PT93773A - Processo para a preparacao de aminoacidos protegidos - Google Patents

Description

u presente invento di3 respeito a derivadas ds afflinoâ-cidos con tendo grupos N-tritil-carbameíloj a processos para a sua preparação e à sua utilizaçSa na sintess ds psotidstjs,

Ds grupos amída dos amirioácidos asparagins a glutamina slo frequentemente responsáveis por rsacçSes secundárias indsss·-jadas no decurso da síntese de peptídeos» por exemplo a desidratação que dá crigera ao nitrilo5 a ciclizaçlo intramo1ecular qus dá origem â imida e5 no caso do aminoácido glutamina? a formação de pirrolidona» Além disso9 observa-se frequentemente no decurso da síntese em fase sólida com glutamina uma ausência de dilatação por parte das resinas-peptídeos qus é consequência da formaçao inisrmolecular de 1igações a átomos de hidrogénio s que dá origem a um reduzida número ds acoplamentos.

Estas desvantagens pode® ser evitadas mediante a prctecção dos grupos carbamoilo da asparagina e cia glutamina, Os grupos protectores frequentemente utilizadas são o 4?4'-dimetoxi~ •-•mstilo <di-t4-©@toxi—feni 1 3-meti io9 454' -dxmetoxi~benzidrilos abreviatura 5 iibh? ou o 294Pé“-tri®eto5<i~benzilo (abreviaturas Tmob) r;

Contudo, ds inventores do presente invento descobriram rscsntsments sarem os próprias grupos cai-bamaila conhecidos até à data os responsáveis5 em determinados casos, por reacções secundárias indessjadas no decurso da sua eliminação. Este fenómeno hem lugar em consequência de os carbocaiiões formados no decurso d® eliminação acidaiítica reagirem quase imsdia iamente e ds uma forma irreversível com iriptofano»

Partindo desta descoberta que5 coma ponto de partida, jâ é em certa medida objecto tío presente invento, o ohjectivo dos .i.nvsntorss tío presente inventa concentrou—ss na descoberta de um grupa carbaraaíla qus nSo dt origem às referidas reacçSes secundárias e na preparaçSo dos correspondentes derivados de aminoácitíos protegidos« 0 presente invento dis respeito a compostos da fórmula

O (I)

RrNH-HC-C-0-R2 (ÇH2)n o=c-nh-r3 ssm que n representa i ou 2, representa hidrogénio ou um grupo protector ds ssnino, R.~> representa hidroqênio ou um grupo protec-ior ds carboxilo e RT representa trifsnilmetilo, 4-manomstoxi--tritilo ou 4?4'-difnetoKi-tritilo? a sais dos referidos compostos que contenham um grupo formador de sais e a derivados de ácido carboxilico rsactivos daqueles compostos da fórmula I em que representa hidrogénio. A confiquraçao em torno do átomo HC assimétrico á (DSL>=, CD) ou, preferancialmente* <L> „

Na sintess ds pept.ídeos3 os compostos da fórmula I náo revelam qualquer acçSo de alquilação em relação à cadeia lateral indole do triptofano. Além disso5 a sua ohtençãcs é mais fácil5 sáo mais solúveis em solventes orgânicos e o seu grupo protector de amido pode ser mais facilmente eliminado com ácido trifluoro-acetico do que bí» compostos análogos em que representa 2 ç4«ó-·--1 r i ms tο μ i ~ bsn silo (Tmob) ou d i- < 4~metox i~f en i 1) -meti 1 o (Mbh)« Por exemplo3 as meias-vi cias ds Fmoc-SlnCTrt)“OH3 Fmoc-θΐπíTmob)-"•□H e Fmoc-Sln C Mbh) -OH na decurso da clivagem em (ácido y $

trif luoroacético) /1 <,2-dicXaraetano (isi) a 22 °U sla da 2,9 e 27 minutas !S rsspsc tivamsn te *

Os derivadas ds ácido carbcxílico raactivas dos compostos da fórmula 1 são nitidamante mais estáveis sob condições de acoplamento» isto s = na presença de catalisadores de acoplamento tais como i-hidraxi-iH-benzotriasale < HOBt) e na presença de solventes geralmenta utilizados em rsacçSes de acoplamento na síntese de peptídeos, por exemplo dimstilacstaffliua (DMA) e 1 j,2"dicloro--atano íDIEA) , que os compostos análogos em que Fu representa hidrogénio» Por exemplo» as meias-vidas na decomposição ri® Fmoc-Asn-O-Tcp e Fmoc-Asn-O-Pip (Fmoc=9-fluorofeni i-meic-vi-carbcnila, Pfpepentafluora-fenila, Tcp=2=4,5-tricloro-fenilo) em DMA -í- í equivalente de HOBt -f- i ,7 equivalentes cie DIEA são apenas 2 minutos e mesmo menos de 1. minuto, respectivamente , snauáfito que os cosspostsD análcqos em que representa um O* radical tritilo slo coropletamente estáveis sob as mesmas condi-çóss „

Surpreendentemente , os volumosos grupos profcectores tritilo não diminuam a velocidade das rsacçSes ds acoplamento» Pelo contrário? nSo tfm virtualmente qualquer efeito sobre a velocidade das reacçSes de acoplamento. A introdução e eliminação ds grupos protectores é descrita» por exemplo em "Protective Sroups in Organic Chsmistry" (Grupas Protectores em Química Orgânica), Plenum Press» Londres, Mova Iorque5 5.973= em “Methodem der organischen Chemie" (Métodos da Química Orgânica)» Houben-Wayl, 4ã edição, vol* 15/i, Seorg--Thieme Verlag, Estugarda, 1974 s em Tbeodora W. Sreane , "Protective Sroups in Organic Synthesis" (Grupos Protectores em Síntese Orgânica)| John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1981» Consti-cux uma caractsristica dos grupos protec tores a sua fácil ϊ

eliminsçlCi, isto é? sem que tenham lugar rsacçSss secundárias indesejadas, por exemplo mediante solvólise, redução, fotólise ou ainda sob condições fisiológicas»

Um grupo amino protegido R^-NH pede ancontrar-ss sob a forma de um aos grupos facilmente cliváveis acilamino» arilmetil-amino, mercaptosmino eterifiçado» Ξ-acil-íalq-l-usnilo inferior>--•amino ou si li lamino»

Acila representa num correspondente grupo acilamino, por exemplo, o radical acilo de um ácido csrboxilico orgânico cora, por exemplo, um máximo de 18 átomos de carbono, em particular da um ácido alcanocarboxílico facultativamsnts substituído» por exemplo, com halogênio cu arilc ou um ácido bsncáico faculta-tivsmente substituída, por exemplo, com halogênio. alcoxi inferior ou nitro ou um monoéster d© ácido carbónico» Btío sKsrapias destes grupos acilos alcanoílo inferior tal como formilo» acetilo ou própionilo, halogsnc-íalcanoilo inferior) tal como 2-haIogenoacstila» em particular 2-clora~s 2-bromo-5 2-iado-, 25252~frif1uoro- ou 2,2,2-tFieIoroacetilo, benzoilo facultativa-mente substituído, por exemplo, com bslogénio» alcoxi inferior ou nitra5 par exemplo benzaílo, 4~c 1 oroben.soíIo, 4-nBstoxibensoí 1c ou f-nitrcbencoílo» ou (alcoxi inferioricarbonilc ramificado na posição 1 do radical alquilo inferior ou adequadsraant© substituído nas posições 1 ou 2, em particular t-íalcoxi inferior>carboni~ 1g5 por exemplo t-butiloxicarhonilo, ari1metoxicarboni1o com um ou dois radicais arilo que representam da preferencia fenilo f aeultativamente mono- ou polissubstituidc» por exemplo com alquilo inferior, por exemplo t-Calouilo inferior) tal como t-buiilo, alcoxi inferior tal como metos<i, hidroxi, halogênio» por exemplo cloro e/ou nitra» tal como benziloxicarbonilo facul-tativamsnts substituído, por exemplo 4-nitrobenziIoKÍcarfaonilo, cu d i f en i i me icx ic a rbon i i α substituído» por exemplo ben zidri 1okicarbon ila ou d i-< 4-mstox i f©n i1)-metox icarbon i 1 o * araílmetoxicarbonilo em que o grupo aroílo representa de preferência bensoilo f ac u i ta fc i vamen te substituída* por exemplo cora halogénio tal como bromo* por exemplo fenaciloxicarbonilo, 2“halogena”<slcoxi infsriorícarhonila* por exemplo 2*2*2—triclo-rostoxicarfaoni 1 o * 2-bromoetoxicarboni lo ou 2-iodoe toxicarbon£ 1 o * ou 2-(sililo trissubstituídaJ-etoxicarbonilo em que os sutasti-·-tuintss representam ambos* indepentíentemente um do outro* um radical hidrocarboneto alifático* araiifático* cicloalifâtico ou aromático facuitativamente substituído Cpor exemplo substituído com alquilo inferior* alcoxi inferior* arilo* halogénio ou nitro) com um máximo da 15 átomos de C* tal como um dos radicais adequados alquilo inferior* fenil-Ialquilo inferior)* cicloalquilo ou fenilo facultativamente substituídos* por exemplo 2-tri-íalquii inferiar)si 1 i 1.atoxicarbonilo tal corno 2-1rimetilsili 1 etoxicarho~ nilo ou 2”< di-n-buti1-metiI-si1i1)-etoxicarbonilo * ou 2-triaril-si3 ílatoxicarbonilo tal coso 2-trifenilsiIiIetoxicarhonilo» S&:? também radicais acilo adequados como grupos protestares Fq os radicais apropriados dos ácidos fosfórico* fosfónica ou fosfínico orgânicos* tais coma di-talquil inferior>fosforilo* por exemplo dimefcá.1 fosfori la* tíietilfosforilo* di-n-propi1fasfo-rila ou d i-isopropi1fosfori1o * dicicloalquilfcsforilo* por exemplo dicicloftexi1fosfori1o* difeni1fosfori1o facultativamente substituído * por ® s? amplo difenilfosforilo ou difenil fosfori la facuitativamente substituído com nitro* di-ífsnil-Calquil inferior! )-fosforilo* por e5íemplo dibensilfosforilo ou di-<4-nitro-bencil)-fosforilo* feniloxifenilfosfonilo facu1 ta ti vamen te substituído * por exemplo feniloxifeniltosfanilo* di-íalquil inferior)fosfinilo* por exemplo dietilfosfinilo* ou difsnilfosfi-nila facultativamente substituído* por exemplo difsnilfosfinilo.

Os radicais arila de um grupa arilmetilamina representado por um grupo mono·-, di- ou, em particular, trimetilamino são sspecialmente radicais fsnilo facultativamenie substituídos. São exemplos destes gruposs benzi1-, difenilmetil- e, em particular, tritilamino»

Um grupo msrcapto eieriíiçado num grupo smino protegido com um radical deste tipo é primariamente ariltio ou aril-íaJ.qui 1 inferior)tio em que ariio representa, em particular, fenilo facultativamsnts substituído» por exemplo, com alquilo inferior tal como meti lo ou t-metilo, alcoxi inferior tal como metoxi, halogénio tal como cloro, e/ou nitro ou, em particular, um manoésfer de ácido carbónico tal como um monoCéster alquíiico inferior tis ácido carbónico)» Slo grupos protestares adequados: í-Calcanoil inferior)-prop~l-en~2-ilo, por exemplo 1-acetil-prop--i-en-S-ilo, ou l-<alcoxi inferior>carboni1-prop-l-en-2-i1o, por exemplo 1-etoxicarbon i1-prop-i-en-2-i1o» São grupos protectores de amino preferidos os radicais acilo de íTiOnoéstares de ácido carbónico, em particular t-butilo-xicarbonilo, faenziloxicarbonilo facultativamente substituído, por exemplo do modo atrás referido, por exemplo 4-nxtro--benciloKicar-bonilo ou tiifenilmetoxicarbonilo ou 2~ha1ogeno-(a1coxi inferior)-carbonilo, tal como 2,2,2-tricloroetoxicarboni1o, ou aliloxicas— boniio e grupos protectores relacionados com este último ou, ss psc i a 1 mar! t e, 9—f 1 uoren i 1 -meto xicar bon i 1 o»

Os grupos protectores de carhoxila R^, são narmalmente grupos esterificadores, principalmente grupos alquilo inferior ramificados na posição 1 ou adequadamer, te substituídos nas posições i ou 2« São grupos carboxilo esterifiçados preferidos, entre outros, os seguintess t-Calcoxi inferior)carboni1o, por exemplo t-butiloxicarbonilo, arilmetoxicarbonilo com um ou dois radicais arilo, representando este última radicais fsnilo faculta ti vamsn te mono- ou polissubsiiiuídosj, por exemplo com alquilo inferior tal como t-íalquilo inferior), por sxsmglo t-butiIo5 alcoxi inferior tal como meter;i,, hidroxi, halogénio, por £;;as,ãu cloro,, s/ou nitro,, tal como benz iIox ic arbcni 1 o facu 1tativamenis substituído,, por exemplo da modo atrás referido,, por exemplo 4~me tα x i h®n z i1ox zc arbon i1o ou 4~nitrcbsnziloxicarbarsilo., ou d i f en i 1 -meto x i c a r bon ilo ou d i — < 4-meto x i f sn i 1) ~ms toxica r bon i l o 3 :l·--(alcoxi inferior)-(alcoMÍ inf srior)carboni 1 o9 tal como metoxi-me toxicarboni 1 o5, i-metoxietoxi-carhonilo ou l-etoximetoxicarboni- Ια,, 1.....(alquil inísrior)tio-Calcdkí inferior )carbonilo,= tal como i -me tilt i. orne toxicar bon í 1 o ou 1 -et i X tioetox ica r bon i lo,, a ro i 1 meto ·· xxcarhon.ilo em que o grupo aroílo representa benzoilo facultati-vsmente substituído, por exemples com hâlogénicu tal como bromo3 por exemplo fenaciloxicarbonilo, 2-h&logsno~-<aIcoHi inf srior )esr-· boniloj por exemplo 2?2?2-tricloraetoxicarbonilO|, 2-bromoetoxi-carhonilo ou 2-iodoetoxicarbonilo ou 2-C si 1i1 trissubstiiuído>~ -etaxicarbonilo em que os substituir?tes representai?? cada um,, indspendsniesrienis dos outros9 um radical hidrocarhoneto alifáti-CQ,, aralifàtico,; cicloalifático ou aromático facultativamente substituído (por exempla substituída com alquilo inferior,, alcoxi inferior,; arilo,, naloqénio e/ou nitro) tal como apropriados a vacultativamente substituídos radicais alquilo inferior? fenil-<alquilo inferior) ? cicloalquilo ou fenilas por exemplo 2-tri- .....(alquil inferior>siIil-etoxicarbcnila5 2-trimetilsililetoxicaí— bonilo ou 2—<di—n—buti1—metiIsi1il)—etoxicarbonilo? ou 2—triaril— si 1 i 1 stoxicarbcn;L 1 ou tal como 2-trifenilsililetoxicarbonilo» SSo grupos protectores t--( alcoxi inferior>carbonilQ? tal ρrincipalmente, benziloxicarbonilo pó? exemplo do modo atrás de carboxilo preferidos 5 c aso t~ou to x i ca r bon i1o s, facuitativamente substituídd 5 mencionado,, ! ’ tal como 4-rs i trobenc i laxicarbani lo, ou tíifenilmetoxicarbanila s5 em especial, 2-ítrimetiIsi1i1l-etoxicarbonilo»

Um grupo formador de sais nuss composto da fórmula 1 é, por exemplo, um grupo amino livrs ÍR1»H> ou um grupo carboxilc livre {R^=H)« Os compostos da fórmula I em que representa hidrogénio podem formar sais de adição de ácido, por exemplo com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido sulf&rico ou ácido fosfórico, du com adequados ácidos orgânicos carboxílicos ou sul fónicos, por exemplo ácido trifluoroacêfcico» Os compostos da fórmula I sm que R^ representa hidrogénio podem formar sais metálicos ou de amónio, por exemplo sais de metal alcalino ou sais de metal alcalino-terroso, por exempla sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou saís com amónia ou aminas orgânicas adequadas, sendo principalmente adequadas para a formação de sais as mono-, di- ou pollaminas primárias, secundárias ou terciárias alifáiicas, cicloaiiíáiicas, cicloalifático--alifáticas ou araiifáticas, hem cama as bases hetaroeíc1icas, tais como (alquil inferior)sminas, por exemplo trietilamina, hidroxi-íalquil inferior laminas, par exempla 2-hidraxietiI-amirm, bis-(2-hidroxietil)—amina, 2—hidroxietil-dietil—amina ou tri-í2--hidroxist.il >-amina, os ésteres alif áticos básicos de ácidos csrhoxílicos, por exemplo 4-affiino-taencoato ds 2-clietilaminoetila, {alquileno inferiorlaminas, por exemplo 1-sti1 pi peridina, ciclo-alquilaminas, por exemplo diciclohexilamina, ou bensilaminas, par exemplo iM,M' —dibenziletilenodiamina, e ainda as bases do tipo piritíina, por exemplo piridina, colidina ou quinolirsa»

Ds compostos da fórmula 1 em que e R„ representam hidrogénio podem formar sais internas. * 4

Estes sais podem ser utilizados nooeadamente na isolamento e purificação de compostos da fórmula 1 em que R4 e/ou I Λ- reprsssntam hidrogénio„

Os derivados de ácido carboxílico rssctivos de um composto da fórmula I em que R« representa hidrogénio sSo principal mente ésteres activados reactivos ou anidridas reacfciYos, e ainda amidas ciclicas reactivas»

Os ésteres da ácidos activados sSo, sm particular, ésteres insaturados no que diz respeita ao átomo ds carbono de IigaçSo do radical esterificador, por exemplo do tipo do éster vinílicd„ tal como os próprios ésteres vinilicos (que podem ser obtidos5 por exemplo mediante transesteríficação d© um éster apropriado com acetato de vinilop método do éster vinilíco activatio), ésteres carbamoilvinilicas iqus podem ser obtidos., par exemplo,, mediante q tratamento do ácido apropriado ccoí um reagente isoxazólioj método do 1,2-oxazóXio ou método de Wocídwarti), ou ésteres l-íalcoxi inferiorlvinílicos (que podem ser obtidos, por exemplo, mediante o tratamento do ácido apropriado com um (alcoxi inferior)acetileno| método do etoxiacatileno), ou ésteres do tipo amidino tais como ésteres amidino N,N'-dissubstituioo Cque podei» •ser obtidos, por exemplo, mediante o tratamento do ácido apropriado coro uroa carbodi-iroida N,1M‘-dissubstituida adequada , por exemplo N, N' -diciclohexi 1-carbodi-iroida| método da carbodi-imida) ou ésteres amidino N 3 N~d issubsti tu idos (que podem ser obtidas, por exemplo, mediante o tratamento do ácido apropriado com uma cianamida N,N-dissubsti tuída| método da cianamida), ésteres arilicos adequados, sm particular ésteres fenilicos adsquadamsnte substituídos, em particular com substiiuintes que atraem elec-irSes (que podem ser obtidos, por exemplo, mediante o tratamento tio ácido apropriado com um tonal adsquadamsnia substituído, por -exemplo 4-nitrof enol, 4-meti 1 suIfcni 1 -fenol, 2,4,5-triclorcfenol, * ΐ

2?3?4?5?6-ρ©ηtsclorafenol ? 253s45556-pentaf luorofenol ou 4~fen.il-tíiaxofsncl, na presença de um agente de condensação tal como iM;iW~diciclahsKil-c:arbotíi-iíaida§ método da sster arilica activa-do)5 ésteres cianometilicos íqus podem ser obtidos, por exemplo* mediante α tratamento do ácido apropriado com cloraacetonitrilo na presença de uma basef método do éster cianamet£lico> * tioésteres ? em particular tioésteres fenilicos facultativaments substituídos, por exemplo com nitro (que podem ser obtidos, por exemplo, mediante o tratamento da ácida apropriada cam fciafené-is facu1is ti vamente substituídos, por exemplo com nitro, nomeadamen-te mediante o método do anidrido ou da carbodi-imidai método da tiolèster activado), ésteres de amino ou de amido (que podem ser obtidos, par exempla mediante o tratamento do ácido apropriada com um composto N-hidroKi.--ami.no ou N-hidroxi—amido* por exemplo M-hidraxi-succinimida, N--hidrox i~5-norbornsno~2,3-dicarbOKÍrnida* M-h i d ro x i-pi per id ina, N-hidroxi—ffcalimida* l-hidroKi-bensotriaso-le ou 3?4-di~hidro~3-hidroKÍ-4—οκό-i ?2,3-ben2otriasina5 por eλempio mediante α método do anidrido ou da carbodi-imida5 método do éster de N-bidroxi activado) ou ésteres siiiliças (que padsm ser obtidos, por exemplo, mediante o tratamento tío ácido apropriado com um agente da si1 ilação* por exemplo hexameti1dissi1a-cano s que reagem prontausente com hidroxilo mas nlo com grupos amino)

Os anidridos dos ácidos podem ser simétricos ou, de preferencia, ser anidridos mistas desses ácidos, por exempla, anidridos com ácidos inorgânicos, tais como hslstos ácidos, em particular cloretos ácidos (que podem ser obtidos, por exempla, mediar»te o tratamento do ácido apropriado com cloreto de tionilo, pentacioreta de fósforo ou cloreto de axalilop método da cloreto ácido), âHitias (que podem ser obtidas, por exemplo* a partir de um éster de um ácido apropriado por intermédio da corresponder»ts hidrasida e do tratamento desta com ácido nitrosos método da A 1

acida), anidridos com mono-derivados de ácido carbónico., tal como com ésteres apropriados» por exemplo inono-éstsres íalquil infs~ rior)icos da ácido carbónico Cqus podem ser obtidos,, por exemplo» mediania α tratamento do correspondente ácido com íalquil infs-rIor)-haIogeno-··, tal como e: lorcrf crmiatos , ou com i~< alcoxi inferior)carbonil-2-CalcoKÍ inferior) ~ 1»3-tíi-hidrc-quxnolina» por exemplo i “· í a 1 c o x i in f srior) tar bon i 1 -2 -e t o x i --· 1,2 -d i. - h i d roq u 1 nα -iinap método do anidrido misto Q-alquil-carhónico>» ou anidridos com âcitío fosfórico di-halogenado, sm particular dic lorinado (que codam ser obtidos» por exemplo, mediante o tratamento do ácido correspondente com oxicioreto de fósforos método do oxiclareho de fósforo)» ou anidridos com ácidos orgânicos» tais como anidridos mistos com ácidos orgânicos carboxílicos íque podem ser obtidos, por exemplo» mediante o tratamento do ácido apropriado com um haleto da Calcano inferior)- ou fenilalcanocarbonilo» por exemplo cloreto de* fenilacstilo, de pivaloílo ou de trifluareanatilo$ método do anidrido misto carboxílico)» ou com ácidos orgânicos sul fónicos (que podam ser obtidos» par exempla» mediante o tratamento de um sal» tal como um sal de metal alcalino» do ácido apropriado com um halato de sulfonilo orgânico adequado, tal como cloreto de a1cano inferior ou de arilo, por exempla de metano ou de e.-~to 1 uenossu 1 foni 1 ορ método do anidrido misto sul fónico)» bem como anidridos simétricas íque podem ser obtidos, par exemplo, mediante condensação do ácido apropriado na presença de uma carbodi-imida ou de l-dietilaminoprapinai método do anidrido simétrico), SSo amidas cíclicas adequadas, sm particular» as amidas com compostos cíclicos diaca com 5 membros de naturszs. aromática, tais como amidas com imidazoles» por exemplo imidazols (que podem ser obtidas, por exemplo, mediante d tratamento do ácido apropriado com N»N'-carbonildi-isnidazole| método da imidazolida) ou pirazcíles, por exempla 3»5“dimetil-pirasale íque pode ser obtida, *. 1

por £K3fiiBiDs por intermédio da hidrazida ácida mediante o tratamento desta com acetilacetcna? método da pirazolida)«

As abreviaturas dos aminoácidos usadas no presente tento sao as usuaiss Asp designa ácido aspártico* Asn designa asparagina, Gin designa olicina* Ser designa s©rinas Leu designa leucinã:; Sli designa glicina* Lis designa Usina* His designa hisfcidina, Pro designa prolina* Tir designa tirosina5 Trp designa triptofano, Arg dssiqna arginirta, vai designa valina s lis designa isoleucina»

Em conformidade com as regras de nomenclatura interna-cionalments reconbecitíãs5 as abreviaturas dos aminoácidos usadas no prsssnts tento9 per exemplo as abreviaturas atrás mencionadas* designam o ácido livre ε, salvo cnençSo em contrário* a configura- gao 1...... 0 grupo s-amino deve ser considerado como estando situado à esquerda da abreviatura s o grupo carboxilo como estando situado è direita da abreviatura» A ausfncia ds mn átomo H no grupo a-amina é indicada por meio de um traço è esquerda da abreviatura do aminoácido e a aasáncia de dois átomos H é indicada por meio ds dois traços à esquerda da abreviatura» fi aus'ê'ncia de um grupo HO no grupo carboxilo é indicada por meio de um traço á direita da abreviatura» Os substitutotes da cadeia lateral de -SiTíinoácidos sáo colocadas entre parênteses imediatamente após o símbolo do aminoécido» For exempla* Z-Asn í Trt)-OH designa o composto da fórmula CIa>» ο Ο

li (L) II C6H5-CH2-0-C-NH-HÇ—C-OH CH2 i 0=C-NH-C(C6H3)3

As vantagens inerentes á utilização das compostas da fórmula 1 na síntese de psptídeos são ilustradas na secção dos Exemplos da presente memória descritiva^ A titulo de stemplo5 H~B1n-61η H31n-G1η-β1n-Set—Leu—B1i~0H é obtido sob a forma de produto bruto cora uraa pureza tís 92% quando α grupo carbamoílo dos resíduos de Bln ê protegido com tritilo no decurso da preparação * Sem esta protscção no decurso da síntese de Merrifield , o produto bruto apenas conterá 30% do produto desejado e não 92% como «ntsriormenta«

Os produtos brutos obtidos a partir das sínteses de Fmoc-Lis-Sln-Asn-Pro-Lis-Tir-Bln-Trp-Asn-OH5 estando os grupos carbamoílo da Asn s Bln protegidos com tritilo Cproduto bruto A) s com 2545ò~triraetoxi-toenzi1α (produto bruto B) confira cerca de 95% do produto dessjado? no caso do produto bruto A? e apenas cerca de 8% do produto desejados no caso do produto bruto B„

Os compostos da fórmula Ϊ podem ser usados como unidades estruturais na síntese de quaisquer psptídeos desejados que contenham resíduos de glutamina ©/ou ds asparagina ou como in terraediários para a preparação destas unidades estruturais * Ma síntese de psptídeos ds Merrífield usam-se aqueles compostos da 'fórmula T em que FM representa ura grupo pratector ds amino tal como 5 sm particulars 9-fluorofenil-metoKicarbonilo ou «Γ t

t-butiloxicarbonilo, R„ representa hidroqénio e K-. representa trif onilmstilo,, 4-mQnometoxi-triiilo ou 494'~dimetos<i~tritilo © os seus derivados de ácida carboxílica reactivas.

SaSCo compostos preferidos da fórmula I aqueles sm que

Fq representa ben z i 1 αχ icar bon i 1 o * 9-fluorenílmetaxicarbonilo, sliloxicarbonilo ou t-butiloxicarbonilo, R0 representa hidrogénio ‘ ~ e R~T representa trifenilmetilo.

Seio compostos particularmente preferidos da fórmula 7. os que ss encontram descritos nos Exemplos.

Entre os derivados de ácido cs.rboxí 1 ico precedentemente descritos em pormenor.. sSo particularmente dignos de menção os ésteres 2s455-tricloro-fenilicos, os ésteres pentafluoro-feni1i~ cós, cs ésteres com Í“hiuroMibsncotriacQÍs? com 3.4.....di-hiciro-3- -•!iidro:íi“4“-o;ío-“i 52?3"bensotr.íasina ou os snidridos. especialmente •aqueles derivados da ácido carboxilico reac ti vos dos compostos da fórmula I anieriormente assinalados como sendo preferidos.

Surprssndentsmants5 o grupo protsetor da amids R.v da acordo com o presente invento é estável no decurso da hidrogena-çsq catalítica sob condições em que o benziloxicarbonilo ou R.,. coma grupo protsetor de amino ou benzi Io coma grupo protecior de carboxilo já teriam sido eliminados. 0 qrupo protsetor R,. pode ~ ‘Jr ser eliminado, por exemplo» com íácido trifluoroacético)/água/” i ,2-etanod.itiol {9Θϊ5ϊ5> a uma temperatura situada entre a temperatura ambiente e +5β°Ό5 por exemplo a *3®°C=

Os compostos da fórmula 1 são preparados por um processo em si conhecido. 0 processo de preparaçSo da acordo com α presente invento caracteriza—se por a> se fazer reagir um composto da fórmula ϊ I ?

^ O

II r4-nh-h(|:-c-or2 (n) (ÇH2)n oc-nh2 e«i que Rfl representa hidrogénio ou um grupo protector de afflino estável soh as eondiçSes de rsacção s n s Fu tfm os significados atrás mencionados5 com um composto da fórmula m* —.....—............- (ΠΙ)

R3-OH sm que R7 tem o significado atrás mencionado* s se eliminam aqueles grupos protectores que nSo fazem parte do produto final, da fórmula I desejado do produto resultante* ou b> no caso cie se pretender preparar um composto da fórmula I em que R., representa um grupo protector da amino5 se introduzir um grupo protector cie amino num composto da fórmula geral Iv5

O

II H2N-(jB-C-OR2 (IV) (ÇH2)n o=c-nh-r3 em que n? R.·, e R·* t®m os significados atrás mencionados:; ou Λ. ·—* “ (V) c) -se fazer reagir um composta da férmula V5

O

R5-NH- H^-C-OR6 0=C-OH sm que n tem d significado atrás mencionado, R,_ representa um grupo protector de amino estável sob as condições de rescçlo s R, representa um qrupo protector de carbcnilo “ O *“ estável sob as condiçSes de reaccsa,, com um composto da fórmula VI„

R3-NH2 em que R^. tem o significado atrás mencionada, a se eliminam ·_!· aqueles grupos protsctores que nlo faze® parte do produto final da fórmula I desejado do produto resultante e, se desejado,, após a realizaçlo de um dos processos a),, b) ou c),: se converte um composto resultante tía fórmula Ϊ contendo um grupo formador de sais num seu sal,, ou se converte um sal resultante no seu composto livre,, ou se converte um composto resultante da fórmula I em que R? representa hidrogénio num seu derivado ds ácido carfeCHílico reactivo*

Estas variantes do processo mencionadas serão presente-mente suplicadas em pormenor 1

Processo a)5 i ί

Ο processo a) é realizado num solvente orgânico adequado * tal como* par exemplo* ácido acético* na presença de tuna quantidade catalítica de uns ácida de Levais forte tal como., por exemplo* triflucrato de boro* ácido trifluororaetanossulfónico cu* de preferência* ácido sulfórico e na presença de um agente de dasidrataçlío * tal coíbo* por exemplo* anidrido acético* a uma temperatura situada entre cerca de 0°C e *Ϊ0Θ°Ο* de preferencia entre a temperatura ambiente (cerca de 20°C> e +70*0* por exemplo a *50*0» Quando RA representa hidrogénio* é vantajoso utilizar uma quantidade de ácido sulfúrico anidro superior á usada no caso em que R/s representa um grupo protector de amino» por exemplo 1 * 1 equivalentes* e a reacçlo é realizada de prsfsrfncia a cerca de * à©°C;· especia 1 mente quando Ra representa hidrogénio e n representa i nos compostos de partida da fórmula 11«

Um grupo protector de amino é um grupo protector de amino estável sob condições acídicas* tal como * por exemple* aliloxicarbonilc?* trifluoroacetilo ou* de preferência, benziXoxi-carbonilo ou 9-fluorenil-metoxicarbonilo ==

Quando R, e/ou representam hidrogénio no produto final da fórmula í desejado* torna-se necessário eliminar os grupos protsctorss s/du R?, A maior parte dos grupos protsctorss ds carboxilo já torsas eliminados sob as condições tís rsacçSío- Os únicos grupos protectores de carboxilo R7 estáveis sao, por exemplo* metilo, siilo ou alilo* que podem ser eliminados* por exemplo* mediante hidrólise catalisada por bases- 0 grupo protector ds amino Ra representado por trifluo-roacetilo é eliminado por meio de hidrólise em meio fracemente

alcalino5 por exemplo com soluçSa aquosa tíe amónia, hidróxido da sódio ou bário ou com rasinas da permuta iónica básicas» 0 grupo protestar de amino R„ representado por bencilo-xicarbonilo á eliminado por meio de h i. d rog criação na presença do catalisador paládio sobre carbono em solução metanólica de ácido clorídrico à temperatura ambienta s sob presslo atmosférica:, 0 grupo profector ds amino R. representado por v-fluo-reni 1 -metoKicarbani1 o é eliminado com piperidina/dimetilacstaiuida <ls4) a temperatura ambiente- 0 rendimento do processo a) situa-se entre &ΘΧ e 9Sn do valor teórico»

Processo P)" 0 processo fc) é realizado num solvente orgânico, facultativamenta aquoso5 adequado, ou numa mistura ds solventes deste tipo» a uma temperatura situada entre ©°C s cerca tíe "§·8#°0, ds preferencia a uma temperatura situada sntra a temperatura ambiente e *5@°C, podendo também ser real içado em suspensão» Assim, por aKeraplo, o 9-f luoreni 1—meto>= icarbcni lo pode ser introduzido como grupo protecior de amino por meio da reacçao ds um composta de partida da fórmula IV num solvente orgânico tal ecoa tstrahidrofurano ou dianano, na presença ds água e ds uma base inorgânica, tal como bicarbonato de sódio ou hidróxido de sódio s, ss necessário» de uma amina orgânica terciária» tal como trietilamina, com carbonato de 9-fluorenilmetil N-succinimidilo» 0 grupo protector de amino R, t-butilOKicarbonilo podo ser introduzido, por eKemplo, em solução aquosa ds tetrshidrofurano a 90%? na presença de trietilamina à temperatura ambienta com uma quantidade equimolar da dl carbonate ds di-t-butilo» U rendimento do processe* b) situa-se entre 90% e 99% do valor teórico»

Conirarlamente ao processo a)3 o processo b) permite a introdução de todo e qualquer grupo protector de amino R, deseja- do»

Processo c)5 0 processo c) é realizado num solvente orgânico adequado ? tal como í52-diclarostanos a uma temperatura situada entre ~2@°C e +70°C=i por exemplo a βο0, e preferencialmente sob uma atmosfera de gás protector^ por exempla sob uma atmosfera de árgon. Para tal é necessária uma activaçlo in situ do grupo carboxilo livre no composta de partida da fórmula V? por exemplo com o auxilio de l-cloro~N,Ns2-triínetil~prop—í-enilamina» 0 rendimento do processo c) si tua—se en tre 4®% e 7Θ% do valor teórico»

Um exemplo ds um grupo protector ds amino R~ que é estável sob as condições ds rsacçSo é o grupo 9-fluorenil-msto-xicarbonilo. Um exemple de um grupo protector de carboxilo R, estável sob as condições de rsacçlo é o grupo benzi lo»

Os grupas protectores de carboxilo e/ou de amino que nSa fazem parte do produto final da fórmula I desejado sMo eliminados por processos em si conhecidos? por exemplo mediante solvólise5 em particular hidrólises alcoólise ou acidóliss,, ou por meio de redução5 em particular hidrogenólise ou redução quimica5 quando apropriado sm passas sucessivas ou simultaneamente.: ssndo igualment® possível a utilização ds métodos enzimâti-cos

Em particular., um grupo benzi lo Rá pode ser eliminado por meio de hidrogenaçMo na presença de um catalisador paládio sabre carbono à temperatura ambiente.; caso sm cus são mantidos o grupo 9~f luorenil-metojíicarbonilo e o grupo protector R^« 0 *—í ·—5 grupo 9~fluoreni 1-metoKicarbonilo R,- pode ser eliminado da forma descrita no processo a)« 0 rendimento da eliminação dos grupos prot-actores situa-se entre cerca da 90% e cerca de 99% do valor taórico.

Os compostos da fórmula I slo preferencialmente preparados pelo processo b> e, em especial , pelo processo a) =

Oper . ..adicionais.;

Os sais dos compostos da fórmula I contendo grupos formadores de sais podem ser preparados par um processo em si conhecido. Assim, os sais dos compostos da fórmula 1 contendo grupas ácidas podem ser obtidos por maio da rsacção da uma base adequada, por eKemplo mediante o tratamento com um composto metálico adequada tal como um sal de metal alcalino de um ácido orgânico carboKílico adequado, por eKemplo o sal de sódio do ácido a-stil-capréico, ou com um sal inorgânico de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso, em particular se derivar de «m ácido fraco e de preferência volátil» por exemplo bicarbonato de sódio? ou com amónia ou com uma amina orgânica adequada, caso em que se usa, de prsferlncia, uma quantidade estequiométrica ou apenas um pequeno encesso do agente formador de sais» Os sais de adição de ácido dos compostos da fórmula I slo obtidos da forma usual» por eKemplo por meio do tratamento com um ácido ou com um reagente de permuta aniónica adequada» Os sais internas dos compostos da fórmula I) que conttm, por eKemplo, um grupo csrbo- rilc livre s um grupo amino livre, podem ser obtidos3 por snem-·-pio, mediante & neutralização de sais, tais como sais de adido

de ácidoaté atingirem o ponto isosléctricô, por exemplo com bases fracas, ou por meio do tratamento com agentes de permuta iónica Ϊ.iquitíos,: A formação de sais tem lugar de uma forma virtuaioents quan titstiva»

Os sais podem ser convertidos de uma forma virtualmente quantitativa nos respecfcivos compostos livres pelos processos usuais.; sendo-o os sais metálicos e de amónio mediante, por -exemplo, do tratamento com ácidos adequados e os sais de adição de ácido por meio do tratamento com um agente básico adequado«

Os derivados ds ácido carboxilica rsaciivo-s tís um composto da fórmula I em que FL, representa hidrogénio podem ser

.:U preparados da forma atrás descrita aquando da caracterização dos derivados de ácido carboxílico reactivos. Para alcançar este objecfcivo, pode partir-se de um composto da fórmula I em que R,. representa um grupo protector de amino adequado e R.~, representa hidrogénio» 0 rendimento situs-ss entre cerca de 85% e cerca de 98% do valor teórico no que se refere a ácido carhcxilico reacti- VO::

Os processos atrás descritos, incluindo os processos para a eliminação ds grupos protectores e as medidas processuais adicionais, são realizados, salvo «menção sm contrário, de forma em si conhecida, por exemplo na presença ou ausincia de solventes e diluentes prsferencialmente inertes, se necessário na presença de agentes de condensação ou cataiisadores, a uma temperatura reduzida ou elevada, por exemplo a uma temperatura situada entre cerca de -20 °C e cerca de 150°C, em particular entre cerca ds ©°C a cerca d® +70°C, de prefertncia entre cerca da +10°C e a temperatura ambiente e especialmente a esta última temperatura, num recipiente adequado e, se necessário, numa atmosfera de qás inerte, por exemplo azoto. 24

Isto implicará a utilização, tendo em conta todos os siAbstituintss presentes na molécula, se necessário, por exemplo na presença de radicais facilmente hidrclisâvsis? de condições de rsacção sspacialmente suaves, tais como tempos de reacção curtos,, utilicação de baixas concentrações de agentes fracamente acidicos ou básicos, a utilização de quantidades sstequicméiricas, escolha de catalisadores, solventes e condições de temperatura e/ou pressão adequados» 0 presente invento diz também respeito àquelas formas de execução do processo que partem de um composto obtido como intermediário em qualquer um dos estádios do processo e o submetem aos passos do processa restantes, ou em que o processo ê interrompido em qualquer um dos seus estádios intermédios, ou em que um composto de partida é obtido sob as condições de reacção ou usado sob a forma de um seu derivado reactivo ou sal * Isto implicará, de preferencia, a utilização daqueles compostos de partida que, submetidos ao processo, dlo origem aos compostos precedeni-smente descritos como particularmente úteis. 0 presente invento diz igualmente respeito á utilização de compostos da fórmula I, em particular à utilização daqueles compostos da fórmula Ϊ em que Fu representa um grupo protector de amino tal como benz i 1 oxicarboni 1 o, a1i1oxicarboni 1 o, b-butilaxi-carfoonilo ou, em particular, 9—f luoren.il—metoxicarbonilo, R.~, representa hidrogénio s R-,. representa 4-mGrmmetaxitriiila, 4,4'-dimetoxitritila ou, em particular, trifenilmetilo Ctritilo), e â utilizaçlo de derivados de ácido carhoxílico reactivos destes compostos na síntese de peptídeos, especia1mente na fase sólida, par SHsmplo para a síntese de Merrifisld» 0 presente invento diz ainda respeito a substâncias que confifii pelo menos um radical bivalente da fórmula VII,

ο

II (VII) -NH-HC-C-O-

I (ÇH2)n o=c-nh-r3 sm que n representa i ou 2 e representa trifenilmetxlo, 4~*TiC?iometoKi-tritilo ou 4,4J -dimetíSKi-tritilo, a um processo para a sua preparação e à sua utilização na siniese de peptídeos, Estas substâncias são essencialmente derivados de psptídeos tais como os produzidos sob a forma de intermediários, por escempla, na síntese de peptídeos» Em conf ormiclade 5 estes derivados de psptideos também podem ser ligados a uma resina sintética»

Os Exemplos subsequentes ilustram o presente inventa sem limitarem o seu âmbito» A unidade das temperaturas indicadas é o grau Cslsius»

Bui :rr t-butilo Boc t-buto xica rboni1α Bcl ;r- ban silo Dhbt 3 5 4-di-hídro-3-hidroxi-4-oxo-lfi2 , 3-bsnccstria EM-BfiR rr. Espectro de massa ds bombardeamento atómico FíTíOC sr 9-~fluorsnil-mstoxicarbonila C-LAP cr: cromatagrafia liquida sob alta pressão conc, concentrado Pf p = pen ta f1uorofsnilo PinC ss 2 s 2 , 5 j, 7 , 3-peniamsti 1 -croman-è-sul f oni 1 o p = f = cc; ponto ds fuslo Tc ρ rr: 2 ? 4,5—triclorofenilo THF ZS t e t r a h i d r o f u r an o Tmob :rn 2,4, ò“trimetoxi--bsnsilo Trt -· tritilc (trifen.il.....metilo) .á. benziloxicarhonilo Exemola is Z-Asn(Trt)-OH ftgita-ss uma mistura de 1ύνώ g ds Z-Asn-OH <5® nmai>, 26 g ds irifenilmebanol (1®® mmal)„ 15® ml ds ácida acética e 9?5 ú\l (1@0 fflfflol) ds anidrido acético a 5®° durante 15 minutos, A adicao ds ®?25 ml de ácida sulfdrica conc» dá origem, passados 5 minutos, a uma solução amarela transparente. Após 1 1/2 hora, a solução s arrefecida s vertida para dentro de 1,5 l ds àgua-gelo, D precipitado obtido á retirado por fiItraçSo? exaustivamente lavado com água a dissolvido em cerca de 5®® ml da acetato de atilo, A fase orgânica é lavada com uma solução aquosa saturada ds cloreto ds sódio, secada sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida até a sua massa ser 25® g. Induz-se a 27 27

cristalização de i--Asníirt)~OH mediante a adiçSo de 1Ξ5 ml de hexano ? p „ f ,·-i95™i9è° = Í.Es2SÍ9....^

Hidrogena-se uma suspensão de 1®?2 g os Z-fisn(T r t)-OH (2® mrnol> em 12# ml de metanol s 2& ml de ácido clorídrico aquosa iN na presença de ©f5 g de um catalisador paládio sobre carbono a i#% á temperatura ambienta a sob pressão atmosférica» Uma vss: completada a absorção de hidrogénio, o catalisador é retirado por filtração e exaustivamente lavado com metanols ® o filtrado é concentrado sob pressão reduzida até a sua massa estar reduzida a 1ΘΦ g. A adição de 2,8 ml de trie ti lamina <2# mmol) é seguida da nova concentração até a massa estar reduazida a 5# g e o precipitado cristalino é retirado por filtração s lavado com uma mistura is1 tíe metanol e água e depois com água atè estar isento de cloreto, 0 H-ftsn<Trt)-OH contém ©,5 mol de água e dscompSe-sa Isntamsnts a temperaturas superiores a 22#°,

Ensmolo 5? Fmoc-AsníTrt)-OH

Atíicionam-se 3,4 g de carbonato de 9-fluoren.ilmeti 1 W-succinimidi1o í16 mrool) e? simultaneaments s gota a gota, da modo a que o pH passe a ter um valor entre 8,3 e 8,7, 1,4 ml de tristilamina a uma solução vigorosaments agitada de 3,8 g de H—Asn í Trt)—0H“#=I5H„0 (1© mmol / em 2Φ ml de tetrahidrofurano, i# ' -d. ml de água e ls4 ssl de trietilamina (i# mmol) = Passados 2© minutos, a mistura é arrefecida num banha as gelo e são-lhe adicionados acetato de stilo e 25 ml de uma solução aquosa 1M de bíssulfata de potássio, A fase orglnica ê lavada com água até estar isenta de sulfato, secada sobre sulfato ds sódio e concentrada sob pressão reduzida atè a sua massa estar reduzida a 5# g.

Cn 0 Frooc-Asn( S rt)-UH pode ser cristalizado mediante a lenta adição da éter isopropilico» P.f„-210-211° (com decompisiçlo)«

Eijemplo.......4i___Ffipc-Agoi,Jrt),rOH m ita-se uma suspensão de 3?54 g de rmoc-ftsn-OH (10 mmal> e 5S2 o de trifeniimetanol <20 minol) em 3Θ ml de ácido acético e i?9 sil de anidrido acético (20 mmol) a 5©° durante 15 minutas e, em seguida? adiciona-se-1fts uma solução de Θ?Φ5 ml de ácido sulfúrico conc. em 5 ml de ácido acético. Após cerca c!e uma hora á temperatura ds 50° obtém-ss uma solução s, após l 1/2 hora começa a formar-se um precipitado. Passadas 3 horas, adicionam-se lentamente à suspensão 2ΦΘ ml ds água gelada;, sob arrefecimento em gelo, agita-se brevemante a mistura e o precipitado á retirado por filtração e exaustivamente lavado com água. 0 material húmido é dissolvido em acetato de etilo e a fase orgânica é lavada com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio9 secada sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. Antes do produto começar a isolar-se, &a cristalizars a solução é diluída com i?2-dicloroets.no5 novassnis concentrada e filtrada através de 50 g ds gel ds sílica. O excesso de fcrife-nilmetanol é eluido corn 20® ml de 1,2-tíicloroetano e, em seguida, o Fiboc-Ash < Trt) -OH ê eluido com duas porções ds 50Θ ml 3 uma ds uma mistura 98s2 e outra de uma mistura 9és4, de i,2-dicIarometa-e metanol. 0 resíduo resultante da evaporação até á secura é dissolvido em 1Θ ml de tetrahidrofurano, à solução sao adicionados 3@ ml ds acetato ds etilo, a solução é concentrada até a sua massa estar reduzida a 2Θ g e adiciona—se éter di—isopropí1ico para provocar a cristalizaçlo. 0 Fmoc-AsrK Trt}-Oh obtido dssta forma funde a uma temperatura situada entre 21® s 211° (com decomposição)„

templo tis_hmoc-Asn (, ir t.)-UH

Hidrogena~se uma solução de 0,69 g de Fmoc-AsntTrí>~ -OBzI em 1Θ ml de uma nsistura 9si ds metanol s água na presença de 0,,07 g ds catalisador paládio sobre carbono a 10%,, á temperatura ambiente s sob pressão atmosférica, até que o composto ds partida já não seja visível no cromatograma em camada fina (solventes mistura 1 si ds tolueno e acetona)» 0 filtrado ê

evaporado após remoção do catalisador por filtração e o resíduo é dissolvida numa mistura 9ós4 de 1,2-dicloroetano e metanol e filtrado através de uma pequena quantidade de gel de sílica» A evaporação do solvente dá origem a Fmoc-AsnCTrt)~0H, p» f*“2i©..... -211° (com decomposição). 0 composto de partida pode ser obtido do seguinte modos

Etapa 5»1§ Suspendem-se 1,12 q de H-Asp—OBzI \5 mmol) e 1,05 g de bicarbonato de sódio em 25 ml d® uma mistura 9si de dionano e água, adicionam-se á suspensão 1,85 g de carbonata de 9-fluorafenil M-suecinimidilo e agita-se a mistura è temperatura ambiente durante 15 horas» A solução é concentrada e depois diluída com acetato de etilo, a fase orgânica é lavada com solução aquosa #:,5M de bissulfato de sódio e água e, em seguida, secada sobre sulfato de sódio a concentrada» 0 Fmoc-Asp-OBz1 separa-se, cristalizando, após a adição de éter ds petróleo»

Etapa 5„2s Adicionam-sa 0,8 ml de 1-c1oro-M, N,2—t rime- til-prop-l-enilamina CA,, Devos s outros, J» Chem=, Soc»_______Qhsm =

Canjinun ,.· , vol« 1979, p» 1180) a uma solução agitada de 2,09 g de Γmoc-Asp-OBzl em 20 ml de 1,2 tíicloroetano a Θ° sob uma atmosfera de ârgon„ Passados 10 minutos, adiciona-se uma solução de 1,2 g te tristilamina em 4 ml de i,2—dicloroetano, e, em seguida, agita-se a mistura durante 2 horas, dilui-se com acetato de stilo e lava-se com água. A fase orgânica é secada s evaporada. 0 resíduo é dissolvido em clorofórmio e cromatografado sobre 250 g da gsl de sílica. As fracções contendo o Fmoc—AsníTrt)-DBcl são combinadas e evaporadas? o produto ê obtido sob a forma de uma espuma amorfa.

E;-;emplo fc;;______Z-61n<Trt)-0H

Adiciona-se 1.1 ml de anidrido acético (12 mmol) a uma mistura de 2;:8 g de Z-Bln-OH (10 mmol) , 5,2 g de trifeniImetanol {2Φ mmol) em 3Θ ml de ácido acético e agita-se a mistura a 5 durante 15 minutos. Em ssguida5 adiciona—ss ®?Θ5 ml tís ácido sulfúrico conc. (cerca da 1 mmol> , obtsndo-se uma solução amarela transparente após alguns minutos. Passadas 2 horas, a solução é adicionada gota a gota a 5ΘΘ ml de água, sob agitação s arrefecimento em gelo, e o precipitado é retirado por filtração e exaus-tivamante lavado com água.’ 0 material húmido é dissolvido em acetato de etilo, a fase aquosa é retirada e a fase orgânica é lavada uma única vez com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secada sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida até a sua massa ser 20 g» A cristalização do Z-Bln CTrt)-~0H ê provocada por meio da adição de hexano em porções. P. f „ -- :l ó i - i S2 ° „

ÍMmslQ...2l______R-S1 n.(T.r t > —QH

Hidrogsna-se uma suspensão de 10,4 g de Z~81n(Trt)-OH (2Φ mmol) em 180 ml de uma mistura 9s1 de metanol e água e 2© ml •d® acida clorídrico aquoso 1M à temperatura ambiente, sob pressão atmosférica e na presença de ®?5- g de catalisador paládio sobre carocno a 10¾. uma vez completada a absorção de hidrogénio, o composto de partida encontra-se dissolvido. 0 catalisador é retirado por filtração e lavado ccm metanol. 0 filtrado á

concentrado atá a sua massa ser 2©ô g s adicionam—se—lhe, s ó©°3 2 = 9 ml de irisiilamina (2© mmol) após o que o produto começa imediatamente a cristalizar* A mistura à concentrada até a sua massa estar reduzida a 1Θ0 g, deitada em repouso, a cerca de 4°? durante algum tempo e os cristais são retirados por filtração s lavados com uma mistura de metanol s água até estarem isentos de cloreto* 0 H-81n<Trt)-0H obtido desta forma contém 0S5 mal de água e funde a 233° (com decomposição).

5*affial.flJÍl.__Fir»oc~Sln(Trt)-OH

Adiciona-se 3 = 4 g de carbonato de 9-fluoreniImsti1 M-succinifliidi1o (ΙΦ mmol) e? simultaneamente s gota a gota» da modo a que o pH passe a ter o valor 8?5? 1s4 ml de trietilamina a uma solução vigorcsassnts agitada de 4 g de hsmi-hidrato de HH31η<Trt)"OH Cl© mmol) em 2Θ ml de totrahidrofurano s 1& ml tis solução aquosa IN ds hidróxido de sódio» Passados 2© minutos, a mistura & arrefecida num banho de gelo, coberta com uma camada de acetato ds ©tilo s acidificada, atá o seu pH atingir um valor entre 2 e 2*5» com 25 ml de solução aquosa 1M de bissulfato d© potássio» A fase orgânica é lavada com água até à neutralidade, secada sobre sulfato de sódio s concentrada até á secura sob pressão reduzida atá a sua massa estar reduzida a 3© g= A cristalização do produto ê induzida por meio da adiçao» em porçóss, ds 35 ml ds ster di-isopropí1ico* Após um prolongado período ds repouso no frio, o material cristalino é retirado por filtração e lavado uma única vez com uma mistura 1.54 de acetato ds etilo e éter isopropílico e trfs vezes com éter di—isoprooili— ca» 0 Fmoc-Gln(Trt)-OH ainda contém ©s5 mol ds áfcsr di-isaprapi-lico, mesmo após prolongada secagem a è©° sob vácuo» Fuf. superior a 125° (fusão lenta com perda de éter di-isopropílico) „ .*ν \

E»gmpl.o 9¾ .Fmpc-gln.l.Trti-gH

Agita-se a IS#0 durante 1Θ minutas- uma mistura de 7,4 g da Fmoc-GJ.n-OH (2® smol} s i©„4 g os ir 1 feniImstana 1 (4® ιτ«τ.α1) sm ml ds ácido acético» Adiciona-se 0?1 ml de ácido sulftirico conc» a agita-ss a 1©®° durante msis 15 minutos com o propósito de ss obter uma solução amarela transparente» Esta solução é evaporada a &&° sob pressão reduzida e o residuo ê sniao secado sob pressão reduzida durante 10 minutos» O resíduo sólido ê dissolvida em ó© ml de ácida acética a 60° durante 2® minuto» = adicionam-se-lhe5 em seguida, 2 ml de anidrido acético <2© meiol) a5 após 1 hora a όθ% a mistura é evaporada sob pressão reduzida» 0 residuo oleoso é secado a 60° durante 1@ minutos, dissolvido, em seguida» em i©© ml de ácido acética s adicionada gota a gota a 50© ml de água» 0 precipitado é retirado por filtração, sKausii-vamsnts lavado com água s dissolvido em acetato ds stilo» A fase aquosa é retirada e a fase orglnies é lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio» A fase orgânica é secada sabre sulfato de sódio s, em seguida, evaporada atè â secura» O resíduo é dissolvido em 5© ml de i ?2-dicloroetana e aplicado sobre 100 g ds gel de sílica» A eluição com 1,2-tíiclorostano s 1»2-díclGroetano contendo 2%, s depois 4%, de metanol» As fracçSes contendo Fmcc—GinCTrt)~DH slo evaporadas sob pressão reduzida e o produto é cristalizado a partir ds uma mistura ds acetato ds etilo s éter di-isopropilico= P=f» superior a 125o»

__j±^lπz^jJlz^ijl·rSlπi^lπ-Serrl-eu~,G 1 i-OH 0 peptídeo é preparado de duas formas, ambas aplicando a síntese ds Merrifield em fase sólida, a partir de Fmoc-Sln-OH, numa delas, e a partir de Fmoc-Bln{Trt)-OH9 na outra»

A molécula de peptideo é preparada no decurso de uma síntese de Nerrifisld a partir ds 1 g daquilo qus ss designa por (resina po 1 iestireno)-íáster £~· benzi lo«ibensí 1 ico ds Fmoc-Gli ) ícoã 1% da liqaçoas cruzadas) , adquirido a Navsbiochsnq Laeuíãlfingsn, Suíça, sm qus d grupo carboxilo da glicina, sujo grupo amino está protegido cos» 9-íluoreni1— metoxicarbonilo (FiTicc) , se encontra esterificado com álcool 4~snetoKi-henz í 1 ic o, estando o átomo de carbono do grupo mstoxi ligado a um anel aromático da resina poliestireno que tfm t°Á ds ligações cruzadas com tíiviniIhenzsno a serve, simultaneamente:; como material ds suporte. Isto implica a utilicagSo ds um aparelho de síntese ds psptídecs automático que é adequada para a eliminação alternada dos grupos protsctorss ds amino, no caso presente, o grupo Fsaoc , e para o acoplamento com os compostos aminoácidos protegidos com N—Fmoc, Como consequfncia, no primeiro passo d grupo protector FfliQc no (éster gp-benz iloai benzi 1 ico ds Fmcc-81 i)~(resina poliestireno) é removido e o Fmoc-Leu-OH ê acoplado ao (éster p-bensilo Kibensílico ds H-Bli)-<resina poliestireno) obtido deste modo, e, em seguida, os outros M-Fmoc-amxnoácidas sSa acoplados, por etapas, na ssqufncia Fmoc-Ber<But)~OH e depois ou em Fmoc-Sln-BH, Fm-oc-Gin-OH, Fmoc-Sln—OH, Fmoc~Gln—OH s Ffíioc-Gln-OH ou em Fmoc--•31 η (Trt >-OH, Fmoc-BlnCTrt)-OH, Fmoc-GlníTrt)-OH, Fírqc-G 1 η(Tr11 --OH e. Fmoc-Sln(Trt)-OH ao intsrmediàrio peptiuso/rssina obtido em cada um dos casos» Cada uma das etapas é realizada de acordo com o esquema adiante apresentado, utilizando cerca ds 16 ml ds liquido ds lavagem em cada um dos casos, sfectuando cada uma das operações á temperatura ambiente, salvo menção em contrário» e agitando regularmente a mistura de reacçlo em cada um dos casos8

Partindo de 1 g do material de partida Fmcc-Bli/resina atrás reter ido Icargas 6,47 mmol/qí rsslisarais-ss os seguintes passos do processo, repetindo cada ums 34

i = uma única lavagem com isopropanol durante 0*8 minutos 2= trfs lavagens, cada uma durante €>,5 minuto cada uma, com dimetilacetamida desgaseificada sob pressão reduzida < isenta de dimetilamina)% 3« cinco tratamentos, cada um durante 1,7 minuto, com uma mistura i s4 de piperidina e dimetilacetamida (eliminação do grupo protector de Fmoc)s uma única lavagem com isopropanol durante 6,8 minutos 5« cinco lavagens* cada uma durante 6,5 minuto, com dime-tilacetamitía desgaseificado sob pressão reduzida íisento tíe dimetilamina)s ò. uma única lavagem com isopropanol durante 6,8 minutos 7. tr§s tratamentos, cada um durante 1,7 minuto* com uma mistura i s4 de piperidina e dimetilacetamida ícom o propôsi-ta de eliminar comp1etamente o grupo protector de Fmoc;s 8. duas lavagens* cada uma durante 0*5 minuto* com dimetilacetamida desgaseificada sob pressão reduzida (isenta tíe dimetilamina)ρ 9« uma única lavagem com isopropanol durante 0*8 minuto? seis lavagens, cada uma durante 6,5 minuto, com dimetil — acetamida desgaseifiçada sob pressão reduzida (isenta ds diraetilamina)5 1 iadição do reagente de acoplamento que foi preparado entretanto (obtido do seguinte medos dei;;a-sa â temperatura ambiente durante 3® minutas uma mistura ds 1,4 mmol ds l-hidro;íi-ÍH~-benzotriazole s 1,55 mmol de di-isopropiIcarbo-di-imida em 4 ml de dimstilacstamida (isenta de dimetilamina) e depois utiliza-se)= A rescçSo de acDplaaentD propriamente dita demora 6ô minutas â temperatura ambiente, 12= uma única acetilação com uma mistura islsS de anidrido acético, piridina e dimetilacetamxda (isenta de dimeti,lamina) durante 5 minutoss 13, trf’s lavagens„ cada uma durante 0,5 minuto., com dimetil-aceiamida degasexfxcada sob pressão reduzida (isenta ds diroetilamino) ?, 14= uma única lavagem com isopropanol durante 0,3 minuto e 15= duas lavagens, cada uma durante 0,5 minuto, com dimeti!-aestamida desgassifícado sob pressão reduzida (isento de tíimetilamina)=

Os rendimentos de cada um dos cinco últimos passos de acoplamento com Fmoc-Gln-QH ou Fmoc-Θ1n<Trt)~0H slo determinadas a partir da i-<9-fluorsnilmetil>-piperidina obtida como produto secundárit? em cada eliminação do grupo Fmoc = Com este propósito, diluí-se cada um dos filtrados combinados obtidos nos passos 3 a lu até perfazer um determinado volume s submetem-se a fotometria por Uv (lambda.,,=299 ,B nm, €~7S00>» Os rendimentos da série com Fmoc-Gln-OH slo 99%, 97%, 98%, 49% e 72% e os rendimentos da série com Fmoc-Gln(Trt)-OH são 100%, 100%, 99%, 99% s 100%, 0 psptídeo é eliminada tís resina por meio do tratamento desta com 1Θ ml d® uma mistura 90s5x5 d® ácido trif luoroacético,, água e i=2-etanotíitiol durante S minutos. A mistura de reacção é filtrada.,, d filtrado é concentrada sob pressão rsducida s o psptídeo é precipitado com auxilio de uma mistura 1s1 de éter di-isopropí1ico s hsxsno s secado. 0 tratamento atrás referido com (ácido trifluoroacético)/água/l?2-etanoditiol, em si? também origina uma eliminação parcial dos grupos tritilo (quando estes ss encontram presentes) e do grupo t-butilo» Esta eliminação é completada mediante o aquecimento da precipitado psptidso em (ácido trifluoroacético)/água/i*2-etanoditíoI C9©s5g5> a 3Θ° durante 30 minutos. Os produtos brutos resultantes da síntese com e sem grupos protectores tritilo slo submetidos a CLAP (colunas Mucieosil 5CÍS? 25© mm x 4.,6 mms fase mévsls A ácido trifluoroacético a ®„1% em águas B = ácida acético a 0,1% em acetonitrilos gradientes & a 4(?% de B em 30 minutos? caudais 1 ml/minuto? detecçãos 215 nm). Q produto em epígrafe desejado tem um tempo de retenção de 17s98 minutos * 0 perfil CLAP do produto bruto obtido na síntese com protecçSo com tritilo dos resíduos glutamina apresenta um sinal (8%) para c tempo de retenção de 18.6-5 minutos além do composto em epígrafe (92%)= 0 perfil CLAP do produto bruto obtido na síntese sem protecção com tritilo dos resíduas glutamina apresenta um sinal (70%) para um tempo' de retenção de 18=38 minutos além do composto em epígrafe (apenas 30%).

Exempla 11 s H-Aro-ftrcs-Ser—ftsn-Gln—vai—Ser-Oln-Asn-Tir-Prc?--! i;s-

::: In- A s η -II s-B I. n -Gli-ftrq-Arq-OH com 0 psptídeo em epígrafe é preparado da duas formas pelo processo de síntese descrito no Exemplo 10,, primeiro c om e

Fnioc—Asn-OH s Fmac-Sin-OH não protegidos e depois

Fmoc.....Asn(Trt)-0H e Fmoc-GInCTrt>-0H» Partindo da resina

Fflíoc-ArgCPfflc) (Movabiochans) 9 obtiveram-se sucassivamen te ? por condensação,, os seguintes aminoácidoss Fmoc-Arg<Pmc)? Fmcc-Θϊí-f Fnoc-GIn ou Fmoc-βΐηíTrt) , Finoc-Ila, Fmoc-Asn ou Fmoc-Asn(Trt)? Fmae-Sln ou Fmac-Sln(Trt) ? Fmoc-Val, Fmoc—Ile? Fmoc—Pro,

Frooc-TirCBut)3 Fmoc-Asn ou Fmoc-Asn(Trt)? Fmoc-Sln ou

Fmac-Sln(Trt)? Fmoc-Ser(But)% Fmoc-Val? Fmoc-Sln ou

Fmac-Sln(Trt)s Fmoc-Asn ou Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Ser(But),,

Fmoc-Arg(Pmc) e Fmoc-ArgCPmc)„ 0 psptídeo á eliminado da resina após eliminação do grupo Fmoc N-tsrminal por meio do tratamento com (ácido trifiuo— ro&cético)/égua/l?2-etanoditiol 90s5s5 durante 8 minutos5 senda os restantes grupos protectores subsequentemente eliminados por meio do tratamento com (ácido trifluoroacêtico)/água/1 *2-etanodi-fciol/4-mercaptafenol 90s5s3s2 durante 90 minutos. 0 produto bruto resultante da síntese a (com protecçlo com tritilo) aprs-senta no EIT-BAR um sinal (rTt-H)' para 2414,,1 (massa molecular calculadas 24i3?7>= 0 perfil CLAP (colunas Nucleosil 7C18, 125 mm ?í 4 ?& mms fase móvel s A — ácido trif luoroacêtico a ®=,i% em água, B = ácida trifluoroacêtico a θ51% em acstonitrilop gradiente;; β a 90% de 8 em 30 minutos? caudals 1,5 ml/minutop astsc-çSok 215 nm) dos produtos brutos obtidos em ambos os processos; da síntese (as com protecçlo com tritilo de Asn s Gin;; jhs sem protecçlo com tritilo de Asn e Gin) é apresentado na Figura 1= As abcissas indicam o tempo de retenção a«i minutos,

ÍÍ<l«mÍS.....iSLl__Fmpc-L i s-G 1 rv-Hi s-Asn-Pr o-L j. s-T i r-0 í n-T r p-Asn-OH

Adicionam—se em quatro porçSes, na decurso de 5 horas» 3335 ml (23?4 mmol) de cloreto de 2?6-dicloro-bensoálo (Fluka) a

uma suspensão de 10 g do chamado (álcool 4-bsnciloxihsnzí1ico)--poliestireno <0,78 mmcl OH/gj 1% de iigaçSss cruzadas com divinilbensenoi os grupos fenilo do poliestireno estio substituí-dos na posição 4 cosr. 4-hidrDMimetilf©niIo>íimetila§ Movabiochem) , 9,3 o (1556 mmol) do Fmoc-Asn (Trt) -OH s 3,1 ml (38,,5 mmol) de piridina em 60 ml de dimeti1acetamida, e a mistura resultante é agitada durante 24 horas. A resina é retirada por filtração e sKaustivamente lavada com metanol e 1,2-dicloroetano.. A oarga sobre a resina á #,48 ramol/g ídeterminação de Fmac por meio de fotometria) ,= Os grupos OH remanescentes são acetilados com (anidrido acético)/piridina/dimetilacetamida 1=1=8 durante 2 horas antes de se iniciar a síntese dos peptídeos. De forma análoga;, prepara-se uma rssina-Fisac-ftsnCTrt) (substituição de Fmoc-Asn<Trt)-OH por Fsnoc-Asn<Tmob)-OH). Esta última tem uma carga de 0,44 mmol/g. Acoplam-se 0,5 q de resina-Fmoc-Asn<Trt> <0,24 mmol de Asn) s 0,5 g de rssina-Fmcc-ftsn<Tmob) <0,22 mmol de Asn) sucessivamente com os seguintes aminoácidos por meio do processo da síntese descrito no Exemplo l9s Fmoc-Trt, Fmoc--81n<7rt;· ou Fmoc-81η ΐTmob) , Fmoc-Tir CBut) , Fmoc-Lis<Boc ) , Fiiioc-Pro, Fmoc-Asn< Tr t) ou Fmoc-Asn (Tmob) , Fmoc-HisCTrt), Fmoc-—Θ1 n (T mo b) e F moc -L i s < Boc ) .

Pis rssinas-peptídeo resultantes slo agitadas com (ácido trifluoroacético>/<su1fureto d© dimetiio)1,2-etanoditiol 77s20s3 durante 15 minutos a fins de eliminar o psptídeo da resina,, Os grupos protectores remanescentes slo então eliminados por meio tío tratamento com (ácido trifluoroacético)/água/1,2-etanoditiol 90s5s5? à temperatura ambiente, durante 40 minutos. 25Θ

Os produtos brutos resultantes da síntese com protscçlo com tritilo do Asn e do Gin (- produto bruto A), por um lado, e com protscçSo com Tmob do Asn s do Sln (- produto bruto 8), por outro, slo submetidos a CLAP (colunas Nucleosil 5018, mm x 4?6 mmp fase móvel; A = ácido irifluoroscético a ©s i% em água. B = ácido trifluoroacético a @?i% em acetoniirilop gradientes 0 a 90% de B em 3© minutosρ caudals 1 ml/minutop daiecçlos 215 mu). 0 composto em epígrafe desejado tem um tempo de reten-çSo de 29:,8 minutos. 0 perfil CLAP do produto bruto obtido na síntese com protecçlo com tritxlo <produto bruto A> revela* além do composto em epígrafe (95%s ul-ί-ΗΓ no ΕΜ-BAR = 15é594p massa molecular calculadas 1564=7)? um sinal (5%) para o tempo tíe rstsnçSo 30^9 minutos pars

Fmoc-Lis-Gln-His-Asn-Pro-Li s-Ti r-Gln-Trp( CH2

9 OH)-Asn-OH. 0 perfil CLAP do produto B (com protecçSo com Tmofe) apresenta, além do sinal do composto em epígrafe (apenas cerca da 8%) e do sinal atrás mencionado (cerca de 3%) pars um tempo d® rsisnçSo de 3®.9 minutos= um sinal (89%) para um tempo de reten™ gMa de 33.7 minutos correspondente a

OCH3 r (ί'Ί-f-H? no EM--BAK = 1/45 = 6;; massa molecular calculada; 1744?93 e outros sinais muito pequenos. EKsmgl^JLSi_bmpcrAsn,< ) rt±~ujcp flrrefecsu-se até ®° uma soluçlo de 1,5 g <2,51 rosno 1) de Frooc—Asn í Trt) -OH e 0,54 g <2,75 rosno 1) ds 2,4,5-fcricloro-f sncsl em 10 ml de tstrahidrofursnc» Adiciona-se 0,57 g <2,75 mrool) de dieiclohsKil-carbodi-iroida sob a forma sólida s a mistura é agitada a ®Ct durante 3® minutes, à temperatura ambiente durante 2 horas s novamsnfce a ®° durante 3® minutos, s a diciclobezilursía que se formou é retirada por filtraçio* 0 Frooc-Asn(Trt)-0Tcp separa-se do filtrado ao cristalizar, sendo a c r is ta 1 i e a.ç%a provocada pela adição ds è® ml de hsxano= P»^--133--135^, ‘7C:- \\·7η'.....-E51 . 1'"· i THF > „

Exemplo.......14g_____Frooc:-Gin(Trt)-OTcp

Dissolvsrasí-ss 1® g ds Fmoc-Gin í Trt)--OH = ® ,5 éter di-isopropí 1 ico e 3 = 26 g <16,6 rorool) de 2,4,5—tricloro-fsnol em 1®® ml ds tetrahidrofurano e arref©ceu-ss a solução até & sua temperatura atingir ®°„ Adicionaram-se 3,41 g (16,6 rorool) de dicic1oheni1carbodi-iroida sob a forma sólida, agitou-se a mistura durante 1 hora a 0°, durante 2 horas è temperatura ambiente s durante 3® minutos novamente a A diciclohe>íilursia que se separou ao cristalizar é retirada por filtração e o Frooc-81n<Trt)-0Tcp que se precipitou sob a forma ds um gel após atíiç&o de 75® ml ds éter de petróleo è retirado por filtração, secado e cristalizado a partir ds (cloreto ds metileno) /hes-iano. P»f = = 166°, L « 3^ 16,1° (THF) .

AéJlTêls 15;: . FffiQC-Asn (Trt) -OPf P

Dissolve-se 1,5 g (2,51 rorool) ds Frooc—Asnb(Trt>—OH em 15 ml ds tetrahidrofurano« Adiciona-ss 0,51 g (2,76 rorool) ds

L

pentafluoro-fsnoi5 arrefece~ss a solução até a sua temperatura atingir ®° e, em seguida* adiciona-se 0*57 g (2*76 mmol) d© dicicloheKÍIcarbodi-imida sob a forma sólida» A mistura é agitada a 0° durante 3® minutos* à temperatura ambiente durante 2 horas ε novaments a ©* durante 3® minutos. A diciclohewilursis que se separou ao cristalisar é retirada por filtração s o filtrado é evaporado até à secura a triturado com 4® ml de éter di-iscpropílico. G resíduo pulverulento ê retirado por filtração 5 secado s recrietalizado a partir ds (cloreto de metileno > / (éter de petróleo). Obtém-se o Fmoc-Asn < Trt)~QPfp * P f ,, -54-156 *, r a J n ^=-7,8o < THF) .

Exemplo......i&g________Fmoc—Bln(Trt)—OPfp

Dissolve-se 1*5 g <2.27 mmol) de Fmoc-GIn(Trt)-OH»®*5 éter di-isopropí1ico e 0,46 g (2,5 mmol) de pentafluoro-fenol em 35 ml ds acetato de etilo* arrefece-se a solução resultante até a sua temperatura atingir Θ° e? sob agitaçao* adiciona-se θ*52 g <2*5 mmol) de diciclohe>íilcarbodi-ifflida = A mistura é agitada a 0° durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 3 horas* © o material insolúvel á retirada por filtraçlo e lavado com tetrahi-drofurano. 0 filtrado è evaporado até à secura e o resíduo é dissolvido em 3® ml ds tetrahidrofurano. A lenta adição ds éter de petróleo,; sob agitação* provoca a cristalização do Fmoc--Gln(Tri)-GPfp. P.f . =185-187*, Ι«:ΐη^β=:-ΐ 6,4° (THF).

Exempla 17 s_____Fmoc-Asn(Trt)-QSbbt

Dissolve-se 1.5 o (2,51 mmol) ds Fmoc-AsnCTrt)-OH em 1© ml ds tetrahidrafurano e mistura-se a solução resultante com uma solução ds 0,,45 g (2,,76 mmol) de 3s4-di-hidro-3~hidrOfii-4-OKO~ ~J. ,:2::3-benzotriacina em 5 ml de tíimeti 1 formamida. A mistura é arrefecida até a sua temperatura atingir Φ°, é-lhe adicionado fc

©„57 g (2s7è mmal) ds dicielohsKilcarbotíi-iíitida sob a forma sólida s a mistura é agitada a θ° durante 1 hora* è. temperatura

ambiente durante 3 horas s novaments a durante 1 hora» A diciclohsKilureia que se separou é retirada por filtração* o filtrado ê evaporado até à secura s o resíduo é triturado com 3Θ ml de éter di-isopropí1ico* retirado por filtraçlo s secado* 0 produto bruto á purificado por meio de nova precipitação a partir ás (cloreto ds metilsno)/ηοκοηο, Obtêm-se o Fmoc-ftsn(Trt)—ODhbt vr sob a torma ds um pò amor to,: r,T = =csrca ds 1 ao , lajn h =-= ·: THF > , - ~ · 1...1.3¾______Fjppç~:M 1 n,l,J rt)-UDbbt

Dissolve-se i g U.55i mmal) ds Fmoc-Gln (Trt > -OH« © =, 5 éter di-isopropílico em 1® ml de acetato de Btilo» Adiciona-se ©,27 y (Ijéíó mmol) de 3,4-d i-hidro~3~hidγοκi-4-oxo-1*2*3-benso-triazina sob a forma ds um pó fino a* uma vez arrefecida a suspensão até à temperatura ds ©°;. adiciona-se também ®,34 g (:1,:56 mfiíol) d& diciclobsKilcarbodi-iffiida sob a forma sólida. Após agitação a durante uma hora, adieionam-se mais 10 ml de acetato ds etilo* agita-se a mistura novaments â temperatura ambiente durante 3 horas, retira—se a diciclohsKilureia por filtraçlo s lava-ss com acetato ds atilo, 0 filtrado é concentrado até c? ssu volume se reduzir a 1® ml s o Fmoc-Sln (Trt)-ODhbt separa—se dele ao cristalizar* cristalização essa que s provocada psla adição cie 5© ml de éter de petróleo, P, f ,-130-133°, 7rL7i":*=~o3,;7* (THF) ,

E Hemo lo í?s..... H-Asn (Trt) -OH - ©liSl-UO

Suspendem-se 2® g <0,1515 sol) de H-Asn-OH e 78*8 g <05303 mol) da Trt-OH em 455 ml da ácido acético glacial, ftoacxonam-sa v,28 ml (®,174 mol) de H^BO^ conc=, seguidos ds 28,6 43

ml (#:=303 (5ío1 ) da anidrido acéticos a a mistura é agitada a é®° durante 75 minutos,: A dissolução de todo o material è completa após 4# a 50 minutos» 0 produto de rsacçSo é precipitado mediante a lenta introdução de 91# ml de H^O qelada» 0 valor do pH é entSo ajustado para 6 com cerca de 85# ml de NaOH IN» A agitação durante cerca de 1 hora é seguida pela filtraçlo5 a repetida lavagem com Ho0 s depois com tolueno até o filtrado já não conter

Trt.....OH» 0 produto em epígrafe resultante decoropSe-se lentamente a temperaturas superiores a 22#

Exemplo 20s________Boc-Asn(Trt)-OH

Disso 1 vem-ss 3,83 g <1# mmol) ds H-Asn<7rt)-OH"0,, 5!íJj s ! 537 ml í 10 mmal 5 de trietilamina em 38 ml de teirahidrafuranes a 90%:: Adicionam-se 2,:2 ml < %<ò mfflol) de bicarbonato de t-butilo e5 em seguida» mais 1=37 ml de trieti lamina» Deixa-s© a reaeçlo processar-se à temperatura ambiente durante 2 i/2 horas e entrai-—se a mistura com 25Θ ml da acatato de atilo © 125 ml da solução aquosa 1M de KHSQ*» A fase orgânica ê lavada até à neutral idade, secada sobre Na„BO/s e evaporada até à secura» D resíduo é cristalizado a partir de metanol/(acetato de etilo) /hexano. P»f. do produto em epígrafe resultante = 201—200°,, CsJ^" -=-17,,721° í THF)»

EiismaM_.2i.li_________Spc-SliiUrt )-GH

Suspendem—se 3f9S g (10 mmol) tíe H—OlníTrt)—0H«®=. 5HU0 e 1,:38 ml í 1.0 mmo I) tíe trieti lamina em o# ml da tstrahidrof urano a 90%s sni seguida adicionam-se à suspensão resultante 2,28 ml í 1©„2 amai> tíe (BocMO e «tais 1,38 ml de trietilamina e a mistura é agitada è temperatura ambiente durante 2 horas» Obtém-se uma solução límpida passados 3# minutos» 0 procedimento subsequente é análogo ao do Exemplo 2® se sxceptuarmos o facto de o resíduo ser cristalizado a partir de metarml/UH^Cl^/Cétsr de -i. r = f:= do produto em epígrafe resultantes cerca < THF) » petróleo de 1Í2

Claims (6)

1. mviimi£â£Sisi iã - Processo para a preparaçlo de um composto tie fórmula íi. >5 O II

   d) 0=C-NH-R3 em que n representa 1 ou 2 R<, representa hidrogénio ou um grupo protector ds amino9 R.-, representa hidrogénio ou um grupo protector de carbQKis R^. representa trifenilmetilo, 4--monomeioxi~tritiIo ou 4,4'“dimetoKi~tritiio? um sal. tís um destes compostos de fórmula (I) contendo um grupo formador de sal ou um derivado de ácido carboKílico reactivo de um destes compostas em que H._, representa hidrogénio? caractsricado por s a) se fsssr reagir um composto de fórmula ÍII>, O II

   (Π) oc-nh2 em qus representa hidrogénio ou um grupo protsctor de amino que é estável nas condições da reacçlo? e n s FU, os significados atrás indicados,, com um composto de fórmula ίϊΐϊ),, sm que tem os significados atrás indicados,. e por os grupos protsctoros que nlo fazem parte do produto final de fórmula (I) desejado serem eliminados do produto resultante,, ou b) para a preparação de um composto de fórmula Cl) em cus R_: J. representa um grupo protsctor de amino se introduzir um grupo protsctor ds amino num composto de fórmula CIv)s O II H2N-CH-C-OR2 4 I(ÇH2)n o=c-nh-r3 (IV) em qus n

   e Hx tfè‘m os significados atrás indicadoss ou c: 5 ss fazer reagir um composto de fórmula (V) = ο R5-NH-H(j:-C-OR6 (V> (ÇH2)n 0=C-OH em que n tsm o significada atrás mencionado* R,» representa um grupo protestar da smino qu® ê estável nas condições da rsacçSo, e R, representa um grupa prctectar de csrboKi gus é estável w nas condições da rsanção* coíu um composta de fórmula (VI5, - NH2 (VI) sm que R? tsm o significado atrás indicado s em qus os grupos protestares que nSo formam parte do produto final d® fórmula (I) desejado slo eliminados do produto resultante caso se deseje» após se ter sfsctuado um dos processos a)» h> ou c) ss converter um composto resultante de fórmula (I) com um grupo formador eis sal „ num sal * ou ss converter um sal resultante no composto livre» ou se converter um composta resultante de fórmula (I) em qus representa hidrogénio num derivado d® ácido sarhoKílieo r"eac ti VD = 2ã - Processo de acordo com a Reivindicação 1s carac-terizado por ss fazer reagir entre +20 °C e +7€*° C um composto de fórmula Π.Ϊ) sm qus 9- f 1 uoren i 1 -me toxicar- Rj representa benzi lojiicarhoni lo ou ΡΟΗ Í 1 Q 48 num sol vante orgânico adequada, na presença, da quantidades catalíticas de um ácido de Lewis forte e isento d® água e na presença de um agente de desidratação,
2. 31 - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2? caracterizado por R« ser um grupo protector de amino» R-f ser hidrogénio e RT trimetiIfenilo? 4-monometoxi-tritilo ou 4*4'~ .....dimetoxi-iriiilc ou um seu sal metálico ou d® amónio»
3. 41 - Processo ds acordo com as Reivindicações 1 ou 2* caracterizado por R, ser benziloxicarbonilo* 9-f 1 uoreni 1 -metoxi~ carbonilo, aliloxicarbonilo ou i—butiloxicarbonilo, ser hidrogénio e RT ser trifenilmetilo ou um seu sal metálico ou de amònxo cã - Processo de acordo coo as Reivindicações 1 ou Ξ;; caracterizado por R., ser 9~fluorenil-metoxicarbonilo ou um sal metálico ou de amónio desse composto? em que R.~. representa hidrogénio. 5§ - Procssso de acordo com as Reivindicações 1 ou 2» caracterizado por se preparar benzi1oxicarboni1-Asn< t r ifenilmeti 1) -OH ou um seu sal metálico ou ds amónio»
4. 71 - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 25 caracterizado por se preparar Ç—fluorofenil-mstoxicarbonil—Asn--<irifeni!ínetil )-0H ou um seu sal metálico ou de amónio» Si - Procssso ds acordo com as Reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se preparar H-ftsn í trif en.ilmeti 1) ~0H ou um seu :-& 1 · 4?

   91 ~ Processo de acordo cosn as Ke i y i π d i c aç 3es i ou 2* carsctsricado por se preparar t-butiloKicarbonil-Asnitrifenilme— til)-OH ou um seu sal = iOã caractaricada til)-OH ou um - Processo de acordo com as Reivindicações i ou 2= por se preparar bensilosicarbcni 1 -81 n < trifeni 1 sne-seu sal metálico ou de amónio» liâ - Processo de acordo com as Reivindicações i ou 2? caracterisado por se preparar 9~fluorofenir-fflstoKicarbonir-Sln-(irifsnilmsfciΐ)—QH ou um seu sal metálico ou de amónio* 12s - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou Ξ= caracfcerizado por se preparar H-Glnitrifenilmetil>~0H ou um seu sal - Í3§ - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2? csracteri zado por se preparar t-butilo>u.carboni1-Gln(trifeni1meti D--GH ou um seu sal» :14§ - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2, caractsricatío por se preparar um derivado ás ácida carbaKíiica reactivo de um composto ds fórmula Cl),
5. 151 - Processo ds acordo com as Reivindicações 1 ou 2i; corscterissdG por se preparar um derivado ds ácido carboKílico raactivo ds um composto de fórmula <I) sob a forma ds um éster 254?5~tricloro-f©ni1ico, de um éster pentafluoro-fsniiico* de um cloreto ds ácido* da um anidrido simétrico* ds um éster com l-hidroKibenzotriasol ou de um éster com 354-di-hidra-3-hidro?;i--4--o>fO“i j2j3—bensotriazina ou ds um éster com N-bidroMi-S-norbor— n sn o.....2 5 3-d i c a r bo κ i m i d a * ν'-s 1óâ - Processa da acordo com as Reivindicações i ou 25 e&ractsrizado por ss preparar 9-fluoreni l-metoxicarbonil-Asn < tri-f eni lmeti l) -0-2 5 4 r. 5-tric: 1 orofeni 1 o =
6. 171 - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2S csracter i zada por se preparar 9-f luoren i1-metoxicarbon iI~B1n < tri~ fen i 1 meti I) --0-2,4 3 5-1ric 1 orof enx 1 o « iSi -· Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2, caractsrizado por se preparar 9-fluorenil-metoxicarbonil-Asn{tri-f en i 1 meti 1) -D-pen taf 1 uoro-fsn á. 1 o „ 19ã - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 23 caracterizado por se preparar 9-f luorenil-metoxicarboni 1 —01 n í tri-feni1meti1)-0-pentaf1uoro-fenilo» 2®ã - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2= caracterizatío por se preparar 9~fluoreni1-metoxicarhanil-AsnCtri-feni1meti1)-0-3 ,4-d i-hidro-3-hi drox i-4-oxo-1?2?3-benzotriazini1o = 21â - Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2g caractsrizado por se preparar 9-fluorenil-metoxicarbonil-81n<tri-fen 11 meti 1 )-0-~3?4-di--hidro~3--hidroKi~4~OKO“l 52s3~benzotria2iniloa 22i - Processo para a preparação de uma substância contendo pelo menos um radical bivalente de fórmula ίνΙ1)ξ 51 jj> (VII) -NH-HC-C-O- (ÇH2)n o=c-nh-r3 sfii que n representa i ou 25 ou R.,r representa trifenilmstilo., 4~íuonomstQKi--tri ti Io 4 , 4' “d i. me to x i -ir i t i 1. α,, através da sinisse dos psptideos em fase sólida. Lisboa, ió tís Abril ds 199Θ

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