PT97095A

PT97095A - Metodo de clivagem local de cordao simples de dna

Info

Publication number: PT97095A
Application number: PT97095A
Authority: PT
Inventors: Thomas R Cech; Daniel Herschlag
Original assignee: Univ Colorado Foundation
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-21
Publication date: 1991-11-29
Also published as: EP0521108A4; FI924188A0; IE910925A1; US5180818A; WO1991014699A1; AU645083B2; JPH05505937A; AU7665891A; CA2078680A1; PL167866B1; EP0521108A1; FI924188A

Description

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Refs USBC-Site Speoifio Cleavage (02598/015 m)

Antecedentes da Invenção

Esta invenção foi feita com o apoio de um subsídio do lational Institute of Health (Subsídio n2 GM 28 039)# 0 governo dos Estados Unidos tem direitos sobre a invenção. A invenção refere-se a processo para a divisãc de acido deoxiribonueleieo de cadeia simples (DIA)·

Zaug e Cech, 231 Science 470, 1986, afirmam que certas moléculas ácidas ribonucleicas (RIA), actualmen-te designadas por ribozimas, são capazes de eatalizar a divisão celular e a reunião de moléculas RIA de cadeia simples. Esta actividade parece ser específica dos ribonueleé-tidos, não se observando qualquer reacção com os deoxiribo-nucleotidos. Contudo» uma cadeia de cinco resíduos de deo-xiribocitosina (dG^) é um inibidor competitivo para a divisão celular de uma cadeia de cinco resíduos de citosina (C5).

Cech, 236 Science 1532, 1987, descreve a divisão celular de oligonucleotidos mistos (contendo simultâneí mente ribo- e deoxiribo-nucleotidos), apenas se observando divisão celular entre um deoxiribonucleotido e um ribonu-cleodito. Ião se observa qualquer divisão celular entre dois resíduos de deoziribonucleotido.

Sugimoto et al, 17 lueleie Acids Research,355, 368, 1989, descrevem ume. reacção em que uma molécula RIA circular é aberta através da adição de um dinucleétido,que pode incluir um ou mais deoxinucleétidos. 0 dinucleotido é adicionado à molécula de RIA, e o círculo é aberto para foa mar um fragmento único. ISo se descreve qualquer divisão celular de DIA.

Resumo da Invenção 1 I 63311 Refs USBC-Site Specific Cleavage (02598/015 ΡΪ1)

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 ) 25 30 A invenção refere-se a um processo para divisão celular específica de uma molécula DBA de cadeia simples· 0 processo inclui uma molécula RIA (ou rlbozima) com uma actividade deoxiribonuclease independente de qualquer proteína, contactando aquela molécula RIA com a molécula DIA de cadeia simples por forma a causar a divisão celular da molécula DIA de cadeia simples. leste processo, divide--se uma molécula DIA linear para formar dois ou mais fragmentos DIA, e divide-se uma molécula DIA circular para for*· mar um ou mais fragmentos DIA. Estes fragmentos são libertados do ribozima como moléculas livres. Por "divisão celular específica” entende-se que a molécula RIA se encontra activa numa ou apenas em poucas sequências nucleotido de uma molécula DIA de cadeia simples, lais sequências têm um comprimento entre três e oito deoxinucleotidos, normalmente entre cerca de quatro e seis deoxinucleotidos. A sequência específica que e dividida pode ser escolhida através da alteração de uma porção da localização activa da molécula RIA, um procedimento bem conhecido que é descrito, por exemplo, por Cech et al, deposito de patente PCI W088/04300; Haseloff e Gerlach, 334 latnre 585, 1988; Been e Cech, 47 Cell 207, 1986; e Haseloff efcal·, deposito de patente PCI W089/05852* Uma molécula DIA de cadeia simples inclui qualquer molécula com uma sequência contínua de pelo menos quatro, de preferência oito, deoxinuoleétidos. lais moléculas podem ser ligadas com outras moléculas DIA ou RIA, ou híbridos das mesmas. Em realizações preferidas, o processo inclui uma molécula RIA num meio de reacção a uma concentração suficiente para causar divisão celular de, pelo menos, 1% da população das moléculas DIA numa hora, mais preferencialmente a uma concentração suficiente para causar divisão celular de pelo menos 10% de tais moléculas DIA. 0 meio de reacção incluiu, normalmente, moléculas DIA a qualquer concentração desejada, como, por exemplo, entre O.luM e 1Q/JM, 2- 35 1 5 10) 15

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e é mantido s ata pH entre 6.0 e 9.5, e a uma temperatura entre 202C e 702C. A molécula RIA é geralmente fornecida a uma concentraçSo entre O.^i/M e 100/M* A molécula RIA é, de preferencia, a que divide uma molécula RIA para deixar um grupo hidréxilo-31; mais preferivelmente, a molécula RIA inclui a localizaçSo active de divisSo celular de deoxiribonuclease de uma molécula RIA seleccionada de um grupo I ou grupo II intron (Lambowitz, 56 Oell 323, 1989; Peebles et al., 44 Cell 213, 1986; Van der Veen et al·, 44 Oell 225, 1986; e Jarrel et al·, 263 J. Biol. Chem. 3432, 1988) ou RIase P (Altman, Advances in En-zymology and related areas of Molecular Biology,(Progresso na Enzimologia e éreas relacionadas da Biologia Molecular) 1, 1989), ou derivados dos mesmos. Ainda mais preferencialmente, a molecular RIA é um derivado de uma sequência interveniente (IVS) de Tetrahymena, como, por exemplo, I. ther-mophila. e a molécula RIA é L-19, L-21, ou um derivado das mesmas.

Por "derivado” entende-se qualquer molécula RIA que tem a localizaçSo activa de qualquer ribozima conhecido que possua uma aetividade deoxiribonuelease. Esta localizaçSo activa pode ser alterada por forma a dividir es-pecificamente a desejada sequência DIA de cadela simples. Tal molécula RIA tem apenas que conter aquelas porçbe3 essenciais do ribozima necessárias para a aetividade deoxiri-bonuclease* Tais ribozimas podem ser facilmente concebidos pelos peritos do ramo mediante a utilizaçSo de qualquer das técnicas Standard. loutras realizaçbes preferidas, a fase de contacto inclui ainda i8es de magnésio, fornecendo guanosina, monofosfato guanosina, difosfato guanosina ou trifosfato guanosina, ou outra porçSo contendo guanosina, como, por exemplo, um dinucleotido contendo guanosina; e o tratamente da molécula DIA com um desnaturante, como, por exemplo, glioxilato ou glioxal, antes da fase de contacto; o proces- -3" 63311

Refí TJSBC-Site Specific Cleavage (02598/015 m) so inclui ainda o fornecimento de um cheiator de iões de magnésio, como, por exemplo, EDTA, para impedir outras reao ções da molécula KNA com a molécula DNA·

Ainda em outras realizações preferidas, a molécula UNA inclui uma localizaçSo de ligaçSo para a DNA de cadeia simples, que é complementar de uma localização de divisSo na molécula DNA de cadeia simples; o processo inclui uma pluralidade de moléculas RNA, tendo cada uma uma loealizaçfio de ligaçSo diferente para a DNA de cadeia simples; e inclui, ainda, a separaçSo dos fragmentos DNA divididos através de electroforese no interior de uma matriz de gel·

Esta invençSo proporciona um processo através do qual moléculas DNA de cadeia simples podem ser divididas especifieamente* Tal processo é útil porque permite o levantamento de localizações de divisSo celular específica ot. de sequência de nueleétidos no interior de DNA· Os processos anteriores para determinaçSo de localizações DNA específicas incluem a digestSo de DNA de cadeia dupla com endo-nucleases de restriçõo. Tais endonucleases de restriçõo encontram-se activas em sequências especificas, mas a sua especificidade nSo pode ser alterada rapidamente· Além disso, sabe-se que hé várias sequências DNA que nenhuma endonuclee se de restriçSo divide. Em contrapartida, os ribozimas podem ser rápidamente alterados ou sintetizados para dividir qualquer sequência DNA de cadeia simples desejada, podendo assim ser usados para caracterizar moléculas DNA com poucas limitações nas localizações que sSo reconhecidas·

Apesar deste processo estar limitado à divisBc de DNA de cadeia, pode usar-se, no processo, DNA de cadeia dupla, desde que seja primeiro desnaturado para formar DNA de cadeia simples· Este método é extremamente útil in vitrc para levantamento genoma de humanos e de outros organismos. Além disso, os ribozimas podem ser usados in vivo, para dividir DNA de cadeia simples. Por exemplo, os ribozimas com -4- 1 1

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Refs USBC-Site Specific Cleavage (02598/015 PI1) 5 10 } 15 elevada actividade para divisão de DHA de cadeia simples podem ser utilizados para dividir vírus DM de cadeia simples e, desta forma, reduzir a sua infeociosidade e qualquer sintoma de doença que eles causem. Outras características e vantagens da invençãc tornar-se-ão claras a partir da descrição seguinte de realizações preferidas da mesma, e a partir das reivindicações Descrição das Realizações Preferidas Em primeiro lugar, descrever-se-ão, sumaria-mente, os desenhos. Ilustrações

Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 20 A Figura 1 é uma representação em diagrama da reacção deoxiribonuelease proposta de um ribozima; As Figuras 2 e 3 são imagens de geis poliacri-lamida demonstrando a actividade deoxiribonuelease de um ribozima (na Figura 2, as linhas são referidas, no sentido descendente, como linhas 1-8, começando a partir do lado esquerdo); e A Figura 4 é uma representação grafiea do curso de tempo para a reacção de um ribozima com unj/sabatraoto DM de cadeia simples.

Ribozimaa 25 30

Gomo acima se referiu, qualquer ribozima com actividade deoxiribonuelease pode ser usado neste invento. Em geral, os ribozimas úteis são aqueles que dividem uma molécula EM de modo a deixar um grupo hidróxilo-3*, ou um fosfato 3*# e não um fosfato cíclico 2*, 3*· Estes ribozimas podem ser isolados, e modificados de modo a fornecer derivados, tal como é descrito por Cech et al. PCI, supra: Lambowitz, supra. e Van der Veen, supra. Qualquer um do grupo vasto de derivados de ribozimas que ocorrem naturalmente é útil nesta invenção, podendo ser rapidamente isolados pelos peritos do ramo. Por exemplo, tal como I descrito por Cech et al·, PCI, supra, o ribozima de letrahymena thermophilla pode ser rapidamente modificado por forma a -5 10 16

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que a sua localização activa seja activa na dâvisão de moléculas EUA de diferente sequência RHA# Da mesma forma, este ribozima pode ser alterado para dividir moléculas DEA com diferente sequencia DEA· Tais alterações podem ser levadas a cabo por mutagénese de direcção localizada, ou por qualquer processo equivalente (ver, por exemplo, Murphy e Cech, Proc. Eat# Acad. Sei. BUA, 1990). Eormalmente, a localização activa é concebida de modo a ter uma sequência baj-se complementar à sequência base a ser dividida; isto é, pel— lo meios 3 das 4 bases são posicionadas para formar pares base; por exemplo, A é complementar de, e sera par base corr T ou U, e G é complementar de, e sera par base com C ou U (em que A, T, U, CeG são os sfmbolos Standard de adenina, timina, uracil, citosina e guanina, respectivamente). Além disso, a supressão ou adição de varias porções de ribozima, ou mutação por outros meios, podem ser usadas para criar rij-bozimas mais pequenos ou maiores que retêm, e devem também aumentar, a sua actividade deoxiribonuclease. Tais alterações são do conhecimento dos peritos do ramo, não sendo necessária qualquer experimentação para determinar quais destes ribozimas são activos# Tais ribozimas precisam apenas de ser criados e testados num protocolo de divisão DEA, tal como, por exemplo, o adiante descrito, para determinar se possuem ou não actividade deoxiribonuclease suficiente para serem úteis nesta invenção# Bm geral, os ribozimas úteis nesta invenção são aqueles que podem ser fornecidos a uma concentração nun meio de reacção suficiente para fazer que, pelo menos, 1# de preferência 10$ ou mais, de uma população de moléculas DEA seja dividida em uma hora, sob as condições adiante dei critas· A razão da concentração de ribozima para com a concentração de DEA pode ser variada, dependendo do ribozima e do DEA, e pode situar-se em qualquer razão desejada, sendo geralmente, entre 1:106 e 1000:1, de preferência entre 1:1C e 1000:1# Quanto mais elevada for a razão de ribozima para 35 I 10 15

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DBA, mais rápida será a reacção. As razões mais elevadas, contudo, desperdiçam ribozima e não precisam de ser utilizadas· E importante que o ribozima usado sega concebido de tal forma que o substracto DIA de cadeia simples se;ja dividido em um, dois ou mais fragmentos, que são libertados do ribozima. lambem á importante que o ribozima não se^a alterado pelo processo, de modo a que possa reciclar e dividir moléculas DITA adicionais. Para uso in vivo, á aconselhável ter ribozimas que tem actividade deoxiribonuclease mais elevada sob as condições predominantes in vivo. Para este fim, sSo aconselháveis os ribozimas que tem actividade para dividir, pelo menos, 10$ de uma população de moléculas DIA, no prazo de uma hora, a 379C. Embora se descreva acima a alteração de uma versão sintética de um RIA que ocorre naturalmente em letral- hvmena thermoohila este exemplo não e limitativo da inven ção uma vez que os peritos do ramo podem facilmente alterai outros ribozimas do grupo I ou grupo II ou RIase P para conseguir ribozimas úteis nesta invenção. Seguem-se exemplos do uso de ribozimas in vi-tro para divisão de DIA de cadeia simples. Estes exemplos não são limitativos da invenção, sendo, apenas, apresentados para ilustrar a invenção, e os peritos do ramo fácilmente reconhecerão que a invenção pode ser praticada como em termos amplos se reivindica seguidamente. Relativamente à Figura 1, os requerentes da patente propõem um modelo geral para a divisão de DIA de caldeia simples através de um ribozima. Este modelo destina-se apenas a ilustrar a explicação reacção, apresentada na presente memória descritiva, não se destinando a ser limitativa da invenção. Este exemplo diz especificamente respeito s actividade deoxiribonuclease da versão RIA sintética de um RIA em ribozima letrahvmena thermoohila; esta versão sintética é um ribozima. Ia Figura 1, apresenta-se a reacção dec- 7' 35 10 15

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xiribonuclease do ribozima Soai L-21 (i z.aug et al., 27 Bioc 8924, 1988) com um substracto 18 DIA (deoxi-OOCUOUA^)· Todas as fases sSo reversíveis. A ligaçSo de guanosina (G) ar terior ao substraoto 18 oligonucleéfido é mostrada, para simplificar; as duas localizações de ligaçSo (substraoto e localizações de ligaçSo G) sSo essencialmente independenteis pelo que pode dar-se qualquer ordem de adiçSo. A sequencia 5* do ribozima (sombreado, GGGAGG-5*), chamada localização de ligaçSo exon 5* 12, é responsável pelo reconhecimento dc substraoto através de emparelhamento base. De novo em relaçSo à Figura 1, propõe-se que 0 ribozima 10 tenha uma localizaçSo de ligaçSo substracto 12 e uma localizaçSo de ligaçSo guanosina 14* Um resíduo guanosina (G) liga até à localizaçSo 14* A localizaçSo acti va 12 do ribozima interage entSo com um substracto 18 para formar a estrutura mostrada como 20. 0 ribozima 10 na estrutura 20 provoca a divisSo celular do substracto 18 por forma a libertar uma cadeia A^ deoxi tendo 0 resíduo guanosina anexo (GdA^), e 0 resto do substracto (dCCCUCU0g), para reformar 0 ribozima 10. Desta forma, 0 ribozima 10 actue de uma forma catalítica, uma vez que é capaz de actuar sobre qualquer número de substractos para causar divisSo celular de cada substracto e subsequente libertaçSo dos fragmentos resultantes da divisSo celular. L-21 Soai de T. thermophilla Io que diz respeito à Figura 2, mostram-se os resultados da reacçõo de divisSo celular deoxinucleotida de um substracto oligonucleótido DIA catalizado pelo ribozima L-21 Scali 0 ribozima formou-se de acordo com o processo Standard ( Zaug et al·, 27 Bioc. 8924, 1988). 0 substracto, deoxiCCCUCUA,j, foi fornecido a uma concentraçSo de, aproximadamente, 2 nanomolar, e classificado no seu ex- ap tremo - 5* com ·* p. Foi sintetizado num sintetizador de Biq— ciências Aplicadas DIA. Este substracto foi incubado a uma concentraçSo de 2 nanomolar, com um ribozima L-21 Seal de -8- 35 1 5 10 15

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1 mieromolar (id·) durante 15 horas, a 502G, na presença de 800 mieromolar G, 50 miliomolar MBS (polidor), pH 7*0 e 10 miliomolar MgClg (linha 4)· A mesma reacção foi levada a cabo sem G (linha 5), com 800 mieromolar ATT substituindo o G (linha 6), sem MgClg (linha 7), e sem ribozima (linha 8)· A linha 2 mostra o substraeto sozinho, e a linha 3 mostra o produto putativo, deoxi ^2p-CCCUCIJ. A linha 1 mostra os produtos da digestão do substraeto por 0.2 unidades por mierolitro nuòlease PI num milimolar íris, pH 7*5, 2 miliomolar de cloreto de zinco, 0.1 miliomolar de EDTA, e 0.1 micrograma por mierolitro tRM, durante 6o minutos, a 3720. As reacçbes ribozima foram iniciadas por adição do substraeto DM após uma pré-incubação de 10 minutos do ribozima, polidor e MgGl2, a 502C. As reacções foram reprimidas com EDPA e ureia, a 020, e s ujeitas a electrofore--se no gel poliacrilamida dssnaturante a 20^, tal como é descrito por Zaug et al., id.. 0 substraeto DM foi dividido especificamente na mesma posição que o substraeto analogo RRA para este ribozima· Porma-se um produto classificado simples a partir desse substraeto DM. Este produto comigra com deoxi ^2p--CGGUCU (linha 3) e com o produto apropriado da digestão nuclease PI do substraeto DM (linha 1). Mg e necessário (linha 7). AIP (trifosfato adenosina) não pode substituir G (linha 6) e GEP (trifosfato guanosina) pode substituir G (não representado) sendo cada um também uma propriedade da reacção com substractos RM. Porma-se urna pequena quantidade de produto na falta de adição de G (linhas 5 e 6, vistas em exposições mais longas). Isto é semelhante à hidrólise lenta dos substractos RM que ocorrem na ausência de Λ OO G. Experiências similares com deoxi-"' p-GCCUGUA proporcionam, também, uma divisão específica entre U e A, dependendo da presença do ribozima. Relativamente a Pigura 3, demonstrou-se, uti- -9- 35 1 5 10 15

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lizando o substracto DMA que foi classificado na extremidade 3*, que o cofactor quanosina era c ova lent emente adicionado ao fragmento de produto - 3*· Incubou-se deoxi-CCCUC UAjj p-3*da (2nM, produzido por reacçSo de deoxy-CCCUCUA^ com !>-3V] 3*dATP na presença de transferase terminal) durante quatro horas com 4/UM L-21 Seal ribozima, 50 mM MES, pH 7·0, e 10 ou 100 mM MgClg. Reprimiu-se um alíquota com EDTA e ureia (mostrado com w-tt na Pigura 3)* e tratou--se o outro com 0.05 U///1 ribonuclease Tl, durante uma hora, a 3720 (mostrado com ,l+n na Pigura 3)· As linhas 3 e 4 mostram a reacçSo com 1 mM G e 10 mM MgOlgi as linhas 5 e 6 mostram a reacçSo com 1/iM G e 100 mM MgCl2; as linhas 11 e 12 mostram a reacçSo com 1 mM GTP e 100 mM MgCl2 (a reacçSo é mais rapida com concentrações MgCl2 mais elevadas); as linhas 7 e 8 sSo de incubaçSo com 1 mM GTP e 100 mM MgCl2, na ausência de ribozima; as linhas 1 e 10 mostram substractos sozinhos; e as linhas 2 e 9 mostram deoxi--A5 32P-3*dA (M). 0 produto de reacçSo de deoxi-CCCUCUA5P32 P-3*dA com GTP (linha 11) migrou mais rapidamente num gel poliacrilamida do que o produto de reacçSo com G (linhas 3 e 5, em condições conforme acima descrito; nSo se observou qualquer produto sem um cofactor guanosina, sem MgCl2 ou sem ribozima). Os produtos das reaeções ribozima com GTP e com G (linhas 4» 6 e 12) comigraram, seguindo um tratamento através de ribonuclease Tl, que divide celularmente resíduos (ribo) - guanosina que têm grupos fosforil-3’. 0 novo produto formado a partir do tratamento Tl comigrou com jiQdA^32P3,dAgIi (linhas 2 e 9), tal como se esperava a partir do mecanismo esquematizado na Pigura 1· A reacçSo endonuclease DHA e catalitica. Por exemplo, a mistura de reacçSo com 25/UM de substracto ΏΜ (deoxi-CCCUCUAj.) e um traÇo (cerca de InM) de substracto classificado na extremidade - 5* foi incubada com 0.55//M ribozima e 800/tM G, durante 20 horas. Cinco por cento do DMA classificado foi convertido em produto, o que corres- -10- 1 5 10

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 ) 25 30 63311 Ref: USBC-Site Specific Cleavage (02598/015 EDI) ponde a maia de 2 reviravoltas· Relativamente à Figura 4» moatra-ae um curso de tempo para a formação de produto (deoxi^2P-CCCUCU) a partir de deoxi "^P-CCCUCUA^ (2nM) com 1,1 micromolar ribozima, 800 micromolar G, 50 miliomolar SSES, pH 7 e 10 miliomo-lar MgGlg* a 5020· As reacções foram reprimidas, os produtos separados por electroforese de gel desnaturante, e quai.-tifiçados com um escanção radionalítico AMBIS* Tal como se pode ver no gráfico, aproximadamente 1% do produto é libertado em cada 30-50 minutos, sob estas condições· Os substractos DITA têm uma afinidade mais baixa e uma taxa mais lenta de reacção do que os substractos RUA correspondentes com um ribozima. 0 alongamento da sequência de guia interna aumentará a ligação, e pode aumentar a taxa de reacção endonuclease DITA· Utilizações

Tal como acima se referiu, o processo deste invenção é útil na determinação da localização de sequêncií DIA específicas numa molécula DIA com cadeia simples· Tal s análise e análoga ao levantamento endonuclease de restrição, usando proteínas endonuclease de restrição e DIA de cadeia dupla. Em geral, o DIA de cadeia dupla e desnaturado e as moléculas DIA de cadeia simples resultantes da desnaturação são postas em contacto com um ribozima sob condições apropriadas (por exemplo, as acima descritas) para produzir um, dois ou mais fragmentos DIA de cadeia simples que podem ser então separados numa matriz de gel. 0 tamanho dos fragmentos resultantes reflecte a posição da localização D3JA específica na molécula DITA de cadeia simples. Os alíquotas separados de DITA podem ser trata** dos com diferentes ribozimas, de modo que se pode determinar a localização de diferentes localizações de divisão celular* Em algumas experiências pode ser útil contactar o DIA com dois ou mais ribozimasj ou o DIA pode ser contacta-* do com um ribozima e, após remoção do primeiro ribozima. -11- 35

Claims

1 1 5 10 15 Mod. 71 - 20.000 ex. 20 25 30

63311 Refs USBC-Site Specific Cleavage ( 02598/015 PT1) contactado com um segundo ribozima· 0 processo desta invenção pode ser usado in vivo através de contacto de DIA de cadeia simples, no interior de uma célula ou num meio rodeando a célula, com um ribozima que se^a activo sob condições in vivo» Como alternativa, o ribozima pode ser sintetizado in vivo pela transferencia de uma molécula DIA para uma célula, por forma a causar expressão daquela molécula DMA para produzir o ribozima desejado in vivo. Esse ribozima pode então ser activo para dividir qualquer DIA de cadeia simples no interior da célula· Outras realizações integram-se nas reivindicações seguintes· REIVINDICAÇÕES lã.-Método específico de clivagem de uma molécula de DIA de cordão simples caracterizado por: a) se proporcionar nma molécula de RIA que possui uma actividade de desoxiribonuelease independente de qualquer proteína e b) se fazer contactar a referida molécula de RIA com a molécula de DIA de cordão simples para provocar a clivagem de molécula de DIA de cordão simples· 2§*-Método de aeorcb com a reivindicação 1 caracterizado por se proporcionar a molécula de RIA num meio de reaeção numa concentração suficiente para provocar a clivagem pelo menos 1$ de numa população de moléculas de DIA numa hora· 3§«-Método de acordo com a reivindicação 1, cs racterizado por se proporcionar a referida molécula de RIA num meio de reacçSo numa concentração suficiente para provocar a clivagem de pelo menos 105¾ de uma população das moléculas de DIA numa hora· 4§.-Método de acordo com a reivindicação 1 ca -12’ 35 1 5 10 > 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 63311 Refs USBC-Site Specific Gleavage

'S. / racterizado por se seleocionar a molécula de RUA de entre as que clivam uma molécula de RITA para libertar um grupo 3 *-hidroxilo· 51«-Método de acordo com a reivindicaçSo 4 ca-racterizado por a molécula de MA compreender o local aeti-vo de clivagem de desoxiribonuclease de uma molécula escolhida de entre um intrão do grupo I ou grupo II ou Rlíase P ou derivados correspondentes· 6§.-Método de acordo com a reivindicaçSo 4 ca-racterizado por a molécula de RUA ser um derivado de uma sequencia intermediária de letrahymena· 7i«-Método de acordo com a reivindicaçSo 5 ea-racterizado por a molécula de RUA ser L-19» L-21 ou um derivado correspondente· 8§«-Método de acordo com a reivindicaçSo 1 ca-racterizado por se proporcionar também iões Mg « 9§.-Método de acordo com a reivindicaçSo 1 ca-racterizado por se proporcionar também guanosina ou trifos-fato de guanosina. 101.-Método de acordo com a reivindicaçSo 8 caracterizado por se proporcionar um agente de quetaçSo dos iões líg®* para parar a reacçSo adicional da molécula de RNi com a molécula de MA· 11§«-Método de acordo com a reivindicaçSo 10 caracterizado por o agente de quelaçSo ser o ácido etileno--diamino-tetracético (EDTA)· 12§.-Método de acordo com a reivindicaçSo 1 caracterizado por a molécula de RNA compreender um local d« ligaçSo para MA de cordSo simples cujo local de ligaçSo é complementar para nucleotidos adjacentes a um local de clivagem na molécula de MA de cordSo simples· 13ã*-Método de acordo com a reivindicaçSo 12 caracterizado por se proporcionar uma pluralidade de moléculas de RNA que possuem diferentes locais de ligaçSo para MA de cordSo simples· -13- 35 1 63311 Ref: USBC-Site Speoific Cleavage (02598/015 PT1) 14ã*-Metodo de acordo com a reivindicação 12 caraeterizado por se separar os dois ou mais fragmentos por electroforese dentro de gel* Lisboa, 5 Por IHS URIVERSIIY OF COLORADO FOUUDATIOR IRC#, 0 AGEETE OFICIAL 10

MíCO MMtQSES Itf* Agente Oflc)·! 4$ Propriedade Industriei QMórit-Arc* da Coocelçi·, 3, L·*!!·9 UMBfc Mo<J. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 I 25 30 -14- 35