PT97956A - Novo vector para a producao de peptidos biologicamente importantes - Google Patents

Description

"NOVO VECTOR PARA A PRODUÇÃO DE PÊPTIDOS BIOLOGICAMENTE IMPORTANTES" Âmbito da presente invenção A presente invenção refere-se â construção de novos vectores de secreção com base na sequência que codifica a en-terotoxina da E. coli. Demonstrou-se categoricamente que as regiões pre e pro do gene da toxina eram absolutamente necessárias para a secreção extracelular da toxina estável, Demons trou-se também, através de exemplos específicos, que quando se fundia estruturalmente, a sequência que codifica o nucleo-tido de um pêptido heterõlogo, com a extremidade da região pro do gene st, o vector resultante, num hospedeiro E, coli, segregava, para o meio extracelular, pêptidos heterõlogos cor-rectamente processados, A presente invenção abrange, também, a construção de vectores adequados no caso de ser possível efectuar esta fusão genética. Descrevem-se ainda métodos gerais para a criação das referidas fusões que incluem: a) a tec nologia do ADN recombinante e, b) a utilização de mutagenese comandada de um sítio, in yjtro, A presente invenção refere-se também a um método geral para a purificação de pêptidos hete-rõlogos. Podem utilizar-se estes novos sistemas vector para a hiperprodução e secreção extracelular de pêptidos biologicamen te importantes. -2

Antecedentes da Presente invenção e dá Tgcnjca Anterior

As proteínas secretoras, assim como muitas das pro-teinas da membrana eram inicialmente sintetizadas como pre-pro teínas nascentes intracelulares com um piptido principal liga*' do ao terminal N, Õ piptido principal tornava possível a proteína atravessar a barreira da membrana interna. De acordo com o presente processo, a proteína cliva e liberta-se como uma proteína madura, que reside, normalmente, no espaço periplasmi cq. Constituem algumas excepções a este mecanismo determinadas proteinas de membrana cujos piptidos principais permanecem por clivar (S, Letenhardt, et al« in Protein Engineering, Application in Science, Medicine and Industry edt. for M, Inouye e R. Sharma, 1986 Academic Press, Inc,, 157-171). AUgumas proteínas ou piptidos procariõticos são sintetizados como grandes piptidos principais possuindo precursores (pre-regiao) assim como pro-regioes. Ambos os segmentos são clivados para proporcionar as proteínas maduras ou piptidos. Os exemplos incluem a subti-lina do Bacillus subtilis (C. Nishio, et al, 1983, Biochem, Biophys, Res, Commun, 116, 751-758) ou toxinas estiveis de Es-cherichia coli (P. Dwarakanath, et al, 1989, Gene 81, 219-226)

Estirpes enterotoxigenicas de E, coli (ETEC) que ori ginam diarreia em seres humanos pela elaboração de toxinas ex-tracelulares classificadas como a familia das toxinas libeis ao aquecimento (LT) e estiveis ao aquecimento (ST), (R,N. Gre-enberg e R.L, Guerrant (.1981) , Pharmacol. Ther.II, 507-537; M. D. Gill e M, Woolkalis 1985 in Microbial toxins and diarrhoeal diseses, Ciba Foundation symposium 112, Pitman, London, 57-73) As toxinas ST são de dois tipos í toxinas solúveis em metanol (STI) e toxinas insolúveis em metanol (STII. As toxinas STI -3- classificam-se ainda em três grupos conforme a sua origem/ is-to ê/ STh (humana), STp (porcina) e STb (bovina), Os genes para ambas as LT e ST são codificados por plasmídeos, A sequência nucleotídica do gene st. encontra-se indicada na figura 1, (P, Dwarakanath et_al, 1989, Gene 81, 219-226), Para a sequência nucleotídica, assim como para a sequência aminoãcida traduzida, concluiu-se que o pêptido de 72 aminoãcidos ê um precursor de ST, que é processado apôs a tradução, libertando um pêptido de 19 aminoãcidos a partir da extremidade carboxi-ter-minal, tal como a toxina biologicamente activa, (P, Dwarakanath et al, 1989, Gene, 81, 219-226),

Foram feitas tentativas por diversos grupos, para utilizar uma porção da "sequência principal" das proteínas secretoras naturais, para se construírem vectores recombinantes que segregarão proteínas heterõlogas. Em muitos casos também se utilizaram sequências principais de síntese. Em todos estes casos, os produtos recombinantes localizaram-se nos compartimentos sub-celulares, Constituem exemplos específicos? uma patente de invenção de Gray et al (US Patente dos Estados Unidos 4755465, 1988 Julho 5) em que os inventores reivindicavam a construção, de um vector que promovia a secreção da hormona do crescimento humano correctamente processada (HGH) na E, coli e Pseudomonas, A "sequência principal" que também se encontrava englobada pelas reivindicações da referida patente, era muito diferente da "sequência principal" da toxina estável da E, co-li, II, Uma segunda patente (patente de invenção norte-ame ricana N9 4 704 362, datada de 3 de Novembro de 1987), de Ita-kura e outros descreve um veículo de clonagem recombinante pa- -4 ra expressão, de polipêptidos microbianos em que se produz um produto de fusão de β-gal e de somatostatina gue ê, posterior mente, processado in vitro para se obter o produto final,

Um exemplo em gue se emprega especificamente uma se quência principal de enterotoxina, foi referido por Cray e ou tros, (patente de invenção norte-americana N9 4 680 262r de 1985) em que os inventores ligaram geneticamente a "sequência principal" da toxina estável insolúvel em metanol (STII), com o gene da hormona do crescimento humano (hGH) e localizaram o produto na região periplãsmica da célula hospedeira, É interes^ sante notar que os inventores procuravam, especificamente, um veiculo de expressão que localizasse a proteína recombinante expressa, intracelularmente, A sequência principal de st II não tem qualquer semelhança com a sequência principal de stl, sendo considerada como uma estrutura diferente.

No presente pedido de patente de invenção, os inventores tiraram vantagem das regiões pre e pro de STI, para criar um veículo recombinante no qual a sequência nucleotídica que codifica um péptido se funde estruturalmente, na extremidade da região pro, A expressão do gene completo originou a secreção extracelular de um peptido recombinante correctamente processado, Apresenta-se a seguir um diagrama esquemático do prin cípio; • *t %J ♦ · « -5 -5 Seq. Principal Pré-região

Pro-região Pêptido ST maduro

Vector

Pro-região

Seq, Principal Pré-região Pêptido hete- — rõlogo maduro

Vector. A vantagem deste sistema consiste no facto da purificação dos produtos recombinantes se tornar muito mais simples, uma vez que as células portadoras deste vector recombinante podem crescer num meio de síntese constituindo depois o péptido recombinante, o principal pêptido presente no sobrenadante da cultura. Descreve-se na presente invenção um método geral para a purificação de um pêptido heterologo recombinante. (An-giotensina I) tal como se referiu.

Sumario da Presente Invenção;

Utilizando a região pre e pro do gene stl da E, co-li da espécie humana, construiu-se um novo vector recombinante que pode processar e segregar correctamente, qualquer pêpti do, no meio extracelular. Na presente invenção, descreve-se^ um método generalizado para a purificação de um pêptido recombinante, deste tipo. F.esume-se a presente invenção, de acordo com as clãu sulas que se seguem: 1. Um vector susceptível de facilitar a secreção de uma proteína heterõloga que se expressa numa célula hospedeira, en

globando esse. vector o ADN que codifica a sequência pre- pro do gene st da E, coli MKKSILMIFLSVLSFSPFA QDAKPVESSKEKITKESKKCNIAKKSNKSG P E S M, 2. 0 vector pARC 0101, com ο N9 de deposito NCXB 40115, 3. Um hospedeiro EV coli contendo o vector pARC 0101 de acordo com a clausula 2, 4. a utilização de pARC 0101, de acordo com a cláusula 2, na construção de um vector de expressão para proteínas he-terologas, 5. Um vector que contenha a sequência pre-pro do gene st de E. coli, tal como se definiu na cláusula 1. 6. Um vector, de acordo com a cláusula 5, contendo a sequência BamHX-HindIII da sequência pre-pro do gene St de E. coli, tal como se definiu na cláusula 1. 7. Um hospedeiro de E. coli contendo um vector, tal como se definiu em qualquer das cláusulas 5 e 6. 8. Um processo para a produção de proteínas heterologas na E. coli, que se caracteriza por se desenvolver, de acordo com métodos normalizados, um hospedeiro de E. coli, tal como se definiu na cláusula 7 e no isolamento, de acordo com métodos normalizados, da proteína desejada. 9. Um processo, de acordo com a cláusula 8, que se caracteriza pela secreção extracelular da proteína. 10. Construção pARC 0726, contendo a sequência pre-pro do gene st da E. coli estruturalmente fundida com a sequência que codifica a cadeia A da Angiotensina I. 11. Utilização da construção pARC 0726, de acordo com a cláusula 11, na expressão da Angiotensina 1, -7 12. Um hospedeiro de E, coli contendo a construção pARC 0726, de acordo com a clausula 10, 13. Um processo para a produção de Angiotensina I, gue se caracteriza por se desenvolver um hospedeiro de E, coli, de acordo com a reivindicação 12 e em isolar a referida proteí na, 14. Um processo, de acordo com a clausula 13, em que a proteína i segregada no meio extracelular. 15. Construção de pARC 0801 contendo um sítio interno EcoRI, tendo o referido sítio EcoRI sido criado pela utilização do codão alternativo para a Ser 55, do péptido ST maduro. 16. Utilização de uma primeira construção pARC 0801, de acordo com a clausula 15, como material de partida, na preparação de uma segunda construção, por fusão de uma sequência de um gene homólogo ou heterólogo no sítio EcoRI da construção pARC 0801. 17. Um vector capaz de facilitar a secreção de uma proteína heteróloga expressa numa célula hospedeira, englobando o referido vector o ADN que codifica a sequência pre-pro do gene St da E. COli, MKKS ILMIFLSVLSFSPFAQDAKP VESSKEKITKESKKCNIAKKSNKSGPESM. 18. Uma construção que englobe um vector, de acordo com as cláusulas 5, 6 ou 7, estruturalmente fundido com o ADN que codifica a proteína pretendida. 19. Uma construção, de acordo com a cláusula 18, em que o ADN codifica a Angiotensina X, 20. Uma construção, de acordo com a cláusula 18, em que o ADN codifica a cadeia A da insulina. 21. . Uma construção, de acordo com a cláusula 18, em que ) -8 o ADN codifica a cadeia B da insulina, 22« A construção pARC 0726 que engloba a sequência pre- -pro do gene st da E. coli, estruturalmente fundida com a sequência que codifica a cadeia A da insulina. 23, A construção pARC 0726 contendo a sequência pre e pro do gene st de E. coli, estruturalmente fundida com a sequên cia que codifica a cadeia B da insulina. 24, Um hospedeiro de E. coli que contem um vector ou cons^ trução, de acordo com as cláusulas antecedentes. 25, Um processo para a produção de uma proteína heterologa para a E, coli, que se caracteriza por se desenvolver um hospedeiro de E. coli/ tal como se definiu na cláusula 24 e no isola mento da proteína expressa. 26, Um processo, de acordo com a cláusula 25, em que a proteína ê segregada no meio extracelular. 27, Um processo, de acordo com as cláusulas 25 e 26, em que se isola a Angiotensina I. 28, Um processo, de acordo com as cláusulas 25 ou 26 em que se isola a cadeia A da insulina. 29, Um processo de acordo com as cláusulas 25 ou 26, em que se isola a cadeia B da insulina. 30, Um processo para facilitar a secreção a partir da célula hospedeira de uma proteína expressa numa célula hospedeira que se caracteriza por se fundir estruturalmente o ADN que codi fica a proteína que se pretende expressar com uma sequência pre -pro do gene st da E« coli, tal como se definiu em uma qualquer das cláusulas de 1 a 11,

31, Um processo para a formação de uma construção que se caracteriza por se fundir a sequência desejada, no sítio Eco RI -9 da construção pARC 0801,

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção; A identificação e clonagem da variedade humana do gene stl de EY coli, foi detalhadaroente descrita por P, Dwara kanath et al (1989, Gene, 81, 219-226). Resumidamente, identi ficou-se um plasmídeo de 100 MDa, na E, coli estirpe 86 cal que continha o gene st. Construiu—se uma biblioteca BamHI do plasmídeo 100 MDa de E, coli 86 cal, em pBR 322 e identificou —se o clone contendo o gene st, por hibridização com uma sonda de ADN. Subclonou-se, depois, este gene st em M13mpl9 como um fragmento de BamHI-HinduI e sequênciou-se o fragmento com pleto, de acordo com o método de Sanger.

Na fig, 1 indica-se uma parte da sequência contendo a sequência de transcrição aberta (QRF) do gene st. A extremi dade carboxi 19 aa do pêptido codificado por ORP corresponde â sequência do pêptido ST^ (Aimoto et al 1982 Eur. J. Biochem. 129, 257-263), Foi possível identificarem-se quatro nucleoti-cos que precediam o codão de partida, uma sequência que sugeria um hipotético sítio de ligação ribossõmico. A seguir â se quência de cõdigo encontrava-se um par de codões de paragem (TAA) e uma faixa de 15 nucleõtidos com simetria díada, indicando, presumivelmente, um sinal de terminus de transcrição. ORF codifica um pêptido de 72 aminoãcidos, no qual a extremidade carboxi, de 19 aminoãcidos é o pêptido biologicamente ac tivo. A faixa de 10 ou 20 aminoãcidos N-terminal constitui o pêptido de sinal, que possui dois resíduos de bases £ Lis2, Lis3 J a seguir ao iniciador metionina, uma faixa hidrofõbica de aminoãcidos e uma sequência de consenso para a junção da -10- -10-

clivagem do pêptido principal. Não se conhece a junção exacta da clivagem do pêptido principal a partir da região pro-ST, A região pro ST expande-se até Met 53, onde é finalmente cliva da para proporcionar um pêptido biologicamente activo segrega do extracelularmente com Asn54 como o terminal N do pêptido maduro.

Obteve-se uma estimativa da concentração de ST^ em sobrenadantes de cultura utilizando a técnica do ensaio ELISA competitivo. Este ensaio ELISA utiliza-se, por rotina, ao lon go da presente investigação para se calcular o nível de ST^ em sobrenadantes de culturas. Conseguiu-se a hiper-expressio do gene st, subclonando o fragmento do gene vector que continha o promotor T7. Num tal sistema de hiperexpressão, conseguiu-se a indução da hiperexpressão, por adição de um indutor, IPTG (isopropiltiogalactosido). 0 esquema de purificação utilizado para o pêptido ST (tipo selvagem/mutante), foi efectua do de acordo com o método descrito por P, Dwarakanath et al. (1989; Gene '81. 219-226) . Efectuou-se a analise da sequência aminoãcida do pêptido num Analisador de Sequências Aminoãcidas da Applied Biosystems (Modelo 477A). Utilizou-se o método da mutagenese dirigida de um sítio, in vitro, para se criarem mu-tantes na região pro, assim como na parte madura da sequência que codifica o pêptido da toxina, seguindo métodos normalizados (Das et al 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86_, 496-499). De modo idêntico, de acordo com o método de mutagenese dirigida de um sítio, in vitro, substitui-se a região que codifica o pêptido ST maduro, completo, pela sequência que codifica a An-giotensina I (Ang l) e monitorizou-se a secreção de Ang I, por ensaio radioimunologico (ERI). Os resultados encontram-se des-

critos na parte de dados experimentais

Dados Exper imen tai s I, Construção de Vectores de Secreção;

Detectou-se STT no sobrenadante da cultura de um iso lado de E, coli ETEC 86 cal, que demonstrou transportar um pias mídeo de 100 MDa. Construíu-se uma biblioteca de BamHl do pias mídeo de 100 MDa de E. coli 86 cal, no pBR 322 e examinaram-se os clones recombinantes quanto ao gene st. Identificou-se um dos clones recombinantes como portador do gene St num fragmento BamHl de 1,9 kb (pARC 074). Clonou-se um fragmento BamHI--HindlII de 1,1 kb, obtido de pARC 074 em pBR 322, para se obter o plasmídeo pARC 0101. O plasmídeo pARC 0101 ê o material de partida para todas as outras experiências. Depositou-se este plasmídeo no National Collection of Industrial Bactéria, Aberdeen, Scotland (estirpe NCIB 40115), de acordo com o Trata do de Budapeste, sendo a data de depósito 15 de Fevereiro de 1989. Os sobrenadantes da cultura de E. coli HB 101 portadores de pARC 0101 induziam uma resposta biológica positiva para ST nos ratos ainda em período de aleitamento. II, Construção do ADN bacteriofãgicQ de M13mpl9ss contendo a inserção st

Isolou-se um fragmento BamHI-HindiII de 1,1 kb contendo o gene st, a partir de pARCO101. Subclonou-se este plasmídeo em Ml3mpl9RF digerido com BamHl e HindiII. Transformou-se a forma replicativa recombinante (RF) em JM101 e colocou-se numa placa em presença de X-Gal e de IPTG. Rastrearam-se as placas brancas de transformantes para se despistar o gene st e identi- -12 ficou-se um desses danes de bacteriõfagos como #192 (fig. 2) que, ao ser propagado em JM101, libertou uma toxina estável nos sobrenadantes da cultura. 0 clone #192 ê o material de par tida para todos os ensaios de mutagênese, in vitro, que se dess crevem, III. Construção de um vector de hiperexpressão para a hi-perexpressão de ST^. de tipo selvagem ou mutante.

Propagou-se o clone #192 ou os seus mutantes em JM101 e isolou-se KF a seguir a uma noite de desenvolvimento das bactérias, de acordo com um protocolo normalizado de purificação de plasmídeos f T. Maniatis et al. 1982 Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Co— de Spring Harbour, NY J. Isolou-se um fragmento de BamHI- HindlII de 1,1 Kb e subclonou-se num vector contendo o promotor T7, como um fragmento BamHT-HindIII de tal modo que o prometor se encontrasse orientado na mesma direcção da transcrição do gene st:. Designou-se o plasmxdeo de hiperexpressão que continha 0 gene st de tipo selvagem, por pARC 0601 (fig. 3). IV. Exemplos que demonstram que a região pro e essencial para a secreção no meio extracelular

Para se demonstrar que a região pro ê essencial para a secreção extracelular de uma toxina estável, fabricaram-se dois mutantes do gene st, em que as mutações se localizavam na região pro. No primeiro exemplo efectuou-se uma mutação no sitio de processamento, em que se alterou Met53 para Ile53, utilizando como matriz o clone #192 desenvolvido em CJ136 estirpe 1 dut ung J. O iniciador mutagênico utilizado para criar es- -1 ta alteração, possuia a sequência 5' CCTGAAAGC A T T AATAGTAGC 3' (ATG —> ATT). Este iniciador (GD21) foi recozido com a matriz e estendido na presença de Sequenase e de quatro dNTPs. Ligou-se a cadeia estendida com ADN ligase T4 e utilizou-se este ADN de cadeia dupla sintetizado in vitro, para transformar JM1Q1, Efectuou-se o rastreio das placas de transformantes, por sequenciação do ADN e identificaram-se os clones mutantes. Um desses clones mutantes (_0ÍGD21) foi purifi cado em placa e subclonado no vector de hiperexpressão, de acordo com o método referido na secção de dados experimentais III, Utilizou-se o plasmídeo resultante, pARC 0701, para trans formar a E. coli HB101. Comparou-se a produção extracelulat de ST (M53-^153) numa cultura de uma noite com pARC 0601 desenvolvido na E« coli HB 101, Indica-se a seguir, o resultado:

Plasmídeo em HB101 Produção de ST em jig/ml pARCQ601 7 pARCO7Q1 1 0 ensaio demonstrou que uma alteração conservadora (Met53- y Ile53) na região pro, reduzia o nível de secreção de toxinas estáveis numa percentagem superior a 85%, A atenuação de secreção de ST^ foi mals evidente quando se construiu um mutante de st, por eliminação, em que a eliminação se estendia desde Ser48 a Ser52 na região Pro. 0 protocolo experimental foi idêntico ao descrito na secção anterior, com excepção do iniciador mutagênico utilizado, que -14- possuia a sequência 5’ GCAAAAAA.AAGTAATA.AAA TGAATAGTAGCAATTAC3' (GD-11)« 0 plasmídeo de hiperexpressão que continha este st mutante (elim* Ser48--Ser52) designou-se por pARC 0702, Quando se propagou este plasmídeo em HB101, o clone resultante não produziu ST^ detec tãvel, no meio extracelular, Deste modo, estes exemplos (Met 53-^ lle53 e eliminações Ser48-^ Ser52) demonstram claramente que ê necessária a presença da região pro intacta para a secreção extracelular de ST^. V, Exemplos demonstrativos da não especificidade do resíduo N-terminal do pêptido maduro, para um correcto pro-cessamento e secreção extracelular do pêptido ST^.

Para se verificar o efeito do resíduo N-terminal no pêptido ST no processamento e secreção extracelular do referi do pêptido, construíram-se dois mutantes de sjt. No primeiro exemplo, substituiu-se Asn54 de ST^ por Gln54, seguindo exac-tamente o método descrito na secção III da parte de dados experimentais. 0 iniciador mutagénico possuia a sequência 5' G A AAGCATGC A_G AGTAGCAAT3’ (ATT—> CAG) , Designou -se por pARC 0732 o plasmídeo de hiperexpressão que continha o mutante st Asn54-^ Gln54. Quando se propagou este plasmídeo na E, coli ou na estirpe de hiperexpressão BL21-DE3, produziu-se uma quantidade de toxina extracelular equivalente, em comparação com a quantidade produzida pelas estirpes HB101 ou BL21--DE3, portadoras do plasmídeo pARC 0601« No sentido de se determinar o sítio de processamento do mutante de ST (Asn54-^GLn54) segregado extracelularmente, sobre-expressou-se o gene -15- c mutante e purificou-se o pêptido seguindo essencialmente o me · todo descrito por P, Dwarakanath e outros ("Gene", fTL, 1989;p, 219-226) .. Na £ig, 4 indicam-se as caracteristicas da purificação por CLEP. A sequência N-terminal deste pêptido revelou uma sequência Gin - Ser - Ser - Asn - Tyr.

Efectuou-se um outro ensaio idêntico no qual se alterou Asn54 de ST^ para His54, 0 plasmídeo resultante que con tinha o gene st mutante foi designado por pARC 0716« A seguir â sobrexpressão. de st Asn54->Ile54 e â purificação do pêptido, determinou-se a sequência N-terminal do referido pêptido. Os dados sequenciais tornaram evidentes a presença de dois pêpti-dos com as sequências N-terminais (1) His-Ser-Ser-Asn-Tyr ... e (2) Ser-Ser-Asn-Tyr ,Na fig, 5, indicam-se as caracteristicas de purificação por CLEP.

Estes exemplos demonstram, de um modo claro, que o N-terminal do pêptido ST^ (Asn54), não é crucial para o proces sarnento de pos-tradução e secreção do pêptido. VI, Exemplo em que se demonstra a generalidade do yector de expressão com base na toxina estãvel

Para se ensaiar a generalidade do vector de secreção com base em st, substitui-se no gene st maduro a região de código que correspondia ao pêptido St maduro (isto e, Asn54 a Tir72),'pela sequência que codifica a Angiotensina I, A Angio-tensina I ê um pêptido decamêrico que se converte, a partir de um precurso maior, Angiotensinogênio pela renina-protease,

Posteriormente a Angiotensina I ê modificada para se produzir a Angiotensina II, pelo "enzima conversor da Angioten sina" que elimina os últimos dois resíduos carboxi-terminal -16 c (his-Leu) da Angiotensina X, Sabe-se que a Angiotensina II e um potencial vasoconstrictor. Efectuou-se a substituição da sequência que codifica a AngI pela sequência que codifica ST, no gene st, de acordo com o método de Kunkel (T, A* Kunkel,

1985 Proc.Natl. Acad, Sei, usa 32, 488-492), com algumas rnodi ficações, Sintetizou-se um iniciador mutagênico (GD9), que possuia a sequência 5' GTGGTCCTGAAAGCATGGA CCGGGTGTACATACACCCCTTCCACCTCTT AATAATATAAAGGG3', Recozeu-se este iniciador 62--mero, com a matriz de ADN ssQ'192, desenvolvida em CJ 236, A

P- O temperatura para a reacçao de recozimento foi de 55 C. A quan tidade de matriz utilizada foi de 3 jjlg, por reacçao, enquanto que a quantidade de iniciador utilizada foi de 10 ng, A seguir ^ o ao recozimento, efectuou-se a reacçao de extensão, a 37 C, durante 4 horas, na presença de 8 unidades de Sequenase e de qua tro dNTPs (a conc, final de cada dNTP foi de 1 mM), A mistura de extensão continha também 4 unidades de ADN Ligase T4 para que tivesse lugar a ligação do iniciador em extensão. Utilizou -se este complexo para transformar a E, coli JM101 e identificaram-se os hipotéticos clones por sequenciação do ADN, Sub-clonou-se £t ligado â sequência que codifica a AngI, no plas-mldeo de hiperexpressão e designou-se o plasmídeo por pARC 0726, Quando se propagou este plasmídeo em HB101 ou na estirpe BL21-DE3, de hiperexpressão, as estirpes portadoras do plasmídeo produziram AngI, no meio extracelular, tal como se detec-tou por ERI, A seguir â hiperexpressão de pARC 0726 em BL221--DE3 em meio M9, purificou-se o pêptido para sequenciação N--terminal, Descreve-se a seguir o esquema de purificação. Pen sa-se que este esquema de purificação pode ser aplicado, de um -17- -17-

modo geral, a outros pêptidos.

Desenvolveram—se células BL21—DE3, portadoras de pARC 0726 em meio M9 (250 ml x 4), Quando a cultura atingiu A600 nra= 0,86, induziram-se as células, adicionando IPTG (conc, final, 0,5 mm). Decorridas 2,5 horas sobre a indução, recolheram-se as células e misturou-se 470 ml do sobrenadante da cul tura com 30 g de Amberlite XAD-4 e deixou-se em repouso, à tem peratura ambiente, durante a noite. Apos lavagem cuidadosa da resina com agua, eluiu-se o pêptido ligado com uma mistura de 99% de etanol/1% de acido acético, e depois com uma mistura de 80% de etanol/1% de acido acético. Concentrou-se o eluldo por evaporação ultra-rãpida e verteu-se o concentrado numa coluna SP Sephadex C-25 (.10 ml) , previamente equilibrada com fosfato tampão 20 mM, a pH 6,4. Antes de se efectuar a eluição, lavou -se a coluna com agua. Efectuou-se a eluição com trietilamina 50 mM, Trouxe-se o pH do eluldo até 6,0 com acido acético. Liofilizou-se o eluldo e reconstituiu-se o po seco num mililitro de ãgua. Submeteu-se a preparação a CLEP numa coluna RP-8, utilizando um gradiente de acetonitrilo £ solvente A; 0,1% de TFA; Solvente B; 0,1% de TFA/95% de acetonitrilo; debito 1 ml/minuto, 0 gradiente foi de 10-50% de B em 40 minutos J. De-tectou-se o pico de Ang X a 29% B (fig. 6). Sequenciou-se o pêptido purificado e confirmou-se a sequência com a sequência nativa.

Este exemplo demonstra claramente que se pode ligar geneticamente, uma sequência que codifica completamente, um pêptido heterologo, com a pra região do gene st e que se pode detectar, extracelularmente, o pêptido correctamente processa do, a seguir â propagação de tal construção num vector de E, CQli, adequado. -18 VII. Construção: de um vector geral de secreção com um sitio de clonagem adequado,

Pode efectuar-se a introdução de um sitio de clona-gem adequado na região que codifica o pêptido maduro, conforme se seguei

Para se introduzir um sítio de restrição na região que codifica o pêptido maduro ou muito próximo da mesma, es-colheu-se a sequência de ADN, 5' ATGAATAGT3' que re presenta a sequência de aminoãcidos de Met53 a Ser55, Alterando a sequência nucleotídica do codão de Ser55 (ATG) para o codão alternativo TCT, pode criar-se um sítio EcoRI sem se alterar o resíduo aminoãcido. Apresenta-se a seguir um diagra ma esquemático.

Met53 Asn54 Ser55

ATG AAT AGT

ATG AAT TCT

Sítio EcoRI

Efectuou-se a mutação da matriz de ADN 0192 de cordão duplo (ss), de acordo com o método anteriormente descrito. 0 iniciador mutagênico (GD13) tinha a sequência nucleotídica 5'AGCATGAA T T C T A GCAATTAC 3'. Pode construir -se um sistema vector de hiperexpressão geral, utilizando este sítio EcoRI, como o sítio adequado para inserção da proteína heterõloga e da sequência que codifica o pêptido. Digeriu-se o plaesmídeo pET7 de: hiperexpressão com EcoRI e com' BamHI e isolou-se -19 o fragmento grande. Isolou-se #192 (GD13)RF e digeriu-se com BairiHl e EcoRl. Depois do tratamento com FIV (fosfatase intestinal de vitela) do produto de digestãof isolou-se um fragmen to de 620 pb. Ligou-se este fragmento com o fragmento grande de pET7. Designou-se o plasmldeo recombinante resultante por PARC 0801,

Depositou-se o plasmldeo pARC 0801, de acordo com o Tratado de Budapeste, na National Collection of Industrial and Marine Bactéria, Aberdeen, Scotland, com o numero NCIMB 40417 0 deposito foi efectuado em 29 de Abril de 1991. (Fig, 7). Este plasmldeo pode ser utilizado como um vector de secreção geral. Pode inserir-se qualquer sequência que codifique um péptido heterõlogo ou uma proteína, no sítio EcoRl (sítio de inserção), por exemplo, pêptidos tais como An-giotensina I, factor de crescimento fibroblãstico de bovino, (FCFb), insulina e outros, A expressão deste plasmldeo num hospedeiro de E. co-li, origina a secreção do péptido ou proteína no meio, podendo depois ser purificada. Deve ter-se em atenção que os pêptidos produzidos a partir deste plasmldeo recombinante podem possuir um resíduo aminoãcido adicional na sua extremidade amino (Ser) A possibilidade de se produzir Angiotensina I, e especialmente insulina, representa um aspecto importante da presente invenção. Pode utilizar-se a cadeia A ou a cadeia B da insulina purificadas, para se produzir insulina, VIII. Exemplos que demonstram a secreção das cadeias A e B da insulina a partir do vector de secreção coro base na toxina 'estável 0 Exemplo que se segue demonstra a generalidade do -20 vector de secreção com base na, toxina estável, A insulina humana consiste em duas cadeias polipeptídicas, as cadeias A (21 resíduos de amlnoãcidos) e B (30 resíduos de aminoãcidos) que se encontram ligadas através de ligações SH, Podem separar-se estas cadeias, in vitro, por redução podendo obter-se as formas puras das cadeias A e B, Em condições adequadas, podem re-oxidar-se as cadeias A e B purificadas, para formar insulina humana imunoreactiva e biologicamente activa. As sequências ge neticas das cadeias A e B da insulina humana foram separadamen te fundidas na extremidade da pre- e pro-sequência de ST, O Plasmideo recombinante englobado em hospedeiros de E« coli em crescimento activo, segregaram no meio de cultura substâncias que eram imuno-reactivas contra o anticorpo de insulina humana. A incubação do anticorpo de insulina humana com as autênticas cadeias A e B de insulina inibiram, de um modo competitivo, e nos respectivos casos, em que se esperava a produção de cadeias A e B recombinantes, indicando que, em cada um dos casos, se ti nha produzido o produto pretendido. Construiram-se os plasmídeos recombinantes utilizando uma estratégica idêntica â descrita nos dados experimentais VI. Utilizou-se um ADN fãgico recombinante (0GD24), baseado em M13mpl9 como matriz para o primeiro ciclo de mutagênese. 0 0GD24 possui um gene de ST inserido como um fragmento de BamHI-HindlII no sítio de clonagem múltipla de M13mpl9, Esta inserção especial de ST possui a mutação incor-recta no resíduo N-terminal do pêptido da toxina madura em que Asn54 i substituída por Gli 54, O iniciador mutagênico adequado para se introduzir o primeiro ciclo de mutagênese possuia a seguinte sequência nucleotídica: 1

CCTGAAAGCATGGGTATCGTGGAG

CAGTGCTGTACATCTATCTGCTCA 1 CTGTATTAATAATATAAA3

Esta mutagênese originou o fago j?GD26 que. possuia a sequência de ADN correspondente aos resíduos 1-14 do termi na:l N da cadeia de insulina A fundido na estrutura com a região pre-pro de ST. Utilizou-se ô ADN de GD26 como matriz pa ra a segunda fase da mutagênese. 0 iniciador mutagênico tinha a sequência nucleotídica

5' TGCTC-ACTGTATCAGCTAGAGAAC TACTGCAACTAATAATATAAA3' A seguir â mutagênese, identificou-se GD28, que pojs suía o gene completo da cadeia A fundido com a secção C-termi nal da região pre-pro de ST. Resumindo, com dois ciclos de mu tagênese, a sequência nucleotídica completa da cadeia A da in

I sulina, fundiu-se estruturalmente, com a extremidade 3 da se quência pre-pro, substituindo/ deste modo/ completamente, a sequência do gene da toxina madura. No entanto, a parte restan

I te da sequência da extremidade 3 do gene ST conservou-se intac ta ate ao final da construção. Desenvolveu-se o fago recombi-nante GD28 em JM101 e isolou-se o RF, Digeriu-se. o KF com BamEíI -HindIII e clonou-se o fragmento de 1,1 kb em pET7 com um frag; mento de BamHI-HindIII, para se obter pARC0750. Transformou-se a hiperexpressão da E, coli, estirpe BL21-DE3 com pARC0750. Sintetizou-se também, de modo idêntico, a cadeia B da insulina

I que se fundiu na extremidade 3 com a região pre-pro de ST. A matriz inicialmente utilizada foi GD23 que possuía uma inserção ST, N54F. A sequência nucleotídica do primeiro iniciador de mu -22- tagénese foi a seguinte;

δ' GGTCCTGAAAGCATGTTTGTGAAT CAGCATCTTTGCGGAAGTCATCTG GTTGAGGCTCTTTATTAATAATAT A A A 3* A seguir ã mutagênese identificou-se um clone mutan te (0 GD23) que possuia a sequência de ADN correspondente aos resíduos de 1-16 da cadeia B da insulina, estruturalmente fun dida com a sequência pre-pro de ST. Utilizou-se o ADN de 0GD23 ss como matriz para o segundo ciclo de mutagênese. A sequência nucleotídica do iniciador mutagênico era t

5 GTTGAGGCTCTTTATCTTGTATGT

GGTGAACGTGGTTTCTTCTATACA CCTAAGACATAATAATATAAAGGG

I 3 A seguir â mutagênese, isolou-se o fago mutante 0GD33 que possuía a sequência completa do gene da cadeia B fundida na f extremidade 3 da sequência pre-pro de ST, Isolou-se esta inser ção genética de fusão a partir de J2ÍGD33, como o fragmento BamHi -Hindlll e subclonou-se em pET7 para se obter pARC 0759, Transformou-se a hlperexpressão da E, coli, estirpe BL21-DE3 com pARCO759 e efectuou-se o rastreio dos clones para se efectuar o despiste da presença do plasmídeo. Para se verificar se os danes pARCO75Q e pARCO759 segregavam respectivamente as cadeias A e B, desenvolveram-se procedimentos de acordo com o ensaio ELISA, em que se podiam ensaiar directamente os sobrenadantes da cultura. Descrevem-se, a seguir, as características essenciais do procedimento ELISA;

Adquiriu-se insulina humana na Novo Industries* Encontrava ~se numa forma de elevada pureza, o que foi confirmado por analise CLEP de fase inversa. Reduziu-se quantitativamente uma alíquota desta insulina pura com DTT e carboxiamidou -se utilizando iodoacetamida para formar cadeias A e B estáveis* Levou-se a efeito um ensaio ELISA directo, assim como um ensaio ELISA de inibição para a detecção das cadeias A e B, utilizando um anticorpo lançado contra a insulina humana. Desenvolveram-se separadamente os plasmldeos pARCO750 e pARCO759 no hospedeiro BL-21-DE3, em meio M9 e induziram-se com IPTG, tal como se descreveu nos exemplos anteriores, A seguir a indução centrifuga-ram-se as culturas e examinaram-se os sobrenadantes para se efec tuar o despiste da presença de cadeias A e B, A produção de cadeias A e B, tal como foi calculado, de acordo com o ELISA di-recto, foi de aproximadamente 16 jig/ml e de 30 jig/ml, respecti-vamente. Os estudos de acordo com o ELISA de inibição, também confirmaram a estimativa quantitativa ou o nível de secreção res pectivamente das cadeias A e B.

Devera considerar-se a matéria constantè das reivindi cações, em anexo, como parte da descrição geral da presente invenção .

Claims (29)

1. 24- REIVINDICAÇÕES 1. - Vector, caracterizado pelo facto de ser sus-ceptível de facilitar a secreção de uma proteína heteróloga que se expressa numa célula hospedeira, englobando esse vector o ADN que codifica a sequência pre-pro do gene st da S. coli Μ K K'S ILMIFL SVLSF S PFAQDAKPVE S SKEKI TKESKKCNIAKKSNKSGPESM.
2. 2. - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de conter o segmento BamHl-HindIII da sequência pre-pro do gene st da E. coli/ tal como se definiu na reivin dicação 1. 3.- Vector pARC 0101, caracterizado paio facto de 25 ter ο N2 de Depósito NCIB 40115.
3. 4. - Construção, caracterizado pelo facto de englobar um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações antecedentes, estruturalmente fundido com o ADN que codifica a proteína desejada.
4. 5. - Construção de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o ADN codificar a Angiotensina I.
5. 6. - Construção de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o ADN codificar a cadeia A da insulina.
6. 7. - Construção de acordo com a reivindicação 4, caracterizado·. pelo facto de o ADN codificar a cadeia B da insulina.
7. 8. - Construção pARC 0276, caracterizado pelo facto de conter a sequência pre-pro do gene st da E. coli estruturalmente fundido com a sequência que codifica a Angiotensina I.
8. 9. - Construção pARC 0726, caracterizado pelo facto de conter a sequência pre-pro do gene St da E. coli estruturalmente fundida com a sequência que codifica a cadeia A da insuli na.
9. 10. - Construção pARC 0726, caracterizado pelo facto de conter a sequência pre-pro do gene st da E. coli estruturalmen te fundida com a sequência que codifica a cadeia B da insulina.
10. 11. - Vector ou construção de acordo com uma qualquer das reivindicações antecedentes', caracterizado pelo facto de se encontrar essencialmente em concordância com o anteriormente descrito no que se refere aos dados experimentais.
11. 12. - Hospedeiro "E. coli", caracterizado pelo facto de conter um vector ou uma construção.de acordo com uma qualquer das reivindicações antecedentes.
12. 13. - Processo para a produção de uma proteína hete-róloga. para a E. coli, caracterizado por se desenvolver um hospe deiro E. coli, tal como se definiu na.reivindicação 12, e por se isolar a proteína expressa.
13. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a proteína ser segregada no meio ex-tracelular.
14. 15.- Processo de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo facto de se isolar a Angiotensina I. 27-
15. 16. - Processo de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo facto de se isolar a cadeia A de insulina.
16. 17. - Processo de acordo com as reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo facto de se isolar a cadeia B da insulina.
17. 18. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações 13 a 17, caracterizado. pelo facto de encontrar essencial mente de acordo com. o anteriormente descrito, no que se refere aos dados experimentais.
18. 19. - Processo para facilitar a.secreção a partir de uma célula hospedeira de uma proteína expressa numa célula hospedeira, caracterizado por se fundir sequencialmente o ADN que codifica a proteína que se pretende, expressar, com. uma sequência pre-pro do gene .st de E. coli, tal como definido em uma qualquer das reivindicações de 1 a 11.
19. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se encontrar essencialmente em concordância com o anteriormente descrito no que se refere aos dados experimentais.
20. 21. - Construção pARC 0801, caracterizado pelo facto de conter a sequência completa do gene st da E. coli e conter um sítio EcoRI interno, tendo o referido sítio EcoRI sido criado utilizando um codão alterno para a Ser -55 do péptido ST maduro.
21. 22. - Processo para a formação de uma construção, caracterizado pelo facto de se fundir a sequência pretendida no sítio EcoRI da construção pARC 0801.
22. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de se encontrar essencialmente em concordância com o anteriormente descrito no que se refere aos dados experimentais.
23. 24. - Processo para o desenvolvimento de um vector pa ra a'secreção de proteínas heterõlogas, caracterizado pelo facto de se utilizar a' sequência pre-pro do gene. st de E. coli que codifica para MKKSILMIFLSVLS. FSPFAQDAKPVE SSKEKI TKESKKCN IAKKSNKSGPE. SM.
24. 25, - Processo para a construção de um vector de expressão para proteínas heterõlogas, caracterizado pelo facto de se utilizar o vector pARC 0101, com ο N2 de Depósito NCIB 40115.
25. 26.- Processo para a expressão da Angiontensina 1, -2 caracterizado pelo facto de se utilizar a construção pARC 0726, contendo a sequência pre-pro do gene sr de E. coli, estruturalmente fundida, com a sequência que codifica a Angiotensina I.
26. 27. - Processo para a preparação de uma segunda construção, fundindo uma sequência heteróloga ou homóloga do gene, no sítio EcoRI da construção.pARC 0801, caracterizado pelo facto de se utilizar uma primeira construção pARC 0801, que contém a sequência completa do gene st da E. coli e que contêm um sítio EcoRI interno, tendo o referido sítio EcoRI sido criado utilizando um codão alterno para a Ser 55 do péptido ST maduro, como material de.partida.
27. 28. - Processo para a expressão da cadeia A da insulina, caracterizado pelo facto de se utilizar, a construção pARC'0726, contendo a sequência pre-pro dogene et da E. coli es truturalmente fundida com a sequência que codifica a cadeia A da insulina.
28. 29.- Processo para a expressão da cadeia B da insulina, caracterizado pelo facto de se utilizar a construção pARC 0726 contendo a sequência pre-pro do gene £t da E. coli estruturalmente fundida com a sequência que codifica a cadeia B da insulina. -3
29. 30.- Construção de pARC 0801, caracterizado pelo fac to de ter ο N2 de Depósito NCIMB 40417. O Agente Oficial da Propriedade Industrio!