PT95376B - Processo para a cultura de celulas em esferas microporosas - Google Patents

Description

A invenção refere-se a um processo para a cultura de células em esferas microporosas, suportadas num leito sólido e alimentadas descontínua ou continuamente com um meio nutriente.

Conhecem-se uma série de métodos através dos quais se podem imobilizar células inteiras. Podem por exemplo colocar-se células, através de medidas adequadas, num gel humedecido, mantendo-se assim e continuadamente vivas e acti vas (Klein, Wagner Methods for the Immobilisation of Microbial [Cells em Appl. Biochem. Bioeng. 11-51 (1983)). Na prática verificou-se, contudo, que as células vivas saltam da matriz de !gel durante o crescimento indo desse modo para a solução nutri1 .7

I i ente circundante. AÍ, podem continuar a multiplicar-se e desse ί: modo dificultar muito a reserva celular em processos contínuos.

[ I ί Na patente US 2 958 517 descreve-se um í processo para a cultura de células de mamíferos livres, no qual se efectua a mistura da solução nutriente com um agitador magné ! tico. Neste processo, contudo, ocorre a colisão das células j umas com as outras com consequentes prejuízos para as funções vitais que podem conduzir à morte das células.

;i Na patente US 706 872 descreve-se uma cultura contínua de células de mamíferos em partículas esponjoh sas porosas. Cerca de 1 a 5% da população celular no reactor Li ι berta-se para a solução nutriente, podendo por isso os disposi! tivos de reserva para os imobilizados, como membranas ou placas de vidro sinterizado, ficar ligeiramente recobertos pelas células livres parando o processo.

! É particularmente difícil o desenvolviii '' mento de células de plantas ou de animais. Estas células têm i membranas muito sensíveis e frágeis, que podem ser facilmente ^: enfraquecidas ou destruídas sob uma acção mecânica mesmo suave.

! Deste modo, a vitalidade e a produtividade destas células pode í ser muito prejudicada.

í Um outro método de imobilização consis'1 - — h te em encerrar as células em membranas semipermeáveis, que se

I passarão a designar por esferas microporosas. Nos registos de - patente europeus 0 173 915 ou 0 280 155 e na patente alemã μ 3 529 203 referem-se exemplos desta técnica. Nesta patente alei mã mostra-se ainda como as células imobilizadas se podem desenvolver num reactor com agitação. No entanto, mesmo neste tipo : de reactor ocorrem fortes cargas mecânicas sobre as células, pro , vocadas pelo agitador. Isto pode levar â destruição das cápsui, las e à libertação das células nelas encerradas e por fim a uma ji lesão dessas mesmas células.

j Descobriu-se então surpreeendentemente, ; que através da compactação ordenada das esferas microporosas so

II pbre um leito sólido se podem superar as dificuldades atrás refe ji ridas. Apesar da densa compactação as esferas microporosas man*j têm a sua estabilidade e possibilitam assim ãs células nelas 1 contidas condições óptimas de crescimento e produção. 0 aperta2

do ordenamento das esferas microporosas no reactor impede tamί bêm surpreendentemente a formação de canais entre as esferas mi j croporosas. Assegura-se deste modo uma alimentação regular e fa h

cilmente controlável das células com todos os elementos nutrien i; tes necessários. Este processo permite assim uma cultura das cé lulas prolongada, suficiente para várias gerações e livre de ji perturbações.

A invenção refere-se por isso a um proj cesso para a cultura de células em esferas microporosas, cuja i membrana é constituída por um gel de polissacárido aniónico ou por uma membrana de polielectrólito, caracterizado por as esfe)i ras microporosas estarem suportadas num leito sólido.

I ί As esferas microporosas encontram-se no leito sólido na forma de um denso empacotamento de esferas na ‘ corrente de solução nutriente. Sofrem assim apenas ligeiras alterações no seu modo de arrumação ocorrendo por isso apenas li! geiras fricções mecânicas sobre as membranas que poderiam levar à sua destruição.

A invenção será em seguida detalhadamen í! te descrita, em especial nas suas formas de execução preferenci jj ais. Além disso, a invenção estã definida nas reivindicações.

jl

H As esferas microporosas adequadas para h a invenção são constituídas por uma membrana biocompatível, não ! tóxica, semi-permeãvel e insolúvel em ãgua. A preparação destas !' membranas encontra-se descrita por exemplo no registo de patenl· ii te europeu 0 173 915. Para isso, em particular, suspendem-se as 1 células numa solução aquosa do polímero base. 0 polímero provoij ca um aumento de viscosidade da suspensão celular, o que impede | a mistura da solução quando se introduz gota a gota na solução aniónica de polissacárido. Como polímero base são adequados to: dos os polímeros neutros, solúveis em ãgua, biologicamente assjL milãveis, que aumentem a viscosidade. É por exemplo o caso da hidroxipropilmetilcelulose ou da hidroximetilcelulose. A estes ' polímeros adicionam-se um ou mais tipos de catiões divalentes, i como p. ex. CaC^. Transforma-se então a mistura na forma de go tas e introduz-se numa solução aniónica de polissacárido, por • ί . exemplo de alginato, carrageenano, chitosano, pectinato ou car1; boximetilcelulose. Emprega-se de preferência alginato. Na inter

face entre o polímero base e a solução de polissacárido forma-se, devido à presença de um ou mais catiões divalentes, uma me mória semipermeável, que acaba por encerrar as células. A membrana é constituída pelo polissacárido aniónico, que toma a for ma de um gel devido aos catiões divalentes. 0 polímero, no qual as células se encontram em suspensão, continua, pelo contrário, na forma líquida.

De modo análogo, podem suspender-se células como descrito no registo de patente europeu 0 280 155, nu ma solução aquosa de um polímero aniónico (poli-ácido), como por exemplo alginato, carrageenano, ácido hialurõnico, carboximetilcelulose, xantano ou furcelarano, transformar-se em gotas e em seguida introduzir-se numa solução aquosa de um polímero catiõnico (poli-base) como p. ex. um copolimerizado de cloreto de l-vinil-3-metilimadazólio e l-vinil-2-pirrolidona ou um copo limerizado de polialilamina 2-hidroxipropileno. Utiliza-se de preferência um copolimerizado de cloreto de l-vinil-3-metilimidê. zólio e l-vinil-2-pirrolidona. Na interface entre o poli-ácido e a poli-base forma-se uma membrana de polielectrólito semi-per meável que encerra as células. Também neste caso, o polímero ba se, no qual as células se encontram em suspensão, continua líquido. A membrana impede a passagem das células, mas é livremen te permeável a gases e aos componentes do meio nutriente.

Nestas esferas microporosas podem encer rar-se e cultivar-se quaisquer células vivas. É o caso de bactê rias, fungos ou leveduras e, em especial, todas as estirpes celulares de origem animal ou vegetal, bem como, muito preferenci almente, células de hibridoma. Em condições adequadas, as células multiplicam-se por divisão celular nas esferas microporosas. Através da membrana semipermeável efectua-se, por difusão, o fornecimento dos nutrientes e a rejeição dos produtos formados.

A cultura efectua-se num recipiente no qual se encontram as esferas microporosas num empacotamento den so. O recipiente pode ser constituído por um material inerte, como p. ex. metal, cerâmica, vidro ou um material plástico, que se pode esterilizar por métodos químicos ou físicos. O recipien te pode ter em particular uma forma cilíndrica. A relação entre a altura e o diâmetro pode variar numa gama muito larga. A rela i

ção altura/largura pode variar numa gama de 100:1 a 1:100, em especial de 2:1 a 20:1.

ί 0 recipiente de cultura possui em extre : mos opostos aberturas de entrada e de saída; entre elas encon! tram-se as esferas microporosas. As aberturas estão colocadas de tal maneira que a solução nutriente possa atravessar todas as esferas microporosas que se encontram entre elas. Entre as il aberturas e as esferas microporosas encontram-se dispositivos i de retenção para as esferas microporosas, como p. ex. membranas ou placas de vidro sinterizado, facilmente permeáveis à solução ΐ, nutriente. Com este tipo de ordenamento é possível fazer fluir ti | a solução nutriente contínua ou descontinuamente, através do re í cipiente, com qualquer fluxo desejado. O volume de líquido mantém-se constante com o tempo. Por meio de um dispositivo especi al pode fazer-se reciclar a solução nutriente, de modo a poder ,i aproveitar com melhor rendimento alguns elementos nutrientes ; mais dispendiosos.

Todos os processos de regulação, mediί ção e ajustamento se podem efectuar, quando necessário, fora do i

j! recipiente de cultura. É prineipalmente o caso da medição da temperatura, do pH e da pressão parcial de oxigénio, mas também |j da permuta de gases de Ο₂ θ ^C02' regulação do pH e da renova |j ção dos componentes da solução nutriente.

Sem prejudicar as células encapsuladas, , e ainda possível retirar uma parte da solução nutriente, de mo'í do a separar e a tratar os produtos produzidos. A solução des₍ viada pode ser substituída por solução fresca. A permuta de nu]; trientes e a recuperação de produtos pode efectuar-se descontí( nua ou continuamente a partir do dispositivo de reciclagem da i corrente nutriente.

!' , A escolha e ajustamento dos parâmetros ί físicos e químicos de cultura faz-se de acordo com as necessida des de crescimento e da produção das células encerradas nas es! feras microporosas. Os limites destes parâmetros de cultura poi! dem oscilar numa gama muito larga. Não é no entanto difícil pai ra o especialista determinar os parâmetros óptimos em cada situa * ção para as células em causa.

< Para as células de hibridoma, por exem5 pio, revelaram-se convenientes os seguintes parâmetros físicos ; e químicos de cultura. A temperatura de cultura situa-se entre e 39QC, de preferência a 37QC. Obtém-se um crescimento suficiente a um valor de pH entre 6,8 e 7,2, de preferência a 7,0.

, A velocidade do fluxo através do reactor pode variar entre larj gos limites, conforme o meio de crescimento. Obtêm-se bons resultados entre 0,1 e 50 litros de meio por hora e por litro de jj volume de reactor, de preferência entre 5 e 20 1/h.l.

Descobriu-se surpreendentemente, que as esferas microporosas, apesar do seu denso empacotamento no reci piente de cultura, mantêm a sua estabilidade. Nao se verificou •l qualquer formação de canais nem qualquer aglomeração das cãpsuu las. Pode efectuar-se assim a cultura durante longo tempo. Devi, do ao empacotamento denso das esferas microporosas e à constan,, te reciclagem dos elementos nutrientes, é possível efectuar a ; cultura das células e a recolha dos produtos num espaço muito I pequeno, em condições estéreis, com aparelhagem simples. Em par ticular, a reciclagem dos nutrientes conduz a um aproveitamento ii efectivo e económico dos elementos nutrientes a empregar, muiI tas vezes dispendiosas. É também possível a regeneração da solu j ção nutriente através da separação selectiva de produtos finais de metabolismo, como p. ex. ácido láctico, CO2 ou iões amónio, ' por meio de permutadores iónicos ou outros processos de separação, na corrente nutriente isenta de células, l· Os exemplos a seguir apresentados desti^ i nam-se a melhorar a ilustração da invenção.

EXEMPLO 1 í Diluiu-se uma suspensão de células de ij hibridoma com uma solução de carrageenano a 3% (Sigma Chemie

I ! GmbH, Munique) em meio de Dulbecco (Dulbecco e Freeman, (1959),

I Virology 8, 396) na proporção 1:2 (relação de massas). Utilizai -se uma pipeta para fazer cair esta solução gota a gota. A pipe ta consiste numa cânula de diâmetro interno 0,2 mm e diâmetro externo 0,4 mm. Coloca-se esta concêntricamente a um cilindro • de madeira, de modo a que se possa fazer passar uma corrente de

C-.

j ar tangencial no espaço circular assim formado, que comprime as ί gotas que saem da pipeta. Conforme a velocidade do ar obtiveram

-se gotas com um diâmetro de o,1 mm - 3 mm. As gotas caíam numa solução da poli-base.

ί' A poli-base prepara-se da seguinte ma! neira:

ί Num balão de vidro de 4 litros dissolvem-se 1443 g (10 mol) de i cloreto de l-vinil-3-metilimidazólio e 56 g (0,5 mol) de 1-vii nil-2-pirrolidona em 3,8 1 de água, contendo 38 g de persulfato ί de potássio como iniciador. Polimeriza-se a mistura durante 6 h a 60QC, sob atmosfera de azoto. Obtém-se uma solução límpida, '1 ,· amarelo-acastanhada, a 40%, de pH neutro. Ajustam-se ate ao vo< lume final de 2 1 100 ml desta solução a 40% com uma solução aquosa de NaCl a 0,9%. A um litro da solução de polimerizado di luída adicionam-se gota a gota cerca de 100-120 ml da suspensão ; de células em carrageenano.

jl Após a diluição deixa-se sedimentar as cápsulas, decanta-se a solução e suspendem-se 3 vezes com a soi lução de NaCl a 0,9%. Em seguida podem cultivar-se as células ' nas esferas microporosas.

í| ij

I EXEMPLO 2

I' ^! Dissolvem-se 28,2 g de hidroxipropilme| tilcelulose em 675 ml de uma solução de NaCl a 0,9%. Em seguida I adicionam-se 75 ml de uma solução de CaC^ x 21^0 a 13,3%. Misί tura-se esta solução com a suspensão de células de hibridoma na razão de 3:1 (razão de massas). Faz-se cair gota a gota esta

I suspensão como descrito no Exemplo 1. As gotas são recebidas nu ma solução de alginato. A solução de alginato prepara-se do moj do seguinte. Dissolvem-se 15 g de alginato em 500 ml de uma soI ! lução de NaCl a 0,9% e dilui-se em seguida com uma solução de NaCl a 0,9% até ao volume de 2 1. Adicionam-se gota a gota 80 ml da suspensão celular anterior a 1 1 de solução de alginato.

J' Na interface entre as gotas e a solução de alginato forma-se um

I / polímero de gel de alginato que mantém as células encerradas.

• Lavam-se as esferas microporosas 3 vezes com uma solução de NaCl

a 0,9%, transferem-se depois para uma solução de CaC^ x -^ϊ^Ο a ί 2% e agitam-se durante 2 minutos. Decanta-se em seguida a solu; ção e lavam-se várias vezes as esferas microporosas com uma so; lução de NaCl a 0,9%.

EXEMPLO 3 ; As células encapsuladas de acordo com o i Exemplo 2 colocaram-se, em condições estéreis, num reactor em ;; forma de coluna. Enche-se completamente a coluna com as cápsu' las e alimenta-se constantemente com o meio nutriente num siste i ma fechado. O ajuste e regulação dos parâmetros efectua-se num reactor de 5 1 que está ligado â coluna por meio de tubuladuras.

A permuta de gases faz-se no reactor através de membranas de l· h borracha. Efectua-se a cultura nas seguintes condições:

' Meio Solução nutriente de Dulbecco (Dulbecco ^! (1959), Virology, 8 296) ii Soro de vitela fetal a 10%

Volume da coluna:	0,4 1
Fluxo do meio:	7 1/h
pH	7,0
P°2	60% da saturação do ar
T	37°C

I' Mede-se a pressão parcial de C>2 no extremo da coluna com um electrodo de oxigénio. Garante-se a cirI culação da solução com uma bomba peristáltica. O tempo do ensaio estende-se a 25 dias. Muda-se o meio 4 vezes. Para isso substi!j tui-se de cada vez 50% do meio antigo por novo. A ocasião da mu

Ί ii dança de meio calcula-se por determinação dos produtos de meta! bolismo. As concentrações de amónio superiores a 3 mmol/1 e de i

! glutamina inferiores a 1,5 mmol/1 procede-se a uma mudança de i meio. O numero de células é a princípio de 20500 células por i cápsula e atinge no fim da cultura um valor de cerca de 200 000 : células por cápsula. A produção média de anticorpos ê de 0,08 •í mg/ml de volume de reactor e por dia.

A determinação dos teores em amónio e glutamina efectuou-se por métodos padrão enzimãticos, da firma Boehringer, Mannheim.

j EXEMPLO 4 t

|í A cultura das células encerradas nas !! cápsulas microporosas efectua-se como indicado no Exemplo 8. Co mo reactor utiliza-se uma coluna de vidro cilíndrica com 400 ml i de volume útil. A razão entre a altura e o diâmetro é de 3 para

1. Na entrada e na saída da coluna de vidro colocam-se placas ij de vidro sinterizado com um diâmetro de poros de 0,1 mm para re ^; tenção das cápsulas microporosas. A superfície da placa de vidro sinterizado à saída é o dobro da superfície ã entrada.

I EXEMPLO 5 | Colocaram-se células encapsuladas de |ΐ acordo com o Exemplo 1, em condições estéreis, numa coluna de h reactor esterilizada, como a descrita no Exemplo 3. A cultura ί! efectua-se como indicado no Exemplo 3, mas em solução nutriente í de Iscove (Iscove e Melchers (1978), J. Exp. Med., 147: 923). A ! produção média de anticorpos é de 0,06 mg/ml de volume de reaci i tor e por dia. A cultura efectuou-se durante 4 semanas.9

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lã - Processo para a cultura de células em jí esferas microporosas, cuja membrana ê constituída por um gel de j polissacárido aniónico ou por uma membrana de polielectrólito, í caracterizado por as esferas microporosas estarem suportadas i num leito sólido.

   - 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se efeetuar a cultura, em esferas microporosas, de células de origem vegetal ou animal.

   - 3ã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se efeetuar a cultura, em esferas microporosas, de células de hibridomas.

   - 4ã Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a membrana das esferas microporosas ser constituída por um gel de alginato.

   - 5ã Processo de acordo com a reivindicação i 4, caracterizado por se efectuar a preparação da membrana de al f ginato através de complexação com um agente molhante a partir j da fase de gota.

   - 6ã Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a membrana das esferas microporosas ser constituída por um copolimerizado de cloreto de l-vinil-3-metilimidazólio e de l-vinil-2-pirrolidona.

   - 7â 1 ι Processo de acordo com uma ou mais das

   I ; reivindicações 1 a 6, caracterizado por o fornecimento do meio nutriente se efectuar através de uma corrente fechada de soluJ ·

   1' „ ^; çao nutriente.

   Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o fornecimento do meio nutriente se efectu ar de um modo descontínuo ou contínuo.

   - 9ã ί' Processo de acordo com uma ou mais das

   I i reivindicações 1 a 7, caracterizado por a permuta de meio nutri, ente se efectuar de modo descontínuo ou contínuo.

   A requerente reivindica a prioridade do ! pedido alemão apresentado em 21 de Setembro de 1989, sob o NQ.

   P 39 31 433.2.