PT93645A - Matodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas - Google Patents

Matodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas Download PDF

Info

Publication number
PT93645A
PT93645A PT93645A PT9364590A PT93645A PT 93645 A PT93645 A PT 93645A PT 93645 A PT93645 A PT 93645A PT 9364590 A PT9364590 A PT 9364590A PT 93645 A PT93645 A PT 93645A
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
cell
membrane
cells
biotin
vitamin
Prior art date
Application number
PT93645A
Other languages
English (en)
Inventor
Philip Stewart Low
Mark Alan Horn
Peter Frederich Heinstein
Original Assignee
Purdue Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Purdue Research Foundation filed Critical Purdue Research Foundation
Publication of PT93645A publication Critical patent/PT93645A/pt

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

iilMM.JÍe_iELvsnta Ο presente invento tíís respeito a um método para intensificar α transporte através da membrana de moléculas exógenas» 0 presente método tira partido de (!) localização e multiplicidade de recsptores nas superfícies das membranas da maior parte das células e (2) dos processos de transporte através da membrana mediados por receptores associados» Forma-se um complexo entre uma vitamina solúvel na água e uma molécula exógena e põe-se em contacto com a supsrfíicie da membrana? iniciando—se deste modo o transporte através da membrana do consplexo vítsminico mediado por um recaptor» 0 transporta através da membrana de moléculas exógenas? incluindo proteínas e ρο1inuc1sótidos? sob a forma de complexos vitaminicos? tem sido fomentada em células de plantas? de mamíferos e bacterlanas.
Antecedentes e Sumário do invento 0 transporte através da membrana de moléculas exógenas ou nutritivas é decisivo para o funcionamento normal da célula» Pelo facto dos especialistas terem reconhecido a importância deste processo celular fundamental ρara muitas- áreas da ciência médica e biológica? incluindo a terapia medicamentosa e a Irans— fecção do DMA? verificaram-se significativos esforços de pesquisa no sentido da compreens-So e da aplicação de tais processos» 0 fornecimento através da membrana de moléculas específicas foi encorajado através do uso de veículos de proteínas? veículos de anticorpos» sistemas de fornecimento lipossómicos? electropora-çãa? injecção direcia? fusão celular? veículos virais? choque osmótico e transfecção mediada por fosfato de cálcio» No entanto? muitas destas técnicas estão limitadas tanto -aos tipos de células» como -ãs condições fls utilização para transportar com êxito através da membrana espécies moleculares exógenas» Além disso, muitas destas técnicas conhecidas estia limitadas pelas tipos e dimensões das moléculas exógenas que podem ser transportadas através da membrana sem perd-a de bioactivida.de „
Um método de fornecimento através da membrana de moléculas exógenas com uma vasta aplicabilidade baseia-se no mecanismo da actividade endocitótica mediada por um receptor. Ao contrário de muitos outros métodosv a actividade endocitótica mediada por um receptor pode ser utilizada com fxito tanto ín vivo como in vitron A entíocitoss mediada por um receptor compreende o movimento de ligandos ligados ao receptor da membrana numa área delimitada pela membrana através da irrvag inação da membranan 0 processo é iniciado ou activado pela lígaçSo ao receptor de um ligando especifico do receptor» Foram caractsri-zados muitos sistemas sndocitáticos mediados por um receptor5 incluindo a galactose, a ntanoss, o é-fosfato de manose, a trans-ferrina5 a asialoglicoproteina? a transcobolamina (vitamina B-12), a. s-2 macroglofoulina, a insulina e outros factares de crescimento peptidicos tais como o factor de crescimento epidérmico (epiderroal groivth factor - E8F) A actividade endocitótica mediada por um receptor foi utiliçada para o fornecimento através da membrana de moléculas-exógenas tais como proteínas e ácidos rmcleicos, Bera1mente o ligando é quimicamente conjugado por ligação covalente iónica ou de hidrogénio a uma molécula exógena que tenha interesse (isto é, o composto exógeno) formando uma molécula conjugada contendo uma fracção (a porção ds ligando) que continua a ser reconhecida no conjugado por um receptor alvo» Usando esta técnica, a proteína fototóxica psoraleno foi conjugada com a insulina e interiorizada pela via endocitótica da receptor da insulina (Gasparro, Biochem, BiophysRes» Comm„ 141(2:), págs» 5Φ2-509, S98ó)p o receptor especifico de hepatócitas para as asialo—glicaprotaínas terminais da galactose foi utilizado para o administração hepatócito-específica através da membrana de asialoorosomucoid-poli-L-lisina complexada ds forma não covalente com DMA ds plasmídeo (Wu, S.Y», J„ Biol. Chem., 262(10)·, páqs. 4429-4432B 1987)¾ e d receptor celular para o factor de crescimento epidérmico foi utilizado para fornecer ao interior da célula polinucleótidos ligados de forma cova lente ao EOF < rlysrs, Pedido ds patente europeu 86810614s75 apresentado a 29 de Dezembro de 1986, data da publicação 6 de Junho de 1988). O método do presente invento intensifica o transporte através da membrana ds uma molécula sxégsna5 membrana essa com receptorss para vitaminas soláveis na água que iniciam o transporte através da membrana seguido da ligação com uma vitamina solúvel na água ou com um agente farmacológico que imita a ligação de uma vitamina solúvel na água. 0 presente método foi aplicado com sucesso a células de mamíferos,; de plantas e baeta— r.lanas·, 0 transporte através da membrana mediado por um receptor de vitaminas que forma a base do presente invento é iniciado pela ligação de vitaminas solúveis na água* tais como biotina,, ácido ascórbicoj, cobalamina? ou folatos ao seu receptor respectivo associado à membrana. Um receptor alvo preferido para o método do presente invento é o receptor ds biotina,, A biotina é um factor de crescimento celular necessário que se descobriu estar prefsrencialments ligado por proteínas receptoras de biotina associadas âs membranas celulares. Os reagentes biotinizantes adequados a uma ligação covalente de uma fraeção de biotina a polinucleótidos, proteínas ou a outras moléculas adequadas estão à venda no comércio.-. A ligação da fraeção vitamina ao seu receptor da superfície celular iniciai o transporte através da membrana da vitamina solúvel na água. ou, no caso do presente invento, do complexo constituído pela vitamina e pela molécula exógena„
um transporte através da fornecer moléculas exógenas água através da membrana-vitamina solúvel na água e' 0 complexo é depois pasto 0 presente invente* utiliza membrana mediado por um receptor para complexadas com a vitamina solúvel na Forma-se primeiro um complexo entre a uma molécula exógena pré-determinada. em contacto com a célula que solúveis na água e, associada através da membrana mediada por de tempo suficiente para permiti na do complexo com o auxilio tis tem receptores para vitaminas 5 uma aciivitiade de transporte um receptor5 durante um período r o transporte através de. membra" actividade de transporte st reves ti a membrana mediada por um Deste modo, as moléculas transportadas com uma maior captor da vitamina solúvel na agua» jxógenas são ou transportadas, oU aρides através da membrana» D método do presente invento é particularmente Útil para aumentar o rendimento de internaiizaçlo <absorção celular ) de moléculas exógenas que são normalmente resistentes à interna 1ização celular» fts proteínas e os polinucleótidos previamsnt© considerados como difíceis se moverem através das membrana celulares podem ser internaiizados através da aplicação do método do presente invento» Por exemplo, foi demonstrada a transfecç»* e a expressão dum produto proteico codificada através de um gane funcional internaiisado, complexado com biotina» A biotina conjugada com um DMA de plasmídeo contendo uma sequência qué codifica a cloramfenicol aciltransferase (CAT) foi transportada para a E» coli através de uma via endocitótica mediada por um receptor de biotina» 0 transporte de produtos proteicos bioti— nilados tanto nos mamíferos como em células vegetais foi conseguido quer em sistemas in vivo quer in viiro» 0 método do presente invento cabo utilizando análogos químicos ou químicos também pude ser levada a derivados de vitaminas 6 - *
solúveis na água que têm reacção cruzada com um receptor de vitamina solúvel na água»
Descrição.....pormenorizada do invento 0 método do presente invento requere a presença de receptores apropriados para. vitaminas solúveis na água associadas â membrana. A membrana pode definir um volume intracelularP tal como o retículo endoplasmático ou outros organelos, tais como mitocSntíriãSj ou pode, alternativamsnte, definir a fronteira da célula» G transporte trans-membrana através da fronteira da célula ocorre geralmente em virtude de um mecanismo de transporte endocitófcico» Em regra, concluiu-se que os receptores de vitaminas solúveis na água medeiam a interiorizarão celular de vitaminas solúveis na água através da actividade endocitática. Os receptores podem ser constituintes naturais da célula ou podem ser inseridos na membrana celular através de manipulação física externa» Alternativamente, a expressão para a proteína ou a apoprofceína, de um gene estranho inserido correspondendo a um receptor da vitamina solúvel na água, por meio de uma célula transfectada, pode assegurar a presença de um receptor de vitamina solúvel na água numa célula alvo»
As vitaminas solúveis na água conhecidas ou que se julga terem receptores celulares adequados para os fins do presente invento incluem, mas não se limitam à biotina, aos análogos da biotina tais como a 6-iM-hioti.nil-L-Iisina Cbioci-tina), o sulfóxido de biotina, a oxibiotina (oxobiotina), a 5,6 -dimeti 1benzimidaaoloiIcianccobamida Ccianocobalamina - vitamina a 5,6 - dimetilbenzimidazoloilaquaocobamida (aquocobalami— na - vitamina a 5,6 - dimetilbensimidazoloilhidroxoco-
Cl o bamida (hidroxocobalamina - vitamina B-12^19 a adenosilcobalami-na, a metilcofoalamina, os ácidos fálicos tais como a folacina.
metotrexato, o ácida ptsropal Iglutãmica ? as ptes^idinas* a niaci-na, o ácido pantoténico, a rxboflavina e a tlamina»
As experiências preliminares usando a vitamina solúvel na água piridoxina revelaram uma reduzida actividade potenciando a sua absorção» έ possível que a piridoxina e os análogos da piiririoxina não sejam adequados para serem utilizados de acordo com o presente invento»
Devido à fácil, obtenção dos reagentes de biotini 1 ação e dos métodos de biotinilação adequados para serem usadas com peptídeos? proteínasoligonucleótidos e polinucleótidos, a biotina constitui uma vitamina solúvel na água preferida para os fins do presente invento» A biotina ê também uma. vitamina solúvel na água preferida já que ela é um factar de crescimento necessário a uma grande variedade de células e receptores de biotina mediando a actividade endocitótica foram identificados era mamíferos, plantas e células bacterianas»
A formação de um complexo entre uma vitamina solúvel na sigua, tal como a biotina» e uma molécula exógena de interesse é conseguida com facilidade no caso de numerosas moléculas s macromoléculas. As fracções de biotina podem ser facilmente conjugadas ás proteínas tornando o grupo carboxilo da biotina reactivo em relação aos grupos amino livres das proteínas» Pode ser usado um reagente de biafcinilação tal como o éster ds D—bio-t i ri “”M- h i d r ο κ i —~-u.cc i n i m i d a ou o éster ds biotinil—p—nítrofenilo* O éster activado reage era condições suaves com os grupos amino para incorporar um resíduo de biotina na molécula desejada» O processa a ser seguido para biotinilar macromoléculas usando iJ—taiotin—N—hidroxi—succinimida ê bem conhecido da técnica da especial idade (Hofraann et al»5 J» Am» Chenu Soc» Ιβθ, 3505-3590 (1978))» Os processos adequados, para biotinilar uma molécula
exógena usando um éster de biotinil-p-nitrofenilo como reagente de biotinilação também são bem conhecidos da técnica da especialidade (Bodsnszk et ah J» Am» Chem. Soc = 99„ 235 (1977))« Outros reagentes tais como d éster M~hidroKÍ—succinimida do ácido D~biotinil—€-aminocaproico em que o ácido €—aminocaproico serve como uma ligação espaçadora para reduzir o impedimento estérico também podem ser usados para os fins do presente invento. 0 oligonuclsótidos e os polinucleótidas também podem ser biotinilados usando métodos quer directos, quer indirectos» Qs métodos indirectos incluem a marcação terminal de um polinu-cleótido com um nucleótitío biotinilado? ou a "nick translation" que incorpora nucleótidos biotinilados- A ,5nick translation55 ou marcação terminal do DMA pode ser conseguida usando os métodos descritos em Maniatis et al.? "Molecular Cloning s A Laboratory ManualiS« págs» 109-1 íé»s Cold Spring Harbor Press (1982)»
Os métodos directos referem-se aos processos em que a biotina é directamente ligada a um pclinucleótido alvo usando um reagente de biotini1ação. Os reagentes susceptiveis de serem fotoactivados tal como o sal de N-(4~azido~2--nitrofsnil) -N-<3~bio-tinilaminopropil>~N~metil~ls3— -propanodiamina C fotobiotina) podem ser usados para biotinilar o DMA de acorda com o método de Foster st a! = 5 Nuc . Acids Res. 13s745-761» Um método alternativo usa um reagente de hidrazida de biotina numa reacção catalisada por um bissulfito capaz da transaminação de bases de nucleótidos,, tais como a cistidina3 de acordo com o método descrito por Reisfsltí et al» 5 B«B»R.C» 142s5i9-52ó (1988)« Este método requere simplesmente uma incubação de 24 horas do DMA ou do RNA com hidrazida de biotina a 1Θ mg/ml num tampão de acetato 5 pH 4j5s contende? bissulfito 1 n = A hidrazida de biotina pode? também ser usada para biotinilar carbohidratos contendo um aldeído 1ivre»
A absorção celular de polinucleófcidas biotiniladas mediada por ura receptor de vitamina solúvel na água fornece um mecanismo alternativo para a transfeeção das células» A técnica do presente invento é particularmente valiosa visto ser aplicável a certos tipos de células, tais como células vegetais, que sSo normalments resistentes a técnicas de transfeeção correntes» 0 fornecimento de genes· estranhos ao interior da célula pode ser conseguido ou intensifiçado através do presente invento» Uma vez administrados ao interior da célula, estes genes estranhos podem ser inseridos e expressos com o auxilio ds um promotor natural ou exógeno para produzirem a proteína desejada» Para além das proteínas» podem ser produzidas outras macroraoléculas. Por exemplo, uma sequência RNA de sentida contrário capaz de ligar a intsrferência com o RMA mensageiro endógeno» é igualmente útil a administração de proteínas e de outras moléculas não-nucleotídicas através da absorção mediada por um receptor de vitaminas solúveis na água» Os anticorpos, os psptidsos bioactivos, os peptidsos tóxicos, ou os peptídeos tarraaceuticamente valiosos podem ser fornecidos ao interior da célula pelos meios indicados no presente invento» Isto tem um valor particular no caso de aplicações terapêuticas in vivo, que envolvam o fornecimento de moléculas que não são normalmente interiorizadas por uma célula alvo»
Os exemplos que se seguem são apresentados para melhor ilustrar a gama de moléculas exógenas e de tipos de células a que o método do presente invento pede ser aplicado» i©
\ .?
CONJUGADA COM BIOTINA POR
Exemplo í - ÃBSORçSO DE INSULINA CÉLULAS DE FEOCROHOCϊ TOMA DO RATOs (PC-12) do rato foram adqui- Células ds f eocromocitoma ridas à "American Typs Culture CdIlection'* 5 células essas que foram cultivadas (37'°C, em ar humidificado com 5% de CO^) aderentes a frascos de plástico, durante 2 a 3 semanas, até estarem confluentes em meio de 85% HMPI 164©, 1©% v/v de soro de cavalo inactivado pelo calor e 5% de soro fetal de vitelo contendo 1% de ss trep tomic ins.-pen ic i 1 ina,,
Preparou-se insulina marcada com biotina s fluores-ceína» Adicionaram-se simultaneamente a 1 ml de uma solução de í mg/ffll de proteína de insulina em tampão de fosfato salino, 1©Θ μΐ de uma solução de 1 mg/ml de isotiocianato de fluoresceína (FITO sííi dimetilfarmamida CDMF) e 1©© μΐ de uma solução de 1 mg/ml de N-hidroxi-succinimidobiotina em dimetilsulfóxido (DMSO). Permitiu-se que os dois reagentes de marcação reagissem à temperatura ambiente durante 4 horas, após o que os reagentes que não reagiram foram parados com 1© μΐ ds stanolamina.·. A mistura de. raacção parada foi depois dialisada contra água bidestilada até os derivados de fluoresceína que não tinham reagido deixarem de dialisar para a água, A ligação covalente ds biotina e de fluoresceína à proteína pretendida foi confirmada por meio de electroferese em gel ds dodscilsulfato ds sódio-policriamida e de análise por transferência “Western“r.
Como testemunha preparou-se insulina não biotinilada marcadada com fluorasceína. A 1 ml de uma solução de í mg/ml a ©35 ml de insulina adicionou-se ©,5 ml de uma solução a 1 mg/mi de isotiocianato de fluoresceína (FITO em d i me t i1fornamida <DMF)„ Deixou-se a raacção prosseguir durante 4 horas no escuro, à temperatura ambiente» Passadas 4 horas a reacçSo foi parada ii
com 10 μΐ de etanolamina a a solução de insulina marcada foi dialisatia contra água bidestilatia até deixar de aparecer na solução α FITC que não reagiu»
As células PC12 de rato foram cultivadas em meio RPM! 164Θ modificado5 como uma monocamada no fundo de um frasco de cultura» Antes das células serem removidas, a monocamada foi lavada com uma porção de 20 ml de uma solução de Locke fresca» As células ressuspensas fcfra.su depois deslocadas para dentro de 20 ml da solução de Locke através de agitação suave, com um fluxo da solução de Locke» As células suspensas foram sedimentadas por centrifugação a 10.000 x g durante i« segundas s depois de ressuspenslio em solução de Locke em tubos de policarbonato separados (4Θ ml/tubo) para uma densidade final de 1,14 x 1Θ° células /ml, adicionaram-se as seguintes quantidades de proteínas à suspensões de células s adicionou—se ao primeiro tubo 4Θ pg de insulina marcada com fluoresceína e ao tubo testemunha adiciona-ram-se 40 pg de insulina conjugada com biotina marcada com fluoresceína. Deixaram—se os tubos a incubar a 37°C. A intervalos de 5, 15 e 33 minutos, removeu-se 0,5 ml ds cada suspensão celular e sedimentou-se a 10.000 x g durante 10 segundos. 0 sedimento de células foi lavado e novamente sedimentada duas visses em 1 ml de solução ds Locke e depois fixado pela adição de 20Θ μΐ de uma solução a 2% de formalina em tampão ds fosfato salino. Adicionaram-se seguidamente treze microlitros da suspensão de células fixadas a uma lâmina de microscópio e foram observados com o microscópio de fluorescfncia a fim de se detec-tarem as proteínas internalizadas» Não se notou qualquer evidência ds internaiizaçSo para a insulina marcada com fluoresceína que actuava como testemunha. Observou-se a internaiização celular para a insulina biotinilada marcada com fluoresceína, aumentando a quantidade internalizada com o tempo»
X - -V ί ϊ V \ ν--'"
Exemplo 2 - ABSORÇSO DE HEM06L0B ϊ ΝΑ CONJUGADA COM ΒΙ ΟΤΙ ΝΑ POR CÉLULAS DE FEOCROMQCI TOMA· DE RATO g
Seguindo o mesmo procedimento geral estabelecida no Exemplo i , biotinilou-se hemoglobina e observou-se que a forma» hioiinilada é preferencialmente internaiisada pelas células ds feacromocitcma do rato quando comparado com a hemoglobina nSo-biotinilada.
Exemplo 5 - ABSORçSO DE ALBUMINA SÉRICA BOVINA POR CÉLULAS DE SOJAs
Culturas ds suspensões de- células de soja de Slycine iíiax Nerr Var Kent foram mantidas transferindo células de 7 em 7 dias para o meio ds crescimento fresco N-38. A 2© ml de uma cu.ltura em suspensão de células ds soja adicionaram-ss 1® μΐ de albumina sérica bovina marcada com fluoresceína (testemunha) ou marcada com fluoresceína e biotina» As células foram deixadas em incubação durante, no máximo,* 6 horas. A intervalos de tempo variáveis, 1 ml da suspensão celular foi filtrado para remover o meio ds crescimento, lavado com 5€> ml de meio de crescimento fresco e ressuspsnso em 2Θ ml do mesmo meio. A suspensão de células foi depois observaria num microscópio de fluoresCincia para se determinar se a internai i--caçSo celular da albumina sérica bovina tinha ocorrido. A xnternaIxsaçSo só se verificou para», a -albumina sérica bovino biotinilada.
Exemplo 4 - ABtíGRÇSO DA INSULINA POR CÉLULAS DE BOJA s
Seguindo o mesmo processo geral estabelecido no Exemplo 3» a insulina foi biotinilada e observou-se que a forma
X » 5 ; i. '. hiotinilads da insulina é preferencialmente inisrnalizatía pelas células da soja se comparada com a insulina nSo-hiotinilada»
Exemplo 5 - ABSORçãQ DE HEMOGLOBINA POR CÉLULAS DA SOJAs
Seguindo d mesmo processo geral estabelecido no Exemplo 3, a hemoglobina foi bíotínilada e obssrvou-ss que a forma biotinilada da hemoglobina é preferencialmente internaiizada pelas células da soja se comparada com a hemoglobina nSo-hiotini-laría,.
Exemplo 6 - ABS0RÇ80 DE ALBUMINA SÉRICA BOVINA POR CÉLULAS DE CENOURA s
Colocarain—se e mantiveram—se células de cenoura tipo selvagem em cneio de crescimento MS suplementado com Θ51 mg /1 da ácido 2*4—diclorofenoxiacético. Albumina sêrica bovina foi marcada com fluoresceína sozinha como controle ou com fluorores-ceina e biotina de acordo com os processos descritos no Exemplo 3. As células de cenoura foram depois incubadas durante 7 horas na presença da respectiva albumina séries bovina marcada * Mantiveram-se todas as outras condições tal como se descreveu no Exemplo 3» Observou-se internaiizaçlo celular apenas nas células que contactaram com albumina sérica bovina marcada com biotina..
Exemplo 7 - ABSORÇSO DE INSULINA POR CÉLULAS DE CENOURA s
Seguindo α mesmo processo geral estabelecido no Exempla &, a insulina foi bioiinilada e observou-se que a forma biotini— lada da insulina é prefsrencialmente internalizada pelas células da cenoura se comparada com a insulina nSo-biotinilada.
Exemplo 0 - ABSORçKO DE HEMOGLOBINA POR CÉLULAS DE CENOURA 8
Seguindo o mesmo processo geral estabelecido no Exemplo 65 a hemoglobina foi biotinilada e observou-se que a forma biotinilads da hemoglobina é prefersneialments internaiisada pelas células da cenoura se comparada com a hemoglobina nSa-hioti-ni Xada„
Exemplo ? - DESRADAçSO DE HEMOGLOBINA POR CÉLULAS DE SOJA
Para se determinar se a hemoglobina foi rapidamente degradada após internaiisação celulars pelo transporte através da membrana,* deixou-se que as células de soja internaiizassem s metabolizassem hemoglobina biotinilada durante um período de 8 horas nas condições descritas no Exemplo 5, após o que as células de soja foram rapidamente homogeneizadas numa solução de dodecil-sulfato de sódio a fim de desagregar e desnaturar todo a material proteico. Os polipeptídeos solubilizados foram separados de acordo com o seu peso molecular por alectroforese em gel de policriamida e depois electrotransferidos para papel de nitro-celulose, fts posições dos peptídeos marcados com biotina foram então visualizadas sobre o material de nitroceiulose por coloração avidina ligada ligada a peroxidass de rábano e o substrato corado p—cloronaftol« Observou—se que todo o material ligado a biotina migrava com um peso molecular aparente de m iè „ΘΘΰ dal tons, praticamente igual ao peso molecular das cadeias de globina parentais da hemoglobina,, indicando que não houve degradação das cadeias de globina parental durante o período de incubação de 8 horas.
Exsmols 10 - LIBERTAçSO DO INIBIDOR DA TRIPSINA DE SOJA IN VIVO EM RATINHOS s O inibidor de tripsins de soja íSBTI) i~6 mg) foi 1 marcado radioactivamsnte com usando 8 iodoesferas (tíio Rad) i em í ml de tampão que foi depois dialisado para se remover ο Σ....... que não reagiu. Depois de se dividir sm duas fracçSes iguais, uma fracção foi biotinilada com M-hidroxisuccinimidil-biotina s a outra fracção foi deixada como controlo não modificado. Os ratinhos (£'25 g) foram então injectsdos com SBTI biotinilado ou SBTI testemunha por inserção de uma seringa hipodérraica tendo uma agulha de 25 gauge na veia da cauda do rato. Passados 15 minutos, cada um dos ratos foi morto efectuando-ss em cada um deles uma perfusão com soro fisiológico isotónico contendo heparina pelo método de sfluxo e influxo cardíaco directo» Quando aparen-temente os tecidos deixaram de ter sangue, a perfusão foi parada e os tecidos/orgãos foram removidos, pesados s contados para - I 25 ___ I '"'--SbíI num contador gama. Embora se dstectasse alquma radioac— •3 ·7:ΡΤ tividade nos ratinhos tratados com I não-biotinilado, foi 105__ encontrado entre 4 a 1ΦΦ vezes ma is ϊ — -Stíll nos ratos tratados com 8ΒΤΣ biotinilada o que indicou o 'fxito da libertação in vivo para os tecidos celulares murinos.
Contaçens por minuto/grama de peso moldado
TseÃâfi SBíI testemunha Biotina SBil Fígado 535 1967 Pulmão 1®7 2941 Rim 5152 S697 Intestino ® 70® Músculo 0 1065 Coração 0 739 Cérebro 0 267
Exemplo 11 - ABSOEÇSO DE DMA DE ESPERMA DE SALMaO POR CÉLULAS DE SOJA s DMA de esperma de sai ma d Bem proteínas, numa formai altamente polimerisada <£ 50.ÔÔ© pares de bases de comprimento), ou numa forma partida CÍ5®® pares de bases de comprimento) foi transaminado nos resíduos citosina. 0 DMA transaminado (1 mg) foi marcado com fluorescsína através da adição de 0,5 «ig de isotiocianato de fluoresceína (FITO em dimefcilsulfóxido ÍDMSO)« R mistura da reacção resultante foi dividida em duas fracçSss e a re-acção de marcação foi parada numa das fracçÕes= mediante a adiçao de 1® μΐ de etanoiamina. Esta fracçSo parada serviu como testemunha não-biotinilada» 0 restante DMA foi então marcado covalentemente com biotina através de uma reacçSo com 0,5 mg de N-hidroxi-succinimidil-biotina em DlfSQ, Após purificação, os dois derivados (1 pg/ml) foram incubados separadamente numa cultura da células de soja em suspensão? à. temperatura ambiente, durante 6 horas es em seguida, as células foram lavadas em 5Φ ml de meio de crescimento fresco s observadas por microscopia de 17
fluororsscfncia» Apenas o DMA biotinilado eritrbu nas células d® so j a»
Exemplo 12 - TRANSFORHAÇSO DE E. CDLI E EXPRE8SS0 DO BENE DE RESISTÊNCIA À AMPICILINA: 0 DMA dE plasmideo CpUCS) foi biotinilado por "nick translafcion*' na presença de biotina-14-dATP usando um estojo comercial de "nick translation" (Bethesda Research Laboratories)» 0 DMA biotinilado e o DMA nlo modificada íi ;ag) foram adicionados a E, Coli estirpe Cu 123Θ que foi tornada competente por tratamento com s CaC 1 de acordo com o método de Maniafcis et «1»» !!Hol^£MÍar_ÇlQninq s A Laboratory Manual % págs. 25Φ-251, Cold Spring Harbor Press í!9B7)« Após transformação os transfor— mant.es positivos foram seleccionados semeando as células em meio L.B que continha 5® sigml de ampicilina e em seguida incubados durante a noite a 37°CAs colónias que sobreviveram à ampici— lina foram contadas e determinou—se a eficácia da transformação. O número de colónias de EColi sobreviventes foi. pelo menos 1 ®Θ venes superior em E-Coli transformada com os plasmideos faiotini— lados.

Claims (2)

  1. ; ' ι iâ — Método para intensificar o transporte de uma molécula exógena numa célula vegetal, caracterizado por o referido método compreender o passo de pSr em contacto a célula vegetal com a molécula exógena complexada com uma vitamina solúvel em água ou com um agente de ligação receptor da vitamina, solúvel em água5 durante o período de tempo suficiente para permitir o transporte através da membrana do referido complexo» 2-ã - Método de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado por a vitamina solúvel em água ser a hiotina ou seus an ax og os»
  2. 32 - Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a molécula exógena -ser um ácido nuclaico» 4§í — Método de acordo com a Reivindicação 1 ou. 2, caracterizado por a molécula exógena ser uma proteína» 5ã - Método para intensificar o transporte de um ácido nuclaico numa célula» caracterizado por o referido método compreender o passo de pSr em contacto a célula com o ácido nucleico complexada com uma vitamina solúvel em égua ou com um agente de ligação receptor da vitamina solúvel em água, durante o tempo suficiente para permitir o transporte através da membrana do referido complexo» áã - Método de acordo com a Reivindicação 5, earacts-rizado por a vitamina solúvel em água ser a biotina ou seus análogos» / ^ I Método da 3.C ortío coíb a Reivindicação 5 ou d 3. r 3 C. *Í1S £”* isado por s célula 5£-f • uma célula an x ma1 . *“í s - Método _Λ _ wi \ZÍ •3C ordo com a RsivindicaçSo S ou 6, caractar isado por s cèlu ; 1 S. ser uma caiu.ia veqetal» 03 - Método de J3;*~ ardo com a Re i v i n d i cação T*j ij ΰ *»:« s; c ar a o x;e r isado por a célula ser ' u ff? ρ r oc a r i i □ta» ·} X ®ã — Método pa ra in tens if íc ar o a nspo r te d 0 uma mo lécu 1 Θ. esí óqena no teci. do r-ç» lular d e um nos uede i ro d atado de um si. stern 3 cir cu. 1 -a*corx o !j ca ra c te risado por o re f e r ido UíCr? toao c :om-- pr 00Π d er D passo de se in j ectar o ho SpSd ro S fifíi 3. ÍRO léc ula 0X ógen 3 com iplsxada com um a v itamina so IÚVS 1 em áqua ou c Offl um ag en t.*s? d e 1 iqação recept ο ί de Li iTr S vi. tami na s ol ÚV' e 1 0ΓΠ áqua« ís - Método d ο aco rdO CQíTí a R 0 x v i nd ic a C ão 1@ 5 c a rac ’ 'CO“ r i ze.do r> or a vitamina so Ιών e 1 em áqua ser a h iotx na ou s sus an cl i OQ DS L. iSbOci ç 3 d® ftbtll dfc; IW0’
    nUA VICTOR CCfíC®N, 10-A, 1/ 1200 LieaoA
PT93645A 1989-04-03 1990-04-03 Matodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas PT93645A (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33181689A 1989-04-03 1989-04-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT93645A true PT93645A (pt) 1990-11-20

Family

ID=23295498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT93645A PT93645A (pt) 1989-04-03 1990-04-03 Matodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas

Country Status (6)

Country Link
AU (1) AU5356490A (pt)
GR (1) GR900100248A (pt)
IL (1) IL93982A0 (pt)
PT (1) PT93645A (pt)
WO (1) WO1990012095A1 (pt)
ZA (2) ZA902538B (pt)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5574018A (en) * 1994-07-29 1996-11-12 Amgen Inc. Conjugates of vitamin B12 and proteins
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
ES2244006T3 (es) * 1996-08-27 2005-12-01 University Of Utah Research Foundation Bioconjugados y administracion de agentes bioactivos.
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
WO2003093449A2 (en) 2002-05-06 2003-11-13 Nucleonics, Inc. Methods for delivery of nucleic acids
AU2008224988A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Endocyte, Inc. Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57186492A (en) * 1981-04-17 1982-11-16 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Transformation of bacterium
NZ217821A (en) * 1985-10-10 1989-07-27 Biotech Australia Pty Ltd Oral delivery system; complex of active agent and vitamin b12 or analogue thereof
EP0273085A1 (en) * 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging

Also Published As

Publication number Publication date
ZA902538B (en) 1991-01-30
ZA902539B (en) 1990-12-28
GR900100248A (el) 1991-09-27
IL93982A0 (en) 1991-01-31
AU5356490A (en) 1990-11-05
WO1990012095A1 (en) 1990-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11944642B2 (en) Compositions of functional mitochondria and uses thereof
PT93646A (pt) Metodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas
JP3814294B2 (ja) 親水性分子の脂質化のための方法および組成物
EP3167935B1 (en) Method and carrier complexes for delivering molecules to cells
ES2211882T3 (es) Sistema de cesion de polinucleotido, automontable que comprende policationes de dendrimeros.
RU2113485C1 (ru) Средство для переноса нуклеиновых кислот или их производных в клетки человека или животных
KR20080041755A (ko) 에리트로포이에틴-응답 세포, 조직 및 기관의 보호, 회복및 향상
US7205387B2 (en) Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist
JPH10504709A (ja) ポリヌクレオチドの細胞への標的を定めた送達を増大させるための細菌成分の利用
JP2000509394A (ja) 細胞膜を横切って物質を輸送するためのポリペプチド結合体
JPH11510787A (ja) 腫瘍画像化法および組成物
Rushbrook et al. Identification of alpha-cardiac myosin heavy chain mRNA and protein in extraocular muscle of the adult rabbit
Shelanski Chemistry of the filaments and tubules of brain
EP1053024A1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
JP2002513747A (ja) ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体
PT93645A (pt) Matodo para intensificar o transporte atraves da membrana de moleculas exogenas
US6974698B1 (en) Methods for delivering biologically active molecules into cells
US20220211624A1 (en) Fusion protein nanodisk compositions and methods of treatment
WO2023201432A1 (en) Composition for the inhibition of nrf2 and uses thereof in cancer therapy
Su'etsugu et al. Reconstitution of in vitro inactivation and reactivation systems of DnaA protein for the control of chromosomal replication initiation in Escherichia coli
Monsigny et al. Synthesis of Glycoconjugates: Their Use to Study the Intracellular Traffic of Endogenous Lectins and to Deliver Oligonucleotides and Genes
AU2007200697A1 (en) Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs

Legal Events

Date Code Title Description
FC3A Refusal

Effective date: 19951215