CA2067240A1 - Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue - Google Patents

Abstract

2067240 9202627 PCTABS00110 La présente invention concerne un intégron de corynébactérie caractérisé en ce qu'il comporte: un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie, une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie. Application notamment à la production de protéines par culture de corynébactéries transformées par ledit intégron lorsqu'il comporte une séquence codant pour une protéine d'intérêt.

Description

W092/02627 PCT/FR91/0065~

2 ~ ~A r, ~
tNTEGRON DE CORY~'EBAC~ERI~, PR3CEDE ~ TRA~SFORMATION D'U~'E
CORYNEBACTE~IE PAR LEDIT INTE~RO~ ET CORY~EBACTERIE 08~EN~'E
La presente ~nven~ion concerne l'inté~ratlon ce séquences d' ~,D'~i prédéterminées dans le ~énome des corynéDactéries.
Ce~te intégration peut avoir deux grandes finalités. Il peut.
d'une pars, s'agir de falre produire par une souche de corynébactérie une 5 protéine particulière, soit que cette protéine ne soit pas normalement exprimée par la souche en cause, ou bien de lui faire surproduire une protéine homologue. .Uais, d'autre part, il peut s'agir de bloquer l'expression d'un ~ène en effectuant une interruption de celui-ci, ce qui conduira à l'annulation de l'activité enzymatique correspondante et à
10 l~accumulation du susstr2~ de la reactlon dans la cellule.
Les CorynéDaC erles qui regroupent, outre Corynebacterium, arevibac:er;um. sons ces bactéries dont la mampulation s'est révélée jusqu~à present assez délicate:
- tout d'abord car il niex stait que peu ou pas de métnode permettant leur transformat~on, et - des barrières de restrictlon très importantes exlstent qui font que les transformations mettant en oeuvre de l'ADN provenant d'autres sources bactériennes sont la plupart du temps inefficaces.
Récemmen~, on a pu mettre en evidence la possibilité de 2~ transformer des corynébactéries par des méthodes d'électroporation.
Toutefois~ si les techniques de transformatlon par vecteur autoréplicatif sont interessanses, il est préférable la plupart du temps, et au niveau industriel, de disposer de bactéries qui ont été transformées par integration dans le chromosome, c'est-à-dire des souches qui sont stables dans le temps, 25 tant quant au nombre de copies de l'élément intégré que quant à sa localisation.
C'e~t l'objet de la pre5ente invention de proposer des systèmes d'intégration dans le génome des corynébacséries, La présente invention concerne des intégrons de coryné-30 bactérics caractérisés en ce qu'iis comportent:- un gène assurant une sélection, appelé ci-apres "gène de selectlon", efficace dans ladite corynébactérie, - une sequence homologue du génome de ladite corynébacterie.
Iesdites séquences ayan~ été adaptées à ladite bactérie, WO 92/02627 PCI /FR91/006~6 2Q~ ~2~ -Par "integror". on en-end dési~ner un ~ec-e_r non répilcatif avant la proprié~é ce s'intégrer dans le gér,ome d;Jne C~rvnéDaC-.éi-lC. ce~
ntégron pouvaî~ e:re sous forme lineaire ou clrcu.alre.
Toutefois. I'intégron provient, en gcnéra!. d'un plasmide 5 autoréplicatif qui permet la s~nthèse dans un hôte différent, Escher~_hia coli par exemple. ~lais avant l'étape d'intégration, on supprimera. de préférence, toute trace d'AD,~ d'origine non corvnébactérienne, sauf le gène de sélection, et en particulier toutes les séquences impliquées dans la réplication.
Les gènes de sélec ~on e'ficaces aans lesc~tes corvnéDactér~es sont:
- 5;!!- ces ~enes ce resls.ance - ~ne s~as-ar,cC rar.icuiiere. an~l~iotique notammen .
- soit des gènes conféran un phénotvpe clalrement Identifiable, colorallon e:/ou compiémen.~ on par exemple.
Dans le cas présen;. Ie séleclion par resistance a un antibiotique est plus partlculieremenl intéressanle. ~insi. on pourra utiliser:
- les gènes ~phlll conféran. Ia résistance à la kanam~cine. noté KmR, 25 - les gènes Cat conféran~ la résistance au chloramphenlcol. noté CmR.
~la~s. d'autres genes peu-ert etre utilisés. notammen~ la resistance à
l'érvthrom- cine.
Par "séquence nomologue". on en~end désigner des sequences qui correspondent à celles présen~es dans ia cor neDacterle transformée ou 25 qui présentent un taux d'homologie supérieur à ~ C~. il peut s'a~lr de séquences de la meme espèce ou non, ces séquence5 peuvent d'ailleurs etre synthétiques.
Les séquences devront être adaptées ou non, c'est-à-dire tenir compte des problèmes de barrières de restriction existant chez les 30 corynébactéries, par des procédés dont certains sont décrits ci-après.
De préférence, cet intégron provient d'un plasmide qui compor~e. outre l'intégron, une partie réplicative, I'inté~ron étant flanqué
de sites de restriction permettant son excision. e~ de préférence de .
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séquences répétees mve~ses c~rres~ondant à un slte aP restric~lon non present dans ll;ntog!on~ D_r eYemp~e ~otl. ~st`il o~ Sacl. ims.. par algestlor à l'âlde ae !'en; me. c_; roconr,ail ieclt sl~e de restrlctlon. on peut obtenlr dlrectemer,t l'lntégron~ lequel peut. si besom est. etre clrcularisé. puisque les extremités obtenues sont complémentaires. avant d'être utilise pour la transformation de la corvnébactérie.
Dans le système selon la présente invention. I'intégron fait donc, de préférence, partie d'un vecteur plasmidique qui est suscep~ible de se repliquer à l'aide d'origmes de réplicatlon, ou répilcon, placées dans la 1~ partle répllcati~e. Se!^n la r,ature ~ ré?llcor, present dans cet~e cassetterépilcati~e. ie plasrnlGP composlte peut se rér~llauer so~; unlquement dans ies CorVneDaCTérles. s l. es. cons;ltue a un seul re~llcon endogPn,e. sol; à la fois aans les cor~neoacterles et cans un hote etranger. Escherlcnla coii par exemple. Iorsqu'on l'assocle au plasmlde deux réplicons differents. chacun permet-an~ i_ réDnCa;lOn dans son hole propr~.
Dans ce cas. Ia constructlon du plasmlde pourra e~re efiectuee dans des s~stèmes différents des corvnebactéries. ce qul peuT parfols présenter des intérets compte tenu des difficul~és de construction dans Cor- nebacterium et ~revlbacterium.
2û Grâce a la présence de séquences homologues présentes slmul~anement dans l'in~egron et dans le genome. I'ln~egron va s'insérer par recombinalson dans le chromosome. ,~unsi. aans le transIorman~ pr~malre. le gene clone initialement au site muitlple de clonage de l'mtégron se retrouve dupliqué dans le chromosome bactérien (~olr schema Figure 2a).
line telle dupllca~ion peut presen~er un m~éret technologlque dans la mesure où le doublement du gène peue entralner un accroissement de l'activité codee par ce gène. notamment l'activité enzymatlque correspondante.
Comme la structure de l'intégran~ prlmaire correspond a une 30 duplication en tandem directe des sequences homologues encadrant le gene de selec~ion. il es~ possible de prevolr une amplifica~ion de cette slructure par sélection de la croissance de l'intégran~ primaire sur un milieu permettan; de de;ecter les souches surexprlman; le gene ae seiectlon.

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-WO 92/0262 / PCT/FR91/0065~ .
26~7'~

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~insi. Iorsque le gene de sélec~lon est ie gène de réslstance à un ant!bio:~que. ~n peu~ sélec~lonner les soucnes les piu~ réslstantes. sur mlileu~ avec une ~eneLr croissante en antlDiotique. IescueJIes soucnes de- ront corresponare ~ une surexpresslon des gènes correspondant aux séquences homologues. mais également à tOUI gène ou sequence d'ADN qu aurait été inséré dans l'intégron.
~ien entendu, I'intégron comportera. de préférence, outre la ou les séquences homologues, une séquence codant pour une séquence d'intéret, notamment pour un peptide ou une pro~éine d'intérêt qui pourra 1~ être homologue. c'est-a-dire provenir d'une corynébac~érie. ou bien hétérologue. c'est-a-d!!e provenlr d'autres especes bactériennes. mals egalement e~re c'orl~lre eucarvote ou syntnétlque.
Ces séquences comporteront, de préférence. Ies éléments assurant leur expression dans les corynébactér!es ou bien seront insérées en phase pour pouvolr et!e exprimées par les eléments d'expresslon ae ia bacterie hôte.
Dans le cas de Corynebacterium. il peut etre Intéressant par exemple d'obtenir une surexpression de certaines enzymes. notamment gltA
ou gdhA.
Comme cela a ete indique precédemment, il est possible d'utlliser ce système pour assurer l'interruption d'un gène en utilisant un intégron selon l'inventlon. Par interruption ou par substitution, comme cela est décrlt a la figure 2b. Ie gène correspondant est inactivé. ceci conduit a une surproduction du substrat de l'enzyme codée par le gène correspondant.
En général, I'intégron sera-conçu sous forme d'une cas5ette d'ineegration, c'est-à-dire qu'cn plus du gène de sélection et de la séquence homologue, qui dans certains cas peuvent etre confondus, on prévoira une séquence comportant plusieurs sites de clonage qui permettra d'insérer des sequences d'ADN et/ou des gènes à volonté.
Dans tous les cas, à des fins de confinement génétique, on essaiera de prévoir un intégron dépourvu d'ADN réplicatif d'une autre espece.
Il est également possible de prevoir des systèmes d'intégration plus complexes, en particulier des systemes d'intégration qui comportent en WO 92/02627 PCT/FR91/006~;6 2~2~

outre les séquences d'u^, élerr,er~ transpos2b!e. ~GS secuer,ces d'élements transposables peu\en- e re l'ersemrbie des sea,uer,ce~ au assurent la transposltio^,. c l'e,~ce~ aGS r,ro-e~nes codées ,r, r i_ C3!~ rie~actér~e.
mais il peut egalemer,- slcr:r ce transposabies qu! son- aepour~us des séquences codant pour les transposases.
Parmi les é!emen.s trans?osaDJes. il fau~ c~ter le pnacoe ~lu. en particuJier sous la forme d'un phace mlni.~lu. Dans le cas des éléments transposabJes comme Je phage mini.~lu. comme on le verra ci-après, on a utilisé des marqueurs qui peu~ent ~aire partie du pnage ou d'origine I G difIérente. par exemp!e des rr,arqueurs colorés.
L'in~ern;l?~ corcer?~G eg-!ernen- ces inte~rors util~sant des éJémer:s Tr2nsDos;,~!es ~o~encr. ce d~fiereritej cor~neDccteries~ no.am-ment Ge Bre~,~acTeriur,. er. p2~.lCUI!G! 15aB! -G~ cue cecr:-. carj ia f~gure 9.L'exemple !' ?resen~e la caractérlsatlon ae l'élement ISaBI et I'e~emp!e I ! donne une meT:-ode généra!e perme~t_, t de sélect~onner et d'identlIIer ce t\,r,e d'éiPme-.- trans?os2r,1e.
La présente in~entlon concerre egalemert IGS IntégrOnS
compor;an~ une séquence pro~enar,- des élén-~ents transposes. notamment des éléments codant pour ies trar,s?osases eticu les répresseurs de la 2~ transposition, Les integrons selon l'in~ention peu~ent comprendre tou; ou parlie des séquences en cause. noTamment celle corres?ondan~ a ISaBI.
Ce type de str~-ture d'lntegratlon comportant un fragment de phage mini.~lu. une séquence d''~D~ homologue et ur, gène de sélection peut permettre. comme à l'aide aes s.ruc.u!es decrites precédemment. d'obtenir soit une surexpression d'un gène particuJier, soit la disruption d'un gène lorsque cela se revèle nécessalre.
Ces dernieres structures. bien que di~ferentes des s~ructures précédentes seront néanmolns appelees par simplification "intégron".
La présente in~ention concerne egalement des souches de corynebacterie obtenues par transformation intégrative à l'aide des intégrons décrits précédemmenl. notamment lorsque l'intégron a eté
introduit par électrotransformation, Parmi les soucnes de corynébactéries utilisables. il faut citer

3 j plus particulièrement WO 92/02627 r'CT/FR91/0065t~ .

2~'~72~
- B. Iactofermentum.
- B. fia~urr.
- C. glutamlcu,.-,.
- C. melassecoia.
pour leur intérel induslriel.
Dans le cas où le clonage es; realisé chez un hôte difiérent de la corynébactérie hôte final de l'intégron, le transfert de l'intégron peut mettre à profit les propriétés rëplicatives éventuelles de la construction;
dans la corynébactérie afin d'adapter l'intégron à la corynébactérie. Ainsi on commencera par introduire le plasmide comportan" outre l'intégron, une partie ré?licati~e. dans 12 soucne merre ou s'e-iecTuera l'intégration, puis cet inte ro-, amsi aaaa:e ser- récuDerG D_' e~-.r_cllon au plasmide puis diges~ior, p2' ia OJ les er,z~mes "'J. liaore-- I ;~legror. !e fra~ment purlfié
étant alors autoligué ou non e: le Drodu~ . de ligation utilisé pour la transformatior; inle~rati\e : aars ce cas Jes Darrieres de res~riction ne constituer,T pi~s une diii,cu!te.
DaAs certains cas il peul êlre utile de passer par une corynébactérie intermédiaire. notamment dans le cas où J'AD.~ est d'origine E. coli. il peut ê~re intéressai ~ d'adapter l'intégror, à ~re-ibacterium lactofermentum a~ant de l'ada?ler à CorvneDaCterium melassecola.
Er.fin. I'in~ention cor.cerne l'utilisallon des Corvnébactéries selon l'invention dans le cadre de procédes indus~riels, notamment pour la préparation de proteines ou de metar,oliles mettant en jeu l'intégron selon l'invenlion.
Les e~;emples ci-apres permetlron~ de mieu.~; mettre en évidence les a~antages de la présente in~ention.
Sur les figures annexées:
- la figure I schématise la préparation d'un in~égron en partant d'un plasmide réplicatif, 30 - la figure 2 schématise l'insertion d'un intégron.
. par simple recombinaison (a) . par double recombinaison ((b).
- la figure 3 schématise la structure de pCGL519.
- la figure ~ schématise le pourcentage de résis-ance à la kanam~cine en fonction du temps pour deu.~: souches transiormées.

- .

2 1~ ,~;t 7 2 ~

- la figure 5 schématise lâ structure des mini\l~
Mudll 1681.
. .~ludll 1681-Ca - la figure 6 schématise les plasmldes . pCGL 107 et pCGL 107::Mud-, - la figure 7 schématise l'intégration des intégrons désirés contenant ou non le miniMu.
- la f igure 8 représen~e la carte de restriction de l'élément d'insertion de Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B115) cloné à partir d'une insertion dans l'e~:trémité terminale 3' ae l'opéron lac.
- 12 figure 9 représente la séquence IS2~.
- 12 fi~tJre 1~ représen~e 12 c2r~e ce restricticn de lSaBI
- la figure 11 représente la carte de restriction du Dlasmide pCGL33~, - la figure 12 représente la carte de restriction du plasmide pCGL331.
EXEMPLE I
Construction d'une banaue d'ADN chromosomique de Corvnebacterium melassecola ATCC17965 et clona~e du ~ène ~ItA
- L'ADN chromosomique de la souche de C. melassecola ATCC
17965 a été préparé sui-ant la méthode adaptée de Ausubel et al. (1987).
Une digestion ménagée par l'enaonucléase de restriction Mbol (~oehringer) a ete réalisée sur I 0 ug de cet ADN en suivant le protocole décrit dans Maniatis et al. (1982). Les fragmen~s d'AD~3 ont été séparés en fonction de leur taille sur gradient de sucrose comme décrit par Ausubel et al. (1987).
Les fragmenls d'une taille comprise entre 6 et 15 kb ont été retenus pour la construction de la banque.
Le plasmide de clonage pUN121 ~Nilsson et al., 1983) a été
préparé par la méthode de ~irnboim and Doly, (1979) à partir de la souche de E. coli G~12199 disponible librement. Le plasmide a été linéarisé par I'endonucléase de restriction ~cll (~oehringer).
La banque a été construite par ligation avec la T4 DNA li~ase (E~oehringer) dans les conditions décrites par ~usubel et al. (1987), de 1 ~8 de plasmide pUN'121 linéarisé par ~cll et de 2 IJg des fragments d'ADN de 6 à 15 kb décrits ci-dessus. Le mélange de ligation a été introduit dans la souche de E. coli DH5alpha par électroporalio n en sui~!ant le prolocole WO 92/02627 PCI/FR91/006~6 2~72~'~
décrit par Dower et al. ( 1988). Les ciones de E. co!i portant les plasmides recombinants ont é~é sélectlonnés directement par leu, capacité à croître sur milieu LB con~enan~ I G ~iml de tétrac~cline. Les plasmides de la totaJité des clones résistants à la tétrac~cline ont éte preparés par la 5 méthode de ~irnboim et Doiy (1979). LlensembJe de ces plasmides correspond à la banque d'AD~.
La souche de E. coli W625 déficiente pour l'activité citrate synthase a été transformée avec la banque d'ADN de C. melassecola ATCC17965. Un clone transformant de E. coli W62û capable de croître sur IG milieu minimum de sélection contenant de la tétracyciine a été sélectionné.
Ce clone est porteur d'un p~asmide recombir,an. pCGL5GS. Différents sous-clonages on. perm!s be raccourcir !e fragment d'AD~; de C.
melassecoia porlant le gène glt~ compie~ à un fragment d'~,D~; de 3,5 kb délimité par deu~; sites de restriction Hindlll.

Inté~ron pCGL5 19 Le schéma de préparation de l'lntégron est représenté à la Figure 1.
Le gène aphlll a été choisi comme gène de sélection; il 20 confère la résistance jusqu'à 605 I~g/ml de kanamycine lorsqu'il est intégré
à une copie dans le chromosome. On travailJe habituellement à 25 ~g/ml.
Le fragment Hindlll de 3.5 kb portant le gene de structure gltA codant pour la citrate svnthase de C. melassecola obtenu à l'exemple 1 a été choisi au depart comme fragment d'AD~! homologue du génome des Corynébactéries 25 et inséré dans l'un des sites uniques du site multipie de clonage (le site Hindlll). Les sites de restriction bordant l'intégron prévus pour être les plus utilisés dans la stratégie d'intégration sont les sites Notl qui corre5pondent à une séquenCe à 8 nucléotides, et les sites 3stXI. L'enzyme 3stXI reconna~t la séquence (CCAN5NTGG); de ce fait elle coupe aussi fréquemment qu'une 30 enzyme à 6 nucléotides et on peut s'attendre à générer plusieurs fragments.
Mais les fragrnents libérés se réassocient en fonction de la nature des séquences internes des différents sites ~stXI, ce qui doit conduire ~inalement à la seule reconstituTion du fragment de départ.
Le plasmide pCGL519 (Figure 3) est un exemple de plasmide 35 versatile susceptible de génerer un intégron, On a testé l'intégra~ion dans WO 92/02627 PC r/FR91 /00656 9 2~7~

C. melassecola de sa cassette inté~rati~e ~ partir d'un plasmide issu au départ de E. COI!. pCGL519 est constltué des deux ~ragments replicati~s et intégratifs bordés par les sites Notl. Le premler Ira~mer,. correspondan~ à
l'intégron qul comprend un slte muJ~iple de cJona~e. Ie ~ène de séJection 5 aphlll et un fragment Hlndlll homologue du chromosome portant le gène gltA qui code pour Ja citrate synthase. Le second fragment comprend la partie réplicative du plasmide pBLI (fragment 5spl-Hpal de 3 kb) qui se réplique chez les corynébactéries, la partie réplicative du plasmide pACY184 qui se réplique chez E. coli, ori pl5A, et l'ori~ine de réplication 10 du phage ,~113 compJémentable en trans. Le plasmide pCGL519 a été
construit dars E. coli, pa! insertion d'un fragment Hindlll de 3.5 kb contenant le ~ène ~It.~ dans un ~ecle ,r pCGL2' 3.
Comme représen~é dans la Figure J . après clonage pCGL519 est utilisé pour transformer B. Jactofermentum. Au moment dù transfert de 15 pCGL519 dans Bre~ibacterium lactofermentum CGL2G52, le fragment Notl con~enant les ori~ines de réplication a été sui~s-itué car la partie replicative de pBLI s'était inactivée dans E. coli. Ceci montre un avantage supplémentaire de la structure en cassette.
E~EMPLE 3 2G Inté~ration Le transfert de pCGL519 dans Cor,vnebacterium melassecola ATCC 17965 Irès restricti~ e vls-à-~is de E. col i a été réalisé à partir du même plasmide exlrait de B. Iactofermentum. Le système proposé permet d'isoler le plasmide pCGL519 de la souche de C. melassecola ATCC17965 25 qui est totalement restrictive Yis-à-vis de E. coli mais seulement partiellement vis-à-vis de B. Iactofermentum. Ainsi, une cassette inté~rative possédant la modification de la souche réceptrice a été préparée, Après digestion du plasmide pCGL519 issu de C. melassecola ATCC17965 par l'endonucléase de restriction Notl (Boehringer), I'intégron 30 contenant le gène gltA et le gène de sélection Aphlll a été isolé et purifié
à partir d'un gel d'agarose à bas point de fusion. L'intégron ainsi purifié a ensuite été soumis à une autorecircularisation par ligatlon. Le mélange de ligation a ensuile é~é introduit dans la souche de C. melassecola ATCC 17965 par electroporation (Bonam,v et al., 1995). Les clones de 35 C. melassecola résistant à 25 ,ug/ml de kanam~cine on~ éte soumis à
l'anal ,vse.

- ', . ..... , :

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2~67~

5G5 transforman~s on~ été oblenus. 3 i parmi les 50 analysés ne possédaient pas le piasmide pCGL519 et 20 d'en-re eux ont été analysés par southern DlOt après dlgestlon Xbal. Tous correspondent à un même évènemenl d'intégration s'efIecluant par recomblnaison homoJo~ue dans la 5 région gltA. Selon la nature du produit de li~alion (molécuie monomérique circulaire ou molécule polymérique linéaire ou circulaire), les intégrants primaires peuvent être interprétés comme issus d'un "crossing-over" simple ou double. Une analyse en champ pulsé après digestion Notl suivi d'une hyridation par une sonde correspondant au fra8ment Hindlll de 3,5 kb 10 contenan~ glt~ a été réalisée. L'intégration d'une seule copie de l'intégron est conf~rmée par cetle analyse.
Le modèle Impllque la duplication ce la cooie sau~age du gène - glt.~: I'acti~lté enz-matlque a élé mesurée. elle es~ mu~tipilée d'un facteur 1,82 en accord avec l'interprétation des blots e~ montre que la copie 15 inTégrée n'es. pas Inaclivée. Les résultats sont rassemblés au tableau I par rapporl à la souche sauvage et c la souche transformée par un plasmide réplicatif. La stabilité de la struclure intégrée a été mesurée quant au pourcentage de cellules Kanamycine résistantes après une trentaine de génération (Figure 4) et quant à l'acti-ilé enzymatique de la citrate 20 synthase qui restent s~ables.
L'amplificaTion de la strucTure intégrée a é~é réalisée par sélection de croissance sur boîle conlenant une exces de kanamycine, sélection à 80G l~g/ml puis I 000 ~g/ml puis 1 050 ~g/ml de kanamycine et de néomycine. Une amplification en tandem direct a été obtenue. Malgré la 25 stabilite de la slructure amplifiée et de la résistance à la kanamycine, le haut niveau d'activité enzyma~ique ob~enu au départ dans le cas de la citrate synthase ne s'es~ pas maintenu ul~érieurement. Il est possible qu'une inactivation spécifique du gène gltA se soit produite.

30 Construction à base de miniMu Les dérivés de Mu choisis dans cet exemple sont Mudll 1681 eT
Mudll 1681-Cat (respectivement KmR et CmR) qui ont une taille de 14,8 kb et 16,6 kb respectivement (Figure 5). Le minilMu Mudll 1681-Cat est un déri-atif_du transposon Mudll 1681 (Castilho et al.. 1984). Ils possèdent les 35 éléments nécessaires à la Iransposition énoncés précédemment (excepté

.

WO 92/02627 . PCI`/FR91/00656 ~o72~i't) HU) ainsi que le gène du répresseur thermosensible C (regulateur de l'expression des transposases ~ el B). un ~ène de résistance aux antibiotiques (respectivement aphll et ca~) et les gènes lac:~ lac~ el lac '.
Ce dernier commence au 8ème codon et permet de détecter des fusions 5 traductionnelles de protéines lors~ue Mud s'insère dans un cadre de lecture.
(~n a transféré ces transposons dans les Corynébactéries. Après intégration des transposons dans le chromosome, une méthode, décrite à
l'exemple 8, a permis d'amplifier la copie intégrée. Associée à cette amplification, le gène cible de l'évènement d'intégration (le gène de 10 structure de la glutamate déshydrogénase) a dans de nombreux cas été
également ampliiié avec une augmentatior, jusqu'G un facteur 25 de I'activité enz~matique cor!espondante.

Construction de vecteurs pour le transfert des miniMu Le vecteur intégratif (pCGL107 - Figure 6) contlent le gène gdh t (Gdh') interrompu par le marqueur de réslstance à la kanamycine KmR ~aphlll), le réplicon (ori) de pU.!~1121 (l~lilsson et al., 1983) et les gènes conférant la résislance à la tétracvcline (TetR~ et à l'ampicilline (AmpR).
Ce vecteur n'étant pas réplicatif dans Brevibacterium lactofermentum 2G s'intègre par simple "crossing-over" au site d'homologie du gène gdhA.
Mudll 16S l-Cat a été introduit dans le vecteur in~égratif pCGLlG7 par minimuduction à partir de E. coli OR1836 dans la souche MC4100. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été
retenue donnant un phéno~ype lac- en E. coli (pCGL107::Mud-, Figure 6). A
25 partir de ce même plasmide. a eté preparé un Mud désarmé pCGL107::Mud-, Figure 6) chez lesquels les gènes des transposases A et ~ ont été délétés par digestion Hindlll.
D'autres stratégies de transfert on~ été testées; Mudll 1681 a été introduit chez les Corynébactéries en plaçant le transposon sur deux 30 autres types de vecteurs:
- Vecteur suicide (non réplicatif, non intégratif) pEV I l::Mud, il s'agit d'un dérivé de pl~C18 dépourvu des gènes lac dans lequel Mudll 1681 a été introduit.

WO 92/026i7 PCI`IFR91/00656 2~72~
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- Vecteur navette (pCGL229) possédan~ le réDlicon de pBL I (fra~ment Hindlll-Hpal), le répJicon pl5~ et le gène C2t de Tn9.
Mudll 1681 a élé introdul- sur le vecteur na~et.e par minimuduction chez E. coli Rec-. Parmi les diverses insertions obtenues. une d'entre elles a été retenue donnant un phénotype Lac- (pCGL229::Mud; ). A
partir de ce vecteur, a été préparé un Mud désarmé pCGL229::Mud-chez lequel les gènes des transposases A et B ont été délétés par digestion Pstl.

10 Efficacité d'électrotransformation des constructions et leur transfert dans E~revibacterium lactofermentum Avec les ~ecteurs précédemmenT décrits. o~ éiectrotransforme une souche d'E. coli (DH5alpha) e~ deu~; soucnes de Brevibacterium lactofermentum CGL2052 et CGL20C5 (B115). Ces deu~ souches sont 15 partiellement permissives vis à ~is de l'AD~ issu de E. coli. Ces expériencesont apporté les résultats présen~és dans le tableau 2. On peut faire les observations suivantes:
- Dans E. coli, que ce soit dans le cas du vecteur navette pCGL229 ou dans le cas du vecteur pCGL107 (qui peut s'y répliquer), I'efficacité de transformation est nettement diminuée lorsque Mud~ est présent sur le vecteur ce qui n'est pas le cas lorsque les ~ènes de transposition ont été délétés. Ce phénomène typique des pJasmides réplicatifs portant des dérivés de Mu actifs peut être attribué à une très ~orte expression de la transposase de ~1u dans son hôte naturel. Ceci montre que dans les constructions présentées ci-dessus, les Mud- utilisés (Mudll 16~1 et Mudll 1681-Cat) sont bien actifs.
- Dans aucune des souches de Corynébactérie testées il n'est possible d'obtenir de transformants avec les vecteurs navettes pCGL229~ 1udl ou - (ni avec le vecteur suicide pEVl l::Mud). Dans le cas des dérivés de pCGL229, il est possible que lors de la minimuduction dans E. coli Rec-le réplicon pBLI ait été inactivé expliquant l'incapacilé du vecteur à se multiplier dans B. Iactofermentum.
- Des transformants ont été obtenus dans B. Iactofermentum r JL20G5 (B115) avec le vecteur intégratif pCGL107 et ses dérivés. L'efficacité
de transformation obtenue avec pCGL107~ 1ud- eT pCGLlG7::Mud- esT

' ~7~

semblable. ce qui indique que le ~1inii~1u ~1udll 16~1 -Cat A-B- ne se transpose pas à haute efflcacité lorsqu'il es- in.rodul~ dans B. Iactofermentum à l'aide d'un ~ecteur in~éorat: .
La dim~nution observée (facteur 25) dans l'efficacité de 5 transformation des deux déri-~és de pCGL I G7 comparés à pCGL 107 lui-meme est vraisemblablement due à l'augmentation de taiJle du plasmide transformant (10 kb dans le cas de pCGL1~7! 26,7 kb dans le cas de pCGL107::Mud+ et 22,1 kb dans le cas de pCGL107::Mud-).

IG Etude des évènements d'inté~ration de pCGL107::Mud+ dans B. Jacto~ermentum CGL2005 (B115) Lc transformatlon de Ja soucne C~.L2' r j (Bi l 5) par pCGL1~7::~\1ud- (cl-après dénommé pCGL32~) a permls d'oDtenlr 147 clones resistant à Ja kanamvcine (25 ,uo/ml) mais aucun transformant en 15 sélectionnant pour la résistance au chloramphénicol ( 5 ~g/ml). Cependanl, après réplique su~ chioramphénlcol! I r 3 de ces clones son~ résistants au chloramphénicol. Il s'avere donc que le gène cal de Tn9 ne s'exprime pas suffisamment a une seule copie pour permettre une sélection primaire en colonies; par conTre. cette expression est suffisante pour déterminer un phenotype résistant par des tests ullérieurs en strie. Tous les clones obtenus sont de phénotype lac-, ce qui correspond au phénotype observé
chez E. coli.
Les deux types d'intégrants obtenus (les transformants de type 1, KmRCmS et de type 2, KmRCmR) peuvent correspondre respectivement à la substitution du gène gdh'A par évènement de couble "crossing-over" et à l'intégration du plasmide complet au site gdhA par évènement de simple "crossing-over" (Flgure 7). Les données en faveur de ceste interprétation sont les suivantes:
- Le dosage de la glutamate déhydrogénase ~selon la technique de Meers et al., 1970) chez les transformants de type I et 2 (Tableau 3): 5 sur 7 transformants de type I (pour exemple K2 et K3. Tableau 3) ont une activité gdh nulle, ce qui est en accord avec la substitution du gène gdhA par le gène interrompu. 4 des 5 transformants de type 2 ont une activlté gdh semblable au témoin (KC et KC~ par exemple, Tableau 3).

' '- :
. ' , -2~7~

- Les anaJyses moleculaires er Southern ~iot correspondant à la di~estion BamHI des trans~ormants de t~pe I (1~2) et ae type 2 (KC2 et KC' ) et ré~élation des bandes caractéristlaues (~isualisées sur la Figure 7) par la sonde plasmidlque pCGLlG7 ~résultats non présentés).
Celles-ci indiquent que 12 structure moléculaire des transformants gdh-(K2) est conforme à une substitution de gène. Elle confirme aussi que Jes transformants gdh- (évènements de type 2 tKC2 et KC4) et quelques uns de type I (Kl) sont obtenus par intégration du plasmide au site gdhA.

Sélection des éventuelles transDositions Les transiorman~s de tvpe 2 (Krn~ et CmR) n'expriment pas suffisamment le gène de résistance au chloram?nénlcol pour obtenir la croissance de colonies Isolées en présence de chloramphénicol 5 ~g/ml.
15 Nous avons donc recherché chez ces transformants des sous-clones Cm en espérant sélectionner des ~ranspositions de ~lud (qui porte le gène cat). Ces sous-clones ont été obtenus à une fréquence voisine de 1 pour 155 cellules.
Après réplique sur Xgal, ces clones présentent toute une graduation de couleurs du blanc au bleu (35 ~o sont nettemenl bleus). Ce résultat est 20 confirmé par la mesure des activités béta-galactosidase (Tableau 4). Ceci pourrait indiquer une transposition de Mud, amplifiant la résistance au chloramphénicol'et faisant apparaître des activités béta-galactosidase par fusion de protéine au si~e d'insertion. En fait, les mêmes expériences réalisées avec le pCGL1~7~ 1ud- ont abouti au même résultat indiquant que 25 ces évènements ne sort pas dus ~ des évènements de transposition.

Mise en évidence de l'amplification en tandem su_e_chromosome du plasmide pCGL I 07i-Mud Il s'avère que la quasi totalité de ces clones Lac+ isolés 30 précédemment (à l'exception de KC3T4) ont aussi une activité gdh amplifiée (Tableau 4). De plus. sauf une exception (KC3T4), les activités béta-galactosidase (dosée selon Miller, 1972) et gdh sont quasi proportion-nelles. La même observation peut être faite concernant le dosage de la chloramphénicol acét!d transférase (selon la méthode de Shaw, 1975, 35 Tableau 5). Ce résultat es~ conlradictoire avec la ~ransposition de Mud qui WO 92~02627 PCr/FR91/006~6 ~72 ~

n'emporte jamais de séquences adjacenles lors de sa Iransposi~ion. Il indique plutôt une amplifica~ion en tandem sur le chromosome de l unité de répétition p~ 1ud-~dn qui est bordée par aes homoiogles de sequence. Ce point a été confirmé par digestion de l''AD~ ~énom1que des soucnes KC3, 5 KC3TI et KC3T3 par BamHI, Notl et Xbal. Non seulement la bande l~amHI
interne à Mud (et égale à 7 kb) es; amplifiée mais aussi les bandes contenant les extrémités de Mud ( l l kb et 2,4 kb) ce qui est conforrrie à
une amplification en tandem et ce qui s'oppose à un évènement de transposition. De plus, les digestions Notl (qui coupe une seule fois dans 0 Mudll 168 l-Cat) et Xbal (qui coupe une seule fois dans gdh') amplifien~
nettement la bande de 2', kb de l'unité de répétition.
Cette ampiificatior semble relatlvemen-. stable dans la mesure où l'acli~ité béla-galactosidase res.e ~ un niveau de 7G O de l'activité de départ après 15 générations sans pression de sélection. Les 15 acti~ités Cat et Gdh présentent également une per~e de 3~ i après 25 générations. Cetle ampiification en tandem rappelle des résul~ats d'Albertini et al. (1985) et de Jannière et al. (19~5) chez Bacillus subtilis.
On attribue l'activité béta-galactosidase des clones amplifiés à une traduction parasite amplif iée (hors du cadre de lecture du gène de 20 résistance à l'ampicilline où l'opéron lac est fusionné) présente chez B. Iactofermentum et indétectable chez E. coli.

Etude et caractérisation de l'élément d'inse!tion ISaBI
I in élémen. d'inserlion a élé isolé par récupération de 25 plasmides dans E coli DH5alpha à partir de l'ADN amplifié de KC3T4.
L'ADN génomique de la souche de B. Iactofermentum CGL2005 (~115), de quelques dérivés et d'autres souches de corynébac~éries, a élé sondé par une sonde contenant l'élement d'insertion précédemment isolé. Tout d'abord, le fragment PYUII de 3,5 kb interne à Mu, issu de l'ADN amplifié
30 chez KC3T4 et contenant l'élément d'insertion, a servi pour sonder le blot initial qui contient les digestions d'ADN par BamHI d'intégrants et de souches amplifiées variées (dont KC3T4). Comme l'insertion ne contient pas de site BamHI, cetle expérience permet de révéler les fragments génomiques BamHI contenant au moins une insertion ou un fragment 35 d'insertion. Dans la souche Kl- (aui correspond à un inté~rant substitué de type 1 obtenu à parlir de pCGLI07:Mud-), cmq bandes apparaissen~ ré~élan~
la présence de plusieurs copies (en~!ères ou nor) co l'mser~ion.

16 .
20~72~

-La digeslion BamHI des AD~ génomiques issus de B. Iactofermentum CGL2555 (B115) a montré qua~re bandes communes avec Kl- (de taille respecti\e 18 kb, 5.9 kb. 5 kb e~ ~.5 kb); la cinquième bande présente dans les auTres souches Kl-, KCl- et KC3 (de taille 6,5 kb) peut 5 traduire une transposition dans un ségrégan~ de la souche CGL2005 (B115) à
I'origine de ces souches.
En~re deux lignées de brévibactéries différentes (i) Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (Bl 15), et (ii) ~revibacterium lactofermentum CGL2002~ deux, bandes communes apparaissent de tailJe 1018 kb et 4,5 kb; par conlre la souche CGL2C02 n'a pas d'autres bandes. Ceci traduit une mobilité ae l'élément. Les souches ae Corynebacterium melassecola donnen~ des siPnau~ d'h~bridation .aibies avec l'insertion traduisant l'existence d'2ulres séquences différentes mais apparentées chez cette espèce.
15I_n premier élémen~ d'insertion mobile spécifique de B. Iactofermentum a é~é identifié et cloné: nommé ISaBI. il peut être présent à plusieurs copies (2 à 5 copies) dans le génome. Il est susceptible de se transposer plusieurs fois en des sites différents dans une région amplifiée. Sa carte de restriclion fine est connue. Des séquences 20 différentes mais apparentées exis~ent dans le génome des autres corynébactéries.
ISaBI est constituée de 128~ paires de bases; les extrémités peuvent être identifiées car ISaBI s'est insérée dans un fragmenl qui correspond à la région terminale (3') de l'operon lac qui a été séquencé par 25 Hediger e~ al. (Biochemls~ry Proc. Natl. Acad. Sci. E'SA 82~ 1985). ISaBI s'est inséré entre le nucléotide 5575 et 5576 en duplicant une séquence cible de 5 bp ~CCGAT) (Figure 8). La séquence entière de ISa~l est donnée dans la Figure 9 et la carte de restriction dans la Figure 10. Deux phases ouvertes de lecture ont été identifiées qui pourraient correspondre, étant donné les 30 analyses de séquence, au gène de structure de la transposase et au gène répresseur de la transposition.

~'ecteur pièRe pour les éléments d'insertion et les transposons - L'inser~ion ISaBI a é~é oblenue au cours des études d'ampli-35 ficalion de gène dans le chromosome de B, lactofermenlum (Bl 15). Afin d'isoler tous les élémenls d'inserlion susceptibles de se ~ransposer dans les , WO 92t02627 PC~/FR91/00656 ~72~

corynébactéries, on a cons~rui~ des ~ecteurs intégrati~s partlculiers:
pCGL330 et pCGL331 (Figures 11 et 12). Ces deux ~ecteurs son; consti~ués d'un premier fragment déri~é du ~ecteur pli~;l21.` Le piasmide D~121 es-réplicatif dans E. coli et porteur de la résistance g I'ampicilline; il porte une séquence codant pour le répresseur cl du phage lambda qui inhibe l'expression d'une fusion d'opéron ensre le promoteur PL du phage lambda et un gène de résistance de la tétracycline. L'insertion dans le gène cl inactivera de ce fait le répresseur qui permettra alors l'expression du gène de résistance à la tétracycline qui s'exprime chez les corynébactéries sous le contrôle de PL. On peut ainsi sélectionner les é~ènements d'insertion par la résistance à la tétracycline. On a linéarisé p~ 121 au site Ssp1 e fusionné à un deuxième fr2~men~ obtenu par digeslion du ~eCIeur pCGLlG7 par EcoRI rempli c 12 Kleno~ pou. donner après Iransformatlon de E. coJi DH5alpha, les vecteurs pCGL33G el pCGL331 qui diffèrent enlre eux par le sens du clonage. Le fragment Eco~l dérivé de pCGLlG7 conlienl un gène de sélection pour la transformalion direc~e des cOr,vneDacléries (le gène aphlll qui confère la résistance à la kanamycine) e; un ~ragment contenant une partie homologue du gène gdh,~ (gène de s~ructure de la glutamate déshydrogénase) qui servira de poinl d'intégration dans le chromosome des corynébactérieS-Les souches de ~. Iacto~ermentum CGL2055 (BL 15) et CGL2002 ont été électrotransformées pour la résistance à la kanamycine par les plasmides pCGL33û et pCGL331. La fréquence de transformation a été a peu près de IG3 par ~g dans chacun des cas. ce qui est compatible avec une in~égration des plasmides. Les transformants (comme CGL2005::pCGL330 et CGL2005::pCGL331) sont sensibles à la ~étracycline ce qui confirme que la régulalion de PL par cl ~onctionne bien chez les transformants. La ~réquence des ségrégan~s résistants à la tétracycline a été mesurée après environ 10 générations.
Des mutations inactivant le gène cl apparaissent dans les souches possédant les plasmides in~égrés pCGL330 e~ pCGL331 à une fréquence de 2xl06 par génération.
Une récupération de plasmide a été réalisée à partir de l'ADN
génomique extrait de ségrégants tétracycline résistants isolés à par~ir des souches CGL2005::pCGL331 e~ CGL2005::pCGL330 et digéré par l'enz~ me Pst 1.

- ` , ~
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- WO 92~02627 PCr/FR91/006S6 2a~72~ S

Ces AD~ digérés on~ élé li~aturés et le produit de la ligalion a servi à transformer la souche DH5alpha de E. COI! pOur la résis~ance à la tétracycline. Les plasmides récupéres on~ été anal~sés e~ dans J cas sur 9 clones résistanls à la tétrac~cline, ur élément d'inser~ion a été identifié.
5 Dans un cas (issu de CGL2005::pCGL331), un élément d'insertion identique à ISaBI a été identifié (1,2 kb de taille, possédant les sites uniques Accl, EcoRV et Xhol) avec une localisation inlerne à cl. Dans un autre cas (issu de CGL2005::pCGL330), un élément d'insertion différent d'lSaBI (taille de 1,0 kb, possédant un site AccI mais pas de site EcoRV ni Xhol) a été
10 identifié.
Le vecleur de piège à transposon Ionctionne; dans la majorité
des cas, la muta;lon oblenue est une inser~ion: les tréquences de résistance à la téIrac~cllne mesurent donc assez correctement les fréquences de transposition; les élémen~s les plus mobiles ont donc été identifiés; parmi 5 ceux-ci. ISa~l a é~é réisolée et un autre éiément d'insertion différent d'lSaal a été identifié.
Les souches citées ont les origines suivantes:
Escherichia coli .
. DH5alpha : Gibco BRL
20. MC410G : Casadaban (1976) OR 1836 : Reyes Brevibacterium lactof ermentum CGL2002 : Bonamy et al. (199G) . CGL2005 (~115) : Bonnassie e~ al. (199~) Corvnebacterium melassecola . ATCC17965 : ORSAN
. ATCC17965::gltA: (la présente demande) Quatre de ces souches ont été déposées dans la Collection Nationale de Cultures de 1~4icroorganismes (CNCM) de l'lnstitut Pasteur (Paris) le 23 juillet 1991 - Corynebacterium melassecola ATCC 17965::gltA : n 1-1124 - Escherichia coli OR1836: r~ 1-1125 - Brevibacterium lactofermentum CGL20û5 (B115): n 1-1126 - Brevibacterium lactofermentum CGL2002: n 1-1127.
La souche DH5alpha est disponible dans le catalogue de Clontech Laboratories. n C1521-1. (Palo ~Jto. C~ 'SA) et la souche l~lC41GG à l'ATCC sous le n 35695.

~ ~ .
..... . , ' .

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WO 92/02627 PCI/FR91/006~6 la 20~7~ d FEUILLE ~SE P~EiV.~L~ El~tlENT

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., . . .. ~ . . - . ~ . :

2 ~ ~i 7 f'~

Table~u 2: Efficacit~ de transfomlation des vecteurs portant les MiniMu Souches bactériennes E.coli DHSc~ B.lactofemlenturn B.lactofe~menturn CGL2002 CGL2005 (911 5 pCGL229 5xlO 10 5 6 pCGL229::Mud+ 2xlO n.d.

pCGL229::Mud- 4xlO n.d.

pCGL107 10 3xlO 10 pCGL107::Mud+ 5xlO 4xlO 2 pCGL107~ ud- lO n.d. 5xlO

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PCI/FR91 /006~6 2~72~

TABLEAU ~: DOSAGE DE LA GLUTA~ATE DESHYDROGENASc DANS LES TRANSFOR~ANTS PRI~AIRES

Souche bacterienne Activité spécifique Gdh en llmole de NADPH2consomme/mln/mg protelne -souche de départ Km Cm CGL200s (Bll ' ) 2, 1 8 transformant Km~m Kl 2,0 K2 50,06 K~ ~0,06 K4 ~0,06 K5 . ~0,06 K6 2,18 K7 ~0,06 R R
transformant Km Cm KC2 2,24 KC~ . 2,12 KC4 2,18 KC7 2,06 .
:- . .

.: ~. : . . .
.

: .

20~72~0 TABLEAU 4: DOSAGE DES ACTIVITES 13GALACTOSIDASE ET
GLUTAI~ATE DESHYDROGENASE DANS LES INTEGRANTS A~PLIFIES

.
Souche ~actérienne Activité Activité spéctf ique nga l ac tos i aase g l utam ate deshydrogenase .
soucne ae d~ art K.-S ~s CGL2005 (B115) ~ 7 2,48 ' 1ntegrants primalres Kr?` Cr,P~

KC2 6,2 2,24 KC~ 4,5 2,05 ntégrants amp1ifies KC~T I 27,9 18,2 KC~T2 20,7 16,0 . KC3T~ 48,2 49,6 KC~T4 ~2,2 2,2 KC~T5 19,7 8,55 KC~T6 19,0 11,9 KC~T7 ~4,5 28,0 :. KC2T I 7,4 2,7 ' ', WO 92/02627 . PCI /FR91/006~6 ~72s:~

TABLEAU 5: DOSAGE DES ACTIVIT~S CAT, ~GAl et GDH
DANS LES SOUCHES A~lPLlFlEES

Souche ~acterienne Activité ~3 al Activité Actlvité
9 spéciflque Cat spécifique Gdh souche de départ Kn~Cm - CGL2005 (Bll ~ 7 ~0~07 2,18 ~ C
ntég, an. prlmalre Km`Cm~
K2 ~0.07 S.0,006 ~0,0- ~0,006 intégrant primaire KmRCm R
KC3 4,5 2,72 2,06 KC7 ~,4 1 ,82 intégrants ampliflés KC.T 1 ~7!a 19,7 18,2 KCJ-I 3 48,2 ~3,3 49,6 KC3T4 ~2,2 18,4 2,24 KC~T5 19,7 13,6 8,55 .:

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WO 92~02627 PC'r/FR91/00656 2' 2~72~'~
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20~7240 N~ d~ lii domand~ interntnlonnle PCTI FR91 / C ,~
MlCRO~t~JiRGANlSMES
r~ub heuh~tthr r tr tb- u m e~o-oro-n~-m- m-mionnt n D-o~ 9 . Uon~ 2~ d- 1- rJ-~Crlr~Uon _ _ A. IDE~TlrlCAT10~1 DU Dt~oT
D'-ut o-oo~e eont ~q-nti~i-- ur un- I-uill- eur~DI-m-nl-lr-~om rl- I'lnotltutron o- dtoO~ ~
Collection Nationale de Cultures de Microor~anismes .lnstitut Pasteur _ _ _ . __ _ _ _ ~orolto- rl- I'inotitution rJ- rJ~pot (tr eomono lo eooo ooot-l 11- p- r-) 25 rue- du Docteur Roux . FRANCE
D 1- du rl~r~ol ~ o~ord - ~
23 Juillet 1991 1-112L
OleaT10~ S SU~Lt~lL~TAl~tEs t 1~ n- r-mDIlr qu~ ~, n-c-e ~o)~ Uno buiii- ~eD-r~- -u lolme DCUr 1- euno o- c--rr~no- ~n-m-nt~ ~

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C tTATS DtSlCNts I~OUR L-SOUELS LS II~DICATIO-IS SONT DOI~itES ~ (~i l-C mdlceoone n- eont pe~ oonnoe~ Dour toue 1-~ Et-~e ote~on~c) , _ .

D I~DICATIOIIS FOUI~NIE~I St~ MENT ~ (~ n- r-mp/lr oue ~I n~ce~ee~re) .
L-o Inolot~on~ ~num~oe e~ oor~e ooront eoumle~e ull~r~ou~om~nl eu Eur~ou ~morn~l~oncl ~ ~eo~einor lC nClur~ o~nh~l~ oell mo e tton~ p ~ No d'ororo ou ~110~ ~

J~L- o ~nto builh o ~t~ r~eut ~-e le o~m~noe mtcrnollon~b lor~qu~ e-ll- el c 1- a~Do~ hlr~er o-r l'o/r~eo r~c~Dtour) - 8 AOi'l~ Jgg~ a~ ~ERQU~
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~ Dete qe ~cootlon (en Dro~enenco qu O~DO~cnt) Der Ie tur-~u Int~rn-uon~ p ~"~ , r,~d ^ ~ oa (Fonctionneuo outori~) Formuluro PCT/R0/13t (O-nlr~or lltttl) WO 92/02627 2 7 2 0 ~ 7 2 ~ ~) PCI /FR91/00656 No d~ IZt d~m~tndlt int~rnation~le: PCTI FR91 / 00656 __ MICRO ORGANI~MES
Frwilb beulr ll~o r l~ r- u mic~o oro-n~cm- m-noonn- n P-9- 12 . Ilon~ lL . do b doccrio~on IDEllTlFlcATloN DU Dt~o~ t O ~utr-e rJ~Polc oont idonllli~o cur un- loulilo cuoDl~monto~o ~ 5 .
Nom do t molltulion r~- O-DOI ~ .
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ;
Institut P asteur ~dro~c- rJ- I InUIIut~on d- r~pol ~1 eomD IC ~- ~- Po~-~ ~- P- ~-~
25 rue du Docteur Roux . 75724 PARlS CEDEX 15 .
FRANCE
D-l- dr~ d Pot '~ I N d ordr- -23 Juillet 1991 1-1127 _ I
INDICATIONS SU~PLÉMENT~IRES ' (~ n, ~mPIIr qu~ ~, n-c~cc~lr-) Un~ Nulll- ~oPor~ t ;olm~ pour 1- UIl- a- co~
n--lon-m-nt- 5 _ C tTATS DtSlCNts POUR LESOtJeLS EES INDICATIONS SONT DoNNtES ~c~ h~ Indlcot~on~ n~ cont P-- oonnoo~ DOU~
touc lo~ Er-~ oouon~s) _ _ D. INDIC~TIONS FOUltNlES Stl'~RtMENT ' /~ no rompl~r qu~ cl nococcolro) ~ e Ind~cellono ~num~r~-c e~-eDr~ --ront ~oum~c-~ u~t-neur-monl Cu ur--u ~nlorneuon~ nr r n~ r - ~rl n~.
rJ tlonc p o~ No d orr1ro du d~pOt r ~

L E~Le pr~cont~ buillo o ~t~ rocuo o~oc 1~ oom~nrJc Inlornooonclo lorcquo e-ll- Cl o ~t~ rJCooc~ r~ri~-r p~r l oll~eo /~C~pt~UI) - 8 AOUT 1991 R! ~RQ~r (Fonctlonnuro ~u~or~

C~ D-~o do rocoplion (on Dro~r-n-nc- ou r~-oo~m) p~r 1~ Bu ~u ~m~ n-~on~ ~ tB ~ r 7_ G
(Fonc~onnr~u- cutori~e) Formui-lr- FCT/Ron3~ (u-n~or 19011 , .

WO92/02627 2 ~ ~ 7 ~ 28 PCl/FR91/00656 NO d~ b d-m~ne~ Int~rnrttionritle PCT/ FR9i i ~ j6 . MICRO-ORGANISMES
F beuttJtl~r- n bli~- u mie o oroomom- m-ntlonn~ n pop- 18 , llon~ 32 d- 1- d-cerlo~lon . . _ . IDSI~iTlrleATlON DU DtroT
D~outr - Ci~Dotc cont id-ntifi~c cur un- f-uill- ~uDd-m-n ~ir-_ _ Nom o l'lneututlon d- o~oot ~
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur ~o~oo dO l'mobtulion rl- d~oOI (t~ eomDrl- 1- eorl- ooct-l t 1- P~r~l 25 rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX lS
_ F12A~CF ,, D~ du o~l~o~t ~ ¦ N- d'ord-- ~
23 JUILLET 1991 1-1125 I .
INDIC~TIONS SU~PLt~ENTAlNEs ~ 1~ n- r-rnont qu- ci n c-cccirc~ Unc buillc c~Dorc~ oct jolnlo Dour Ic cunc oc cc~
nod~n-m-nt~

_ __ C. ITATS Dt--lCNtS ~OU~ LE--OUELS LES INOICATIONS SONT DoNNtES ~ cc moic-uonc n- cont DCC oonn~ Dour touo bc Et te d~cir~ncc) O. INDIC~TIONS ~OU~tNl~Si stl~Allttl~ENT ~1~ n- r-mr~lir qu- Cl n-e--c l---- . _ Loo Inoieo~lone ~num~-~o~ C~o -- - on~ eoumb~ uU~nou~on~-nt eu Buroou Inl-rnellon~ -D-CIn-~ IC n~lure o~n~r~l~ det~ Indu e r~-ne p ~ NO d'ordr du d~po~

L. ~ Lo Dr~COnl- buillo o ~1~ roCuo otroe lo d-m-no- Int-rnotloncl- lorcouo e-ll- el o ~1~ d~Doc~e ~ ~r~rllie por l'olr~ee rec-pteur~

- ~ Aû'JT ISS, R~ ~ERQtJ~
~Fonctlonnclro cutorl~e) C Dot- d- r~c-otlon ~cn Dro~-nCnC- du d~Do~cntl Dor lo Bur-cu mtcrncuoncl ~ " ~ t' F-~ : L '---~
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~Foncllonn-ir- utori~e) Formubirc PCT/RO/13~ I lon rl-r 1~1 ) ~ .
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WO 92/02627 9 2 9 ~ 7 ~ ~ ~ PcrtFRgl/006s6 No dlt la d~m-ndu inturnation(tle: PCTI FR91 / 00656 ,1 ~
MICRO-ORGANISMES ~ ~} ~
r utlh beulutl r- r l~ r~ u mlerr~orrJ-n~urn- m-nbonn~ n peo~ 12 . Ilon- 1 ~ d- 1- d-~crrDrlon . IDEflTîFlC~nO1 OU otro D outr-c cJ~Dot~ conl !d-nlifi~c cur un- I-uill~ ~uDDlcm~nuir~
t~om D~ l ln~t~lullon D- d-Pot ' Collection Nationale de Cultures de Microorganismes . Institut Pasteur , ~
~Drrnc--d- I moUlution rJ- d-DOt (Ir comD~l~ 1- eod- oo-l-~ t 1- D-lr-) 25 rue du Doctcur Roux _ FRANCE
Or to r u rJ~*I ' 1 d ondr- ' _ . . ~
S. IIIDICATIO) S SUr~Ltl~E/lTAlttEs ~- n~ r~m~llr qu~ ~ nr~e~u~u~r~l tJnr~ tr~udl- rurDcrc- er~t lomto Dour Ic cuu~ o- eec nor~rpn-m-nt~

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C tTATS OtSlCJltS POUR USOUlLS US ll~tDlCATlOt~S SO~l t DO~Jt~tES ' (c~ 1-- moiecllonc n- cont D-C Donn~-~ Dour louc l-c Eteu ù~e~ne~) _ D. I~DIC~TIO~S FOURI~IES StPARtME~lT ~ (~ n~ r~mDllr quo ci n~e-c~-~ro) _ _ L c ~ndleU~on~ ~num~r~-c ei~ODr~ c-ron~ -oum~o-~ ullerleur-m-nl u Bur-eu Inl-rn~lon~ o~clfi~r 1- nolurc r~n~r~l~ OCi md~
eullono p -~ o d o~r- du rJ~pol) E ~5 Lo pr ~-m- huUI- e ~t- reCuc ~r~c lo oemonde mt~rnctlon~ Drcrtuo e-ll- a ~t~ d~porJ- (~ ~r~nfi-r P-r I orfie- r~eoptour) - 8 ~0~ ~ ~.EP~
(Foncllonnolre outorh~) I N P
~I Det~ d~ r~ccDllon (en provonenc~ du d-Do~n11 Prr Ic fJureou mlorncllonnl ~1 ~'5 ~ u_~ ~'D l.o:-~n~r~
755G2 i~ , CE~EX O~
(fonc~lonnolro ~utorlre) -Formuleire PcTlRO/13~ ~-mrier 1~81)

Claims (26)

REVENDICATIONS

1) Integron de Corynebactérie caractérisé en ce qu'il comporte :
- un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie, - une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant éte adaptées à ladite bactérie.

2) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il provient d'un plasmide qui comporte, outre l'intégron, une partie réplicative, l'intégron étant flanqué de séquences répétées inverses correspondant à un site de restriction non présent dans l'intégron.

3) Intégron selon la revendication 2, caractérisé en ce que la partie réplicative comprend une origine de réplication efficace dans une bactérie non Corynéforme.

4) Intégron selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'origine de réplication est efficace dans E. coli.

5) Intégron selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la partie réplicative comprend une origine de réplication efficace dans les bactéries Corynéformes.

6) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les séquences d'un élément transposable.

7) Intégron selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément transposable comporte des séquences provenant d'une corynébactérie.

8) Intégron selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence provient de Brevibacterium.

9) Intégron selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence provient de ISaBl telle que décrite dans la Figure 9.

10) Intégron selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé
en ce qu'il comporte en outre les séquences d'un élément transposable assurant la transposition à l'exception des protéines codées par la bactérie corynéforme.

11) Intégron selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé
en ce que les séquences de l'élément transposable sont dépourvues des séquences codant pour les transposases.

12) Intégron selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence d'intérét.

13) Intégron selon la revendication 12, caractérise en ce que 12 séquence d'intérêt code pour un peptide ou une protéine d'intérêt.

14) Intégron selon la revendication 13. caractérisé en ce que 12 protéine d'intérêt est une protéine homologue.

15) Intégron selon la revendication 14, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine hétérologue.

16) Intégron selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé
en ce que la protéine d'intérêt est une enzyme.

17) Intégron selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence codant pour une protéine d'intérêt est choisie parmi les genes :
- gltA
- gdhA.

18) Integron selon l'une des revendications 2 à 17. caractérisé
en ce que le site de restriction non présent dans l'intégron est choisi parmi:
- Notl - BstXI.

19) Intégron selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé
en ce que lesdites séquences ont été adaptées pour une souche de Corynébactérie.

20) Intégron selon la revendication 19. caractérisé en ce que lesdites séquences ont été transférées dans une souche de Brevibacterium avant d'être adapté chez Corynebacterium.

21) Intégron selon la revendication 20. caractérisé en ce que lesdites séquences ont eté amplifiées.

22) Intégron amplifié selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'amplification a donné des séquences amplifiées stables.

23) Intégron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence homologue de Corynebacterium melassecola qui s'intègre dans le chromosome de Brevibacterium lactofermentum.

24) Procédé de transformation d'une souche de bactérie corynéforme par un intégron selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que l'intégron est introduit dans ladite souche par électroporation.

25) Corynébactérie susceptible d'étre obtenue par le procédé
selon la revendication 2'.

26) Corynébactérie selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de:
- B. lactofermentum - B. flavum - C. glutamicum - C. melassecola.