PT94211A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo xilanas polihidrogeno-sulfatadas para o tratamento de doencas condicionadas pela proliferacao celular - Google Patents

Description

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Descrição da patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTlEíTGESSLLS-CHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental, (inventores: Renato V.LaRocca, Charles E.

Myers, Cy Stein e Anton Wellstein, residentes nos E.U.A. e Dr. Jorg Czech, Dr. Gerhard Dictoeite,

Dr. Hans Harald Sedlacelc e Dr. limar Schrinner, residentes na Alemanha Ocidental), para: 11ERO CBSSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACEUTICÃS OOEESN-DO XILANAS POLIMIDROGÉNO-SULFA-TÃDAS PARA O IRATAMSI^SO DE DOENÇAS CONDICIONADAS PILA PROLIFERAÇÃO CELULAR "

Descricão A presente invenção refere-se à utilização de xilanas polihidrogeno-sulfatadas para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de doenças que são condicionadas pelo crescimento irregular e não diferen ciado das células.

Ag xilanas polihidrogeno-sulfatadas são já conhecidas a partir de DE-A-36 01 136. AÍ é indicada para estes compostos a seguinte fórmula I - 1 - i

Também ali é descrito um efeito anti--retroviral para estes compostos. Sabe-se ainda que as xila-nas polihidrogeno-sulfatadas inibem a ligação de bFGF (basic Fibrosblast Growth Factor) à linha celular do cartinoma do córtex suprarenal (SW 13) (A. Wellstein et al./ Proc. o£ the American Association for Câncer Research (1980) 30,583).

Surpreendentemente^ descobriu-se agora que os compostos da fórmula geral I inibem as quinases com codificação oncógena e as tirosina-quinases dos receptores de factores de crescimento. Assim, são adequadas para o tratamento de doenças nas quais os receptores de factores de crescimento desempenham um papel importante, em especial da psoríase e de doenças tumorais. A expressão de agentes oncógenos na célula dos mamíferos está associado a transição do tipo celular normal para um tipo celular transformado, que depois passa a uma célula cancerígena. A transformação pode ser provocada pela infecção de uma célula por um retrovirus. Um exemplo bera conhecido é a infecção de frangos com o vírus do sarcona Rous, que depois desenvolvem cancro. 0 respectivo agente oncógeno, que é responsável pela transformação maligna, foi denominado gena "SRC"-(sarcoma). Muitos dos agentes oncógenos até agora conhecidos caracterizam-se pela expressão de urna proteína com actividade de uma quinase. Os enzimas catalisam a transferência do grupo fosfato terminal do ATP para uma 2

arainoácião. Ao contrário de muitas outras proteina-quinase, que transferem o grupo fosfato para um radical serilo ou treonilo, a maior parte das guinases com codificação oncóge-na;fosforilam o radical tirosilo da cadeia proteica. Para além disso, sabe-se que os produtos de agentes oncógenos, nomeadamente os doâ agentes oncógenos, v-mos, v-mil e v-raf, possuem uma actividade de proteina-quinase específica da sérina/treonina. A actividade de tirosina-quinase é também expressa nos receptores de factores de crescimento? os novos conhecimentos revelaram agora que difersites doenças nas quais a proliferação celular desempenha um papel importante, por exemplo a psoríase e o crescimento de muitos tumores, dependem da presença de factores de crescimento, tais como o Epidermal Growth Factor (EGF), 1‘ransforming Growth Factor alfa (TGF alfa), Piatelet Derived Growth ~ Ci

Factor (PDGF) ou Fibroblast Growth Factor (FGF básico, FGF ácido). No seguimento da ligação do factor de crescimento ao seu receptor é estimulada a tirosina-quinase, que cons tituiu uma componente própria do receptor do factor de crescimento .

Assim, um inibidor da tirosina-quinase de um receptor de factor de crescimento inibe portanto o crescimento celular e portanto também, por exemplo o desenvolvimento e proliferação de tumores. Pode, pois, ser utilizado no tratamento dos tumores e no tratamento de todas as doenças nas quais o crescimento celular desempenha um japel importante (p.e., na psoríase).

Objecto da presente invenção é pois a utilização de um composto da fórmula geral I 3

Η

η na qaal n representa 1 a 20, de preferAnc±a S a 10, e era especial 9, ou misturas com um peso molecular médio de aprox. 1.000 até 20.000 Dalton, de preferência de aprox. 5.000 ate 12.000 Dalto, e em especial aprox. 6.000 Dalton (n-9), para a preparação de composições farmacêuticas para a inibição de t irosina-quinases cora codificação oncógena, tirosina--quinases dos receptores de factores de crescimento e da inter -relação factor de crescimento / receptor do factor de crescimento, e portanto para o tratamento de doentes condicionadas pela proliferação celular, em especial da psoríase e de doenças tumorais.

Tais tumores são em especial carcinomas e sarcomas, tais como o carcinoma do rim, o carcinoma da mama, o carcinoma da próstata, o carcinoma do pulmão, o carcinoma do ovário ou o rabdomiosarcoma ou o rnelanoma.

Os compostos a que se refere a presente invenção possuem propriedades farmacológicas vantajosas, pois inibem o crescimento e proliferação de tumores e podem, portanto, ser utilizados no tratamento dos tumores e no tratamento de todas as doenças condicionadas pela proliferação celular, ou seja, doenças que se caracterisam por um crescimento celular desregulado e não diferenciado.

Para esse efeito, os compostos da fórmula geral I podem ser utilizados como tais, em combinação ou

* V

sob a forma dos seus sais de adição a ácidos farmacologica-raente toleráveis. A preparação de uma composição farmacêutica adequada faz-se incorporando gs ingredientes activos, eventual-mente com adjuvantes e/ou excipientes, numa formulação galanica adequada.

Oe exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a presente invenção.

S-iPLOS I*este da Inibição da Tirosina-quinase do Re-

ceotor do SGF

Material de partida para a actividade da tirosina-guinase foi a célula tumoral humana A 431 (ATCC CRL 1555), que foi cultivada em meio RK-II 1640 4* 10% de FK3. 3sta linha celular exprima sobre a superfície celular um elevado numero de receptores de SGF, que possuem actividade de tLrosina --quinase.

Ag células foram cultivadas quase até à confluência, lavadas com PBS (Phosphate Buffered Salina, pK 7,2), raspadas dos frascos de cultura e incubadas durante 1 hora a 4°C, 20x (?) e centrifuçadas a 1000 g durante 3o·. Gentrifugar o sobrenadante durante mais 20 minutos a 20000 g e retomar o pellet como preparação d a membrana de 1 x 10^ células em 100 ^il. A actividade de tirosina-guinase do receptor de SGF foi medida com P0li (Glu, Αχβ, Tvr), (6:3:1) como substrato. As membranas celulares foram previamente tratadas com 100 nM de SGF durante 15' à temperatura ambiente, e depois * adicionadas à mistura contendo o inibidor, substrato (3 mg/ . /ml), Kg2+/mN2+ (S trM/1, 6 mi-í), 0,16% de Triton ii-100 e orto- 5 1 κ

—vanadato de sódio (20 jai-l) em 100 roM de riSíPBS (acido N—2— -hiároxietil-piperazina-H'-2-etanosulfónico), pH Ί, 5, previa-mente incubadas e a reacção foi iniciada através da adição de gama- P ATP (32 uM) . Passados 15* a 30 C, o substrato foi precipitado com TCA a lo% (acido tricloro-acético), filtrado sobre uma "Millititer Filtration Piate" (Millipore Corporation/ Mass., USA)/ lavado e seco. A incorporação de P foi determinada çom o auxílio de um contador de cintilação em líquidos.

Resultadosi A xilana polihidrogeno-sulfatada (n=9) foi testada nurna concentração máxima de 1460 ^ug/ml e diluída progressivamente Is 10. A IG,-0 representa a concentração com a qual é inibida a 50% da actividade enzimática inicial. Para a tirosina-quinase dos receptores de EGF foi determinado um valor de 6 ^ug/ml (Tabela 1).

Tabela 1

Inibição da actividade enzimática de proteína-quinase pela xilanas polihidrogeno-sulfatadas (fórmula geral 1/ na qual n=9)

IC50 em jig/ml IC5q em,ug/ml tirosina-qui- proteina-qui-nase dos recep- nase dependen-tores do SGF te de cAMP

Xilana polihidrogeno- -sulfatada (n = 9) 6 884

Teste da Inibição da proteina-guinase dependente de 3^51 - cAMP por A subunidade catalítica da proteína-quinase dependente de cAMP (Sigma) foi reconstituída conforme descrito 6 i

Sigma- (.giçrna Chemical Co., St. Lotiis, MO, USA) . A actividade enzimática foi medida com Kemptid (Sigma) (Leu-Arg-Arg-Ala--Ser-Leu-Gly) como substrato. 0 inibidor foi previamente incubado com enzima, substrato (190 jiM) , Pg (5mM), 0,25 mg/ml de BSA e 3,75 nM de mercapto-etanol em 50 mM de MO PS (ácido 4-morfolino-propano-sulfónico), pH 6.9. A reacção foi

Q O iniciada através da adição de gama- P ATP (40 >uM). Passados 15* a 30°C vazou-se uma parte aliguota sobre resina de permuta ionica p81 (2 x 2 cm? Mi.atman Papel Ltd, Grã-Bretanha), introduziu-se em K,P0, 75 tiM, lavou-se, secou-se e mediu-se a 32^ 4 incorporação de P por meio de um contador de cintilação em lícruidos.

Resultados í A xilana polihidrogeno-sulfatada (n=9) foi testada numa concentração máxima de 1142 e diluída se progresivamente lílo. A IG5q é a concentração gue inibe 50% da actividade enzirnática inicial. A IC^ para a proteína-guina dependente de cAMP foi de 884 jug/ml (Tabela 1), i.e. a xilana polihidrogeno-sulfatada (n=9) é um inibidor específico da tirosina-quinase.

Inibição do crescimento não aderente de A 549 (linha celular do carcinoma pulmonar humano), de A 204 (linha celular do rabdomiosarcoma humano), de ΡΆ-1 (linha celular do teratocarcinoma ovário humano), de MDA-MB231, MAD-M3468 (linahs celulares do carcinoma da mama humano), de LnCaP (1 inha celular do carcina da próstata humano) e de HRIC (fibroblastos do rim normal de ratazana). O teste foi realizado de acordo cora a metodologia descrita por Hamburger e Salmon (J. Natl. Câncer Inst. 66, 981-988, 1981), com as modificações abaixo indicadas. O meio de cultura condicionado foi substituído por meio RPMI 164o (A 549, A 204, PA-1) ou rneio IMEM (todas as restantes linhas celulares) v 10% de FKS (soro fatal 7 Λ,

de vitelo) . Em conseauAncia da elevada taxa de clonação das **" ô linhas celulares tumorais em Soft /Ag-ar, o número de células tumorais por placa foi reduzida no caso de A 549 para 3 x 10 , s para todas as restantes células para 10 10 J. As células foram semeadas num sistema de agar-agar em duas camadas como camada superior, de acordo com o método de Hamburger e Salmcn (J. Natl. Câncer Inst. 66, 981-988, 1981), sendo misturadas à camada superior de agar-agar, antes da sementeira das células, diferentes concentrações do composto a testar ± 3GF adicional (Spidermal Growth Factor) (1 nK) ou + bFGF adicional (Fibroblast Growth Vactor alcalino) (100 ng/ml).

As placas foram incubadas numa estufa com 5% de CG2, 20% de o9 e 95% de humidade relativa durante 10 dias (A 549 e A 204), 18 dias (PA-1) ou 15 dias (todas as restantes células) . Passado esse tempo, as colónias cora ura diâmetro superior a 60 forara contadas com o auxílio de um aparelho de analise de imagem. Como IC^ foi indicada a con-centraçlo de substâncias com a qual o número de colónias era reduzido para metade. O coeficiente de variação nas experiências repetidas foi inferior a 15%.

Resultadoí

As xilanas polihidrogeno-sulfatadas (n=9) inibem a proliferação de linhas celulares que apresentam recep-tores de tirosina-fosfoquinase para diferentes factores de crescimento. Assim, verifica-se uma inibição da multiplicação celular, independenteaente de ter ou não sido adicionado com-plementarmente o respectivo factor de crescimento (ver 1, 2 e 4 na Tabela 2).

Nas células, que apenas se multiplicam na presença de um factor de crescimento (na cultura celular) observam-se igualmente uma inibição (ver 3). As células que não dependem de factores de crescimento (ver 5) não são influenciadas. 8 i τ nou-se a IC^ de x incubação contínua

Com base na curva de dose-efeito determi-ilana polihídrogeno-sulfatada (n=9) para a . Os resultados foram os seguintes:

Tabela 2

Linha celular tumoral IC50 ^ ^9/^1) 29 (-EGF/ 59 (+ EGF) 4 (-bFGF) 6 (-3-bFGF) 34 (+bFGF) (sem bFGF nenhumas colónias) 200 (-bFGF) 40 60 Inibição do Crescimento do Tumor Humano no Ensaio da Capsula Renal (Ratinho Pelado) 1. A 549 2. ΡΆ-1 3. A 204 4 · 5. LNcap MDA 468 MR.K MDA 231

dependente de EGF 1. Tratamento do Tumor

Os tumores humanos a testar são mantidos e passados por rotina em ratinhos CDl nu/nu. 0 tumor é retirado em condições asséiticas, e liberto do tecido conjunti-vo e das partes necróticas, cortado e digerido com 2-í* 20 ml da seguinte solução (100 ml de PBS sem Ca e Mg" com 800 mg de colagens se (Serva 0.6-0· 8 U/ml) * 2 mg de DMAse). Incubação 2h, a 37°G/ agitando conti-nuamente. Em seguida filtrar a suspensão celular através de uma rede de nylon (diâmdro das malhas 51 um) * 9-)- ' 9-h e lavar por tres vezes com PBS isento de Co e Hg·" .

Em seguida contar as células e fazer os pellets. 9

V

2. Incorporação das células em Pedaços de Fibrina

Humedecer a parede interna de um capilar de vidro de 50 ^jul (diâmetro 1.5 mm) com uma solução de trombina/ /CaCl2 (50 unidades de trombina em 1 ml de CaCl2 40 mmol/1).

Suspender o pellet da linha celular (tumor ou linba tumo-ral) numa solução de fibrogénio coagulavel, tal como p

Beriplast (Behringwerke AG) e diluir com RPMI + 15% de FKS na proporção de 1í2, de modo a obter uma con-centração celular final de 10 células/50 ^μΐ. Aspirar esta suspensão rapidamente para dentro das capilares.

Depois da solidificação da mistura de células e fibri-na (aprox. 5 minutos â temperatura ambiente), remover os cilindros de fibrina das capilares para caixas de Petri, utilizando pressão de ar. Cortar os cilindros de fibrina em pedaços de 2 mm (correspondente a 5 x 10 células/pedaço), e armazenar os pedaços em RPMI + 15% de FKS até à implantação. 3. Implantaçãoí

Anestesiar os animais com Nenibutal (diluído 1:7 com solução salina fisiológica; 0,1 ml/10 g de ratinho).

Expor os rins através de um corte de 1.5 cm de comprimento nos flancos. Abrir a cápsula renal e transferir um único pedaço de fibrina colocando-o sob a cápsula renal. Em seguida medir os dois diâmetros do pedaço implantado com o auxílio de um microscópio equipado com micrómetro ocular. Determchnar a dimensão do tumor de acordo com a fórmula V « a x b# em que V = dimensão do tumor, a maior diâmetro do tumor e b = diâmetro perpendicular a a.

Depois de fechar o peritoneo com adesivo tecidular (Histoacryl) e fixar a pele por meio de pinças. 10 'ΙΊμ·· · *

Tratamento:

Administrar as xilanas polihidrogeno-sulfa-tadas (n=9) diariamente por via i.v. 2-10 com a dose máxima tolerável e com 2/3 da dose máxima tolerável, de acordo com os ensaios preliminares.

Medições

Ao 202 dia após a implantação os animais são sacrificados, expõe-se os rins e mede-se de novo a dimensão dos tumores. A eficácia das substâncias a testar é determinada através da inibição do crescimento dos tumores. A dimensão relativa dos tumores VR é calculada de acordo com a fórmula V_ - V /V em que V. é a dimen-

K *C O “C são do tumor no final do ensaio (dia 2o) e V é a dimensão o do pedaço de fibrina com tumor no dia da implantação.

Sm seguida, calcular a mediana da dimensão tumoral relativa do grupo tratado (v,^) em relação à respectiva mediana da dimensão tumoral relativa do grupo de controle (Vç), e calcular T/C % = V(p/V^ x 100. A significância estatística do efeito anti--tumoral é calculada com o auxílio do teste U de Wilcoxon.

Ag dimensões tumorais relativas no grupo tratado são comparadas com as respectivas dimensões relativas no grupo de controla, e alteração da dimensão tumoral é considerada específica da substância se for estatisticamente significativa com p 0.05. 11 -

Resultados:

Tabela 3

Tumor EXF 529 (carcinoma brônquico humano) MCP7 (carcinoma da mama humano) Oyar-6 (carcinoma do ovário humano) PaTu 890 2 (carcinoma do pancreas humano) HT 29 (carcinoma do cólon humano)

Dose Actividade (T/C %) 20 mg/kg 70 30 mg/kg 71 20 mg/kg 66 30 mg/kg 65 n.s. 20 mg/kg 78 n.s. 30 mg/kg 66 20 mg/kg 56 30 mg/kg 27 20 mg/kg 71 30 mg/kg 76 n.s. n.s: = não significativo

Inibição do Crescimento dos Tumores Humanos em Tumores Humanos cora Crescimento Subcutâneo (Ratinho Pelado) 0a tumores humanos testados foram mantidos e passados por rotina em ratinhos CD1 nu/nu. Em cada terceira passagem testou-se o carácter humano dos tumores, através de imunohistologia com anticorpos monoclonais. Retirar os tumores em condições assépticas e cortar em pequenos 3 pedaços com um volume de aproximadamente 1-10 mm . Implantar respectivamente um pedaço de tumor por via subcutânea, no lombo de cada ratinho pelado. Passados 7-14 dias o pedaço de tumor infiltrou-se nos tecidos circundantes e calcula-se a dimensão do tumor a partir dos seus dois diâmetros, de acordo com a seguinte fórmula: V » a x b (ver acima).

Este processo é repetido duas vezes por semana, e apenas são distribuidos aleatoriamente pelo grupo de controle e pelo grupo a tratar, animais com um crescimento - 12 -

tumoral progressivo. Seio utilizados cinco ratinhos por grupo. Com início no dia da distribuição aleatória, os animais são tratados por via intravenosa, de acordo com o esquema apresentado nos "Resultados". São utilizados duas dosagens para cada substancia. As dosagens seleccionadas são idênticas à dose máxima tolerável (MTD), que foi anteriormente determinada para cada substância a testar num ensaio experimental suplementar realizado com ratinhos pelados.

Os dois diâmetros dos tumores são medidos duas vezes por semana para cada ratinho, e calcula-se a res-pectiva área tumoral individual, de acordo com a fórmula acima indicada.

Avaliação:

Calcular como anteriormente a dimensão tumoral relativa VD e T/C %. A significância estatística do efeito anti-tumoral e calculada por meio do teste U de Wilcoxon. Comparar as dimensões tumorais relativas no grupo tratado com as respectivas dimensões tumorais relativas do grupo de controle, referentes ao mesmo dia de ensaio. A alteração da área tumoral só é considerada específica da substância se for estatisticamente significativa com p ^ 0.05.

Resultados:

Tabela 4

Substância Tumor

Xilanas poli hidrogeno-sulfatadas (n-9) B 17 (carcinoma brònquico humano

Dose -k I ll — ............ 15 mg/kg

Esquema QD9 x i.v.

Actividade (dia 9) s (T/C %) 61.4 20 mg/kg QD9 x i.v. 68,9 13 -

Claims (1)

1. - 12 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de doenças condicionadas por um crescimento celular desregrado e indiferenciado, nomeadamente para o tratamento de carcinoma ou de sarcomas, melanomas, isoríase, e com efeito inibidor sobre as cinases com codificação oncóçena e/ou tirosina-cinase receptoras de factoresde crescimento, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto da fórmula geral I H

   na qual n representa 1 a 20, de preferência 8 a 10, e em especial 9 ou um dos seus sais farmacologicamente toleráveis, numa formulação galénica adequada para essa aplicação. - 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma composição farmacêutica para o tratamento de carcinoma ou de sarcomas. 14 I * * - 3ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças renais, carcinoma da mama, carcinoma da próstata, carcinoma do pulmão, carcinoma do ovário, rabdomiossarcoma, melanoma ou da psoríase. _ 4§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma composição farmacêutica com um efeito inibidor sobre as cinases com codificação oncó· gena e/ou tirosina-cinases receptoras de factores de crescimer}· to. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemã apresentado em 2 de Junho de 1989, sob o Ns P 39 17 982.6. Lisboa, 31 de Maio de 1990 ® â$SE!B GZíDIlli DL LJ ·,·.

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