PT95669A

PT95669A - Processo para reduzir a incidencia de respostas positivas falsas em ensaios imunologicos utilizando imunoglobulina polimerizada

Info

Publication number: PT95669A
Application number: PT9566990A
Authority: PT
Inventors: Eileen G Gorman; David Ta-Chih Hua; Richard Lee Tyson; Deborah K Vickery; Chi-Chin Wang
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1989-10-24
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 1991-09-13
Also published as: IE903795A1; WO1991006559A1; AU6710790A

Description

E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY " PROCESSO PARA REDUZIR A INCIDÊNCIA DE RESPOSTAS POSITIVAS FALSAS EM ENSAIOS IMUNOLÓGICOS UTILIZANDO IMUNOGLOBULINA POLIMERIZADA "

ÂMBITO TÉCNICO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para reduzir as falsas respostas positivas em ensaios imunológicos en-zimáticos, mais especificamente a um método para utilização de imunoglobulina polimerizada para remover falsas respostas positivas em ensaios imunológicos.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Os ensaios imunométricos têm sido amplamente utilizados na detecção de antigénios que possuem epitopes múltiplos. Habitualmente este tipo de ensaio envolve a utilização de pelo menos dois anticorpos, sendo um anticorpo de captura imobilizado num suporte sólido e um anticorpo detector conjugado com um marcador. Um dos marcadores mais utilizados consiste num enzima, embora se encontrem disponíveis outros marcadores colorométricos, radioactivos, fluorescentes ou quimiluminiscentes.

Um marcador enzimático oferece uma sensibilidade elevada, é facilmente adquirível e estável em comparação com um marcador radioactivo. No entanto, devido ao facto de o enzima -2- ser uma grande proteína, contribui para que as interacções proteína-proteína não específica induzam falsas respostas positivas, também designadas por respostas não específicas. Uma falsa resposta positiva significa uma resposta que não se encontra es-pecificamente associada com a ligação do anticorpo de captura ou do anticorpo detector com o antigénio de interesse. Embora o problema de falsas respostas positivas seja menos frequente nos ensaios radio-imunologicos competitivos ou nos ensaios imu-norradiométricos, manifesta-se nos ensaios de elevada sensibilidade que necessitam de uma amostra de grandes dimensões e de um longo período de incubação [Hunter e outros, Lancet, Vol.ii, 1136, 1980]. Deste modo, continua a constituir um problema universal a ser resolvido.

Pode observar-se uma falsa resposta positiva nos ensaios para muitos tipos diferentes de parâmetros clínicos quer de natureza quantitativa quer de natureza qualitativa, incluindo, por exemplo, hormonas de péptidos naturais, tais como hCG, LH, somatotropina, FSH, ACTH, LPH, prolactina, MSH, beta-endor-finas, encefalinas, vasopressina, oxitocina e similares. Para além disso, podem observar-se falsos resultados positivos na determinação de marcadores que são indicadores de malignidade tais como o antigénio carcinoembriónico (ACE), a proteína alfa--fetal, o antigénio prostático específico, os antigénios cancerígenos ca 19-9, ca 125, ca 15-3, a beta-2-microglobulina, a ferritina, a fosfatase ácida prostática e similares. Também se encontram sujeitos a falsos resultados positivos os ensaios para indicadores específicos de doenças microbianas ou víricas. Estes -3- ι indicadores são o antigenio de superfície da hepatite B, o an-tigenio do núcleo da hepatite B, o anticorpo para o antigenio do núcleo da hepatite B, o anticorpo para HIV, o antigenio p17, 0 antigenio p24, o antigenio HTLV-1 e HTLV-2 e os indicadores peptídicos específicos de infecção com HTLV-1 e HTLV-2, indicadores para as hepatites A, C, D e E.

Uma forma de interacção não específica engloba o fac-tor reumatoide IgM (FR). Os métodos para a eliminação da interferência de FR utilizando IgG agregada não específica são bem conhecidos na especialidade. Também se sabe que quando a IgG se encontra agregada tem maior reactividade com o FR em comparação com a IgG monomérica não modificada [Oreskes e outros, Immuno-logy, Vol. 51, 115-121, 1984 e Dissanayake e outros, Immunolo-gy, Vol. 32, 309-318, 1977]· De facto Hallgren, patente de invenção norte-americana 4 184 847 e patente de invenção norte--americana 4 153 417 refere-se a um método para a detecção de FR utilizando IgG agregada marcada. A maioria dos métodos para a eliminação da interferência de FR engloba um processo de tratamento prévio da amostra. Sakai e outros, na patente de invenção norte-americana 4 680 274 emitida em 14 de Julho de 1987, refere-se à utilização de partículas ultrafinas inferiores a 0,2 micra de tamanho, possuindo imunoglobulinas imobilizadas no seu interior para absorver os factores não específicos da amostra. Vejtorp, J. Virol. Methods, Vol. 1, 1-10, 1980 descreve a utilização de partículas de late revestidas com IgG humana agregada como um meio para a eliminação de FR das amostras num ensaio com um anticorpo IgM da rubêo- la com base num ensaio ELISA. Forghani e outros; "J.Clin. Mi-crobiol.,,5 Vol. 18, p. 652-657, 1983 também descrevem um método de tratamento prévio da amostra utilizando IgG humana f polimerizada. Neste caso, a amostra e previamente tratada com IgG humana agregada a glutaraldeído, seguida de centrifugação para se eliminar o agente de interferência. Nestas referências não se explica nem se sugere a utilização de imunoglobulina polimerizada da mesma espécie animal dos anticorpos de captura ou detectores em diluente de amostra ou diluente conjugado.

Briantais e outros, J. Virol. Methods, Vol. 9, 15-26, 1984, descreve a utilização de um anticorpo marcado radioactiva-mente (Fab')2 para ultrapassar a interferência de FR nos ansaios com IgH no núcleo da hepatite B e da rubéola. Nos seus testes com IgM humana descrevem a ligação específica de IgG de um modo não específico com o anticorpo IgG imobilizado. Diz-se que este tipo de interferência só é reduzido pela adição ao meio de diluição de IgG humana não específica ou de soro de feto de vitela (SFV). Os inventores utilizaram IgG não modificada para reduzir a interacção IgG-IgG num ensaio de captura de IgM. A utilização vantajosa de imunoglobulina polimerizada como meio de ensaio não é reconhecida.

Gerlich e outros, J. Med. Virol. Vol. 4, 227-238, 1979, descrevem a utilização de IgG humana agregada pelo calor e em excesso num diluente de amostra para se eliminar as falsas respostas positivas no ensaio com o anticorpo IgM o núcleo da hepatite B. Vejtorp, Acta Path. Microbiol. Scan., B, Vol. 89, 123-128, 1981, também descreve a adição ao diluente do soro de

IgG humana agregada pelo calor para eliminar a interferência de FR no ensaio de IgM de rubéola. Estes são os métodos para se reduzir a interferência de FR apenas aplicáveis em ensaios com IgM. A presente invenção é útil em ensaios imunológicos nos quais o material a analisar e que se reveste de interesse pode ser constituído por marcadores víricos, hormonas ou marcadores de tumores, quando se ensaiam amostars FR-positivas ou FR-negativas. , . ^ - .. -

Levinson e outros, Clin. Immunol. Letter, Vol. 9, 101-116, 1988 propuseram recentemente um mecanismo para falsas respostas positivas em dois ensaios imunológicos de sítio. Isto envolve imunoglobulinas endógenas (anticorpos heterofíli-cos) numa amostra que possua uma larga especificidade contra anticorpos animais. Estes anticorpos heterofílicos são capazes de formar pontes entre os anticorpos de captura e os anticorpos detectores na ausência de um antigénio produzindo uma resposta não específica. A eliminação deste tipo de interferência torna necessário quer um tratamento prévio da amostra com imunoglobulinas de diferentes espécies quer a adição destas imuno * globulinas ao meio de ensaio.

Utiliza-se habitualmente a adição de imunoglobulinas não específicas das mesmas espécies como um anticorpo específi co para o antigénio utilizado para bloquear a ligação não espe cífica originada pelos anticorpos heterofílicos. Por exemplo, a adição de um anticorpo monoclonal não específico de murino que pertence à mesma sub-classe dos anticorpos monoclonais es -6- / pecíficos reduz as interacções não específicas num ensaio intercalado em que se utilizam anticorpos monoclonais de murino. [Fukuyama e outros, JP Application, 63-12, 960, published January 20, 1988]. R. C. McCarthy e outros, Arch. Pathol. Lab. Med.,

Vol. 112, pp. 901-907, 1988, descrevem a natureza do ” anticorpo heterofílico" como a primeira IgM humana que possui reacti-vidade para a IgG do rato. São capazes de inibir este tipo de interferência, mediante a adição de um excesso de IgG de rato não modificada numa amostra (concentração final de IgG: 1,3 mg/ ml). Também referem que se pode reduzir as falsas respostas positivas, mas não se podiam eliminar completamente, utilizando Fab’ ou (Fab’)2 de IgG como o anticorpo detector. Na presente invenção, utiliza-se IgG polimerizada numa escala de peso molecular definida nos meios de ensaio, que é muito mais eficaz na eliminação das falsas respostas positivas.

Os métodos anteriormente referidos não resolvem todos cs problemas de falsas respostas positivas. Por exemplo, observa-se muitas vezes quando se faz a comparação com o ensaio imu-no-enzimático (EIE) e com o imuno-radio ensaio (IRE) que os valores de EIE em determinadas amostras são sempre superiores aos valores de IRE. Para além disso, devido à natireza complexa das interacções proteína-proteína que se encontram envolvidas, a incidência de falsas respostas positivas encontra-se altamente dependente da configuração do ensaio. Por exemplo, num ensaio intercalado em que se incuba uma amostra com o anticorpo de captura num suporte sólido lavada para se eliminar todos os componentes -7- ·«* indesejáveis e depois incubada cora o anticorpo detector, este ensaio está menos sujeito a interacções não específicas. A presente invenção proporciona um método útil para reduzir as interacções não específicas em imuno-ensaios em que o anticorpo de captura e o anticorpo detector são derivados da mesma espécie animal ou de espécies animais diferentes. Este método é útil indiferentemente das falsas amostras positivas serem FR-positivas ou FR-negativas. Pode utilizar-se este método quer com a totalidade do anticorpo quer com um fragmento (Fab*)2.

SUMARIO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção proporciona um processo para reduzir as falsas respostas positivas em um ensaio imunológico para a detecção de um antigénio que se caracteriza por: a) formar uma imunoglobulina polimerizada por aquecimento ou quimicamente que não reaja específicamente com o referido antigénio, b) tratar uma amostra que se suspeita conter o referido antigénio com a referida imunoglobulina polimerizada, e c) submeter a amostra tratada a um ensaio imunológico em que se utilizam anticorpos da mesma espécie animal da imunoglobulina polimérica.

EXEMPLO I: SÍNTESE DE IMUNOGLUBULINA POLIMÉRICA (POLI-IG)

Pode originar-se a Ig polimérica por aquecimento tal como se descreveu nas referências anteriormente mencionadas nos antecedentes da técnica. De um modo alternativo, pode ser sintetizada em condições químicas definidas conforme se segue. Em todos os casos optimizaram-se os procedimentos tendo sempre em vista a manutenção da solubilidade de Foli-Ig em solução tampão aquosa. 1.1 Reacção com Anidrido S-Acetilmercaptossuccínico (SAMSA) e N,N-1,4-Fenilenodimaleimida (PPM);

Introduziram-se grupos sulfidrilo numa IgG monoclonal por tratamento com SAMSA 50 molar em excesso em tampão fosfato, pH 7,0. Clivou-se o grupo protector do enxofre com hidroxilami-na e obteve-se a fracção proteica por cromatografia numa coluna Sefadex G-25 eluindo com fosfato tampão, pH 6,5.

Tratou-se a IgG tiolada com PDM 20 molar em excesso e deixou-se em agitação a mistura reaccional à temperatura ambiente. Monitorizou-se o processo da polimerização por análise CLEP numa coluna (9,4 X 250 mm) Zorbax (R) Bio Series GF-250. Quando o rendimento do polímero de IgG de dimensões óptimas atinge o máximo arrefece-se a mistura reaccional com 2-mercap-toetilamina ou fracciona-se directamente por CLEP preparatória numa coluna (21,1 X 250 mm) Zorbax (R) Bio Series GF-250XL. 1.2 Reacção com suberato de dlssuccinimidilo (DSS):

Fez-se reagir o anticorpo monoclonal de IgG.purificado (sub-classe IgG1) a uma concentração de aproximadamente 5 mg/ml, com DSS num excesso molar de 12 a 25 vezes em relacção ao do anticorpo. Agitou-se a mistura magneticamente durante 2 horas.

Adicionou-se uma solução de azida de sódio à mistura reaccional no sentido de se atingir uma concentração final de azida de sódio de 0,1%. Após agitação durante 0,5 horas, trans-feriu-se a mistura para o recipiente de diálise e dializou-se contra uma solução tampão contendo Tris 0,1 M, cloreto de sódio 0,15 M e azida a 0,1%, durante 24 horas. 1.3 Reacção com glutaraldeido:

Fez-se reagir uma solução de IgG monoclonal numa concentração compreendida entre 4 e 10 mg/ml com uma solução 0,005$ a 0,03$ de glutaraldeido entre 20° è 24°C num período compreendido entre 16 e 24 horas.

As condições preferenciais consistem em IgG a 5 mg/ml reagindo com glutaraldeido a 0,02$ a 22°C durante 20 horas.

Dializou-se a solução durante a noite contra uma solução salina de fosfato tampão. 1.4 Distribuição do Peso Molecular:

Analisaram-se as preparações de IgG polimerizada por cromatografia de peneiro molecular. Fraccionou-se a solução do polímero em uma coluna de vidro ( com aproximadamente 2,5 cm de diâmetro e 85 cm de altura) cheia com um gel tal como Sefacril S300 (Pharmácia Co.) e equilibrada com uma solução salina de fosfato tampão 0,1 M, a pH 7,4· -10-

Para além da IgG monomérica, obtiveram-se quatro reac-ções poliméricas principais. Por comparação com marcadores normalizados de peso molecular calcu!feram-se os pesos moleculares médios das quatro fracções em 1 500 000 a 2 000 000; 1 000 000; 700 000 e 400 000 Daltons. Estes valores traduzem polímeros de 10-15, 6-8, 4-6, 3-4, moléculas de IgG respectivamente. Todas as fracções eram solúveis em tampão aquoso, tal como uma solução salina, de fosfato tampão. A Poli-Ig preparada de acordo com os diversos procedimentos anteriormente descritos possui proporções um pouco diferentes para as quatro fracções. No entanto, a eficácia na redução das falsas respostas positivas não pode ser diferenciada. A preparação preferencial de Poli-Ig consiste por isso em 3 a 15 moléculas de IgG. EXEMPLO II; UTILIZAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA POLIMERIZADA N0 ENSAIO IMUNOLÚGICO ΈΝΖΙ-MÁTICO PARA 0 ANTIGÉNIO HUMANO (ENSAIO HBSAG)

Utilizou-se um ensaio imuno-enzimático para o antigé-nio de superfície da hepatite B humana para se demonstrar a eficácia de Poli-Ig na redução da incidência de falsas respostas positivas. Os passos do ensaio descrevem-se do seguinte modo: II.1 FORMATAÇÃO LEVADA A EFEITO EM DUAS FASES: 1. Captura do Antigénio:

Num tubo de ensaio de plástico, incubou-se, em primei- -11- -11-

Λ»* ro lugar, uma amostra de soro (200 jul) com partículas de dió-xido de crómio (100-200 ug), que se encontravam revestidas com anticorpos monoclonais de anti-HBsAg (sub-classe IgG1) e uma amostra de diluente (100 μΐ) contendo citrato de sódio 0,1 M e cloreto de sódio 0,15 M. Deixou-se prosseguir a incubação durante 30 minutos num bloco de aquecimento a 37°C. 2. Lavagem:

Adicionou-se à mistura reaccional uma solução de lavagem contendo Tris 0,1 Me cloreto de sódio 0,15 M, a pH 7,8.

Após ter-se misturado a amálgama em vortex, colocou-se o tubo de ensaio num suporte equipado com pequenos cilindros magnéticos situados de ambos os lados do tubo. As partículas de dió-xido de crómio eram atraídas para as paredes laterais do tubo. Eliminou-se então a solução de lavagem por sucção. Repetiram--se mais duas vezes os passos de lavagem, separação de partículas e aspiração. 3. Marcação do Enzima:

Adicionou-se às partículas lavadas uma solução (50-250 μΐ) contendo um anticorpo monoclonal de anti-HBsAg cova-lentemente conjugado ou o seu fragmento (Fab’)2, sub-classe IgG1) e fosfatase alcalina de intestino de vitela, albumina de soro de bovino a 5$ e Tris 0,1 M, a pH 7,8. Deixou-se á mistura em incubação a 37°0 durante 30 minutos. 4. Lavagem:

Repetiram-se as fases de lavagem tal como se descreveu na fase (2).

5. Reacção do Substracto e Medição;

Adicionou-se às partículas de dióxido de crómio lavadas uma solução dê substrato (240 μΐ) contendo fosfato de 4-metilumbeliferilo em dietilenoamina, a pH 8,9· 0 substrato reagiu com a fosfatase alcalina originando 4-metilumbelifero-na fluorescente. Deixou-se prosseguir a reacção durante precisamente 5 minutos altura em que se adicionou uma solução de EDTA 0,5 M para se pôr termo à reacção.

Separaram-se as partículas da solução em um suporte magnético e transferiu-se o sobrenadante límpido para uma placa de microtitulação IMMUNLON-2 (R). Mediram-se os sinais fluorescentes num leitor; Dynatech MicroFLUOR (R) com um filtro de excitação de 365 nm e um filtro de emissão de 450 nm.

Quando se utiliza Poli-IgG, adiciona-se quer em di-luente de amostra (Fase 1) quer no reagente conjugado (Fase 3) numa concentração específica para cada ensaio. II.2 FORMATAÇÃO SIMULTÂNEA:

Alternativamente pode efectuar-se o ensaio por incubação simultânea da amostra, do diluente da amostra, das partículas de dióxido de crómio revestidas pelo anticorpo e pelo reagente conjugado. Este formato omite necessariamente o primeiro passo de lavagem (Fase 2 de II.1). Após incubação, o ensaio prossegue com as fases 4 e 5 tal como anteriormente se descreveu. -13-

Neste caso, novamente quando se utiliza Poli-Ig esta é adicionada quer no diluente da amostra quer no reagente conjugado numa concentração específica para cada ensaio.

EXEMPLO III: UTILIZAÇÃO DE IGG MONOCLONAL

POLIMERIZADA SAMSA/PDM (Poli-IgG) NO ENSAIO HBSAG III.1 Eficácia nas amostras de soro normal; 0 quadro 1 apresenta o decréscimo correlativo dos sinais fluorescentes produzidos pela amostra 630 com uma concentração crescente de Poli-IgG adicionada. Esta amostra é factor reumatóide (FR)-negativa. No entanto, isto produz uma falsa resposta positiva com um [(Fab')2-AP] conjugada com anti--HBsAgfosfatase alcalina fragmentada com pepsina. Quando se ensaiam outras amostras de soro normal HBsAg-negativo com a inclusão de Poli-IgG não se observam efeitos significativos. A resposta do controlo positivo contendo HBsAg não foi afectada pela Poli-IgG (ver valores de controlo no quadro 1). Este facto também se torna evidente nos resultados apresentados no quadro 3· 0 quadro 1 indica também que é necessário um mínimo de 7 ug de IgG por ensaio para se reduzirem as respostas ao ensaio para negativas, mas quantidades adicionais não induzem alterações muito maiores. A quantidade preferencial de Poli--IgG utilização neste tipo de ensaio imunológico enzimático heterogéneo é de 7 a 15 ug/ensaio (200 ul de amostra de soro ou de plasma por ensaio). -14-

Quadro 1: Efeito da quantidade de resultados de um ensaio Poli-IgG nos HBSAG ## / Poli-IgG adicionada1 0 jug/ensaio 7 jig/ensaio 14 jug/ensaio Controlo Pos. (RFU)# 1882 1907 1885 Controlo Neg. (RFU) 45 42 49 Grau de Admissão 2 3 165 162 169 No. 630 (+/-) 264(+) 91 (-) 61 (-) 1 positivos os valores superiores ao grau de admissão. 0 quadro 2 resume um estudo em que se compara a ausência de adição, a adição de IgG monomérica e a adição de Poli-IgG no ensaio HBSAG. Enquanto a amostra (#34) com resposta normal não é afectada as amostras positivas falsas são reduzidas a negativas de um modo muito mais eficaz por Poli-IgG do que pela IgG monomérica. 2

Notas: ## Neste ensaio utilizou-se uma formatação progressiva, em duas fases e o conjugado . (Fab’)2-AP. ** Sintetizou-se Poli-IgG, de acordo com o procedimento SAMSA/DPM. # RFU: Unidade relativa de fluorescência. 3

Grau de Admissão = Controlo Neg. + 120, estabeleceram-se como m -15- -15- "Tt

Quadro 2: Comparação de IgG Monomérica com Poli--IgG na Redução de Falsas Respostas Positivas num Ensaio HBSAG *

Amostras Sem Aditivo IgG Monomérica Adicionada** Poli-IgG Adicionada** Controlo Pos.(RFU) N/T N/T 1504 Controlo Neg.(RFU) N/T N/T 49 Grau de Admissão# - - 169 No. 34 98 (-) 91 (-) 89 (-) No. 55 423 (+) 189 (+) 63 (-) No. 57 1260 (++) 214 (+) 114 (-)

Notas: * Neste estudo utilizou-se uma formatação progressiva em duas fases, e o conjugado IgG-fosfatase alcalina. ** Utilizou-se vinte (20) pg/ensaio de IgG monomérica ou poli-mérica. Sintetizou-se a Poli-IgG, de acordo com os procedimentos SAMSA/DPM. # Grau de admissão = Controlo Neg. + 120, estabeleceram-se como positivos os valores superiores ao grau de admissão. III.2 Eficácia de Poli-IgG em amostras positivas ao factor reumatóide:

Os factores reumatóides são. anticorpos auto-imunes que se sabe interferirem nos ensaios imunológicos associados a enzimas e originarem esporadicamente falsas respostas positivas. Estas i -16- falsas respostas positivas não se encontram directamente correlacionadas com as titulações de FR. A utilização de C(Fab’)2] IgG fragmentado com pepsina para se preparar o conjugado anticorpo-enzima foi referido como um auxiliar para reduzir a incidência de falsas respostas positivas associadas com positi-vidade a FR.

Os dados apresentados no quadro 3 indicam que determinadas amostras FR-positivas ainda produzem falsos resultados positivos, mesmo quando se utiliza o conjugado (Fab*)2-enzima. Estas interferências são eliminadas pela utilização de Poli--IgG.

Quadro 3: Efeito de Poli-IgG nas amostras positivas de factor reumatóide quando se utiliza (Fab')2-AP como conjugado de enzima.

Valores de Controlo Controlo Pos.* Controlo Neg. Grau de (Neg. admissão + 120) 1189 * 92 212 Amostras Titulação FR Sem Poli-IgG UFR +/- Poli-IgG UFR +/- 129 N/T 76 101 137 10,240 143 - 90 - 142 10,240 111 - 73 - 147 10,240 94 - 99 - 173 10,240 101 - 78 - 176 10,240 71 - 113 - 177 10,240 767 + 76 - 187 10,240 108 - 139 _ 385 10,240 333 115 - 190 10,240 97 - 90 - 279 10,240 87 - 78 - 327 10,240 76 - 80 - Positivos falsos 2/12 0/12

Notas: * Utilizou-se uma formatação progressiva em duas fases e um conjugado (Fab')2-AP. # Preparou-se a Poli-lgG de acordo com o procedimento SAMSA/DPM, utilizando-se 15 ug/ensaio.

EXEMPLO IV: EFEITO DE DSS-IgG POLIMERIZADA NO ENSAIO HBSAG

No quadro 4 resume-se um estudo que envolve 80 amostras negativas que se identificaram como originando provavelmente falsas respostas positivas e 7 amostras HBsAg positivas.

Quando se efectuou o ensaio sem Poli-lgG, 24 amostras apresentaram respostas falsamente positivas. Com a adição de Poli-lgG polimerizada DSS todas as amostras se mostraram estatisticamente indistintas dos controlos negativos. As amostras positivas não foram afectadas pela Poli-lgG.

Quadro 4: Efeito de IgG polimerizada DSS no ensaio HBSAG*

Sem Poli-IgG Poli-IgG Total de Amostras Negativas Ensaiadas 1 80 80 Total de Falsas Respostas Positivas 24 0 Percentagem de falsas Respostas Positivas 30# 0# Média de falsas Respostas Positivas (Desvio Padrão) 1266(1305) 71(28) Controlo Negativo (Desvio Padrão) 65(6) 65(6) Delta (Média de Falsas Respostas Positivas - Controlo Neg.) 1,201 6 Total de Amostras Positivas Ensaiadas 7 7 Total de Verdadeiras Amostras Positivas 7 7 Média T/P (Desvio Padrão) 3162(976) 3115(1009)

Notas: * Neste estudo, utilizou-se uma formatação progressiva, em duas fases e um conjugado de IgG intacto-fosfatase alcalina; Utilizou-se Poli-IgG a 15 pg/ensaio. 1

Estas são amostras identificadas como prováveis causadoras de falsas respostas positivas.

EXEMPLO V: EFEITO DE IgG POLIMERIZADA COM

GLUTARALDEIDO NO ENSAIO HBSAG O quadro 5 indica os resultados da utilização de duas preparações de Poli-IgG no ensaio HBSAG com cinco amostras falsamente positivas identificadas. Estes dois lotes foram sintetizados a partir de IgG gerada a partir de duas linhas celulares monoclonais de rato. Ambas as preparações reduziram as falsas respostas positivas para uma gama negativa.

Este estudo indica que a IgG polimerizada por gluta-raldeido efectua, assim como o material polimerizado com SAMSA/DPM e com DSS, a redução das falsas respostas positivas. Também indica que a Poli-IgG preparada a partir de dois lotes de IgG funciona igualmente bem.

Quadro 5: Efeito de Poli-IgG sintetizada de acordo com procedimentos que envolvem glutaral-deido num ensaio HBSAG**

Valores de Controlo:

Controlo Positivo 1086 Controlo Negativo 58 Grau de Admissão (=Ctl-negativo +120) 178

Amostra ID* Sem Poli-IgG Poli-IgG #0619 Poli-IgG #0620 9388 174 73 93 8523VS 1066 67 44 L155951 1180 82 76 E47458 4000 70 47 182999 74 46 63 -20- -20- /

Notas: * Estas são as amostras identificadas como prováveis causadoras de falsas respostas positivas no ensaio HBSAG. # Estes dois lotes de Poli-IgG foram sintetizados a partir de duas linhas celulares monoclonais de rato utilizando o procedimento do glutaraldeido. Utilizou-se IgG a 15 pg/ensaio, ** No presente estudo utilizou-se o conjugado IgG-fosfa-tase alcalina Intacta. EXEMPLO VI: EFEITO DE POLI-IgG NUM ENSAIO IMUNOLÓ-GICO HETEROGÉNEO PARA 0 ANTIGENIO CARCIN0EMBRI0NÁRI0 HUMANO (ACE) 0 ensaio imunológico heterogeneo para ACE baseia-se no mesmo princípio delineado no exemplo II. Neste ensaio incubou-se, a 37°C, durante 30 minutos 50 pl de uma amostra de soro, 50 ul de uma solução de anti-ACE conjugada com fosfatase alcalina e 25 pl de partículas de dióxido de crómio revestidas com um anticorpo anti-ACE. Lavaram-se depois as partículas e trataram-se com a solução de substrato fluorescente , do mesmo modo que se descreveu no exemplo II. Depois mediram-se os sinais fluorescentes num comprimento de onda de excitação de 365 nm e num comprimento de onda de emissão de 450nm.

Muitas amostras de soro possuem material de interferência que origina resultados falsamente elevados de ACE. No caso de uma determinação quantitativa tal como a medição de ACE, estes falsos resultados positivos são determinados por comparação com o resultado de um ensaio comercialmente disponível com o resultado Obtido no novo ensaip.ijma vez que os seres humanos normais -21- -21-

possuirão entre 5 a 8 ng/ml de ACE nos seus soros, os valores superiores a estes são indicativos de doença. As discrepâncias entre os dois ensaios quando o valor se encontrar acima dos valores normais poderá ser considerado como resultado de uma substância interferente. Verifica-se habitualmente a interferência como um valor superior ao nível analítico de referência do ensaio comercialmente disponível. A inclusão de Poli-IgG na solução do conjugado numa concentração de 19 ^il/ensaio elimina, de um modo eficaz, estas falsas respostas positivas. 0 quadro 6 apresenta o resumo dos ensaios de ACE que demonstram este efeito.

Quadro 6: Efeito de Poli-IgG em Amostras Falsamente Positivas num ensaio com ACE

Amostra ID [ACE] Sem Poli-IgG [ACE] Com Poli-IgG Em série (r) [ACE]1 102 8,8 ng/ml 0,9 ng/ml 4,9 ng/ml 109 8,0 0,3 1,0 7721 10,1 2,7 4,2 E47458 48,9 10,7 8,6 L215797 65,8 2,5 3,0 1

Fabricado e comercializado pela Hybritech Inc. San Diego, CA.

EXEMPLO VII: EFEITO DE POLI-IgG NUM ENSAIO IMUNOLÓGICO HETEROGÉNEO PARA A HORMONA ESTIMULADORA DA TIRÓIDE HUMMAÇHET) 0 ensaio imunológico para a HET humana baseia-se no mesmo princípio descrito no exemplo II. Efectua-se por uma in- cubação simultânea de 50 jul de amostra de soro, 50 μΐ de uma solução de anti-HET conjugada com fosfatase alcalina e 25 jul de partículas de dióxido de crómio revestidas com anti-HET. A lavagem, a reacção com substrato e a medição da fluorescência efectuou-se do mesmo modo que o descrito no exemplo II. 0 quadro 7 indica o efeito da inclusão da Poli--IgG no ensaio com HET quando se encontram envolvidas falsas amostras positivas. Embora as verdadeiras concentrações de HET se encontrem correctamente medidas nas amostras 8523, L(10) e L(50), as que exibem falsos resultados elevados foram corrigidas utilizando Poli-IgG.

Quadro 7·1 Efeito de Poli-IgG em falsas Amostras Positivas num Ensaio com HET.

Amostra ID [HET] Sem Poli-IgG [HET] Com Poli-IgG# L215797 2,92 mIU/1 0,85 mIU/1 8523 1 ,70 1 ,69 393ms 6,13 2,66 L155951 2,77 1,64 L(10)1 9,99 10,02 L(50)1 49,50 50,02 1

Calibradores que se reforçaram com HET purificada em concentrações de 10 mIU/1 e de 50 mIU/1, respectivamente. # Utilizou-se Poli-IgG a 16 jig/ensaio.

Claims

L/ REIVINDICAÇÕES L· 1.- Processo para reduzir respostas positivas falsas em um ensaio imunolõgico para a detecção de um antigénio numa amostra, caracterizado pelo facto de se executarem os passos se guintes exactamente pela ordem indicada: - formar uma imunoglobulina polimerizada a partir de uma imunoglobulina que não possui reactividade espe cífica com o referido antigénio; - fazer contactar a referida amostra suspeita de conter o referido antigénio com a referida imunoglobuli -24-

na polimerizada; e - submeter a amostra a um ensaio imunolõgico utilizan do anticorpos derivados da mesma espécie animal da imunoglobulina polimêrica.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a imunoglobulina ser IgG.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de a IgG polimerizada conter entre 3 e 15 mo lêculas de IgG.
4.- Processo de acordo com a reivindicação 3/ caracte rizado pelo facto de a IgG polimerizada se encontrar presente em uma quantidade suficiente para proporcionar.entre 7 e 20 ^ag por ensaio imunolõgico.
5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a imunoglobulina ser IgM.
6.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto de se tratar previamente a amostra com IgG po limerizada.
7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a imunoglobulina polimerizada ser um com- -25- -25-

ponente dos reagentes utilizados no ensaio.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser seleccionado no grupo constituído por hCG, LH, TSH, FSH, proteí na alfa de feto, antigénio específico prostãtico, antigénio car cinoembriónico (CEA), antigénios do cancro ca 19.9, ca 125 e ca 15-3, antigénio de superfície da hepatite B humana, antigénio do núcleo da.hepatite B e hepatite C, D e E.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser um vírus ou um marcador virai.
10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser uma hormona macromolecular.
11.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende, detectar ser um componente molecular das células dos tumores malignos humanos .
12,- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser um antigénio de superfície da hepatite B humana.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser a hormona estimuladora.da tirõide humana (TSH).
14. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser o antigénio carcinoembriõnico (CEA).
15-- Processo para a realização de um ensaio imunolõgi co enzimãtico utilizando dois anticorpos da mesma.espécie animal para capturar e detectar um antigénio na amostra que se pre tende analisar, caracterizado por compreender os passos seguintes: a) formar uma imunoglobulina polimerizada da. mesma espé cie das utilizadas no ensaio, não possuindo essa imu noglobulina polimerizada qualquer reactividade para o antigénio que se pretende detectar; b) fazer contactar a referida amostra com uma solução que contenha a imunoglobulina polimerizada do passo a) enquanto se efectua o referido ensaio; c) efectuar o ensaio para determinar a presença ou a au sência do antigénio na referida amostra.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo facto de a.imunoglobulina ser IgG.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16/ carac-terizado pelo facto de se tratar a amostra previamente com a IgG polimerizada.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo facto de a imunoglobulina polimerizada ser um com ponente dos reagentes utilizados no ensaio.
19. - Processo de acordo com a reivindicação 15/ carac-terizado pelo facto de o anticorpo detector.do conjugado da enzima ser constituído por um fragmento de anticorpo produzido por hidrólise da pepsina.
20. - Processo de acordo-com a reivindicação 15/ carac-terizado pelo facto de o anticorpo detector do conjugado da enzima ser constituído por um fragmento de anticorpo produzido pe la papaína.
21. - Processo de acordo com a reivindicação 19/ carac-terizado pelo facto de o fragmento ser (Fab*)2/ F(ab)2 ou Fab.
22. - Processo de acordo com a reivindicação 15/ carac- -28-

terizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser um vírus ou um marcador virai.
23. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser uma hormona macromolecular.
24, - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser seleccionado no grupo constituído por hCG, LH, TSH, FSH, proteí na alfa de feto, antigénio específico prostãtico, antigénio car cinoembriõnico (CEA), antigênios do cancro ca 19.9, ca 125 e ca 15-3, antigénio de superfície da hepatite B humana, antigénio do núcleo da hepatite B e hepatite C, D e E.
25.- Processo de acordo.com a reivindicação 24, carac-terizado pelo facto de o antigénio que se pretende, detectar ser um antigénio de superfície da hepatite B humana.
26.- Processo de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser a hormona estimuladora da tirõide humana (TSH).
27.- Processo de acordo com a reivindicação 24, carac-terizado pelo facto.de o antigénio que se pretende detectar ser -29- V

o antigénio carcinoembriõnico (CEA).
28. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac-terizado pelo facto de o antigénio que se pretende detectar ser um componente molecular de células de tumores malignos humanos.
29. - Processo para formar uma imunoglobulina poliméri-ca, caracterizado pelo facto de se tratar uma imunoglobulina com um reagente de ligação química heterobifuncional ou homobi-funcional pelo que as moléculas polimêricas resultantes existem sob uma forma solúvel; e pelo facto de as moléculas polimêricas serem constituídas por 3. a 15 moléculas IgG monoméricas.
30. - Processo de acordo com a reivindicação .18, caracterizado pelo facto de o reagente heterobifuncional ser o ani-drido S-acetil-mercapto-succínico (SAMSA).
31. - Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o agente homobifuncional ser o substrato de di-succinimidilo (DSS) ou glutaraldeído ou. os seus derivados.
32.- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracte rizado pelo facto de a quantidade de imunoglobulina polimérica no ensaio estar compreendida entre 2 <ug e 25 ug por teste. f -30- v—^'" f
33.- Conjunto de teste para diagnóstico para efectuar um ensaio imunolõgico para a detecção de um antigénio e para re duzir respostas positivas falsas nesse ensaio imunolõgico, ca-racterizado pelo facto de ser constituído por: - uma quantidade seleccionada de IgG polimerizada con tendo entre cerca de 3 e 15 moléculas de IgG, em uma quantidade suficiente para proporcionar um mínimo de cerca de 7 jxq por teste, não possuindo a referida IgG polimerizada. qualquer reactividade específica com o antigénio que se pretende detectar; e - um anticorpo marcado, para o antigénio que se pretende detecar. Lisboa, 24 de Outubro de 1990 O Agente Oficial da Propriedade Industriai