JPH03119990A - 微小孔性ビーズ内での細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定床内に配置され、栄養素が非連続的また
は連続的に供給される微小孔性ビーズ内で細胞を培養す
る方法に関する。

全細胞を固定化するには多数の多様な方法が知られてい
る。たとえば、細胞を架橋ゲル内に適当な手段で捕捉し
、その中で生存および活動を統けさせることができる（
Ｋｌｅｉｎ、　　Ｗａｇｎｅｒ＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆ
ｏｒ　　ｔｈｅ　　ｉＩ！＋＋ｎｏｂｌｉｓａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　＋＋＋１ｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓ、Ａｐ
ｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｅｎｇ、、４：　　１１
−５１゜１９８３）　、　［、かじながら、実際には生
細胞は増殖によってゲルマトリックスを分裂させ、周囲
の栄養素溶液中に入っていくことが明らかにされた。こ
こでも細胞はさらに増殖することが可能で、したがって
、連続過程における細胞の保持は著しく妨害される。

米国特許第２，９５８，５１７号には、栄養素溶液を磁
力駆動撹拌棒で混合する浮遊哺乳類細胞の培養装置が開
示されている。しかしながら、この操作では、常に細胞
同士の衝突が起こり、したがって生存機能の障害を生じ
、このため細胞死を招くことがある。

米国特許第７０６．８７２号には、多孔性のスポンジ様
粒子上での哺乳動物細胞の連続培養が記載されている。

リアクター中の細胞集団の約１〜５％は栄養素溶液中に
遊離していると考えられ、膜または焼結ガラス板のよう
な非移動化細胞を維持するための装置上に遊離細胞が沈
積し、それを遮断しやすい。

植物まＩ；は動物細胞はとくに、培養がきわめて困難で
ある。これらの細胞は、きわめて感受性が高く虚弱な膜
を有し、これはわずかな機械的影響によっても容易に脆
弱化され、傷害を受ける。これは、これらの細胞の生存
能および増殖能を著しく損うことになる。

他の非移動化方法は細胞を半透過性膜中に捕捉する方法
で代表される。この膜を以下、微小孔性ビーズと呼ぶ。

この方法の例は、欧州特許出願０，１７３．９１５号ま
たは０，２８０．１５５号およびドイツ公開公報第３．
５２９，２０３号に特定されている。

このドイツ公開公報には非動化した細胞をどのようにし
て撹拌リアクター中で培養できるかについても記載され
ている。しかしながら、このリアクターでも、撹拌器か
ら細胞への機械的ストレスは依然として大きすぎる。カ
プセルに対する損傷および捕捉細胞の放出、そして最終
的１：は細胞への傷害の可能性がある。

上述の問題は、驚くべきことに、固定床内への微小孔性
ビーズの密接充填配置によって克服できることが明らか
にされた。密接充填にもかかわらず、微小孔性ビーズは
その安定性を維持し、したがってそれに含まれる細胞の
至適な増殖と産生条件が実現される。リアクター中への
微小孔性ビーズのこの密接配置はまた、驚くべきことに
、微小孔性ビーズの間の溝の形成も防止する。これによ
り、必要なすべての栄養素の均一な、制御容易な、細胞
への供給が可能になる。したがって結局、細胞を長期に
わたって中断なく、何世代も培養することができる。

すなわち、本発明は、陰イオン性多糖ゲルまたは高分子
電解質膜からなる膜を有し、固定床内に配置される微小
孔性ビーズ内で細胞を培養する方法に関する。

微小孔性ビーズは、栄養溶液流中に密接充填されたビー
ズとして固定床内に置かれる。これらは、その場所でき
わめてわずかな空間的変動を受けるのみで、したがって
微小孔性ビーズの膜に傷害を与える可能性のある機械的
摩擦もその膜にはほとんど生じない。

以下に本発明を、とくにその好ましい実施態様について
詳細に説明するが、本発明は特許請求の範囲に定義され
た通りである。

本発明に適当な微小孔性ビーズは、生物適合性で、非毒
性、半透過性、水不溶性の膜から構成される。このよう
な膜の製造は、たとえば欧州特許用＠０．１７３，９１
５号に記載されている。この目的では、細胞を、とくに
、核ポリマーの水溶液中に懸濁する。核ポリマーは細胞
懸濁液の粘度を増大させるので、次の陰イオン性多糖溶
液への滴下時に、再溶液の混合が防止される。

適当な核ポリマーは、すべて中性の、水溶性、生物適合
性ポリマーであって、粘度を増大させる。これらの例と
しては、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒ
ドロキシメチルセルロースを挙げることができる。これ
らの核ポリマーは１種または２種以上の２価陽イオン、
たとえばＣａＣＱ、と混合される。混合物はついで小滴
形状に変換され、たとえばアルギン酸塩、カラゲナン、
キトサン、ペクチン酸塩またはカルボキシメチルセルロ
ースからなる陰イオン性多糖溶液中に導入される。アル
ギン酸塩の使用が好ましい。１種または２種以上の２価
陽イオンが存在するため、核ポリマーと多糖溶液の間の
境界相に半透過性の膜が形成され、ついで細胞が捕捉さ
れる。膜は陰イオン性多糖から構成され、これが２価陽
イオンによってゲルの形状に変換される。他方、細胞が
懸濁されている核ポリマーは液体のままである。

欧州特許臼１９０，２８０，１５５号に記載されている
ように、同様の方法で、細胞を陰イオン性ポリマー（ポ
リ酸）、たとえばアルギン酸塩、カラゲナン、ヒアルロ
ン酸、カルボキシメチルセルロース、キサンタンまたは
フルセラランの水溶液中に懸濁し、小滴の形成に変換し
、ついで陽イオン性ポリマー（ポリ塩基）、たとえばｌ
−ビニル−３−メチルイミダゾリウムクロリドと１−ビ
ニル−２−ピロリドンの共重合体またはポリアリルアミ
ン／２−ヒドロキシプロピレン共重合体の水溶液中に導
入することもできる。

■−ビニルー３−メチルイミダゾリウムクロリドと１−
ビニル−２−ピロリドンの共重合体の使用が好ましい。

半透過性の高分子電解質膜がポリ酸とポリ塩基の間の境
界相に形成され、細胞を捕捉する。この場合も、細胞が
懸濁される核ポリマーは液体のままである。膜は細胞の
通過は防止するが、気体およびメジウムの成分は自由に
通過させる。

これらの微小孔性ビーズは、あらゆる生存細胞を捕捉し
、その中で培養することができる。

細胞としては、細菌、かびもしくは酵母、とくに動物も
しくは植物起源のすべての細胞系、ならびにとくに好ま
しくはハイブリドーマ細胞を挙げることができる。適当
な条件下では、細胞は微小孔性ビーズ内で細胞分裂によ
って増殖する。栄養素の供給および形成された生成物の
運搬除去は半透過性の膜を通して拡散により行われる。

培養は微小孔性ビーズが密接充填された容器内で実施さ
れる。容器は不活性材料たとえば金属、セラミック、ガ
ラスまたはプラスチック材料で作成され、化学的または
物理的方法で滅菌することができる。容器はとくにシリ
ンダー様の形状とすることができる。高さと直径の比は
広範囲に変動させることができる。高さと幅の比ハ１０
０：　ｌ　−１：　１００．と＜ニ２　：　ｌ〜２０：
　１の範囲で変動させることができる。

培養容器は両端に導入口と排出口を有し、この間に微小
孔性ビーズが配置される。両開口部はその間に配置され
るすべての微小孔性ビーズ内を栄養素溶液が貫流できる
ように配置される。

開口部と微小孔性ビーズの間には、微小孔性ビーズの保
持具、たとえば膜または焼結ガラス板を配置する。これ
は栄養素溶液は容易に通過させるものである。このタイ
プの配置によって、容器内に栄養素溶液を、所望の速度
で、連続的にまたは非連続的に通過させることが可能に
なる。この間、液体の容量は一定に保持される。

栄養素溶液は適当な装置によってループ内を循環させる
こともできて、これによって経費のかかることが多い栄
養素のより効率的な利用が可能になる。

すべての制御、測定および調整操作は、必要に応じて培
養容器の外部に設置することができる。とくに、温度Ｔ
　ｐＨおよび酸素分圧ならびに０、とＣＯｌのガス交換
の測定、またｐＨの制御、栄養液成分の更新等である。

生成した生成物を採取し、処理するために、栄養素溶液
の一部を分岐させることも、封入された細胞を損うこと
なく、実施できる。分岐させた栄養素溶液を新鮮な液で
置換することもできる。栄養素の置換および生成物の単
離は、栄養液流の循環装置から非連続的にまたは連続的
に行うことができる。

培養の化学的および物理的パラメーターの選択および調
整は、微小孔性ビーズ内に捕捉された細胞の増殖および
産生の要求に応じて行われる。これらの培養パラメータ
ーの限界は広範囲に変動するものである。しかしながら
、用いられる細胞の各場合における至適なパラメーター
を見出すことは本技術分野の熟練者には困雌なことでは
ない。

たとえばハイプリドーマ細胞の場合には、以下の物理的
および化学的培養パラメーターが適当なことが明らかに
されている。培養温度は３５〜３９℃、好ましくは３７
°Ｃである。適当な増殖はｐ＋（６，８〜７．２、好ま
しくは７．０で達成される。リアクター内の流速は増殖
段階に応じて広範囲に変動する。良好な結果は、リアク
ター容量ＩＬ１時間あたりメジウム０．１〜５０１２で
得られ、好マしくは５〜２０ρ／ｈ弓である。

培養容器内で微小孔性ビーズは密接充填されているにも
かかわらず、驚くべきことに、微小孔性ビーズは安定に
保持されることが明らかにされた。溝の形成も、カプセ
ルの凝集も起こらなかった。したがって、長期にわたっ
て培養を行うことが可能であった。微小孔性ビーズの密
接充填と栄養液の連続循環により、滅菌条件下、単純な
装置を用い、きわめて小さな空間で細胞を培養し、生成
物を生産することが可能になった。とくに栄養素の循環
により、きわめて経費のかかることが多い必要な栄養素
の効率的、経済的な利用が達成される。また、細胞を含
まない栄養液流中の代謝最終生成物、ｊ；とえば乳酸、
ＣＯ，またはアンモニウムイオンのイオン交換樹脂また
は他の分離法による選択的除去によって、栄養素溶液の
再生も可能である。

以下の詳細な実施例は、本発明をさらに例示するもので
ある。

実施例　ｌ ハイブリドーマ細胞の懸濁液をダルベツコ培地（Ｄｕｌ
ｂａｃｃｏ　＆　Ｆｒｅｅｒｎａｎ　：　Ｖｉｒｏ２ｏ
ｇｙ、　８．３９６゜１．９５９）中３％濃度のカラゲ
ナン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ。

ＣＩ！ＩｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ）溶液で１：２（重量比）
に希釈する。この溶液をノズルを通して小滴に変換する
。ノズルは内径０．２■、外径０．４＋＋＋ｍの針から
なる。それは中空のシリンダー内の同心円上に挿入され
、生成した環状空間を通して接線方向の空気流を送って
、針から出てくる小滴を落下させる。小滴の直径は空気
流の速度によって０．１＋ｍ〜３＋ａｍであった。小滴
はポリ塩基の溶液中に落下する。

ポリ塩基は次のようにして製造する。すなわち、４Ωの
ガラスフラスコ中、開始剤としてベルオキソニ硫酸カリ
ウム３８ｇを含有する水３．８Ｑに１−ビニル−３−メ
チルイミダゾリウムクロリド１４４３ｇ（１０モル）と
１−ビニル−２−ピロリドン５６ｇ（０，５モル）を溶
解する。混合物を窒素下６０°Ｃで６時間重合させる。

澄明黄褐色の、濃度４０％、中性の溶液が得られる。４
０％濃度の溶液１００ｍ（ｌを、０．９％濃度ＮａＣ（
ｌ水溶液テ２１２　ｒ：　すル。

希釈ポリマー溶液ＩＱに約１００−１２０ｒｎＱのカラ
ゲナン／細胞懸濁液を滴下する。

希釈後、放置してカプセルを沈積させ、溶液を煩瀉し、
懸濁を０．９％ＮａＣＱ溶液で３回行う。

ついで微小孔性ビーズ中での細胞の培養が可能である。

実施例　２ ヒドロキシプロピルメチルセルロース２８．２９を０．
９％濃度のＮａＣρ溶液６７５清Ωに溶解する。ついで
１３．３％濃度のＣａ（ｊ２ｇ・２Ｈｚｏ溶液７５ｍＱ
を加える。

この溶液をハイブリドーマ細胞懸濁液と３：ｌの比（重
量比）で混合する。この懸濁液を実施例１に記載したと
同様にして小滴に変換する。

小滴はアルギン酸塩溶液中に集める。アルギン酸塩溶液
は、アルギン酸塩１５ｇを０．９％濃度のＮａＣｇ溶液
５００ｍＱに溶解し、ついで０．９％濃度のＮａＣ（２
溶液で２１２に希釈して調製する。上記細胞懸濁液８０
ｍαをｌａのアルギン酸塩溶液に滴下して加える。アル
ギン酸塩ゲルが小滴とアルギン酸塩溶液の間の境界相に
重合して、捕捉された細胞を保持する。微小孔性ビーズ
を０．９％濃度のＮａＣＱ溶液で３回洗浄し、ついで２
％濃度のＣａＣｌ２１・２Ｈ２０溶液中に移し、２分間
撹拌する。次に溶液を傾瀉し、微小孔性ビーズを０．９
％濃度のＮａ０ｆｆ溶液で数回洗浄する。

実施例　３ 実施例２のようにしてカプセルに封入した細胞を滅菌条
件下に、滅菌リアクターカラム中に移す。カラムをカプ
セルで完全に満たし、ついで培地を閉鎖系内に連続的に
通過させる。パラメーターの調整および制御は、ライン
で連結した５１２のりアクタ−中で行う。ガス交換はり
アクタ−中で管状膜によって起こさせる。培養は以下の
条件で実施する。

培地：ダルベツコ栄養溶液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　：　Ｖ
ｉｒｏ−１ｏｇｙ、　８．２９６．１９５９）、１０％
ウシ胎仔血清カラム容量：　０．４４ 培地流速ニアＱ／ｈ ｐＨ：　７．Ｏ ｐｏｗ　：　６０％空気飽和 Ｔ：３７℃ ｐＯｔ容量はカラムの末端において酸素電極にて測定す
る。蝮動ポンプが全体への液流を確保する。実験を２５
日間統ける。培地は４回交換する。このｔ；めには、各
回、古い培地の５０％を新しい培地で置換する。培地交
換の時期は代謝生成物の測定によって決定する。培地の
交換はアンモニウム濃度が３ｍｒｎｏＱ／Ｑを越え、グ
ルタミン量が１．５ｍ＋＋＋ｏＱ／　０未満となった場
合に実施する。

開始時の細胞数はカプセルあたり２０，５００個で、培
養の終了時にはカプセルあたり約２００，０００個に上
昇する。平均抗体産生量はりアクタ−容量１ｍＱあｔこ
り、１日に０．０８ｍｇ／　ｒ！ＩＱである。

アンモニウムおよびグルタミンの量は、Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍから供給されている酵素標
準定量を用いて測定した。

実施例　４ 微小孔性カプセルに捕捉された細胞を、実施例３に記載
したようにして培養する。有効容量４００１ＩＱのシリ
ンダー状ガラスカラムをリアクターとして使用する。高
さと直径の比は３〜ｌである。孔径０．ｌ＋ｍの焼結ガ
ラス板を、ガラスカラムの入口および出口に微小孔性カ
プセルを保持するために設備する。出口の焼結ガラス板
の面積は入口のそれの２倍とする。

実施例　５ 実施例１に記載したようにしてカプセル封入した細胞を
滅菌条件下、実施例３に記載したような滅菌リアクター
中に移す。培養は実施例３に指示されたように実施する
がイスコブの栄養液（ｌｓｃｏｖｅ　＆　Ｍｅｌｃｈｅ
ｒｓ　：　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、、　　１４７゜９
２３、１９７８）を使用する。平均抗体産生量はりアク
タ−容量１　ｍＱあたり１日、０．０６ｍｇである。培
養は４週間続けた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）陰イオン性多糖ゲルまたは高分子電解質膜からなる
   膜を有し、固定床内に配置される微小孔性ビーズ内で細
   胞を培養する方法。 ２）植物または動物起源の細胞を培養する請求項１記載
   の方法。 ３）ハイブリドーマ細胞を培養する請求項２記載の方法
   。 ４）微小孔性ビーズの膜はアルギン酸塩ゲルからなる請
   求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５）アルギン酸塩膜は小滴相から架橋剤でのコンプレッ
   クス化によって形成される請求項４記載の方法。 ６）微小孔性ビーズの膜は１−ビニル−３−メチルイミ
   ダゾリニウムクロリドと１−ビニル−２−ピロリドンか
   ら構成される共重合体からなる請求項１〜３のいずれか
   に記載の方法。 ７）栄養素の供給は栄養素溶液の閉鎖流動によって行わ
   れる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８）栄養素の供給は非連続的または連続的に行われる請
   求項７記載の方法。 ９）栄養素の置換は非連続的または連続的に行われる請
   求項１〜７のいずれかに記載の方法。