PT93721A - Matodo de preparacao de um polinucleotido que codifica un analogo imunogenico da proteina do circunsporozoito (cs) de plasmodium - Google Patents
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Description
I 1'
TITULAR:CHIRON CORPORATION
EPÍGRAFE: "MÉTODO DE PREPARAÇAO DE UM POLINUCLEOTIDO QUE CODIFICA UM ANALOGO IMUNOGENICO DA PROTEÍNA DO CIRCUNSPOROZOITO (CS) DE PLASMODIUM"
Μ E Μ O RIA DE S C R I T I V A
Campo do invento O presente invento situa-se no campo da biologia molecular e da bioquímica. Particularmente, diz respeito aos análogos imunogénicos de proteínas do circunsporozoito de Plasmodium (CS), aos quais faltam uma ou mais das sequências repetitivas das proteínas nativas.
Antecedentes do invento A malária é uma doença debilitante causada através da infecçâo por um parasita do género Plasmodium. E transmitida através das picadas de mosquitos. A medida que o mosquito se alimenta, os esporozoitos, que são a forma diferenciada do parasita que se encontra na glândula salivar,, entram na circulação sanguínea do hospedeiro. Numa última fase, os esporozoitos entram nas primeiras células 1 3--
alvo, i.e., as células do figado. A maioria das espécies de Plasmodium que infectam os humanos são o P.falciparum e P.vivax. Outras espécies, tais como o P.ovale e o P.malarie, infectam humanos com muito menos frequência. Há ainda outras espécies do parasita que infectam mamiferos, tal como o P.berqhei que infecta roedores.
Foi feito um primeiro e substancial esforço na tentativa de fazer vacinas de subunidade contra a malária. Uma parte significativa deste trabalho foi realizada por investigadores na Universidade de Nova Iorque (UNI) e centrou-se na proteina CS que cobre a superficie do esporozoito. A UNI apresentou uma série de pedidos de patentes em tecnologia da proteina CS. A sua primeira patente, dos Estados Unidos com o no de série 4.446.917, descreve uma classe de proteínas do esporozoito, designada P-44 (em que P significa Plasmodium, e 44 é o seu peso molecular aproximado, em kilodaltons), que foram purificadas a partir dos lisados de esporozoitos. WO 84/02922 descreve a identificação de uma região imunodominante da proteina CS, consistindo em repetiçOes tandem de um epitopo de sequência relativamente curta, e a sintese de péptidos compostos de- repetiçOes desses epitopos. WO 86/00911 descreve a identificação e caracterização da sequência repetitiva do epitopo da proteina CS do P.falciparum e a sintese de péptidos compostos de sequências tandem. De forma similar, WO 87/00533 descreve a identificação e caracterização da sequência repetitiva do epitopo da proteina CS do P.vivax. Embora esse pedido de patente indique que 2 •S5;·
\\ C outros segmentos da proteína CS podem ser incluídos com as sequências tandem, o ensinamento claro da referência é que a imunogenecidade da proteina é atribuível à presença do epitopo repetido. Não é dado qualquer exemplo de péptido que inclua regifíes delimitadoras. WO 86/01721 ensina que certas regiOes carregadas em cada lado da repetição tandem do epitopo da proteina CS, são imunogénicas. Os péptidos que correspondem em sequência a essas regiOes foram sintetizados e mostraram ligar-se a anticorpos anti-CS. Conjugados desses péptidos sintéticos foram relatados como indutores de anticorpos anti-CS, em animais teste. 0 pedido de patente norte-americano com o no de série 032327, que é co-apresentada pela UNI e pelos assinantes do presente invento, descreve um análogo imunogénico da proteina CS de P.vivax, composto de toda a região repetitiva tandem da molécula nativa e de porçOes seleccionadas das sequências delimitadoras em cada lado da sequência repetitiva. Este polipéptido exibiu propriedades imunogénicas superiores aos péptidos que foram' preparados pela requerente das patentes/pedidos norte-americanos acima descritos.
Eichinger, et al., Molecular and Cellular Biology (1968) 6:3965-3972, de la Cruz, et al., Molecular and Biochemical Parasitology (1988) 28:31-38, e Romero, et al., Vaccines 89 (1989) Cold Spring Harbor, pags 335-340, caracterizam a proteina CS do P.berqhei e o gene que a codifica. A parte de toda esta literatura pioneira sobre as 3 proteinas CS de Plasmodium , ainda nao está bem definida qual a construção que fornecerá in vivo respostas em humanos que ofereçam protecção contra a malária. Neste aspecto, o papel da resposta imune a regiões excluindo repetições tandem, na neutralização do esporozoito, nao foi extensivamente avaliada, dada a extrema imunodominância da região repetitiva.
Exposição do invento 0 presente invento baseia-se no conceito de que uma redução da imunodominância da região repetitiva, relativa aos epitopos nas regiões que delimitam a região repetitiva, irá aumentar qualitativamente a actividade neutralizadora do esporozoito.
Por consequência, o invento diz respeito aos análogos imunogénicos da proteina CS de Plasmodium, onde faltam um ou mais dos epitopos repetitivos da proteina CS nativa, mas que têm pelo menos um epitopo delimitador nâo repetitivo de cada região delimitadora nao repetitiva da proteina CS nativa, polinucleótidos recombinantes e hospedeiros transformados para fazer tais proteinas, e composições de vacinas que utilizam tais proteinas como imunogenes.
Mais especificamente, um aspecto do invento é um análogo imunogénico da proteina CS de Plasmodium que compreenda; (a) uma região ou dominio interno composto de pelo menos duas repetições de uma sequência repetitiva de uma proteina CS nativa de Plasmodium, mas menos repetições das 4
ditas sequências repetitivas do que as presentes na proteina CS nativa de Plasmodium; (b) uma região amina terminal ou dominio delimitando a região interna, tendo uma sequência de aminoácidos que define, pelo menos, um epitopo da região amina delimitadora não repetitiva da proteina CS nativa de Plasmodium; e (c) uma região carboxi-terminal , ou dominio, delimitando a região interna, tendo uma sequência de aminoácidos que define, pelo menos, um epitopo da região carboxilica delimitadora não repetitiva da proteina CS nativa de Plasmodium.
Outros aspectos do invento são polinucleótidos recombinantes que codificam os análogos da proteina CS de
Plasmodium acima referidos, vectores de expressão para expressar tais polinucleótidos numa célula hospedeira compreendendo esse DNA ligado, de forma operativa, ao DNA que permita a expressão do DNA na célula hospedeira, e células hospedeiras que são transformadas com tais vectores e que são capazes de produzir tais análogos.
Ainda outros aspectos deste invento são as vacinas que contêm os análogos imunogénicos da proteina CS e métodos para protecção de indivíduos contra a malária , através da sua imunização com tais vacinas.
Breve Descrição das Figuras
Nas figuras: A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos e a sequência de DNA que codifica um análogo da proteina CS de 5 P,vivax, o Vivax 3. A Figura 2 mostra os oligómeros e o esquema de ligações que foram utilizados para construir a sequência de DNA que se mostra na Figura 1. A Figura 3 é um diagrama esquemático do plasmideo pBSIOO. A Figura 4 é um diagrama esquemático do plasmideo pBS24.1 A Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos de um análogo da proteina CS de P.vivax, o Vivax 3.1, e uma sequência de DNA que codifica o mesmo análogo. A Figura 6 mostra os oligómeros e o esquema de ligações que foram utilizados para construir a sequência de DNA que se mostra na Figura 5. A Figura 7 é um diagrama esquemático do plasmideo pAB125. A Figura 8 mostra a sequência de aminoácidos de um análogo da proteina CS de P.falciparum, o Falciparum 3, e uma sequência de DNA que codifica o mesmo análogo. A Figura 9 mostra os oligómeros e o esquema de ligações que foram utilizados para construir a sequência de DNA que se mostra na Figura 8. A Figura 10 mostra a sequência de aminoácidos de um análogo da proteina CS de P.falciparum, o Falciparum 4, e a sequência de DNA que codifica o mesmo análogo, A Figura 11 mostra a sequência de aminoácidos de um análogo da proteina CS de P.berqhei, o Berghei 3, e uma sequência de DNA que codifica o mesmo análogo. 6
A Figura 12 mostra os oligómeros e o esquema de ligações que foram utilizados para construir a sequência de DNA que se mostra na Figura 11.
Modos de realização do invento Definições 0 termo "sequência repetitiva de uma proteina CS nativa de Plasmodium", diz respeito à sequência repetitiva de aminoácidos que aparece nas regiões imunodominantes ou dominios centrais da proteina CS nativa de Plasmodium , e as modificações dessa sequência repetitiva que não destroem as suas propriedades imunogénicas. As sequências repetitivas nativas para P.vivax e P.falciparum estão descritas nos pedidos das patentes norte-americanos citados acima. As sequências repetitivas nativas para P.berqhei estão descritas por Eichinger, et al., supra citado. Por exemplo, as sequências repetitivas do P.vivax são Asp-Arg-Ala-Asp/Ala-Gly-Glu-Pro-Ala-Gly, as do P.falciparum são Asn-Ala-Asn-Pro e Asn-Val-Asp-Pro, e as do P.berqhei são Pro-Pro/Ala-Pro-Pro-Asn-Pro/Ala-Asn-Asp. 0 termo "região amina delimitadora, não repetitiva, de uma proteina CS nativa de Plasmodium", diz respeito à porção dessa proteina que se estende do grupo amina terminal da proteina à região da sequência repetitiva da proteina. De forma semelhante , o termo "região carboxilica delimitadora, não repetitiva, de uma proteina CS nativa de Plasmodium", diz respeito à porção dessa proteina que se estende do grupo carboxi terminal da proteina à região de sequência repetitiva. 7 0 termo "interno", como usado na descrição de uma sequência de aminoácidos de uma proteina, diz respeito a uma sequência que não inclui um aminoácido terminal da proteina. "Células hospedeiras", "células", "linhas celulares", "culturas de células", e outros termos semelhantes que indiquem microorganismos procariotas ou linhas de células eucariotas cultivadas como entidades unicelulares, são usados alternadamente, e referem-se a células que foram ou podem ser usadas como recipientes para vectores recombinantes ou outro DNA transferido, e incluem a descendência da célula original que foi transfectada. Está entendido que a descendência de uma só célula parental pode não ser, necessariamente, completamente idêntica, em morfologia ou em genoma, ou em todo o complemento de DNA, ao progenitor original, devido a mutações acidentais ou deliberadas. A descendência da célula parental, que é suficientemente semelhante às células parentais, para ser classificada através de propriedades relevantes, como a presença de uma sequência de nucleótidos codificando um péptido desejado, está incluída no que se entende por descendência nesta definição, e está incluida no âmbito dos termos acima descritos.
Uma "réplica" é um elemento genético, e.g., um plasmideo, um cromossoma, um virus, que se comporta como uma unidade autónoma de replicação polinucleótidica na célula.
Um "vector" é uma réplica à qual está ligada um outro segmento polinucleótidico, para efectuar a replicação e/ou expressão do segmento ligado. "Sequência controlo" refere-se às sequências 8
polinucleotidicas que são necessárias para efectivar a expressão das sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências controlo difere, dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências controlo incluem, geralmente, um promotor, um local de ligação do ribossoma, e terminadores; em eucariotas, geralmente, tais sequências controlo incluem promotores, terminadores e, por vezes activadores. 0 termo "sequências controlo" é entendido como incluindo, no minimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, como por exemplo, as sequências " leader". "Ligado de forma funcional" refere-se a uma justaposição onde os componentes descritos estão relacionados de forma a permitir que funcionem na forma pretendida. Uma sequência controlo "ligada de forma funcional" a uma sequência código, está ligada de tal modo que a expressão da sequência código é feita em condiçóes compatíveis com as sequências controlo. 0 termo "imunogénico", usado para descrever os análogos da invenção , diz respeito à capacidade de causar a neutralização do esporozoito de Plasmodium pela indução de uma resposta humoral e /ou celular. 0 termo "neutralização" diz respeito a um estado incapaz de causar infecção e/ou sintomas de malária. 0 termo "tranformação", como é aqui usado, refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno na célula hospedeira, à parte do método utilizado para a inserção, por exemplo, 9 u inserção directa, transdução, ou mediado pelo factor f. 0 polinucleotido exógeno pode manter-se como um vector não integrado, por exemplo, um plasmideo, ou, alternativamente, pode estar integrado no genoma do hospedeiro. 0 termo "tratamento", como é aqui usado, refere-se a profilaxia e/ou terapia. 0 termo "indivíduo", como é aqui usado refere-se a um animal que é susceptivel à infecçâo por uma ou mais espécies de Plasmodium, e inclui primatas e humanos, não estando no entanto limitado a estes.
Caracterização dos análogos da proteina CS
Como indicado acima, aquilo que distingue o análogo deste invento dos análogos da proteina CS precedentes, é que aos primeiros faltam uma ou mais sequências repetitivas das que se encontram na proteina nativa, mas retêm os epitopos sequências de ambas as regiões delimitadoras da proteina nativa. A proteina CS nativa de P.vivax consiste em 373 aminoácidos. Tem uma sequência "leader" N-terminal hidrofóbica, que se estende dos aminoácidos 1 a 22, (todos os aminoácidos referidos são inclusivé, a numeração dos aminoácidos na proteina CS nativa de P.vivax está de acordo com aquela que se mostra na sequência de Vivax 3.1, na figura 5). As repetições tandem, das quais há 19, começam no' aminoácido 92 e estendem-se até ao aminoácido 263, e estão precedidas de uma região conservativa, chamada Região I, que se estende do aminoácido 77 até ao 91. A região C-terminal 10
acaba com uma sequência transmembranar, que se estende do aminoácido 356 até ao 373 e também contém uma região conservativa, chamada Região II,do aminoácido 306 ao 318. Nove das sequências repetitivas são Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly (designada sequência "A") e dez são Asp-Arg-Ala-Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly (designada sequência "B").
Correspondentemente, a proteina CS de P,falciparum consiste em 412 aminoácidos. A sua sequência "leader" N-terminal hidrofóbica, estende-se do aminoácido 1 até ao aminoácido 42 e a sua Região I está localizada nos aminoácidos 107-123, inclusivé. (A numeração dos aminoácidos na proteina CS de P.falciparum está de acordo com a que se mostra na sequência Falc3 mostrada na figura 8).Há 41 repetições na proteina, com quatro sendo Asn-Val-Asp-Pro (sequência "A") e as restantes sendo Asn-Ala-Asn-Pro (sequência "B"). A Região II da proteina CS de P.falciparum está localizada nos aminoácidos 344-356, e a sua sequência transmembranar está nos aminoácidos 391-412. A proteina CS nativa de P.berqhei, como descrita por Eichinger et al.,supra, ( como corrigida por de la Cruz et al.,supra), consiste em 339 aminoácidos. As repetições tandem, das quais há 13, começam no aminoácido 93 e acabam no aminoácido 196. Cinco das sequências repetitivas são Pro-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Asn-Asp (designada por sequência "A"), duas são Pro-Pro-Pro-Pro-Asn-Ala-Asn-Asp, e seis são Pro-Ala-Pro-' Pro-Asn-Ala-Asn-Asp (designada por sequência "B"). A Região I estende-se, aproximadamente, do aminoácido 82 até ao aminoácido 92. A Região II estende-se do aminoácido 272 até ao 11 aminoácido 286. A sequência "leader" N-terminal hidrofóbica compreende os aminoácidos do 1 ao 23.
Os análogos deste invento contêm, pelo menos, duas sequências repetitivas da proteina CS nativa, tendo de preferência presentes ambos os tipos de sequências repetitivas. Na possibilidade mais extrema, as razões entre a sequência A e a sequência B são preservadas no análogo e a sua distribuição (i.e., o posicionamento respectivo dos dois tipos de repetições) é também preservada. Neste aspecto, as sequências A de P.vivax são predominantes na terminação N-terminal das séries de repetições tandem. 0 mesmo se aplica nos casos das proteínas de Pfalciparum e de P.berghei. Consequentemente, nos análogos de P.vivax da invenção há 2-18 repetições, de preferência 2 a 10 repetições, com um número aproximadamente igual de repetições da sequência A e da sequência B,com a(s) sequência(s) A localizada(s) predominantemente na porção N-terminal das séries. Correspondentemente, os análogos de P.falciparum conterão 2 a 40 repetições , de preferência 2 a 20 repetições, com uma razão A/B de 1:10 a 3:10. Os análogos de P.berghei conterão 2 a 12 repetições. A região delimitadora N-terminal compreenderá, tipicamente, a Região I e, opcionalmente, sequências delimitadoras adicionais para fora da sequência "leader" hidrofóbica. Deste modo, a região delimitadora N-terminal do' análogo de P.vivax conterá tipicamente, pelo menos, os aminoácidos 77-91 da proteina CS nativa de P.vivax e, opcionalmente, todos ou uma porção dos aminoácidos 23-76. De 23-91. aminoácidos nos preferência, consiste
Correspondentemente, a região delimitadora N-terminal dos análogos de P.falciparum conterá, pelo menos, os aminoácidos 107-123 da proteína CS nativa de P,falciparum e, opcionalmente, todos ou uma porção dos aminoácidos 43-106. De preferência, consiste nos aminoácidos 43-123. No caso dos análogos de P.berqhei, a região delimitadora N-terminal conterá tipicamente, pelo menos, os aminoácidos 82 a 92. A região delimitadora C-terminal compreenderá, tipicamente, a sequência nativa que se estende do fim da região repetitiva até à Região II e, opcionalmente, toda ou uma parte da sequência que se estende do fim da Região II até à sequência transmembranar. Deste modo, a região delimitadora C-terminal do análogo de P,vivax conterá tipicamente, pelo menos, os aminoácidos 264-318 da proteína nativa e, opcionalmente, todos ou uma porção dos aminoácidos 319-355. De preferência consiste nos aminoácidos 264-335 da proteina nativa. A correspondente região C-terminal do análogo de P.falciparum conterá os aminoácidos 289-356 e, opcionalmente, todos ou uma porção dos aminoácidos 357-392.
As regiões N-terminal e C-terminal dos análogos podem variar na sequência de aminoácidos, em relação às correspondentes sequências CS nativas ou fragmentos destas, devido a uma ou mais substituições, adições, e/ou delecções ("delecção" refere-se à eliminação de residuos internos e não das extremidades) prevenindo, no entanto, que cada uma continue a definir, pelo menos, um epitopo. Normalmente não haverá mais do que 10 variações por região, de preferência não s t» ‘"Μ li mais do que 5 variaçOes por região.
Os análogos da proteina CS de P.vivax, P.falciparum e P«berqhei deste invento podem ser representados pela seguinte fórmula:
X-(AnBm)-Y onde (AnBm) representa uma região interna de repetiçóes tandem , A representa uma das sequências repetitivas da proteina CS nativa, B representa outra das sequências repetitivas, n e m sao números inteiros positivos, em que a soma de n e m é inferior ao número de sequências repetitivas na proteina CS nativa, X representa uma sequência delimitadora N-terminal e define, pelo menos, um epitopo sequencial da região N-delimitadora da proteina CS nativa, e Y representa uma sequência delimitadora C-terminal e define, pelo menos, um epitopo sequencial da região C-delimitadora da proteina CS nativa. No caso dos análogos de P.vivax, X representa pelo menos os aminoácidos 77-91 da proteina nativa e Y representa pelo menos os aminoácidos 264-318 da proteina nativa, enquanto que nos análogos de P.falciparum, X representa pelo menos os aminoácidos 107-123 da proteina nativa e Y representa pelo menos os aminoácidos 289-356 da proteina nativa.
Materiais recombinantes e métodos para produzir análogos da proteina CS
Os análogos da proteina CS deste invento são feitos' através de técnicas de recombinação de DNA. Baseado no conhecimento das sequências de aminoácidos das sequências repetitivas nativas e das sequências delimitadoras, podem ser 14 n
a preparados genes sintéticos codificando os análogos in vitro, através da sintese de fragmentos de oligonucleótidos apropriados do gene, do seu tratamento com cinases e ligando-os uns com os outros. Para a expressão num hospedeiro particular, pode ser desejável desenhar uma sequência de DNA sintético que utilize codOes preferidos pelo hospedeiro particular, no qual o DNA vai ser expresso. 0 DNA sintético que codifica os análogos pode ser clonado em qualquer réplica apropriada, de modo a criar um vector clone. São conhecidos numerosos vectores clone pelos especilistas nesta técnica, e a selecção de um vector clone apropriado é uma questão de escolha. Exemplos de vectores para clonar uma célula hospedeira que possam transformar, incluem o bacteriofago lambda (E.coli), pBR322 (E.coli), pACYC177 (E.coli), pKT 230 (bactéria gram-negativa), pME290 (bactéria gram-negativa que não a E.coli), pHV14 (E.coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), actinofago phiC31 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces), YEp24 e YEpl3 (Saccharomyces), e o virus bovino do papiloma (células de mamíferos).
As sequências polinucleotidicas que codificam os análogos das proteínas CS, são expressas pela inserção das sequências em réplicas apropriadas, criando, desse modo, vectores expressão, e introduzindo os vectores expressão' resultantes em hospedeiros compativeis.
Na criação de um vector expressão, a sequência que codifica o análogo da proteina CS está localizada no vector, 15 %'i com as sequências controlo apropriadas. 0 posicionamento e a orientação da sequência código, em relação às sequências controlo, é tal que a sequência código é transcrita sob o controlo das sequências controlo; i.e,, o promotor controla a transcrição do mRNA derivado da sequência código, e os ribossomas ligam-se ao local de ligação ribossómica para começar o processo de tradução, e o codão stop utilizado para terminar a tradução estará a montante do codão de terminação da transcrição. São preferíveis vectores de expressão de levedura. As sequências controlo para vectores de levedura incluem promotores para a sintese de enzimas glicoliticas (Hess et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7:149; Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900). Promotores adicionais conhecidos na técnica incluem o promotor do 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J Biol Chem (1980) 255:2073). Outros promotores, que têm a vantagem adicional de terem a transcrição controlada pelas condições de crescimento, e/ou património genético, são as regiões promotoras para o álcool desidrogenase 2 (ADH2), isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativos associados com o metabolismo do nitrogénio, o sistema do factor alfa, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Sequências terminadoras da transcrição são desejáveis na terminação 3' das sequências código. Tais terminadores encontram-se na região não traduzida 3', a seguir à sequência código dos genes' derivados da levedura.
Modificações da sequência que codifica o análogo, antes da sua inserção na réplica, podem ser desejáveis ou 16 necessárias, dependendo do sistema de expressão escolhido. Por exemplo, em alguns casos, pode ser necessário modificar a sequência, de forma a poder ligar-se ás sequências controlo com a orientação apropriada, i.e., para manter a estrutura de leitura. Em alguns casos pode ser desejável adicionar sequências como a sequência ' "leader" do factor alfa da levedura, que causa a secreção do polipêptido a partir do organismo hospedeiro, com a subsequente clivagem do sinal secretor. As técnicas para modificar as sequências nucleotidicas , utilizando a clonagem, são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas incluem, e.g., o uso de enzimas restritivos, enzimas como o Bal3l, para remover os nucleótidos em excesso, oligonucleótidos quimicamente sintetizados para usar como adaptadores, para restituir os nucleótidos perdidos. A sequência que codifica o análogo, modificada se necessário, pode ser ligada às sequências controlo antes da inserção num vector. Alternativamente, a sequência código pode ser clonada directamente num vector expressão que já contenha as sequências controlo e um local de restrição apropriado. Para expressão do análogo na levedura, as sequências controlo serão necessariamente heterólogas para a sequência código. Nos casos em que o gene análogo é para ser expresso numa linha celular derivada de vertebrados, as sequências controlo podem ser ou heterólogas ou homólogas, dependendo da linha celular' especifica.
Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando técnicas Standard apropriadas 17 para tais células. Transformações na levedura podem ocorrer de acordo com o método de Beggs, J.D., Nature (1978) 275:104-109, ou de Hinnen, A., et al., Proc Natl Acad Sei (EUA) (1978) 75:1929.
As células transformadas crescem, depois, em condições que permitem a expressão do gene do análogo da proteina CS e, se apropriado, conduzem à proteína madura. Porque o gene é expresso em organismos/células heterólogos, a proteina está livre das outras proteínas a que está associada nos mosquitos. 0 análogo recombinante da proteina CS assim sintetizado, é depois isolado das células hospedeiras e purificado. Se o sistema de expressão segrega o análogo para o meio de crescimento, o análogo é isolado directamente a partir do meio. Se o análogo recombinante não é segregado, ele é isolado a partir dos lisados das células. A selecção das condições de crescimento apropriadas e dos métodos de recolha encontra-se no âmbito dos especialistas na técnica. Em relação à purificação consulte, por exemplo, o pedido de patente da UNI descrito anteriormente. ' Vacinas
As vacinas podem ser preparadas a partir dos análogos recombinantes da proteina CS de Plasmodium acima descritos que têm actividade neutralizadora do esporozoito, ou melhorem ou previnam a malária por outros mecanismos. A' formulação de vacinas que contêm polipéptido(s) imunogénicos como ingredientes activos é conhecida pelos especialistas na técnica. Tais vacinas são tipicamente preparadas como 18
injectáveis, ou em soluções liquidas ou em suspensões; formas sólidas apropriadas para solução ou suspensão num liquido antes da injecção, podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada, ou a proteina encapsulada em liposomas. Os ingredientes imunogénicos activos são muitas vezes misturados com excipientes ou veiculos que são farmacêuticamente aceitáveis e compativeis com os ingredientes activos. Excipientes apropriados sâo, por exemplo, a água, soluções salinas ou de dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes e combinações destes. A concentração do análogo em formulações injectáveis será usualmente entre 0,2 e 5 mg/ml. Adicionalmente, se desejável, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionadores, agentes tampões de pH, e/ou adjuvantes que aumentem a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser efectivos incluem, não estando no entanto limitados a estes: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1 2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraidos de bactérias, monofosforil lipido A, dimicolato de trealose e o esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) numa emulsão a 2% de esqualeno/Tween 80. A' eficiência do adjuvante pode ser determinada medindo directamente a quantidade de anticorpos contra os imunogenes resultantes da administração do imunogene em vacinas, que sâo 19
»»a.íS*Sl» é·" também constituidas por vários adjuvantes.
As vacinas são convencionalmente administradas parentéricamente, por injecção, que pode ser, por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais, que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais e liposomas. Para os supositórios, os veiculos e agentes de ligação tradicionais podem incluir, por exemplo, glicóis polialcalinos e triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o análogo em cerca de 0,5 a 10 p%, de preferência l-2p%. Formulações orais incluem os excipientes normalmente utilisados, tais como , por exemplo, classes farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pilulas, cápsulas, formulações de libertação controlada, ou pós que contêm 10 a 95% do análogo, de preferência 25 a 70%.
Os análogos podem ser formulados nas vacinas em forma neutra ou em sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos ( formados com grupos amina livres do péptido) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos hidroclóricos e fosfóricos, ou com ácidos orgânicos tais como o acético, o oxálico, o' tartárico, o maleico, e outros semelhantes. Sais formados com os três grupos carboxilicos livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como,por exemplo, os hidróxidos de 20 sódio, de potássio, de amónia, de cálcio ou de ferro, e bases orgânicas como a isopropilamina, trimetilamina, etanol de 2-etilamina, histidina, procaina, e semelhantes.
As vacinas são administradas de maneira compatível com a formulação da dose, a com uma quantidade tal que seja profilaticamenta e/ou terapeuticamente eficiente. A quantidade a ser administrada, que é geralmenta entre 5 microgramas e 250 microgramas do análogo por dose, depende do sujeito a ser tratado, capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, e o grau de protecção desejado. As quantidades exactas de ingrediente activo requeridas para serem administradas podem depender da opinião do médico e podem ser peculiares a cada individuo. A vacina pode ser aplicada segundo um calendário de uma só dose, ou, de preferência, com um calendário de múltiplas doses. Um calendário de múltiplas doses deverá ter uma primeira série de vacinações, que poderá ser de 1 a 10 doses separadas, seguida de outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes necessários para manter ou reforçar a resposta imunológica, por exemplo, entre 1-4 meses para uma segunda dose, e se necessário, dose(s) subsequente(s) passados alguns meses.
Exemplos
Os seguintes exemplos ilustram os análogos do' invento e métodos para a sua preparação. Não pretedem limitar, de forma alguma, o invento. 21 ο
Vector expressão do Vivax 3 0 Vivax 3 é um análogo da proteina CS de P.vivax que consiste nos aminoácidos 23-91 da proteina CS nativa de P.vivax (com substituição Gly—>Arg na posição 91),seguida de sequência "A" simples (Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly), seguida de uma sequência "B" simples (Asp-Arg-Ala-Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly), seguida dos aminoácidos 264-335 (com uma Gly adicionada entre as posições 277-278, uma substituição Glu-->Ala na 290, uma substituição Vai—>Leu na 300, uma substituição Arg-Glu na 301 e uma substituição Ala—>Thr na 302) da proteina CS nativa de P.vivax. A sequência de aminoácidos e a sequência de DNA codificante para o Vivax 3 estão ilustradas na figura 1.
Vinte e dois oligómeros sintéticos, que se mostram na figura 2, foram feitos num "Applied Biosystem 380A DNA synthetizer". Estes oligonucleótidos foram tratados com cinases, e hibridizados com fervura e arrefecimento lento até à temperatura ambiente e depois ligados para formar a sequência de DNA que codifica .Vivax 3 (ver esquema da figura 2). O gene completo para Vivax 3 foi excisado de um gel de acrilamida a 7% e clonado no plasmideo pBSIOO, que foi digerido com Ncol e Sall. 0 pBSIOO está esquematicamente representado na Figura 3 e contém a estrutura interna do promotor hibrido ADH2-GAPDH e do terminador GAPDH. Um' fragmento de BamHI/SalI contendo o promotor, a sequência de DNA que codifica o Vivax 3, e o terminador foi isolado do vector de clonagem e inserido no plasmideo pBS24.1 para a 22 produção do vector de expressão pBS24vivax3 para a expressão intracelular em levedura. 0 pBS24.1 está esquematicamente representado na figura 4.
Vector de expressão do Vivax 3.1 0 Vivax 3.1 é um análogo da proteina CS de P.vivax, semelhante ao Vivax 3 com a excepçao de não ter as variações referidas nos aminoácidos das regiOes delimitadoras da sequência nativa. A sequência de aminoácidos e a sequência de DNA codificadora do Vivax 3.1 estão ilustradas na figura 5. 0 gene que codifica o Vivax 3.1 foi preparado como acima descrito, usando os oligómeros e o esquema de ligaçOes que se mostra na figura 6. Este gene foi clonado no plasmideo pAB125, que tinha sido digerido com Xbal e Sall. 0 pAB125 está representado esquematicamente na figura 7 e contém a estrutura interna do promotor hibrido ADH2-GAPDH, a sequência "leader" do factor alfa e o terminador do factor alfa de S.cerevisiae. Um fragmento BamHI/SalI contendo o promotor, a sequência "leader" do factor alfa, o gene de Vivax 3.1 e o terminador, foi isolado a partir do vector de clonagem e inserido no plasmideo pBS24.1 para produção do vector de expressão pBS24vivax3.1 para expressão secretora em levedura. i
Vector de expressão do Falciparum 3
Falciparum(Falc) 3 é um análogo da proteina CS de* P.falciparum que consiste nos aminoácidos 43-123 da proteina CS nativa de P.falciparum, seguido por quatro sequências repetitivas (três "B", i.e., -Asn-Ala-Asn-Pro- e uma A, 23 i.e.,Asn-Val-Asp-Pro, num padrao BABB), seguido pelos aminoácidos 289-374 da proteína nativa. A sequência de aminoácidos e a sequência de DNA codificadora para Fale 3 estão ilustradas na figura 8. 0 gene que codifica o Fale 3 foi sintetizado a partir de oligómeros (ver figura 9), clonado no pAB125 e o resultante factor alfa-Falc 3-ADH2/GAPDH construído e clonado no pBS24.1 para a produção do vector de expressão pBS24falc3 para expressão secretora do Fale 3 em levedura.
Vector de expressão do Falciparum 4 0 Fale 4 é um análogo da proteína CS tendo uma sequência similar ao Fale 3 , com a excepção de ter uma região amina delimitadora mais pequena e uma região carboxilica delimitadora mais longa do que Fale 3. A sequência de aminoácidos e a sequência de DNA que codifica o Fale 4 estão ilustradas na figura 10. Como indicado, a sequência inclui os aminoácidos 68-123 da sequência da proteina CS nativa de P.falciparum. quatro repetições e os aminoácidos 289- 392 da sequência nativa. Os aminoácidos adicionais no N-terminal da sequência são parte da sequência "leader" do factor alfa. O DNA que codifica a sequência do Fale 4, ilustrado na figura 10, foi sintetizado e clonado no pAB125 e depois no pBS24.1, como descrito acima, para providenciar o vector de' expressão pBS24falc4, para expressão secretora em levedura.
Vector de expressão do Berghei 3 24 0 Berghei 3 é um gene sintético que conttém regcbês delimitadoras amina e carboxi terminal e apenas 2 das 13 repetições tandem de oito aminoácidos, que se encontram no gene CS de P.berghei. As 16 repetições QP que seguem as repetições de aminoácidos são também eliminadas. A sequência para o gene e os aminoácidos nela codificados estão ilustrados na figura 11.
Então, a construção começa na Gly 63 e continua através da primeira repetição PPPPNPND terminando no aminoácido 100. De notar que os aminoácidos 69-74, publicados originalmente por Eichinger et al. como PMLRRK, foram mudados para a sequência "correcta" de de la Cruz et al.,ADAPEG. A segunda repetição, PAPPNAND, é derivada da primeira que se encontra mais à frente na sequência. A terminação carboxilica continua então na Gly 239 até à Ser 318. Como se mostra na figura 12, o gene foi feito com 20 48-mers e 2 28-mers para facilitar longas sobreposições na hibridização do gene. Os codões preferidos da levedura foram usados onde possivel, e os locais de Ncol e Sall incorporados no codão de iniciação 5' e no codão stop 3', respectivamente. O gene foi montado através do tratamento por cinases de cada oligómero, mergulhando-os num tampão com ligases e depois dissociando-os a 100 °C e deixando-os arrefecer à temperatura ambiente. A ligase e o ATP foram adicionados e o gene ligado foi depois cortado com enzimas restritivas Ncol e Sall, e purificado por electroforese de gel de agarose . 0 gene está previsto para ser expresso no promotor 25 V -s regulável ADH2-GAPDH da levedura para expressão interna (ver acima). 0 Berghei 3 pode também ser expresso através de secreção por clonagem no pAB125, um vector contendo a sequência promotora/"leader" do factor alfa-ADH2 (ver acima).
Transformação da levedura com os vectores de expressão do análogo da proteína CS A estirpe AB11Q de Saccharomyces cerevisiae (Mat, Ieu2-Q4,ou leu2-3 e leu2-112 (ambos),pep3-4,his4-580,cir°) foi transformada com os vectores de expressão (à excepçao da construção de Fale 4) de acordo com Hinnen et al., Proc Natl Acad Sei (USA) 75:1929-1933 (1978). Colónias de transformantes simples contendo vectores reguladores ADH2/GAP cresceram em 2 ml de meio selectivo para a leú- (deficiente em leucina) até à fase log tardia ou fase estacionária. Apenas as leveduras que contêm tais vectores, crescem neste meio. As culturas foram subsequentemente diluidas de . 1:20 ( v/v ) em YEP ( 1% p/v de estrato de levedura, 2% p/v de peptona ) com 1% de glucose, e crescem até à saturação ( cerca de 36 h ) neste meio. As células lisaram na presença de dodecil sulfato de sódio ( SDS) e ditiotreitol ( DTT ) e os lisados foram limpos por centrifugação. Os lisados limpos foram sujeitos a electroforese de gel de poliacrilamida ( Laemmli, U. K., Nature (1970) 277:680 ). Após a coloração com Coomassie blue,. foram observadas bandas de tamanho apropriado em estratos de transformantes contendo o plasmideo de P.vivax e o plasmideo de Pfalciparum. Estas bandas foram detectadas nas células transformadas com os respectivos vectores de expressão, 26 enquanto se encontram ausentes nos estratos de células contendo plasmideos de controlo.
Para confirmar a identidade das bandas, as proteinas foram submetidas a análises Western. Os lisados de levedura limpos e preparados como descrito acima foram sujeitos a electroforeses em geles de poliacrilamida ( Laemmli, supra ) e as proteinas foram subsequentemente electrotransferidas em filtros de nitrocelulose (Towbin et al., Proc Natl Acad. Sei (USA) (1979) 76:3450). O filtro foi preincubado durante 1 hora com 1% (BSA) em PBS e subsequentemente tratado com anticorpos para as proteinas CS nativas durante 12 horas a 4 °C . Os filtros foram lavados com 1% BSA/PBS e foi adicionado um segundo anticorpo de cabra anti-rato conjugado com peroxidase de rábano (não puro) ( Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califórnia). Finalmente, os filtros foram incubados com um reagente de desenvolvimento de coloração de peroxidase de rábano (não puro) (Bio-Rad, Richmond, Califórnia) e lavados. As análises da Western mostraram que as proteinas reagiram com os anticorpos.
Produção em leveduras de análogo da proteina CS (intracelular) e purificação
Os transformantes cresceram em meio selectivo (tanto para Leu- como para Ura-) para aumentar o número de cópias de plasmideo e cresceram, por outro lado, em altas concentrações de glucose (8%) para manter reprimida a expressão. A levedura passou então para um meio de YEP com 2% de glucose (um meio rico para a expressão intracelular), onde 27 ficou durante 48 horas (a expressão vê-se a partir das 24 horas). A levedura foi retirada do meio por filtração ou centrifugação e a levedura foi quebrada num tampão apropriado. A purificação das proteinas foi iniciada através de precipitação selectiva ao calor, após diluição com igual volume de água e o ajuste do pH para 8.0 (a 100 °C durante 20 minutos; isto não serve apenas de etapa de purificação mas também de etapa de inibição de proteases). O precipitado foi removido por filtração ou centrifugação.
O análogo da proteina CS no sobrenadante foi de seguida purificado por cromatografia de troca iónica num permutador de catiões, através do abaixamento do pH para 4.0, de forma a permitir a ligação. Após a lavagem da coluna a pH 5.0, é usado um gradiente de sal para remover selectivamente as proteinas, incluindo o análogo da proteina CS. O análogo é recolhido, concentrado e sujeito a cromatografia de filtração molecular. A proteina CS purificada foi concentrada e diafiltrada. Foi armazenada, ou por congelamento a menos 80^, ou por secagem fria, e guardada sem humidade num frasco selado.
Produção em levedura do análogo da proteina CS (secreção) e purificação
Os transformantes cresceram em meio selectivo (tanto para Leu- como para Ura-) para aumentar o número de cópias de plasmideo e cresceram, por outro lado, em altas concentrações 28
Claims (11)
- de glucose (8%) para manter reprimida a expressão. A levedura passou então para um meio de secreção de levedura com 2% de glucose (baixo nivel de proteínas) e cresceram durante 90 horas (a expressão vê-se a partir das 36 horas, mas as 90 horas permitem a acumulação do análogo da proteína CS no meio). A levedura é removida do meio por filtração ou centrifugação, o sobrenadante é retido e o pH é ajustado para 8.0 (NaOH). A purificação das proteínas é iniciada por precipitação selectiva ao calor (a 100 °C durante 20 minutos, o que não serve apenas como etapa de purificação mas também como etapa de inibição das proteases). Este precipitado é recolhido por filtração ou centrifugação. A purificação do análogo a partir do sobrenadante foi realizada como acima descrito. Novas modificaçOes de formas de realização do invento acima descrito que são evidentes para os especializados nos campos da biologia molecular , bioquímica, imunologia e campos relacionados, incluem-se no espirito do invento. REIVINDICAÇÕES 1- Um método de preparação de um polinucleótido que codifica uma proteina do circunsporozoito de Plasmodium (CS), caracterizado pelo facto de compreender: 29- a síntese de uma sequência de polinucleótido que codifica, pelo menos, duas repetições da sequência repetitiva da proteina CS nativa, mas que codifica menos repetições da sequência repetitiva do que as que estão presentes na proteina CS nativa, e pelo menos um epitopo da região carboxi-terminal, não repetitiva, que flanqueia a proteina CS nativa.
- 2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda as fases de: (a) sintese ou obtenção de uma sequência nucleotidica amina terminal que codifica, pelo menos, um epitopo da região amina ( terminal, não repetitiva, que flanqueia a proteina CS nativa; (b) ligação à extremidade 3' da sequência nucleotidica amina terminal, de uma sequência nucleotidica interna que codifica pelo menos, duas repetições de uma sequência repetitiva da proteina CS nativa, mas que codifica menos repetições da referida sequência repetitiva, do que as que estão presentes na proteina CS nativa; e (c) ligação à extremidade 3' da sequência nucleotidica interna de uma sequência nucleotidica carboxi - terminal, que codifica, pelo menos, um epitopo da região não repetitiva carboxi-terminal, que flanqueia a proteina CS nativa.
- 3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado ainda pelo facto de na fase (a) a sequência nucleotidica amina terminal codificar, pelo menos, os aminoácidos 23 a 76 da proteina CS nativa do P. vivax e, na fase (b) a sequência nucleotidica interna codifica ambos os tipos ' de sequências repetitivas da proteina CS nativa do P. vivax, e existindo 2 a 18 repetições de sequências repetitivas, e na fase (c) a sequência nucleotidica carboxi terminal codifica, 30 pelo menos, os aminoácidos 264 a 318 da proteína CS nativa do P. vivax.
- 4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, na fase (a), a sequência nucleotidica amina terminal codificar, pelo menos, os aminoácidos 23 a 91 da proteina CS nativa do P.vivax e, em que, na fase (b) a sequência nucleotidica interna codifica ambos os tipos de sequências repetitivas da proteina CS nativa do P. vivax, e existindo 2a 10 repetições de sequências repetitivas, e, na fase (c) a sequência nucleotidica carboxi-terminal codifica, pelo menos, os aminoácidos 264 a 335 da proteina CS nativa do P. vivax.
- 5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, na fase (a), a sequência nucleotidica amina terminal codificar, pelo menos, os aminoácidos 107 a 123 da proteina CS nativa do P. falciparum, e, na fase (b) a sequência nucleotidica interna codificar ambos os tipos de sequências repetitivas da proteina CS nativa do P. falciparum, e existindo 2 a 40 repetições de sequências repetitivas, e, na fase (c) a sequência nucleotidica carboxi-terminal codifica, pelo menos, os aminoácidos 289 a 374 da proteina CS nativa do P. falciparum.
- 6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado também pelo facto de, na fase (a), a sequência nucleotidica amina terminal codificar, pelo menos, os aminoácidos 68 a 123 da proteina CS nativa do P. falciparum, e, na fase (b) a sequência nucleotidica interna codificar ambos os tipos ' de sequências repetitivas da proteina CS nativa do P. falciparum, e existindo 2 a 20 repetições da sequência repetitiva, e, na fase (c), a sequência nucleotidica carboxi-terminal codificar, pelo 31 menos, os aminoácidos 289 a 374 da proteína CS nativa do P. falciparum.
- 7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto da sequência polinucleotidica codificar a sequência de aminoácidos representada nas Figuras 1, 5, 8, 10 ou 11.
- 8- Um método para a preparação de um vector de expressão para a expressão de um análogo imunogénico da proteina CS do Plasmodium, numa célula, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a sintese de uma sequência polinucleotidica, conforme reivindicado nas reivindicações de 1 a 7; e (b) a ligação de sequências de controlo , unidas, de modo operável, à sequência polinucleotidica, e eficazes na condução da expressão da sequência nucleotidica do análogo da proteina, na célula,
- 9- Um método para a preparação de uma célula recombinante capaz de produzir um análogo da proteina CS do Plasmodium, caracterizado pelo facto de compreender a inserção do vector de expressão da reivindicação 8 numa célula hospedeira compatível.
- 10- Um método para a preparação de um análogo imunogénico da proteina CS do Plasmodium , caracterizado pelo facto de compreender o crescimento da célula, conforme reivindicado na reivindicação 8, sob condições que permitam a produção da proteina codificada pelo polinucleótido.
- 11- Um método para a preparação de uma vacina contra a malária, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a obtenção de uma quantidade de um análogo imunogénico da proteina CS do plasmodium, preparado pelo método da reivindicação 32 10; e um (b) misturar o análogo da proteína CS do plasmodium com veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, PEL6 ήθΕΓ'ΤΕ 10 de Abril de 1990 OFICIAL tíft "".'jOADE l!!íiUSTRlAL
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