben kimutattuk a prokollagén termelésnél a két dimenziós sejtsűrűség minden irányban több mint egy mm.

Rázatással a hatékony környezet egy háromdimenziós térré alakul át. A megfigyelés, miszerint a táptalaj rázatásra nem változtatja meg a CDS hatását, amennyiben elegendő sejt van jelen (5 x 10⁵/ml viszonyítva a 5 x 10⁵/ml-hez) jelzi, hogy a táptalaj telíthető CDS-sel addig a pontig, ahol már újraegyesülése a sejt réteggel megakadályozza a biológiai hatás kihígulását.

6. Példa A táptalajba jutott CDS biológiai aktivitása

Kizárólag az 5. Példában bemutatott eredményekre alapozva várható, hogy a CDS a PAT sejtek osztódásának egyik inhibitora és a prokollagén gén expressziójának egyik serkentője. A rázatott PAT sejtek táptalajából visszanyert CDS biológiai aktivitása növekedést stimuláló hatásként jelentkezett.

A PAT sejtek felszaporodott tenyészeteit minimális mennyiségű táptalajban rázattuk, amely még éppen beborította az edényt (1 ml) és a rázatás hatására a CDS kijutott a táptalajba. Ezt a táptalajt adtuk az eredetileg klónozó gyűrűkbe rakott sejtekhez. Azután ennek a kondicionált táptalajnak 5 ml-ét használtuk a sejtek vizsgálatára. Ez kb. 500 szoros növekedést jelentett a sejtek számára hozzáférhető CDS mennyiségében. A teszt sejteket napig növesztettük mielőtt hozzájuk adtuk volna a kondicionált táptalajt, azután pedig azzal együtt további két napig. A kondicionált táptalajt kapott PAT sejtek növekedése nem gátlódott, hanem drámaian osztódni kezdtek. Magasabb koncentrációk esetén még azokat a sejteket is osztódásra lehetett bírni, amelyek a nagy sűrűségű zónában voltak. Ezzel ellentétben a kontrol lemezek nagy mennyiségű elhalt sejteket mutattak a sejt gyűrű szélén.

Az ily módon, egyformán növesztett tenyészet esetében a rázatás egy olyan faktort szabadít fel, amely stimuláló hatással van a homológ tenyészetek osztódására, de a faktor jelenléte az eredeti tenyészetben gátolja a növekedést.

Valaki feltételezheti, hogy a növekedés gátlója még mindig a sejt rétegben van és a növekedést stimuláló faktorral ellentétesen hat. Ez azonban nem felel meg azokank az eredményeknek, amelyeket a sejtsziget fölött lévő táptalaj (amikor nagy volt a táptalaj-sejt arány) rázatásával kaptunk. Ebben az esetben a táptalaj rázatása a sejtek növekedését okozta. Ehelyett ezek a kísérletek azt a koncepciót erősík, hogy a sejt rétegben lévő CDS biológiai hatása eltérő lehet a táptaljban megfigyelt CDS aktivitástól. Jelenleg azonban még nem ismert a mechanizmus, amellyel a sejt rétegben lévő CDS biológiai aktivitása megváltozik, amikor sejtek sűrűsége megnövekszik.

7. Példa A CDS fizikai jellemzői

A CDS növekedést stimuláló hatását használtuk fel je- lenlétének kimutatására, és ez tette lehetővé jellemzését és tisztítását is. A CDS-t stabilnak találtuk ammónium-szulfát csapadék formájában és ez lehetővé tette 100-szorosra történő betöményítését. Ebben a koncentrációban kis mennyiségeit teszteltük különböző körülmények között és azután a táptalajban 1-szeres koncentrációra hígítottuk az aktivitás megtartásának ellenőrzésére .

A CDS megtartotta biológiai aktivitásának legalább 75%át, miután alacsony pH (50 mM nátrium-acetát, pH 5.2 60 percig) hatásának tettük ki, a diszulfid kötéseket redukáltuk (10 mM DTT, 30 percig) és fölmelegítettük (90 °C, 10 percig). Hónapokig stabil maradt a táptalajban vagy PBS-ben is 4 °C-on. Másrészt a Tris ion (50 mM Tris pH 7.5, 60 percig) a CDS biológiai aktivitás több mint 90%-ának elvesztését okozta, amíg a Tris bázis (50 mM, pH 8.8, 60 percig) alig volt hatással (a biológiai aktivitás több mint 90 %-a megmaradt.

8. Példa A CDS proteolitikus érzékenysége

Megvizsgáltuk a CDS érzékenységét proteolítikus emésztés hatására protenáz-K (P9290- Sigma), pronáz (P4531) és tripszin (T-8386 -Sigma) emésztésekkel. Az enzim agarózhoz ill. poliakrilamidhoz történő kötésével segítettük az enzim eltávolítását a reakció után. A kötött enzimet (1 egység) 2-szer mostuk 1 x CDS-t tartalmazó alap táptalajjal (30 perc, egy rázó tálcán). Azután az 1 x CDS-t tartalmazó táptalajt kezeltük 2 órán át 39 °C39 on rázatva, egy asztali centrifugán lecentrifugáltuk és sterilre szűrtük. Az alap táptalajt hasonló módon kezeltük és azt használtuk kontrolként. Azután szérumot és aszkorbinsavat adtunk minden mintához és az ily módon kezelt CDS aktivitását a fentebb leírt módon ellenőriztük.

A CDS molekula érzéketlennek bizonyult a tripszines kezelésre (a biológiai aktivitás több mint 75%-a megmaradt), de érzékeny volt, mind a két proteáz enzimre (a biológiai aktivitásnak kevesebb mint 10%-a maradt meg). A CDS proteáz emésztése egy méreg reakciót váltott ki valamennyi vizsgált sejtnél. Hasonló toxicitás fejlődött ki azokban a mintákban, amelyeket ismételten lefagyasztottunk majd felolvasztottunk.

9. Példa A CDS tsztítása

Mivel a CDS egy stabil vegyület mialatt számos kezelésnek tesszük ki, amelyek tönkreteszik a szerkezetét. Ezeket a kezeléseket (hő, pH és DTT kezelés) ellenőriztük, hogy vajon megváltoztatják-e a CDS kromatográfiás tulajdonságait egy Bio-Gel P30 oszlopon.

Kizárólag a DTT hozzáadása mutatott szignifikáns hatást. A kezelés után a CDS aktivitás többsége eluálódott, de nem folyadék árammal, hanem közvetlenül az üres térfogat csúcs után, ami jelzi, hogy a CDS kismértékben bejutott a gél pórusaiba. (1. ábra) Az 1. ábrán a folyamatos nyilak jelzik a CDS aktivitást tartalmazó frakciókat a DTT kezelés előtt, a szaggatott nyilak pedig a DTT kezelés utáni aktív CDS frakciókat. Ez mutatja be, hogy a CDS aktív komponense egy 25-35 kD mérettartományba eső molekula, amely a rázatott sejttenyészet táptalajában aggregálódott, valószínűleg multimer formában található. Ezt az információt használtuk fel egy tisztítási módszer kidolgozására. A rázatott sejttenyészetről származó táptalajt betöményítettük ammónium-szulfátos kicsapással (Ezt a lépést elhagytuk, amikor kicsi volt a minta térfogata, mint pl. radioaktívan jelölt CDS visszanyerése esetén.) és a koncentrátumot ultraszűrtük egy 30 kD méretű kizárásos membránnal. Valamennyi aktivitás a 30 kD fölötti frakcióban maradt vissza. Azután a visszatartott anyagot 10 mM DTT oldattal kezeltük 30 percig és ismét ultraszűrtük egy 30 kD fölötti membránnal. Most az aktivitásnak kb. a fele átment a szűrón. Az átfolyóból származó aktivitás (megfelel 50 ml kondicionált táptalajnak) nem mutatott csíkokat a SDS-PAGE gélen ezüstös festés után. Ez az anyag mégis megőrizte biológiai aktivitását.

Timikor kondicionált táptalajt használtunk, amely egy éjszakán át jelölt sejtekből származott (nagy mennyiségben tartalmazott jelölt aminósavakat) és a fenti frakcionálási eljárásnak vetettük alá, megfuttattuk SDS-PAGE gélen és fluorografáltűk egy diffúz csíkot figyeltünk meg, amelynek molekula mérete kb. 30 kD. (2. ábra) A 2. ábrán a bal oldali sávba vittük fel a DTT kezelés és a 30 kD méretű szűrés után visszatartott anyagot, a jobb oldali sávba pedig az átfolyót.

Claims (19)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Egy sejtmentes, fehérjeszerű sejtsűrűség jelző molekula (CDS), azzal jellemezve, hogy sejttenyészetben képes az embrionális ínsejtek osztódásának kezdeti stimulálására és azt követően diferenciálódott génexpresszió elősegítésére.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy megfelelően tisztítjuk.
3. 3. Az 2. igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy a diferenciálódott gén egy prokollagén gén.
4. 4. Fehérjeszerű CDS, azzal jellemezve, hogy embrionális ínsejtek választják ki sejttenyészetükben és ezekből izoláljuk, továbbá képes időlegesen stimulálni a kollagént termelő sejtek osztódását és azt követően a prokollagén gén expresszióját kiváltani .
5. 5. A 4. igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy az embrionális sejtek csirkéből származnak.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy az alábbi jellemzőket mutatja:

   a, a relatív mobilitása SDS poliakrilamid gél elektroforézisen megfelel a legalább kb. 25 kD-tól a maximum 35 kD méretttartománynak ;

   b, 90 °C-ig hőstabil;

   c, tripszines emésztésre nem érzékeny;

   d, proteináz K-val vagy pronázzal végzett emésztésre érzékeny;
7. 7. A 4. igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy az embrionális sejtek csirkén kívül egyéb állatból származnak és megfelelő funkcionális homológiát mutatnak, ahol a CDS aminósav szekvenciájának legalább 25 %-a homológ a csirke aminósav szekvenciájával .
8. 8. A 7, igénypont szerinti CDS, azzal jellemezve, hogy emlős embrióból származik.
9. 9. Eljárás megfelelően tisztított fehérjeszerű CDS termelésére, azzal jellemezve, hogy az eljárás tartalmazza:

   (a) elsődleges ínsejtek biztosítását nagy sűrűségben sejttenyészet formájában;

   (b) megfelelő körülmények biztosítását, beleértve a kiegészítetlen táptalajt, amelyben a sejtek kiválasztják a CDS-t tartalmazó polipeptidet;

   (c) a tenyészet rázatását a CDS mennyiségének növelésére a táptalajban;

   (d) a CDS tartalmú kiegészítetlen táptalaj összegyűjtését;

   (e) a CDS tisztítását.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítás az alábbi lépésekből áll:

    a, a CDS tartalmú táptalaj első ultraszűrése egy 30 kD-os ultraszűrővel, amely a CDS biológiai aktivitását tartalmazó visszatartott anyagot eredményez molekuláris komplex formájában, amely komplex látszólagos molekula mérete nagyobb mint 30 kD;

    • « ··« b, az a lépés visszatartott anyagának denaturálása egy diszulfid hidat megbontó ágenssel, miáltal a komplex szétesik felszabadítva a CDS-t_z amelynek molakula mérete a 25 kD-tól a 35 kD-ig terjedő tartományba esik;

    c, a b lépés termékének második ultraszűrése egy 30 kD-os szűrővel; és d, a tisztított CDS-t tartalmazó szűrlet összegyűjtése.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek embrionális csirke ínbői származnak.
12. 12. Ellenanyag összetétel, azzal jellemezve, hogy az alapvető polipeptid specificitást a 6. igénypont szerinti CDS határozza meg.
13. 13. A 12. igénypont szerinti összetétel, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag monoklonális.
14. 14. A 8. igénypont szerinti CDS-re specifikus ellenanyag összetétele.
15. 15. A 14. igénypont szerinti összetétel, azzal jellemezve, hogy az ellenanyag monoklonális.
16. 16. Eljárás kötőszöveti sérülések kezelésére, azzal jellemezve, hogy az eljárás magában foglalja a 8. igénypont szerinti CDS alkalmazását a kötőszöveti sérülés helyén hatékony mennyiségben, amely stimulálja a kötőszöveti sérülés gyógyulását.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szövet ínszövet.
18. 18. A 9. igénypont szerinti eljárással termelt fehérjeszerű

    CDS.
19. 19. A 10. igénypont szerinti eljárással termelt fehérjeszerű CDS.