PT98602B

PT98602B - Integrao de corinebacteria processo para a transformacao de uma corinebacteria pelo dito integrao e corinebacteria assim obtida

Info

Publication number: PT98602B
Application number: PT98602A
Authority: PT
Inventors: Armel Guyonvarch; Oscar Reyes Alvarado; Jean Labarre; Celine Bonamy; Gerard Leblon
Original assignee: Centre Nat Rech Scient
Priority date: 1990-08-08
Filing date: 1991-08-07
Publication date: 1999-01-29
Also published as: PT98602A; FI921527A; BR9105857A; MX9100560A; NZ239309A; FR2665711A1; HUT63656A; IL99126A0; CA2067240A1; FR2665711B1; AU646886B2; EP0495078A1; CN1061624A; KR920702423A; IE912791A1; AU8442391A; WO1992002627A1; FI921527A0; JPH05502797A; ZA916216B

Description

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)

INTEGRÃO DE CORINEBACTÉRIA, PROCESSO PARA A TRANSFORMAÇÃO DE DMA CORINEBACTÉRIA PELO DITO INTEGRÃO E

CORINEBACTÉRIA ASSIM OBTIDA

A presente invenção diz respeito a um integrão de sequências de ADN pré-determinadas no genoma das corinebactêrias.

Este integrão pode ter duas grandes finalidades. Pode, por um lado, tratar-se de fazer produzir por uma estirpe de corine bactéria uma proteína particular, apesar desta proteína não ser normalmente expressa pela estirpe em causa, ou então utilizar-se para fazer sobreproduzir uma proteína homóloga. Mas por outro lado, pode utilizar-se para bloquear a expressão de um gene efectuando uma interrupção deste, o que levará à anulação da actividade enzimática correspondente e â acumulação do substracto da reacção na célula.

As corinebactêrias que reagrupam, além do Corynebacterium, o Brevibacterium, são bactérias cuja manipulação se revelou até ao presente muito delicada :

-2em primeiro lugar visto apenas existirem poucos ou nenhuns métodos que permitam a sua transformação e existem barreiras de restrição muito importantes que fazem com que as transformações que utilizem ADN proveniente de outras estirpes bacterianas sejam na maior parte das vezes ineficazes.

Recentemente, demonstrou-se a possibilidade de transfor mar corinebactérias mediante métodos de electroporação. Contudo, se as técnicas de transformação pelo vector auto-replicativo são interessantes, é preferível na maior parte das vezes, e a nível industrial, dispor-se de bactérias que foram transformadas por integração no cromossoma, quer dizer estirpes que são estáveis no tempo, quer quanto ao número de cópias do elemento integrado quer quanto â sua localização.

Constitui o objectivo da presente invenção propor sistemas de integração no genoma das corinebactérias.

A presente invenção diz respeito a integrões de corinebactérias caracterizados pelo facto de comportarem :

um gene que assegura uma selecção, chamado adiante gene de selecção, eficaz na dita corinebactéria,

uma sequência homóloga do genoma da dita corinebactêria, tendo as referidas sequências sido adaptadas â dita bactéria.

Por integrão, entende-se um vector não replicativo tendo a propriedade de se integrar no genoma de uma corinebactéria, podendo este integrão apresentar-se sob forma linear ou circular.

Contudo, o integrão provém, em geral, de um plasmídeo auto-replicativo que permite a síntese em um hospedeiro diferente, Escherichia coli por exemplo. Mas antes da etapa de integração, suprime-se, de preferência, qualquer vestígio de ADN de origem não corinebactéria, salvo o gene de selecção, e em particular todas as sequências implicadas na replicação.

Os genes de selecção eficazes nas ditas corinebactérias são :

quer genes de resistência a uma substância particular, especialmente antibiótica, quer genes que conferem um fenotipo claramente identificável, coloração e/ou complementação por exemplo.

Μ

χ.

No presente caso, a selecção por resistência a um antibiótico é mais particularmente interessante. Assim, pode-se utilizar :

os genes Aph III que conferem resistência â canamiR cina, assinalada Rm , os genes Cat que conferem resistência ao cloranfenicol, assinalado Cm

No entanto, outros genes podem ser utilizados, especial mente a resistência à eritromicina.

Por sequência homóloga, entende-se as sequências que correspondem as presentes na corinebactéria transformada ou que apresentem uma taxa de homologia superior a 80X, podendo tratar-se de sequências da mesma espécia ou não; estas sequências podem, por outro lado, ser sintéticas.

As sequências deverão ser adaptadas ou não, quer dizer ter em conta problemas de barreiras de restrição existentes nas corinebactêrias, por processos de que se descrevem alguns mais adiante

De preferência, este integrão provem de um plasmideo que comporta, além do integrão, uma parte replicativa, sendo o integrão ladeado por sítios de restrição que permitem o seu corte, /-5e de preferência sequências repetidas inversas correspondendo a um sítio de restrição não presente no integrão, por exemplo Notl, BstXI ou Saci. Assim, por digestão com a enzima que reconhece o dito sítio de restrição, pode-se obter directamente o integrão, o qual se pode, eventualmente, tornar circular, visto que as extremidades obtidas são complementares, antes de se utilizar para a transformaçao da corinebactéria.

No sistema de acordo com a presente invenção, o integrão faz, por conseguinte, de preferência, parte de um vector plasmídico que ê susceptível de se replicar com a ajuda de origens de replicaçâo, ou replicao, colocadas na parte replicativa. Segundo a natureza do replicao presente nesta cassete repli cativa, o plasmideo compósito pode replicar-se quer unicamente nas corinebactérias se for constituído por um único replicao endógeno, quer simultaneamente nas corinebactérias e em um hospedeiro estranho, Escherichia coli por exemplo, quando se associam ao plasmideo dois replicões diferentes, permitindo cada um a replicaçâo no seu hospedeiro próprio.

Neste caso, a construção do plasmideo poderá efectuar-se em diferentes sistemas de corinebactérias, o que pode, por vezes, apresentar interesse tendo em conta as dificuldades de contrução em Corynebacterium e Brevibacterium.

e

-6Graças à presença de sequências homólogas presentes simultaneamente no integrão e no genoma, o integrão vai-se inserir por recombinação no cromossoma. Assim, no transformante primário, o gene clonado inicialmente no sítio múltiplo de clonagem do integrão, encontra-se duplicado no cromossoma bacteriano (ver esquema Figura 2a).

Uma tal duplicação pode apresentar um interesse tecnológico na medida em que uma duplicação do gene pode levar a um aumento da actividade codificada por este gene, particularmente a actividade enzimática correspondente.

Como a estrutura do integrão primário corresponde a uma duplicação em sentido directo das sequências homólogas que enquadram o gene de selecção, é possivel prever uma ampliação desta estrutura mediante selecção do crescimento do integrante primário sobre o meio que permite detectar estirpes que sobre-exprimem o gene de selecção. Assim, quando o gene de selecção é o gene de resistência a um antibiótico, pode-se seleccionar estirpes mais resistentes, em meios com um teor crescente em antibiótico, estirpes essas que deverão corresponder a uma sobre-expressão dos genes que correspondem às sequências homólogas, mas igualmente a qualquer gene ou sequência de ADN que se inseriu no integrão.

Ê evidente que o integrão comportará, de preferência, além da sequência ou das sequências homólogas, uma sequência que codifica para uma sequência de interesse, especialmente um péptido ou uma proteína de interesse, que poderá ser homóloga, quer dizer provir de uma corinebactéria, ou então heteróloga, quer dizer provir de outras espécies bacterianas, mas igualmente ser de origem eucariota ou sintética.

Estas sequências comportarão, de preferência, os elementos que asseguram a sua expressão nas corinebactérias ou então serão inseridas em fase para poder ser expressas por elementos de expressão da bactéria hospedeira.

No caso do Corynebacterium, pode ser interessante, por exemplo, a obtenção de uma sobre-expressão de certas enzimas, especialmente gltA ou gdhA.

Como se indicou anteriormente, é possível utilizar este sistema para assegurar a interrupção de um gene utilizando um integrão de acordo com a presente invenção. Por interrupção ou por substituição, como a descrita na figura 2b, inactiva-se o gene correspondente, o que leva a uma sobre-produçao do substrato da enzima codificada pelo gene correspondente.

Em geral, o integrão será concebido sob a forma de uma cassete de integração, quer dizer que para além do gene de

-8selecção e da sequência homóloga, que em certos casos podem ser confundidos, prevê-se uma sequência comportando vários sítios de clonagem que permitirá inserir sequências de ADN e/ou genes à vontade.

Em qualquer caso, com fins de delimitação genética, tentar-se-á proporcionar um integrão desprovido de ADN replicativo de uma outra espécie.

É igualmente possível prever sistemas de integração mais complexos, em particular sistemas de integração que comportem, para além das sequências, um elemento transponível. As sequências de elementos transponíveis podem ser o conjunto das sequências que asseguram a transposição, com excepção das proteínas codificadas pela corinebactéria, mas pode, igualmente, tratar-se de transponíveis que são desprovidos das sequências que codificam para as transposases.

Entre os elementos transponíveis, é necessário citar o fago Mu, em particular sob a forma de um fago miniMu. No caso dos elementos transponíveis como o fago miniMu, como se verá adiante, utilizou-se marcadores que podem fazer parte do fago ou de origem diferente, por exemplo marcadores coloridos.

A presente invenção diz igualmente respeito a integrões que utilizam elementos transponíveis provenientes de diferentes

-9”

corinebactérias, especialmente de Brevibacterium, em particular ISaBl tal como descrito na figura 9.

Exemplo 10 apresenta a caracterização do elemento IsaBl e o Exemplo 11 descreve um método geral permite seleccionar e identificar este tipo de elemento transponivel.

A presente invenção diz igualmente respeito a integrões que comportam uma sequência proveniente dos elementos transpostos, especialmente dos elementos que codificam para as transposases e/ou os repressores da transposição.

Os integrões de acordo com a presente invenção podem comportar a totalidade ou parte das sequências em causa, especial mente a que corresponde ao ISaBl.

Este tipo de estrutura de integração comportando um fragmento do fago miniMu, uma sequência de ADN homólogo e um gene de selecção pode permitir, como a ajuda das estruturas descritas anteriormente, a obtenção quer de uma sobre-expressão de um gene particular, quer a interrupção de um gene quando esta se revele necessária.

Estas últimas estruturas, ainda que diferentes das estruturas anteriores, serão, contudo, chamadas por simplificação integrão.

-1Q

A presente invenção diz, igualmente, respeito a estirpes de corinebactéria obtidas por transformação integrativa com a ajuda dos integrões descritos anteriormente, particularmente quando o integrão foi introduzido mediante electrotransformação.

Entre as estirpes de corinebactérias utilizáveis, pode-se citar, mais particularmente :

B. lactofermentum,

B. flavum,

C. glutamicum”,

C. melassecola, pelo seu interesse industrial.

No caso em que a clonagem se realiza em um hospedeiro diferente da corinebactéria hospedeira final do integrão, a transferência do integrão pode utilizar com vantagem as propriedades replicativas eventuais da construção na corinebactéria com o objectivo de adaptar o integrão à corinebactéria. Assim, começa-se por introduzir o plasmideo que comporta, para além do integrão, uma parte replicativa, na própria estirpe onde se efectua a integração, pois este integrão assim adaptado será recuperado mediante extracção do plasmideo após digestão com a enzima ou as enzimas que libertam o integrão, sendo o fragmento purificado, então autoligado ou não e o produto de ligação utili-

zado para a transformação integrativa, neste caso as barreiras de restrição deixam de constituir uma dificuldade.

Em alguns casos pode ser útil passar-se por uma corine bactéria intermediária; especialmente no caso em que o ADN é de origem E. coli, pode ser interessante adaptar-se o integrão ao Brevibacterium lactofermentum antes de se adaptar ao Corynebacterium melassecola.

Finalmente, a presente invenção diz respeito â utilização das Corynebactérias de acordo com a presente invenção no quadro de processos industriais, especialmente para a preparação de proteínas ou de metabólitos que utilizem o integrão de acordo com a presente invenção.

Os Exemplos que se seguem permitirão demonstrar melhor as vantagens da presente invenção.

Nas figuras anexas :

A figura 1 esquematiza a preparação de um integrão partindo de um plasmideo replicativo, a figura 2 esquematiza a inserção de um integrão, . mediante simples recombinaçâo (a) . mediante dupla recombinaçâo (b),

a figura 3 esquematiza a estrutura do pCGL519, a figura 4 esquematiza a percentagem de resistência à canamicina em função do tempo por duas estirpes transformadas, a figura 5 esquematiza a estrutura dos miniMu,

MudII 1681, . MudII 1681-Cat, a figura 6 esquematiza os plasmídeos pCGL 107 e pCGL 107::Mud⁺, a figura 7 esquematiza a integração dos integrões pretendidos contendo ou não o miniMu, a figura 8 representa o mapa de restrição dos elementos de inserção de Brevibacterium lactofermentum’' CGL 2005 (B115) clonada a partir de uma inserção na extremidade terminal 3' do operão lac, a figura 9 representa a sequência IsaBl, mapa de restrição de IsaBl,

-13a figura 10 representa o a figura 11 representa o plasmideo pCGL330, a figura 12 representa o plasmideo pCGL331.

mapa de restrição do mapa de restrição do

EXEMPLO 1

Construção de um banco de ADN cromossómico de Corynebacterium melassecola ATCC17965 e clonagem do gene gltA

ADN cromossómico da estirpe de C. melassecola ATCC17965 foi preparado de acordo com o método adaptado por Ausubel e Colab (1987). Realiza-se uma digestão dirigida pela endonuclease de restrição Mbol (Boehringer) sobre 10 jug deste ADN de acordo com o protocolo descrito por Maniatis e Colab. (1982). Separam-se os fragmentos de ADN em função do seu tamanho sobre um gradiente de sacarose de acordo com o processo descrito por Ausubel e colab. (1987). Os fragmentos de tamanho compreendido entre 6 e 15 kb são retidos para a construção do banco.

O plasmideo de clonagem pUNl21 (Nilsson e colab., 1983) foi preparado de acordo com o método descrito por Birnboim e

-u-/

Doly, (1979) a partir da estirpe de E. coli GM2199 disponível livremente. 0 plasmídeo ê linearizado pela endonuclease de restrição Bell (Boehringer).

banco foi construído por ligação com a T4 DNA ligase (Boehringer) de acordo com as condições escritas por Ausubel e colab. (1987), de 1 ytg de plasmídeo pUN121 linearizado pela Bell e de 2 dos fragmentos de ADN de 6 a 15 kb descritos anteriormente. A mistura de ligação é introduzida na estirpe de ”E. coli” DH5 alfa mediante electroporação de acordo com o protocolo descrito por Dower e colab. (1988). Seleccionou-se os clones de E. coli que comportam os plasmídeos recombinantes directamente pela sua capacidade para crescer sobre o meio LB contendo 10 ^lg/ml de tetraciclina. Os plasmídeos da totalidade dos clones resistentes â tetraciclina foram preparados de acordo com o método descrito por Birnboim e Doly (1979). 0 conjunto destes plasmídeos corresponde ao banco de ADN.

Transforma-se a estirpe de E. coli W620 deficiente para a actividade citrato-sintase com o banco de ADN de C. melassecola ATCC17965. Seleccionou-se um clone transformado de E. coli W620 capaz de crescer em um meio mínimo de selecção contendo tetraciclina. Este clone é portador de um plasmídeo recombinante pCGL508. Diferentes sub-clonagens permitiram encurtar o fragmento de ADN de C. melassecola comportando o gene gltA completo para um fragmento de ADN de 3,5 kb delimitado por dois sítios de restrição HindIII.

•te.

EXEMPLO 2

Integrão pCGL519 esquema para a preparação do integrão está representado na Figura 1.

Escolheu-se o gene aphlll como gene de selecção; ele confere resistência até 600 /g/wi]- de canamicina quando é integrado em uma cópia no cromossoma. Trabalha-se habitualmente com 25^ag/ml. Escolheu-se o fragmento HindIII de 3,5 kb comportando o gene de estrutura gltA que codifica para a citrato-sintase de C. melassecola obtido no Exemplo 1 no início como fragmento de ADN homólogo do genoma das Corynebactêrias e inserido em um dos sítios únicos do sítio múltiplo de clonagem (o sítio HindIII). Os sítios de restrição que guarnecem o integrão previstos para ser os mais utilizados na estratégia de integração são os sítios Notl que correspondem a uma sequência com 8 nucleótidos, e os sítios BstXI. A enzima BstXI reconhece a sequência (CCAN^NTGG); por este motivo corta tão frequentemente como uma enzima com 6 núcleo tidos e pode-se esperar que ela produza vários fragmentos. Mas os fragmentos libertados voltam a associar-se em função da natureza das sequências internas dos diferentes sítios BstXI, o que deve levar por fim a uma só reconstituição do fragmento inicial.

ι

τ.

Λ-,

Ο plasmideo pCGL519 (figura 3) é um exemplo de plasmideo versátil susceptível de gerar um integrao. Ensaiou-se a integração em C. melassecola da sua cassete integrativa a partir de um plasmideo resultante no início de E. coli. 0 pCGL519 é constituído por dois fragmentos replicativos e integrativos guarnecidos pelos sítios NotI. 0 primeiro fragmento corresponde ao integrão que compreende um sítio múltiplo de clonagem, o gene de selecçâo aphlll e um fragmento HindIII homólogo do cromossoma que comporta o gene gltA que codifica para a citrato-sintase. 0 segundo fragmento compreende a parte replicativa do plasmideo pBLI (fragmento Sspl-Hpal de 3 kb) que se replica nas corinebactérias, a parte replicativa do plasmideo pACY184 que se replica em E. coli, ori pl5A, e a origem de replicaçâo do fago M13 complementável em trans. 0 plasmideo pCGL519 foi constituído em E. coli por inserção de um fragmento HindIII de 3,5 kb contendo o gene gltA em um vector pCGL243.

Como se representa na figura 1, após clonagem o pCGL519 é utilizado para transformar o B. lactofermentum. No momento da transferência do pCGL519 para Brevibacterium lactofermentum CGL2002, o fragmento NotI contendo as origens da multiplicação foi substituído visto a parte replicativa do pBLI estar inactiva em E. coli. Isto demonstra uma vantagem suplementar da estrutura em cassete.

-17EXEMPLO 3

Integração

A transferência do pCGL519 para Corynebacterium melassecola ATCC17965 muito restritiva em relação à E. coli realizou-se a partir do mesmo plasmideo extraído do B. lactofermentum. 0 sistema proposto permite isolar o plasmideo pCGL519 da estirpe C. melassecola ATCC17965 que é totalmente restriva em relação à E. coli mas só parcialmente em relação ao B. lactofermentum. Assim preparou-se uma cassete integrativa possuindo a modificação da estirpe receptora.

Após digestão do plasmideo pCGL519 resultante de C. melassecola ATCC17965 pela endonuclease de restrição Notl (Boehringer), isolou-se e purificou-se o integrão contendo o gene gltA e o gene de seiecção AphlII a partir de um gel de agarose de baixo ponto de fusão. Submetendo-se em seguida o integrão assim purificado a uma auto-recirculação mediante ligação. Introduziu-se em seguida a mistura de ligação na estirpe G. melassecola ATCC17965 mediante electroporação (Bonamy e colab., 1990). Submeteram-se a análise os clones de C. melassecola resistentes a 25 ^sig/ml de canamicina.

Obtiveram-se 500 transformantes. Trinta e um entre os cinquenta analisados não possuem o plasmideo pCGL519 e vinte

-18i destes foram analisados mediante sou.th.ern blot após digestão Xbal. Todos correspondem a um mesmo acontecimento de integração efectuado mediante recombinação homóloga na região gltA. De acordo com a natureza do produto de ligação (molécula monomérica circular ou molécula polimérica linear ou circular), os integrantes primários podem ser interpretados como resultantes de um crossing-over simples ou duplo. Realizou-se uma análise em campo pulsátil após digestão Notl seguida de uma hibridaçao por uma sonda correspondente ao fragmento HindIII de 3,5 kb contendo o gltA. A integração de uma só cópia do integrão é confirmada por esta análise.

modelo implica a duplicação da cópia selvagem do gene gltA: mede-se a actividade enzimática, a qual é multiplicada por um factor 1,82 de acordo com a interpretação dos blots (manchas) e demonstra que a cópia integrada não está inactivada. Os resultados estão reunidos no Quadro 1 em relação â estirpe selvagem e à estirpe transformada por um plasmídeo replicativo. Mede-se a estabilidade da estrutura integrada quanto à percentagem de células de canamicina resistentes depois de uma trintena de gerações (figura 4) e quanto à actividade enzimática da citrato-sintase que continuam estáveis.

A multiplicação da estrutura integrada realizou-se mediante selecção do crescimento em caixa contendo um excesso de canamicina, selecção a 800yig/ml, depois 1.000yig/ml, depois

1.000^ug/ml de canamicina e de neomicina. Obteve-se um aumento em linha directa. Apesar da estabilidade da estrutura aumentada e da resistência à canamicina, o alto nível de actividade enzimática obtido no início, no caso da citrato-sintase, não ê mantido ulteriormente. É possível que se tenha produzido uma inactivação específica do gene gltA.

EXEMPLO 4

Construção ã base de miniJMu

Os derivados de Mu escolhidos neste Exemplo sã? Mbdl68í e MudII 1681-Cat (respectivamente Km e Cm ) que têm um tamanho de 14,8 kb e 16,6 kb respectivamente (figura 5). O miniMu MudII 1681-Cat é um derivado do transposão MudII 1681 (Castilho e colab., 1984). Possuem os elementos necessários à transposição enunciada anteriormente (excepto HU) assim como o gene de repressor termossensível C (regulador da expressão das transposases A e Β), um gene de resistência aos antibióticos (respectiva mente aphll e Cat) e os genes lacA lacY e lacZ'. Este último começo no 8Q codão e permite detectar fusões traduzíveis de proteínas quando Mud se insere no Quadro de leitura.

Transferiram-se estes transposoes para as Corinebactérias. Depois da integração dos transposoes no cromossoma, um método, descrito no Exemplo 8, permite ampliar a cópia integrada.

-20Associado a esta ampliação, o gene alvo do acontecimento da integração (o gene de estrutura da glutamato desidrogenase) é em numerosos casos igualmente ampliado com um aumento de até um factor 25 da actividade enzimática correspondente.

EXEMPLO 5

Construção de vectores para a transferência dos miniMu vector integrativo (pCGL107 - Figura 6) contém o gene gdhA (Gdh’) interrompido pelo marcador de resistência â canamiR ~ cina Km (aphlll), o replicao (ori) do pUN121 (Nilsson e colab., 1983) e os genes que conferem a resistência â tetraciclina (Tet ) e à ampicilina (Amp ). Este vector nao sendo multiplicativo nos Brevibacterium lactofermentum integra-se mediante simples crossing-over no sítio de homologia do gene gdhA (Leblon e colab., 1990).

MudII 1681-Cat é introduzido no vector integrativo pCGL107 mediante mini-remoção a partir de E. coli OR 1836 na estirpe MC4100. Entre as diversas inserções obtidas, reteve-se uma delas apresentando um fenotipo lac- em E. coli (pCGL107:: Mud+, Figura 6). A partir deste mesmo plasmideo, preparou-se um Mud desarmado (pCGLlO7::Mud-, Figura 6) em que os genes das transposases A e B foram cortados mediante digestão HindIII.

-21Outras estratégias de transferência foram ensaiadas; MudII 1681 foi introduzido nas corinebactérias colocando-se o transposão sobre dois outros tipos de vectores :

Vector suicida (não multiplicativo, não integrativo) pEVll::Mud, trata-se de um derivado de pUC18 desprovido dos genes lac em que se introduziu o MudII 1681.

Vector vaivém (pCGL 229) possuindo o replicão de pBLl (fragmento HindIII-Hpal), o replicão pl5A e o gene Cat de Tn9.

MudII 1681 foi introduzido no vector vaivém mediante mini-remoção em E. coli Rec+. Entre as diversas inserções, reteve-se uma delas apresentando o fenotipo Lac- (pCGL229::Mud+). A partir deste vector preparou-se um Mud desarmado pCGL229: Mud-, em que os genes das transposases A e B foram cortados mediante digestão PstI.

EXEMPLO 6

Eficácia da electrotransformação das construções e a sua transferência em Brevibacterium lactofermentum

Com os vectores anteriormente descritos, electrotransforma-se uma estirpe de E. coli (DH5alfa) e duas estirpes de Brevibacterium lactofermentum CGL2002 e CGL2005 (B115). Estas duas estirpes são parcialmente permissivas em relação ao ADN proveniente de E. coli. Estas experiências levaram aos resultados apresentados no Quadro 2. Pode-se fazer as seguintes observações :

Em E. coli, quer seja no caso do vector vaivém pCGL229 ou no caso do vector pCGLlO7 (que pode aí ser replicado, a eficácia da transformação ê nitidamente diminuída quando Mud+ está presente sobre o vector o que não acontece quando os genes de transposição foram cortados. Este fenómeno típico dos plasmídeos replicados comportando derivados Mu activos pode ser atribuído a uma expressão muito forte da transpsase de Mu no seu hospedeiro natural. Isto demonstra que nas construções anteriormente apresentadas, os Mud+ utilizados (MudII 1681 e MudII 1681-Cat) são bastante activos.

Em nenhuma das estirpes de corinebactéria ensaiadas foi possível obter transformantes com os vectores vaivém pCGL229::Mud+ ou - (nem com o vector suicida pEVll::Mud). No caso dos derivados do pCGL229, é possível que quando da mini-remoção em E. coli

-23Rec+ ο replicão pBLl esteja inactivo o que explica a incapacidade do vector para se multiplicar em

B. lactofermentum.

Foram obtidos transformantes em B. lactofermentum' CGL2005 (B115) com o vector integrativo pCGL107 e os seus derivados. A eficácia da transformação obtida com pCGL107::Mud+ e pCGL107::Mud- é semelhante, o que indica que o MiniMu MudII 1681-Cat A+B+ não se transpõe com elevada eficácia quando é introduzido em B. lactofermentum com a ajuda de um vector integrativo.

A administração observada (factor 20) na eficácia da transformação dos dois derivados do pGGLlO7 comparados com o próprio pCGLlO7 ê provavelmente devida ao aumento do tamanho do plasmídeo transformante (10 kb no caso do pCGL107, 26,7 kb no caso do pCGLlO7::Mud+ e 22,1 kb no caso do pCGLlO7::Mud-).

EXEMPLO 7

Estudo dos acontecimentos de integragão de pCGLlO7: :Mud+ em

B. lactofermentum GGL2005 (B115)

A transformação da estirpe CGL2005 (B115) pelo pCGL107 Mud+ (denominado adiante pCGL320) permitiu obter 147 clones

-ηresistentes à canamicina (25 yig/ml), mas não se seleccionou nenhum transformante resistente ao cloronfenicol (5 yUg/ml). Contudo, após replicação sobre cloranfenicol, 103 destes clones são resistentes ao cloranfenicol. Verifica-se, por conseguinte, que o gene cat de Tn9 não se exprime suficientemente com uma única cópia para permitir uma selecção primária em colónias; pelo contrário, esta expressão é suficiente para determinar um fenotipo resistente mediante testes ulteriores em estria. Todos os clones obtidos são do fenotipo lac-, o que corresponde ao fenotipo observado em E. coli.

Os dois tipos de integrantes obtidos (os transformantes RS RR do tipo 1, Km Cm e do tipo 2, Km Cm ) podem corresponder respectivamente à substituição do gene gdhA mediante acontecimento do duplo crossing-over e à integração do plasmideo completo no sítio gdhA mediante acontecimento de simples crossing-over” (Figura 7). Os dados a favor desta interpretação são os seguintes:

doseamento da glutamato-desidrogenase (de acordo com a técnica descrita por Meers e colab., 1970) nos transformantes do tipo 1 e 2 (Quadro 3) : 5 em 7 transformantes do tipo 1 (por exemplo e Kg, Quadro 3) têm uma actividade gdh nula, o que estã de acordo com a substituição do gene gdhA pelo gene interrompido. Quatro de cinco transformantes do tipo 2 têm uma actividade gdh semelhante ã teste-25munha (KC2 e KC^ por exemplo, Quadro 3).

As análises moleculares em Southern Blot correspondendo ã digestão BamHI dos transformantes do tipo 1 (IL·,) e do tipo 2 (KC2 e KC^) θ revelação das bandas características (visualizadas na Figura 7) pela sonda plasmídica pCGL107 (resultados não apresentados). Estas indicam que a estrutura molecular dos transformantes gdh-Ç^) estã de acordo com uma substituição do gene. Confirma igualmente que os transformantes gdh+ [acontecimentos do tipo 2 (KC2 θ KC^) ^e alguns do tipo 1 (K^)] são obtidos mediante integração do plasmídeo no sítio gdhA.

EXEMPLO 8

Selecção das eventuais transposições

Os transformantes do tipo 2 (Km e Cm ) nao exprimem suficientemente o gene de resistência ao cloranfenicol para se obter o crescimento de colónias isoladas na presença de cloranfenicol 5 yug/ml. Procurou-se, por conseguinte, nestes transformantes sub-clones Cm esperando seleccionar transposições de Mud (que comporta o gene cat). Estes sub-clones foram obtidos com uma frequência próxima de 1 para 10^ células. Após replicação em

Xgal, estes clones apresentam toda uma graduação de cores do branco ao azul (30% são nitidamente azuis). Este resultado é confirmado pela medida das actividades beta-galactosidase (Quadro 4). Isto poderá indicar uma transposição de Mud, aumentando a resistência ao cloranfenicol e fazendo aparecer actividades beta-galactosidase por fusão da proteína ao sítio de inserção. Com efeito, as mesmas experiências realizadas com o pCGL107::Mud- conduziram ao mesmo resultado o que indica que estes acontecimentos não são devidos a acontecimentos de transposição .

EXEMPLO 9

Demonstração do aumento em linha sobre o cromossoma do plasmídeo pCGL107::Mud+

Verificou-se que a quase totalidade destes clones Lac+ isolados anteriormente (com excepção do KC3T4) têm, igualmente, uma actividade gdh aumentada (Quadro 4). Além disso, salvo uma excepção (KC3T4), as actividades beta-galactosidase (doseada de acordo com o método descrito por Miller, 1972) e gdl são quase proporcionais. A mesma observação pode ser feita no que diz respeito ao doseamento da cloranfenicol-acetil-transferase (de acordo com o método descrito por Shaw, 1975, Quadro 5). Este resultado ê contraditório com a transposição de Mud que nunca

-^7transporta sequências adjacentes quando da sua transposição.

Isto indica antes um aumento em linha sobre o cromossoma da unidade de repetição pUN-Mud-gdh que ê ladeada por homologias de sequência. Este ponto foi confirmado pela digestão do ADN genómico das estirpes KCg, KCgTl e KC^Tg com BamHI, Notl e Xbal. Não só a banda BamHI interno de Mud (e igual a 7 Kb) estã aumentada como também as bandas que contêm os bordos de Mud (11 kb e 2,4 kb) o que estã de acordo com um aumento em linha e que se opõe a um acontecimento de transposição. Além disso, as digestões Notl (que corta uma só vez em MudII 1681-Cat, e Xbal (que corta uma só vez em gdh') aumentam nitidamente a banda de 24 kb da unidade de repetição.

Este aumento parece relativamente estável na medida em que a actividade beta-galactosidase permanece a um nível de 70% da actividade inicial após 15 gerações sem pressão de selecção. As actividades Cat e Gdh apresentam, igualmente, uma perda de 30% após 25 gerações. Este aumento em linha recorda os resultados de Albertini e colab. (1985) e de Janniére e colab. (1985) em Bacillus subtilis. Atribui-se a actividade beta-galactosidase dos clones aumentados a uma tradução parasita aumentada (fora do quadro de leitura do gene da resistência â ampicilina em que o operão lac estã fundido) presente no B. lactofermentum e não detectavel em E. coli.

-28EXEMPLO 10

Estudo e caracterizagão do elemento de inserção ISaBl

Isolou-se um elemento de inserção mediante recuperação de plasmídeos em ”E. coli DH5alfa a partir do ADN aumentado de

KC₃T₄.

ADN genómico da estirpe de B. lactofermentum

CGL2005 (B115), de alguns derivados e de outras estirpes de corinebactêrias, foi sondado com uma sonda contendo o elemento de inserção anteriormente isolado. Inicialmente, o fragmento PvuII de 3,5 kb interno de Mud, resultante do ADN aumentado em KC^T^ e contendo o elemento de inserção, serviu para sondar o blot (mancha) inicial que contém as digestões do ADN com BamHI de integrantes e de variadas estirpes aumentadas (das quais KC^T^). Como a inserção nao contém sítio BamHI, esta experiência permite revelar os fragmentos genõmicos BamHI contendo pelo menos uma inserção ou um fragmento de inserção» Na estirpe Kl - (que corresponde a um integrante substituído do tipo 1 obtido a partir do pCGL107::Mud-), aparecem cinco bandas revelando a presença de várias cópias (inteiras ou não) da inserção.

A digestão BamHI dos ADN genõmicos provenientes do

B. lactofermentum CGL2005 (B115) mostra quatro bandas comuns com Kl - (de tamanho respectivo 18 kb, 5,9 kb, 5 kb e 4,5 kb);

a quinta banda presente nas outras estirpes Kl-, KG1- e KC3 (de tamanho 6,5 kb) pode traduzir uma transposição em um segregante da estirpe CGL2005 (B115) na origem destas estirpes.

Entre duas linhas de brevibactérias diferentes (i) Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B115) e (ii) Brevibacterium lactofermentum CG12002, aparecem duas bandas comuns de tamanho 18 kb e 4,5 kb; pelo contrário, a estirpe CGL2002 não tem outras bandas. Isto traduz uma mobilidade do elemento. As estirpes de Corynebacterium melassecola dão sinais de hibridação fracos com a inserção traduzindo a existência de outras sequências diferentes mas aparentadas nesta espécie.

Identificou-se e submeteu-se a uma clonagem um primeiro elemento de inserção móvel específico de B. lactofermentum; denominado ISaBl, ele pode estar presente em várias cópias (2 a 5 cópias no genoma). Sendo susceptível de transportar várias vezes em sítios diferentes em uma região aumentada. 0 seu mapa de restrição fina é conhecido. Existem sequências diferentes mas aparentadas no genoma das outras corinebactérias.

ISaBl é constituído por 1288 pares de bases, os bordos podem ser identificados visto ISaBl estar inserida em um fragmento que corresponde â região terminal (3¹) do operão lac que foi sequenciado por Hediger e colab. (Biochemistry Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 1985). ISaBl inseriu-se entre o nucleótido /305575 e 5576 mediante duplicação de uma sequência alvo de 5 bp (CCGAT) (Figura 8). A sequência inteira de ISaBl está representada na figura 9 e o mapa de restrição na Figura 10. Foram identificadas duas fases abertas de leitura que poderão corresponder, de acordo com as análises da sequência, ao gene da estrutura da transposase e ao gene repressor da transposição.

EXEMPLO 11

Vector armadilha para os elementos de inserção e os transposões

A inserção ISaBl foi obtida no decurso de estudos do gene no cromossoma de B. lactofermentum CGL2005 (B115). Com o objectivo de isolar todos os elementos de inserção susceptiveis de se transportar nas corinebactêrias, construíram-se vectores integrativos particulares : pCGL330 e pCGL331 (Figuras 11 e 12). Estes dois vectores são constituídos por um primeiro fragmento derivado do vector pUN121. 0 plasmídeo pUN121 ê replicativo em E. coli e possui resistência à ampicilina; comporta uma sequência que codifica para o repressor CI do fago lambda que inibe a expressão de uma fusão do operão entre o promotor P^ do fago lambda e um gene de resistência à tetraciclina. A inserção no gene CI inactivarã deste modo o repressor o que permitirá então a expressão do gene de resistência à tetraciclina que se exprime nas corinebactêrias sob o controlo de P^. Pode-se assim

seleccionar os acontecimentos da inserção pela resistência â tetraciclina. Lineariza-se o pUN121 no sítio SspI e funde-se com um segundo fragmento obtido por digestão do vector pCGL107 por EcoRI preenchido com Klenow para se obter, após transformação de E. coli. DHóalfa, os vectores pCGL330 e pCGL331 que diferem entre si pelo sentido da clonagem. 0 fragmento EcoRI derivado do pCGL107 contém um gene de selecção para a transformação directa das corinebactérias (o gene aphlll que confere a resistência à canamicina) e um fragmento contendo uma parte homóloga do gene gdhA (gene de estrutura da glutamato-desidrogenase) que servirá de ponto de integração no cromossoma das corinebactérias.

As estirpes de B. lactofermentum CGL2005 (B115) e CGL2002 foram electrotransformadas para a resistência â canamicina pelos plasmídeos pCGL330 e pCGL331. A frequência de transformaçao foi aproximadamente igual a lOexp porytg em cada um dos casos, o que é compatível com uma integração dos plasmídeos. Os transformantes (como CG12005::pCGL330 e CGL2005::pGGL331) são sensíveis â tetraciclina o que confirma que a regulação de P^ por CI funciona bem nos transformantes. A frequência dos segregantes resistentes à tetraciclina foi medida após cerca de 10 gerações.

Apareceram mutações que inactivam o gene CI nas estirpes que possuem os plasmídeos integrados pCGL330 e pCGL331, com uma frequência de 2 x 10exp-6 por geração.

-,ρ ?32 /

f

Realizou-se uma recuperação do plasmideo a partir do ADN genómico extraído de segregantes resistentes à tetraciclína isolados a partir das estirpes CGL2005::pCGL331 e CGL2005::pCGL330 e digerido pela enzima PstI.

Estes ADN digeridos foram ligados e o produto da ligação serviu para transformar a estirpe DH^alfa de ”E. coli para a resistência à tetraciclína. Analisou-se os plasmideos recuperados e em 7 casos sobre 9 clones resistentes à tetraciclina, identificou-se um elemento de inserção. Em um caso (proveniente de CGL2005::pCGL331), identificou-se um elemento de inserção igual a ISaBI (1,2 kb de tamanho, possuindo os sítios únicos Accl, EcoRV e Xhol) com uma localização interna a’cl. Em um outro caso (resultante de CGL2005::pCGL330) identificou-se um elemento de inserção diferente de ISaBI (tamanho de 1,0 kb, possuindo um sítio Accl mas sem sítio EcoRV nem Xho).

vector de armadilha ao transposão funciona; na maior parte dos casos, a mutação obtida é uma inserção; as frequências de resistência â tetraciclína determinam, por conseguinte, muito correctamente as frequências de transposição; os elementos com maior mobilidade foram identificados; entre estes, voltou-se a isolar o ISaBI e identificou-se um outro elemento de inserção diferente do ISaBI.

-33/

As estirpes citadas têm as seguintes origens :

Escherichia coli

DH5alfa

MC4100

OR1836

Gibco BRL Casadaban (1976) Reys - NQ. 1-1125

Brevibacterium lactofermentum

CGL2002 : Bonamy e colab. (1990) - NQ. 1-1127

CGL2005 (B115) : Bonnassie e colab. (1990) - NQ. 1-1126

Corynebacterium melassecola . ATCC17965 : ORSAN- NQ. 1-1124. ATCG17965::gltA : (o presente pedido)

Quatro destas estirpes foram depositadas na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNGM) do Institut Pasteur (Paris) em 23 de Julho de 1991:

Corynebacterium melassecola ATCC17965::gltA : NQ. 1-1124 Escherichia coli OR1836 : NQ 1-1125 . .

Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B115) : NQ. 1-1126

Brevibacterium lactofermentum CGL2002 : NQ. 1-1127.

A estirpe DH5alfa está disponível no catálogo da Clontech Laboratories, NQ. C1021-1, (Paio Alto, CA, USA) e a estirpe MC4100 na ATCG sob o número 35695.

-34ACTIVIDADE ESPECÍFICA CITRATO-SINTASE

ACTIVIDADE RELATIVA	rd	1,82	5,13
ACTIVIDADE ESPECIFICA	1,041	1,893	o cn R cn
ESTIRPES	ATCC17965	ATCC17965::gltA	ATCC17965 (pCGL519)

co cd *8

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QUADRO 2: Eficácia da transformação dos vectores comportando os MiniMu.

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d	d	d	d	d	d

-36/

QUADRO 3: DOSEAMENTO DA GLUTAMATO-DESIDROGENASE NOS TRANSFORMANTES PRIMÁRIOS

Estirpe Bacteriana	Actividade específica Gdh em yU moles de NADPH2 consumida/min/mg proteína
S S Estirpe Inicial Km Cm
CGL2005 (B115)	2,18
R S Transformante Km Cm
Kl	2,0
K2	Z 0,06
K3	Z.0,06
K4	Z0,06
K5	£0,06
K6	2,18
K7	^0,06
R R Transformante Km Cm
KC 2	2,24
KC 3	2,12
KC4	2,18
KC5	3,45
KC 7	2,06

-37/

QUADRO 4: DOSEAMENTO DAS ACTIVIDADES β GALACTOSIDASE E

GLUTAMATO-DESIDROGENASE NOS INTEGRANTES AUMENTADOS

Estirpe bacteriana	Actividade β galactosidase	Actividade especifica glutamato-desidrogenase
Estirpe Inicial Km^Cm^
CGL2005 (B115)	3,7	2,48
Integrantes Primários _TZ R_n R Km Cm
KC 2	6,2	2,24
KC3	4,5	2,06
Integrantes Aumentados
KC3T1	27,9	18,2
KC3T2	20,7	16,0
KC3T3	48,2	49,6
KC3T4	32,2	2,24
KC3T5	19,7	8,55
KC3T6	19,0	11,9
KC3T7	34,5	28,0
KC2T1	7,4	2,73

-18QUADRO 5: DOSEAMENTO DAS ACTIVIDADES CAT.^GAl e GDH NAS ESTIRPES AUMENTADAS

Estirpe	Actividade	Actividade	Actividade
bacteriana	β gal	específica Cat	específica Gdh
S S Estirpe Inicial Km Cm
CGL2005 (B115)	3,7	£0,07	2,18
Integrante primário Km^RCm^R
K2		4°,°⁷	4 0,006
K3		£ 0,07	< 0,006
Integrante primário Km^RCm^R
KC3	4,5	2,72	2,06
KC 7		3,4	1,82
Integrantes
aumentados
KG3T1	27,9	19,7	18,2
KC3T3	48,2	33,3	49,6
KC3T4	32,2	18,4	2,24
KG3T5	19,7	13,6	8,55

•λ

REFERÊNCIAS

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Shaw W.V. (1975) Chloramphenicol acetyl transferase from chloramphenicol resistant bactéria. Metho. in Enz. 43: 737-755.

Claims

1, - Integrão de corinebactéria, caracterizado pelo facto de comportar:

- um gene que assegura uma selecção eficaz na dita corinebactéria,

- uma sequência homóloga do genoma da dita corinebactéria, sendo as ditas sequências adaptadas â referida bactéria.

2. - Integrão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de este provir de um plasmideo que comporta, além do integrão, uma aprte replicativa, sendo o integrão acompanhado de sequências repetidas inversas correspondendo a um sítio de restrição não presente no integrão.

-433. - Integrão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a parte replicativa compreender uma origem de replicaçâo eficaz em uma bactéria não corineforme.

4. - Integrão de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a origem da replicaçâo ser eficaz em E.coli”.

5. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo facto de a parte replicativa compreender uma origem de replicaçâo eficaz nas bactérias corineformes.

6. - Integrão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de comportar, além das sequências, um elemento susceptível de ser transposto.

7. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o elemento susceptível de ser transposto comportar sequências provenientes de uma corinebactéria.

8. - Integrão de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a sequência ser proveniente de Brevibacterium.

9. - Integrão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a sequência ser proveniente de ISaBl tal como descrito a seguir:

τ 44SEQ ID N°: 1

TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido e suas proteínas correspondentes COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1288 pares de bases

NÚMERO DE HÉLISES: sequência dubla hélise representada a uma só hélise no sentido 5’-3’ da esquerda para a direita CONFIGURAÇÃO: linear

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

ORIGEM

ORGANISMO: Brevibacterium lactofermentum estirpe CGL2005 (B115)

ESTIRPE EXPERIMENTAL IMEDIATA clone isolado para recuperação do plasmideo

CARACTERISTICAS de 1 a 30 orla esquerda de 65 a 355 sequência que codifica para a hélise representada de 487 a 1248 sequência que codifica para a hélise representada de 1256 a 1288 orla direita (sequência inversa homóloga da orla esquerda) método de indentificação das características: S

PROPRIEDADES: sequência de inserção móvel do cromossoma de Brevibacterium lactofermentum gactgacccc tctttgstcc aouxszgm accagcatga tsctgcgaaa sssmtczgc 60 cxcc 54

ATS CCA CSC AAC ACC lys thr TAT ACA cyr thr CAG CAC TTC AAC CCC CAT CCC CTC CCC TTC TAC CAC AAC 124 (MC pro ar» gla gla pAa iy« arg asp ala vU Ua lau cyr glu asa TCC CCA CAC CCT TCS ATC CAS ACC ATC CCS ACC CAT CTC CCS CTC AAC cce CCC ACC TTC 134 sar pro gla ala sor Ua gla cat Ua ala cAr asp lau Uy Vii asa arg Ua CAS lau CCS AAC tse CTC AAA AAA TAC CSC ACC CCA CCT CCC AAC GAA ACA CCC TCC CCA CCC TCT 244 *1* asn trp vai lys lys tyr gly thr ala Ua pro asa glu CAS pro sar pro Ua sar CTC AAC CAS CCT CAS CAS ATC CSC AAA CTC GAA CCS GAA AAC CCT CSC TTC ACA CAA CAC 304 vai asa glu ala glu gla Ua arg lys lau gla arg glu asa ala arg lau arg glu glu CSC CAT ATC cn css AAA CCT CCA AAA TAT TTC CCS GAA CAC ACC AAT TCC 355 arç aap Ua lou arg lys ala ala lys cyr pha ala gla glu CAS asa trp

/ tsasccgcst ccsgstcsts catsacgcct ccaagaccsa ctcscscaag cgskaxgsc 415

ACSTCCTÇAA ACTCAACAGS TCTTCCTACT AXAAAXCSAA AASTACCTGC TCAGCACGCA 475

CGAAACGCCT C

486

ATG TCC CAC OCS AIC CTC CSS CCT CSA CTC AAC CCT CSC TTC ACC ACC CAA AAT CCS TCS 546

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TCAAÀTCCSC CCTCSCSACS ATCCSGCCCS CSSCCCC

1233 l-ΑΊ

10.- Integrão de acordo com uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo facto de comportar além disso as sequências de um elemento susceptível de ser transposto que assegura a transposição com excepção das proteínas codificadas pela bactéria corineforme.

11. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo facto de as sequências do elemento susceptível de ser transposto serem desprovidas das sequências que codificam para as transposases.

12. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de interesse

13. - Integrão de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo facto de a sequência de interesse codificar para um pêptido ou uma proteína de interesse.

14. - Integrão de acordo com a reivindicação 13.caracterizado pelo facto de a proteína de interesse ser uma proteína homóloga.

15.-Integrão de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo facto de a proteína de interesse ser uma heterôloga.

16. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo facto de a proteína de interesse ser uma enzima.

17. - Integrão de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo facto de se escolher a sequência que codifica para uma proteína de interesse entre os genes:

-gltA

-gdhA

18. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 2 a 17, caracterizado pelo facto de se escolher o sítio de restrição não presente no integrão entre:

-Notl

-BstXI.

19. - Integrão de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de se adaptar as referidas sequências para uma estirpe de corinebactéria.

20. - Integrão de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo facto de se transferir as ditas sequências para uma estirpe de Brevibacterium, antes de ser adaptado ao Corynebacterium

21. - Integrão de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo facto de se amplificar as ditas sequências.

22. - Integrão amplificado de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de a amplificação dar sequências amplificadas estáveis.

23. - Integrão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de comportar uma sequência homóloga de Corynebacterium melassecola” que se integra no cromossoma de Brevibacterium lactofermentum”.

24. - Processo para a transformação de uma estirpe de bactéria corineforme com um integrão de acordo com uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo facto de se introduzir este integrão na dita estirpe mediante electroporação.

25. - Corinebactéria, caracterizada pelo facto de ser susceptível de ser obtida pelo processo de acordo com a reivindicação 24.

26. - Corinebactéria de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de se tratar de uma estirpe de:

”B. lactofermentum”

-B.flavum

-”C.glutamicum”

-”C.melassecola.