PT91856B - Processo de preparacao de uma matriz com actividade imunomodulante, a base lipido e saponina - Google Patents
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Description
O presente invento refere-se ao processo de preparação de uma matriz iscom compreendendo pelo menos um lípido e pelo menos uma saponina com um efeito imunomodulante, uma vacina e um conjunto compreendendo a mesma e novas saponinas para incorporação na matriz e ao processo de preparação de novas saponinas.
Podem ser produzidos muitos antigénios virais e microbianos pelas modernas técnicas actuais. 0 seu total compromisso em vacinas não será, contudo realizado a não ser que eles sejam administrados juntamente com um adjuvante efectivo, um agente que aumenta as respostas imunes mediadas por células e/ou anticorpos.
Os únicos ajduvantes correntemente autorizados para utilização em humanos, são na maioria dos paises, o hidróxido de aluminio e o fosfato de aluminio que tém sido utilizados durante muitos anos para aumentarem as respostas dos anticorpos p.e. aos toxóides da difteria e do tétano. Embora estes adjuvantes seja suficientes para muitas vacinas, os estudos têm demonstrado que são muitas vezes mais eficientes outros adjuvantes, p.e. o adjuvante completo de Freund (FCA) e a Quil A na extracção da resposta do anticorpo e da imunidade mediada por célula em animais de experiência. De facto, eles são frequentemente requeridos para protecção. Contudo, o FCA produz granulomas nos locais de injecção, o que os torna inaceitáveis para as vacinas, humanas e veterinárias. De facto, mesmo o hidróxido de alumínio pode originar reacções na forma de granuloma nos locais de injecção. Por estas razões, são feitas muitas tentativas para se desenvolverem adjuvantes com a eficiência do FCA mas sem os efeitos secundários indesejáveis.
Nos pedidos de patente EPC de Morein Nqs. 83850273,0 e 85850326,1 são descritos complexos imunogénicos entre os determinantes antigénicos com regiões hidrofóbicas e os glicósidos, entre eles as triterpeno-saponinas e especialmente a Quil A, assim denominados complexos iscom. Num tal iscom, a quantidade de Quil A pode ser cerca de 10-100 vezes mais baixa e produz o mesmo efeito antigénico do que quando a Quil A na forma livre é misturada com
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-3o antigénio.
pedido de Patente Europeia Nq 87200035,1 indica que a presença de antigénio não é necessária para a formação da estrutura iscom básica, sendo possível que esta forme a partir de um esterol, tal como colesterol, um fosfolipido, tal como a fosfatldil-etanolamlna, e de um glicósido tal como a Quíl A.
Verificou-se agora que não é necessário, um fosfolipido para a preparação da estrutura iscom básica não incluindo o antigénio. Como alternativa um esterol, tal como o colesterol em conjunção com um glicósido tal como a Quíl A são os componentes estruturais essenciais reunidos num complexo semelhante à estrutura iscom semelhante a caixa tipica, assim denominada matriz. Tem também sido descoberto que a matriz tem efeitos imunomodulantes tais como efeitos adjuvantes ou imuno-supressores.
presente invento refere-se ao processo de preparação de um complexo entre pelo menos um lipido tal como o esterol, de preferência colesterol, e uma ou mais saponínas, tais como triterpeno-saponinas, especialmente Quil A ou seus subcomponentes que não é uma vesícula lipldica sem quaisquer antígéníos ou determinantes antigénicos intencionais para utilização como um agente ímunomodulante. Assim, não está integrado qualquer componente antigénico como é realizado num iscom. Esta matriz tem um efeito adjuvante e pode ser utilizada misturada, conjuntamente, com um ou mais antlgénl cos de preferência na forma multimérlca.
Nesta matriz iscom, é também possível integrar outros adjuvantes com regiões hídrofóbícas. Pode ser requerida a adição de outros lipidos para facilitar a inclusão de outros adjuvantes. Assim o presente invento refere-se também ao processo de preparação de um complexo contendo lipidos e adjuvantes, diferentes de colesterol e saponinas. Tais complexos contêm a matriz constituida por colesterol e saponlna, de preferência Quil A ou seus subcomponentes, um ou mais de outros adjuvantes e um ou mais lipidos diferentes do colesterol. Estes são de preferência vesículas não llpi69 948
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-4dicas ou lipossomas e têm uma estrutura muito especial em microscopia electrónica.
Os lipossomas têm sido descritos na literatura e a sua estrutura geral, é bem conhecida dos investigadores biológicos. Os lipossomas são vesículas compreendendo uma ou mais séries de camadas lipidicas formando estruturas semelhantes a cebolas espaçadas umas das outras por material aquoso.
A matriz pode ser injectada num animal ou num ser humano como uma mistura com o antigénio na forma multimérica. Alternativamente a matriz e o antigénio podem ser injectados separadamente. Nesta caso são obtidos os melhores resultados se a matriz adjuvante e o antigénio são injectados em regiões que são drenadas para o mesmo glanglio linfático. Quando o adjuvante está presente na forma multimérica numa matriz de acordo com o invento, a dose de adjuvante pode ser baixada quando comparada com a do adjuvante que é injectado separadamente na forma monomérica ou numa forma indefinida. Isto significa que os efeitos secundários tóxicos causados pelos adjuvantes quando convencionalmente utilizados, i.e. quando são injectados sozinhos como tal, podem ser baixados ou evitados. A dose de adjuvante não pode, contudo, ser baixada tanto como é realizado nos complexos iscom de acordo com os pedidos de patente acima mencionados.
Quando é utilizado um adjuvante numa matriz de acordo com o invento, o antigénio não é integrado na mesma particula que o adjuvante como é realizado numa partícula iscom” de acordo com os pedidos de patente EPC acima mencionados. Isto significa que se pode utilizar antigénios sem propriedades anfipáticas ou antigénios que não podem ser forçados a exposição a regiões hidrofóbicas. Como um exemplo, pode ser mencionado que alguns virus não têm proteínas anfipáticas, p.e. picornavírus, adenovirus ou parvovírus, mas têm uma forma de particula submicroscópica como o antigénio presente em várias cópias, i.e. como multimeros. Para tais vírus é mais prático injectá-los conjuntamente com o novo complexo adjuvante do que associar a eles grupos hidrofóbicos ou criar gru69 948
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-5pos hidrofóbicos por outros meios (p.e. desnaturação parcial) e integrá-los numa partícula iscom.
Tipicamente, a presente matriz contem esterol, de preferência colesterol, e uma ou mais saponinas numa proporção molar de cerca de 1 para 1 ou numa proporção em peso de cerca de 1 para 5. Os complexos têm uma estrutura esférica aberta constituída por subunidades circulares ou partes da estrutura esférica revelada por microscopia electrónica. Eles têm um coeficiente de sedimentação de cerca de 20S.
Quando são integrados outros adjuvantes, a matriz de lipido-adjuvante contem tipicamente esterol e saponina numa proporção molar de cerca de 1:1 e os outros adjuvantes e lipidos aproximam-se conjuntamente dos cerca de 1 molar. Para uma tal matriz a proporção molar de esterol; saponina; outro adjuvante e lipidos é de cerca de 1:1:1. Assim a proporção molar de esterol; saponina; outro adjuvante e outros lipidos é 1:1:0, 1-1: 0,1-1, i.e. o lípido ou adjuvante adicionais podem estar presentes na matriz até que as suas proporções molares (ou a soma das suas proporções molares) seja um meio da da saponina e do esterol presentes.
A estrutura, como revelada por microscopia electrónica é a mesma quer para o iscom quer para a matriz ( ver figura 1).
coeficiente de sedimentação, sendo dependente da densidade do material incorporado na matriz, é de cerca de 12-22S para as matrizes contendo colesterol, saponina, outros adjuvantes e lipidos .
As saponinas podem ser quaisquer saponinas com regiões hidrofóbicas tais como as descritas em R. Tschesche e Wulf, Chemie and Biologie der Saponine in Fortschritte der Chemie Organinischer Natturstoffe, publicado por W. Herz, H. Grisebach, G.W. Kirby, vol. 30 (1973), especialmente as saponinas fortemente polares, principalmente os triterpeno-saponinas polares tais como os bisdesmosidos acidicos polares, p.e, saponina extraida de Quillajabark Aralosido A, Chikosetsusaponina IV, Calendula-Glicosido C, Chikosetsusaponina V, Achyranthes-Saponina B, Calendula-Glicosido
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-6A, Aralosido B, Aralosido C, Putranjia-Saponina III, Bersamasaponisido, Putranjia-Saponina IV, Trichosido A, Trichosido B, Saponaaido A, Trichosido C, Gypsoside, Nutanosido, Diantosido C, Saponasido D de preferência aescina de Aesculus hippocastanun (T Patt e W Winkler: “Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanun), Arzneimittelforschung 10(4), 273-275 (1960), ou sapoalbina de Gyposophilla struthium (R Vochten, P Joos e R Ruyssen: “ Physico-chiraical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability J Pharm Belg 42, 213-226 (1968) especialmente saponinas extraídas da “Qui llaja Saponaria Mol ina**, principalmente o extracto -DQ que é produzido de acordo com K Dalsgaard: Saponin Adjuvants, Buli Off Int Epiz 77 (7-8), 1289-1295 (1972) e Quil A que é produzida de acordo com K Dalsgaard: Saponin Adjuvants III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974) . São preferidos a Quil A e os seus subfragmentos, especialmente os fragmentos B2, B3 e B4B descritos abaixo.
presente invento proporciona também novas saponinas triterpenóides glicosiladas derivadas da Quillaja Saponaria Molina do tipo Beta Amyrin com 8-11 porções hidrato de carbono, que tem as seguintes características:
a) A substância B2 tem um peso molecular de 1988, um espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) do carbono 13 como indicado nas figuras 5A e 6A e um espectro de RMN do protão como mostrado nas figuras 11A e 12A.
b) A substância B3 tem um peso molecular de 2150 e tem um espectro de RMN do carbono 13 mostrado nas figuras 5B e 6B, e um espectro de RMN do protão como mostrado nas figuras 11B e 12B.
c) A substância B4B tem um peso molecular de 1862, um espectro de RMN do carbono 13 como mostrado nas figuras 5C e 6C, e uma estrutura de RMN do protão como mostrado nas figuras 11C e 12C.
Por direito próprio os compostos B2 e B3 têm actividade adjuvante. Por consequência, o presente invento refere-se também à utilização destes compostos como adjuvantes. 0 composto B4B é de uso na preparação de uma matriz iscom. Podem ser incluídos na
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-7matriz ο B2 e ο B3 tendo actividade adjuvante.
A matriz pode ser produzida a partir de um esteroi tal como colesterol e da saponina B4B. Uma tal matriz não parece ter qualquer actividade adjuvante potente. De forma a potenciar a actividade adjuvante nesta matriz, é possível e mesmo preferível integrar as saponinas B2 e/ou B3 e/ou qualquer outra substância com efeito adjuvante e com grupos hidrofóbicos. Se os adjuvantes nâo contém quaisquer grupos hidrofóbicos tais grupos podiam ser associados a eles pela utilização dos processos químicos conhecidos. Se são para serem integrados outros adjuvantes diferentes do B2 ou B3, são de preferência incorporados mais lipidos como registado na página 13, último parágrafo e parágrafos 1-3 da página 14.
Na matriz de esterol-B4B é também possivel integrar substâncias inumo-supressores contendo grupos hidrofóbicos ou às quais té sido associados tais grupos.
É também possivel utilizar a matriz de esterol-B4B como um agente imunomodulante em mistura com adjuvantes, substâncias imuno-supressoras ou antigénios ou suas misturas.
Como os agentes imunomodulantes são consideradas as substâncias que aumentam, suprimem ou alteram o sistema imune tais como adjuvantes, repressores, interleuquinas, interferões ou outras citoqui- nas.
De preferência, o invento refere-se ao processo de preparação de uma matriz contendo um esteroi, especialmente colesterol, B4B e um de B2 e B3 ou ambos. Quando a matriz é preparada a partir de colesterol e Quil A, ela compreende B2, B3 e B4B.
As matrizes podem ser produzidas por solubi1ização de pelo menos um esteroi num solvente, adição da saponina ou saponinas, e possivelmente de outros adjuvantes e lipidos, após o que o solvente podia ser removido e a matriz transformada numa solução onde os seus componentes não são solúveis, p. e., numa solução aquosa. Isto pode ser realizado com filtração em gel, ultrafiltração, diálise ou electroforese. As matrizes podem então ser purificadas do
X?
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-8excesso de esterol e Qull A, p. e., por centrifugação através de um gradiente de densidade, ou filtração em gel. Como solvente podia ser utilizada a água ou os agentes solubi1izantes ou detergentes mencionados abaixo.
único factor limitante para se realizar a formação da matriz é o tempo necessário nos diferentes ambientes fisico-quimicos, sendo o factor limitante de maior valor, a fraca solubilidade do esterol, p. e., colesterol, em água, na qual as saponinas constituintes da matriz são espontaneamente solúveis.
Assim, tem sido mostrado que com a Quil A e o colesterol mesmo uma formação semelhante à matriz de fase sólida tem lugar após um periodo de tempo relatlvamente longo, p. e., cerca de 1 mês. 0 colesterol deve ser posto em contacto com a Quil A ou os seus componentes purificados. Se o colesterol é introduzido numa suspensão aquosa colóidal através de tratamento por ultra-sons e tratamento por ultraturrax, a matriz é formada com Quil A passadas cerca de 12 horas.
Consequentemente, qualquer outra substância tal como um detergente adicionado à água, e que è capaz de aumentar a solubilidade do colesterol no meio aquoso, é capaz de diminuir o tempo necessário para a formação da matriz, é assim possível produzir uma matriz a partir de colesterol, água e Quil A ou os seus subcomponentes, se o colesterol é introduzido na forma colóidal. Contudo, é mais prático adicionar um detergente ou um solvente. De preferência, as saponinas são utilizadas a partir de uma concentração de pelo menos a sua concentração de formação de mícela, critica (CMC). Isto implica para a Quil A uma concentração de pelo menos 0,03% em peso.
Como agente solubi1izante podem ser utilizados detergentes tais como detergente não-iónico, iónico, i.e. catiónico ou aniónico ou Zwítter-iónico tal como Zwltteragente ou detergente baseado no ácido gálico que é utilizado em excesso. Exemplos típicos de detergentes não-íónícos adequados são as N-alcanoi1-N-alqui1-glucaminas, os ésteres de poliglicol e os éteres de pollglícol com
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-9ácidos e alcóois alifáticos ou araiilfáticos. Exemplos destes são os ésteres alquilpolioxietilénicos com a fórmula geral
C Η- ,,(OCH_CH~) OH, reduzida para C E ; os éteres alquilfenilpon ζη+ι ζ ζ χ η x
1ioxietilénicos contendo um anel fenilo entre o grupo alquilo e a cadeia polioxietilénica, abreviados C $E , p.e. Triton X-100 terc. - COE_ , (éter octi1fenólico de óxido de polietileno); os
O 7 t Q ésteres acilpolioxietilénicos; os ésteres de acilpolioxietileno sorbitano, abreviados Cn sorbitano Εχ, p. e., Tween 20, Tween 80, β-D-Alquilglucósidos, p. e., β-D-octilglucósido. Exemplos tipicos de detergentes iónicos adequados são os detergentes de ácido gálico tais como p. e. ácido eólico, desoxicolato, colato e BCTA (brometo de cetiltriamónio). Podem ser utilizados mesmo os detergentes conjungados tais como p. e., taurodesoxicolato, glicodesoxicolato e glicocolato. Outros agentes solubi1izantes possíveis são a lisolecitina e os 1isofosfolipidos sintéticos. Podem ser utilizadas até mesmo as misturas dos detergentes acima mencionados. Quando se utiliza o processo de diálise os detergentes devem ser dialisáveis num per iodo de tempo não muito longo.
Algumas substâncias tensioactivas facilitam grandemente a formação da matriz. Estas incluem os 1ipidos da membrana biológica intrínsecos com um grupo de cabeça polar e uma cadeia alifática não-polar, p. e., fosfatidilcolina (negativamente carregada) e fosfatidi1-etanolamina (positivamente carregada).
A solubi1ização pode também ser realizada com alcóois, solventes orgânicos ou pequenas moléculas anfipáticas tais como heptano-1,2,3-triol, hexano-1,2,3-triol ou substâncias caotrópicas, ácido acético, tal como ácido trifluoroacético, ácido tricloroacético, ureia ou cloridrato de guanidina.
São para serem usados, de preferência, o alcóol etilico, dioxano, éter, clorofórmio, acetona, benzeno, ácido acético, dissulfureto de carbono, MEGA-10 (N-decanoí1-N-metilglucamina) e β-Oct ilglucósido.
Podem ser obtidos vários rendimentos de matriz, com estas substâncias, e a impressão geral é de que quanto mais elevada for
... ..-st»'
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-10a concentração do detergente no sistema» mais matriz se forma.
b técnicamente possível produzir, purificar e esterilizar a matriz em qualquer um dos sistemas descritos. Por consequência as preparações técnicas de adjuvante activo da matriz podem conter agentes solublllzantes se a sua natureza química e a sua concentração é aceitável no produto final, p. e., para fins de vacina. Contudo, em muitos casos será necessário remover o agente solubilizante da matriz por diálise, ultrafiltração, ou técnicas cromatográf icas em coluna, έ até mesmo possível diluir a preparação até ser alcançada uma concentração abaixada de um dado agente solublllzante ou detergente. A preparação é diluida com água ou com uma solução físiologicamente aceitável, de preferência a uma concentração abaixo da CMC para o agente solubi1izante ou detergente utilizado no sistema (a preparação).
agente solubi1izante podia ser incorporado na matriz numa proporção molar de esterol: saponina: outros adjuvantes lípidos ou agente solubi1izante de 1:1:1, i. e. a proporção molar da soma de lipido, adjuvantes e agente solubi1izante é até metade da concentração molar da saponina e do esterol.
Altemativamente o agente solubi1Izante podia ser deixado misturado com a matriz lscom.
De forma a serem integrados» o agente solubi1izante e os outros componentes imunoraodulantes estes devem ter pelo menos uma região hidrofóbica. Se não estão presentes tais regiões hidrofóbícas, elas podem ser associadas aos componentes antes de ser feita a matriz.
Exemplos de adjuvantes que podem ser incorporados na matriz íscom’· são qualquer adjuvante, natural ou sintético, com o efeito imunomodulador desejado, p. e.» derivados do muramildipéptido (MDP), tais como ácido gordo, MDP substituido, análogos treonilo do MDP, copolímeros anfipáticos, aminas alifátlcas tais como avrídina ou DDA, polianiões tais como sulfato de Dextrana, lipopollssacàridos tais como saponinas (diferentes da Quil A).(Future prospects for vaccíne adjuvants.
(1988) CRC Crit
Warren, H.S
Ζ
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-11Rev. Immunol. 8:2, 83-101; Characterization of a nontoxic monophosphoryl lipid A, (1987) Johnson, A.G. et al, REV. Infect. Dis. 9:5, 5512-5516; Developmental status of synthetic immonomodulators, Berendt M.J. et. al. (1985), Year Immunol. 193-201; Immunopotentiating conjugates, Stewart-Tul1, D.E., Vaccine, 85, 3:1,
40-44)
Estas quatro referências sSo aqui incorporadas como referências.
Os detergentes Zwitteriónicos, neutros, positivos e negativos seguintes são exemplos de detergentes que têm actividade imunomodulante, especialmente actividade adjuvante.
Surfactantes de polímeros de blocos não-iónicos contendo polioxietileno hidrofílico (POE) e polioxipropileno hidrofóbico (POP) que diferem na percentagem de peso molecular de POE e modo de ligação ao POP do POE (BASF Wyandotte Corp.), tais como L72, L81, L92, L101 plurónico, L121, 2531 e 31R1; T1501 octablocos; B-D-X-tilglucósido; surfactantes catiónicos tais como brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA), octadecilamina (OCT), e brometo de cetiltrimetilamónio (BCTA); tetrapalmitato de maltostose, monomicolato de trealose, dibehenilbehenato de trealose; detergentes Zwitteragentes (N-alqui1-N,N-dimetilamónio-3-propano-sulfonato) Z3-8, Z3-10, Z3-12, Z3-14, Z3-16, obtidos de Calbiochem (La Jolla, CA, USA); Z3-18 obtido de Serva (Heidelberg, RFA) , Myrj 45, Brij 52, Brij 58 (também de Serva), e dioctilsulfosuccinato e Tween 20, Tween 80, Triton X-100 e desoxicolato de sódio.
Estes detergentes podem ser utilizados quer como detergentes quer como adjuvantes e podem ser incorporados na matriz iscom.
que se segue são exemplos de agentes inumo-supressores que podem ser incorporados numa matriz de B4B-esterol (de preferência colesterol): ciclosporina A, brometo de dodecildimetilamónio, anfifilos de cadeia simples catiónicos com mais de 10 átomos de carbono e de preferência mais de 15 átomos de carbono, anfifilos de cadeia dupla com até 14 átomos de carbono, de preferência até 12 átomos de carbono.
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-12No caso do adjuvante ou agente inurao-supressor desejado não ter propriedades hidrofóbicas adequadas, ele tem de ser modificado para compreender um domínio hidrofóbico para incorporação na matriz.
grupo hidrofóbico que pode ser associado aos adjuvantes não-hidrofóbicos são cadelas allfáticas lineares, ramificadas, saturadas ou lnsaturadas tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23, 24 e 25 átomos de carbono, tais como lipídos, de preferência com 6, 7 e 8 átomos de carbono; péptidos pequenos com 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, de preferência 2, 3, 4 seleccionados de Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu, Vai, especialmente Tyr; ácido colina, ácido ursodesoxícólico ou derivados do colesterol.
Estes grupos hídrofóbicos devem ser ligados a um grupo que pode ser associado a proteína não hidrofóbica tal como um grupo carboxilo, amino, díssulfureto, hidroxilo, sulfidrílo e carbonilo, tais como grupos aldeido.
Como grupos hídrofóbicos que podem ser associados são, de preferência, seleccionados os derivados carboxilo, aldeido, hidroxilo, e díssulfureto do metano, etano, propano, butano, hexano, heptano, octano e péptidos contendo Cys, Asp, Glu, Lys, de preferência octanal e Tyr.Tyr.Tyr-Cys» -Asp ou -Glu. Os grupos hídrofóbicos com um grupo que pode ser associado devem ser dissolvidos em água com a ajuda, por exemplo, dos agentes solubi1ízantes e dos detergentes mencionados acima ou do ácido clorídrico, ácido acético, ácido acético a 67% em volume, solução cáustica, amónia, dependendo da substância em que irão ser dissolvidos. 0 pH é então ajustado em direcção ao neutro sem a precipitação da substância; aqui está para verificar que não é obtido um valor de pH que desnature a proteína à qual é para ser associado o grupo hidrofóbico.
Os grupos hídrofóbicos com um grupo carboxilo como molécula de associação podem ser associados aos adjuvantes através de carbodiímídas, ou anidridos compostos solúveis em água. No primeiro caso o grupo carboxilo é activado a pH 5 com carbodiimida e mlstu-,Α
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-13rado com a proteina dissolvida em tampão de pH 8 com um elevado teor de fosfato. No segundo caso o composto carboxi é feito reagir com isobutilcloroformato na presença de trietilamina em dioxano ou acetonitrilo, e o anidrido resultante é adicionado à proteina a pH de 8 a 9. é também possível converter o grupo carboxilo com hidrazina em hidrazida que conjuntamente com aldeídos e cetonas das unidades de açúcar oxidadas com periodato da proteina dà ligações h idrazona.
Os grupos amino com ácido nitroso podem, a baixa temperatura ser convertidos aos sais de diazónio, os quais dão ligações azo com Tyr, His, e Lys.
Os grupos hidroxilo com anidrido succínico podem ser convertidos nos derivados hemisuccinato que podem ser associados com grupos carboxilo.
Os grupos aldeído podem ser feitos reagir com grupos amino da proteina até se obter uma base de Schiff.
São descritos diversos grupos e processos de acoplamento no Journal of Immunological Methods, 59 (1983) 129-143, 289-299, Methods in Enzymology Vol 93 pgs. 280-83, e no Analytical Biochemistry 116, 402-407 (1981) que são aqui incorporados como referências.
Os outros lipidos diferentes do esterol podem ser as gorduras ou as substâncias semelhantes a gorduras tais como triglicéridos ou triglicéridos mistos contendo ácidos gordos com até 50 átomos de carbono tais como ácidos gordos saturados com 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 átomos de carbono, p. e. ácido butírico, ácido capróico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirlstico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido araquidico, ácido behénico, ácido lignocérico, ou ácidos gordos insaturados com até 30 átomos de carbono, tais como ácido hexadecenóico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico ácido araquidónico; ácidos gordos hidróxilados tais como o ácido 9,10 de hidroxiesteárico, ácidos gordos hidroxilados insaturados tais como óleo de rícino, áci/'
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-14do gordos ramificados; éteres de glicerol, ceras i.e. ésteres entre ácidos gordos mais elevados e alcóois monohídricos; fosfolípidos tais como derivados dos fosfatos de glicerol tais como derivados dos ácidos fosfatidicos i.e. fosfatidos de lecitina, cefalina, inositol, derivados da esfingosina com 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 átomos de carbono; isoprenoides,g1icolipidos, sul foiípidos, carotenóides, esteróides, esteróis, colestanol, caprostanol, fitosteróis, p. e., estigmasterol, sitosterol, micosterois, p. e., ergosterol, ácidos biliares, por exemplo, ácido eólico, ácido desoxicólico, ácido xenodesoxicólico, ácido litocólico, glicósidos esteróides, ésteres de vitamina A, ou suas misturas.
São descritos estes e outros 1ipidos úteis no: Lipid biochemistry and introduction, Ed.MI. Gurr, A.I. James 1980, Chapman e Hall, London, New YorK, University Press Cambridge, que por este meio é incorporado como uma referência.
São utilizados de preferência o colesterol-fosfatidi1-colina, lipossomas ou intralipido(óleo de soja fraccionado 200 g, Lecitina de ovo de vitelo fraccionado 12 g glicerol 22,5 g, e H^O até 1 litro).
Os 1ipidos podem ser adicionados em qualquer fase do processo, de preferência antes da adição da saponina; mas os 1ípidos podiam também ser adicionados após a saponina.
A matriz é melhor produzida pela processo de diálise que se segue.
é misturado colesterol, dissolvido em MEGA-10 a 20% ou em qualquer outro detergente adequado, de preferência um detergente que pode ser removido por diálise, p. e. (i-oct i lg lucósido (em H20 ou num tampão adequado), com 5 vezes mais Quil A (sólida ou dissolvida em água ou num tampão adequado, p. e. PBS. A mistura é extensivamente dialisada contra PBS, primeiro durante a noite á temperatura ambiente (porque o MEGA-10 é capaz de precipitar a +4qC), depois a +4qC. As matrizes são purificadas do excesso de QuilA e colesterol por formação de pelotas através de p. e. sacarose a 30% (p/p) (p. e., 18h num rotor 41,13TST, a 39 000 rpm, *
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-15IOqC) . As matrizes em pelotas são dissolvidas em PBS (ou qualquer outro tampão adequado) e a concentração ajustada a 1 mg/ml.
A presente matriz pode ser utilizada como uma substância imunomodulante. Ela pode ser utilizada como um agente de potenciação para uma substância inumo-supressora ou para um adjuvante, quer misturada com eles quer integrada na matriz.
Pode ser utilizada como um adjuvante uma matriz contendo um esterol tal como colesterol, saponinas, adjuvantes e opcionalmente outros lipidos. Ela pode ser utilizada para potenciar o efeito antigénico de qualquer antigénio ou determinantes antigénicos de qualquer organismo patogénico ou quaisquer fragmentos ou subunidades destes, ou derivados destes. Assim ela pode ser utilizada como um adjuvante para aqueles antigénios que estão integrados num iscom. Tais antigénios são mencionados nos pedidos de patente EPC 83850273,0 e 85850326,1, que são por este meio incorporados como referências. Assim a matriz pode ser utilizada como adjuvante conjuntamente com antigénios ou determinantes antigénicos derivados de virus com ou sem envelope, bactérias, protozoários, micoplasmas, helmintas, moluscos ou conjuntamente com tais organismos completos. Os antigénios ou determinantes antigénicos podiam ser adicionalmente hormonas, enzimas, carbohidratos e estruturas contendo carbohidrato tais como 1ipopossacáridos, péptidos ou proteínas ou seus recombinantes.
Assim, o presente invento, abrange também o processo de preparação de um medicamento humano ou veterinário, caracterizado por compreender pelo menos uma matriz e uma ou mais substâncias antigénicas ou inumo-supressoras e um veiculo farmaceuticamente aceitável em mistura ou em compartimentos separados.
invento refere-se também ao processo de preparação de uma vacina caracterizada por compreender uma matriz, um ou mais antigénios e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Adicionalmente o presente invento refere-se ao processo de preparação de ura conjunto, caracterizado por compreender um tal medicamento ou vacina.
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-16Em alguns medicamentos ou vacinas o detergente utilizado quando se prepara a matriz pode estar presente se o detergente é permitido no produto em questão.
efeito do novo complexo adjuvante preparado de acordo com o invento será agora descrito em experiências lmunoestimulantes.
1. Comparação entre os efeitos imunogénicos de antigénios apresentados como iscoms, micelas ou micelas mais a nova matriz.
Foram Imunizados ratinhos com a proteína do envelope do virus da gripe na forma de complexo iscom, micelas e micelas conjuntamente com o novo complexo preparado de acordo com o Invento (assim denominado matriz). A resposta imune foi avaliada por medição dos anticorpos com a técnica de ELISA passados 15. 30. 44 e 50 dias da Injecçâo . Foram feitas as Injecções seguintes:
1. 5 Mg de mlcela + 0,1 Mg de matriz foram misturados e injectados no antebraço esquerdo.
2. 5 pg de mlcela + 0,1 Mg de matriz ínjectados separadamente no antebraço direito e esquerdo respectivamente.
3. 5 Mg de mícela
4. 5 Mg de íscom preparados de acordo com a EPC 83850273,0.
TABELA 1
DIA 12 3 4
700 | 12 | 900 | 18 | 900 | 41 | 600 | ||
500 | + | 14 | 500 | + | 9 | 500 | ± 1 | 000 |
800 | 8 | 800 | 9 | 800 | 80 | 700 | ||
500 | ± | 7 | 100 | + | 3 | 600 | ± 21 | 700 |
000 | 32 | 600 | 17 | 900 | 129 | 100 | ||
600 | + | 17 | 300 | + | 4 | 200 | ± 78 | 400 |
300 | 136 | 700 | 87 | 600 | 880 | 430 | ||
000 | ±103 | 700 | + | 18 | 200 | ±295 | 500 |
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-17Não foram notados efeitos secundários na forma de reacções locais.
Desta experiência pode-se concluir que a proteína do envelope da gripe, na forma de iscom ou micelas mais matriz dá os titulos de anticorpo mais elevados, λ matriz pode estar presente numa dose muito baixa e ter ainda efeito adjuvante. De forma a obter-se um efeito adjuvante nos ratinhos, é requerida QuilA na forma livre numa dose 100 vezes superior à dose da matriz, i.e. 10 Mg. Com aquela dose a Quil A começa a dar reacções secundárias locais. De forma a que a matriz tenha um efeito adjuvante óbvio o antigénio na forma multimérica devia ser injectado na mesma região p. e., perna, que a matriz, i.e. o complexo matriz adjuvante injectado e antigénio devia estar presente numa região, que é drenada para o mesmo glânglio linfático.
2. Comparação entre os efeitos imunogénicos da proteina do envelope da gripe na forma de iscom ou micela com ou sem matriz ou toxóide da difteria (DT).
Foram injectados ratinhos com proteína do envelope nas formas seguintes:
1 . 5 | pg | de Iscom + 5 Mg de DT |
2. 5 | Mg | de Iscom |
3. 5 | Mg | de micela |
4. 5 | Mg | de micela + 0,lMg de matriz |
A resposta do anticorpo nas proteinas do envelope |
lada no soro com a técnica de ELISA. Foram obtidos os resultados seguintes:
TABELA 2
DIA 12 3 4
52 | 800 |
119 | 202 |
110 | 600 |
1 691 | 000 |
562 | 800 |
1)
48 | 300 | |
155 | 567 | |
136 | 200 | |
3 | 783 | 000 |
2 | 529 | 000 |
8 | 400 | 29 | 000 |
22 | 107 | 87 | 000 |
33 | 400 | 96 | 500 |
283 | 300 | 1 149 | 000 |
512 | 300 | 976 | 500 |
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-181) titulo de ELISA onde a última diluição dá um valor positivo significativo a 450 nm.
Não podiam ser notados efeitos laterais visíveis na forma de reacções locais.
Pode-se concluir que a proteína do envelope do vírus da gripe na forma de Iscom ou micela mais o complexo adjuvante (matriz) de acordo com o invento dá os títulos mais elevados de anticorpo. A dose de matriz pode ser mantida muito baixa, l.e. 0,1 pg, e ter ainda um notável efeito adjuvante.
3. Comparação entre os efeitos imunogénlcos do toxóide da difteria (DT) na forma monomérica, DT monomérico + Iscom contendo proteína do envelope do vírus da gripe, DT monomérico em mistura com Quil A e colesterol e DT monomérico + complexo adjuvante (matriz) preparado de acordo com o invento.
Nesta experiência é utilizado o toxóide da difteria como um antlgénlo modelo na forma monomérica.
Foram injectados ratinhos com o toxóide da difteria nas formas seguintes:
1. 5 pg de DT (toxóide da difteria)
2. 5 pg de DT + 5 pg de iscom
3. 5 pg de DT + 0,5 pg de Quil A + 0,1 pg de CL (colesterol)
4. 5 pg de DT + 0,1 pg de matriz
TABELA 3
DIA | 1 | 2 | 3 | 4 |
15 | < 30 | < 30 | < 30 | < 30 |
30 | < 30 | < 30 | < 30 | < 30 |
50 | < 30 | < 30 | < 30 | < 30 |
65 | < 30 | 90 | < 30 | 10 000 |
80 | < 30 | 60 | 90 | 1 100 |
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-19A resposta Imunogénlca ao DT é baixa em todos os grupos. 0 melhor resultado é obtido com ratinhos imunizados com o toxólde da difteria mais matriz de acordo com o invento.
Das experiências acima pode-se concluir que são obtidos os melhores resultados quando é utilizada a matriz preparada de acordo com o invento conjuntamente com o antlgénlo na forma multimérica. A matriz preparada de acordo com o invento tem provado assim dar muito bons resultados como adjuvante comparada com p. e., a Quil A na forma livre. Assim vale a pena notar que a Qull A é efectiva como adjuvante na forma livre em doses tais como 10 Mg para ratinhos, 50 Mg para cobaias e 1 mg para gado. Um volume prático para injecção de uma vacina é de 1 ml para animais pequenos e de 2 a 5 ou 10 ml para animais grandes. Como a CMC (concentração de micela crítica) para a Quil A é 0,003%, 1 ml implicará uma quantidade de 300 Mg quando é injectado 1 ml. Contudo» após a injecção devido ao efeito de diluição, a concentração tornar-se-à inferior à CMC e a micela tornar-se-á instável.
Contudo, de acordo com o presente invento, a saponina e especialmente as moléculas de Qull A serão ligadas conjuntamente com as moléculas de colesterol para que seja formado um complexo relativamente estável, em concentrações muito baixas. Este complexo é efectivo como adjuvante numa dose, que corresponde a 0,1 Mg de Quil A, I.e. 100 vezes inferior a quando a Quil A está presente na forma livre.
As figuras mostram:
Fig. l mostra uma fotografia em microscopia electrónica de uma matriz tiplca;
fig. 2 mostra os perfis de avaliação em U.V. para subfracções de Quil A;
fig. 3 demonstra a separação por HPTLC da Quil A e das suas subfracções;
fig. 4 mostra os espectros de massa FAB para as novas substâncias preparadas de acordo com o invento;
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-2013 fig 5 β 6 mostram os espectros de RMN do C (2 regiões) para as novas substâncias;
Flgs. 7, 8 e 9 mostram os espectros de RMN do C completos para B2, B3 e B4B, respectivamente;
fig 10 mostra o esqueleto β-amírina;
figs 11 e 12 mostram os espectros de RMN do para as novas substâncias;
fig. 13 mostra partes dos espectros das figs. 7 e 8; e fig. 14 mostra um espectro de RMN a 2-dimensões para a substância B3.
O invento será agora adicionalmente descrito com os exemplos seguintes.
Exemplo 1
Matriz (complexo colesterol-Qui1 A) mg de colesterol dissolvido em MEGA-10 a 20% (em H20) foi misturado com 5 mg de Quil A sólida. A Quíl A foi dissolvida e a mistura foi extensivamente diallsada contra PBS, primeiro durante a noite à temperatura ambiente, depois a +4qC. As matrizes iscom foram purificadas do excesso de Quil A e do colesterol por formação de pelotas através da sacarose a 30% (p/p) (18b num rotor 41,13 TST, a 39 000 rpm, 10qC). As matrizes em pelotas foram dissolvidas em PBS e a concentração ajustada a 1 mg/ml (traçada com uma pequena quantidade de H-colesterol).
Exemplo 2
Foi conjugado MDP (muramildipéptido. Sigma, péptido adjuvante) com fosfatldi1-etanolamina (PEA) utilizando cloridrato de N-eti1-N'-(dimetilaminopropi1) carbodiimida como descrito por Lefrancier et. al, 1977 (Lefrancier, P., Choay, J., Derrien, M. e Lederman, I. (1977) Int. J, peptide Protein Res. 9; 249-257).
A 1 mg de colesterol (em MEGA-10 a 20%, em H20 foi adicionada uma quantidade equlmolar de MDP-PEA (em MEGA-10 ou DMSO ou qualquer outro solvente miscível em água), uma quantidade equlmolar de
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-21fosfatldil-colina e 7 mg de Quil A (um ligeiro excesso em comparação aos 5 mg que são requeridos para a formação de IH). Após uma curta incubação à temperatura ambiente (15-30 min) a mistura foi extensivamente díalisada contra PBS (4-12 h à temperatura ambiente, depois a +4qC.
Após estar completa a diálise, os complexos de matriz com o adjuvante adicional integrado foram purificados do excesso de Quil A por formação de pelotas através de sacarose a 10%.
Exemplo 3
A 1 mg de colesterol (em MEGA-10 a 20% em H20) foi adicionada uma quantidade equlmolar de Avrldlna (N,N-dioctadeci1-N',N'-bls(2-hldroxiet11) propenodlamina) (em MEGA-10 ou DMSO ou qualquer outro solvente miscivel em água), uma quantidade equlmolar de fosfatldil-colina e 7 mg de Quil A (um ligeiro excesso em comparação aos 5 mg que são requeridos para a formação de IH). Após uma curta incubação à temperatura ambiente (15-30 min) a mistura foi extensivamente díalisada contra PBS (4-12 h à temperatura ambiente, depois a +4qC) .
Após estar completa a diálise, os complexos de matriz com o adjuvante adicional integrado foram purificados do excesso de Quil A e adjuvante por formação de pelotas através de sacarose a 10% (o mesmo processo como é descrito na página 15, segundo parágrafo).
Exemplo 4
A 1 mg de colesterol (em MEGA-10 a 20% em H20) foi adicionada uma quantidade equlmolar de DDA (brometo de dimetlldloctadecilamõnio) (em MEGA-10 ou DMSO ou qualquer outro solvente miscivel em água), uma quantidade equlmolar de fosfatldil-colina e 7 mg de Quil A (um ligeiro excesso em comparação aos 5 mg que são requeridos para a formação da matriz). Após uma curta incubação à temperatura ambiente (15-30 min) a mistura foi extensivamente díalisada contra PBS (4-12 h ã temperatura ambiente, depois a + 4qC).
Após estar completa a diálise, os complexos de matriz com o adjuvante adicional Integrado foram purificados do excesso de Quil A e adjuvante por formação de pelotas através de sacarose a 10% (o
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-22mesmo processo como é descrito na página 15, segundo parágrafo).
Exemplo 5 g de MEGA-10 são adicionados a 10 ml de água antes da adição de 200 mg de colesterol, e o colesterol é disperso por ultra-sons/ultraturrax. Podem ser adicionados no máximo 1,6 ml desta mistura aos 10 ml de solução de Quil A a 2%. A mistura reacional clarifica completamente passada menos de uma hora, indicando que todo o colesterol reagiu. Pode ser visto no microscópio electrónico que a concentração de matriz é multo elevada mesmo se a concentração de detergente foi neste caso de 10%. A remoção do detergente por diálise ou ultraf11 tração não afecta quantitativamente o número de partículas da matriz, e a solução de matriz fica corapetamente límpida.
Esta experiência índica que a formação da matriz se realiza quando os surfactantes estão presentes nas misturas reaccionais. e que a completa formação da matriz se realiza em concentrações muito elevadas de detergente.
Exemplo 6
Preparação dos componentes da Quil A B2, B3 e B4B de acordo com o invento.
Foram misturados 5 g de Córtex quillajae (Nordíske Droge of Kemikalieforretnlng, Copenhagen, Batch no 8372) e 50 ml de água destilada, por um agitador magnético, durante 3 horas à temperatura ambiente. A fase liquida foi separada através de um funil de Buchner, por um papel de filtro, e foi purificada por filtração através de uma membrana Metrícel Gelman de 0,22 p. Um tal extracto contém 2,5% de material seco.
produto em bruto foi dialisado contra 200 volumes de água deslilada num tubo Visking sem soldadura a 20/32 durante 48 horas, com mudança da água passadas 24 horas. Este extracto é denominado DQ.
extracto acima dialisado foi submetido a cromatografia de permuta iónlca. Uma coluna de DEAE - celulose equilibrada com
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-23Trls-HCl a 0,1 M, pH 7,5, foi preparada (Whatman DE52) numa coluna K9/15 (Pharmacia Fine Chemicals). 0 material de leito foi equilibrado com tampão Tris-HCl a O,1M, pH 7,5. A coluna foi eluida quer passo-a-passo quer por um gradiente de sal linear, a um caudal de 60 ml/h, utilizando uma bomba peristáltica. Foram introduzidos na coluna 50 ml de DQ e foram recolhidas fracções de 300 gotas (equivalentes a aprox. 5 ml). Sob estas condições, algumas das substâncias do DQ passaram não-ligadas através da coluna, como poderá ser visto na fig.. 2A (pico A). A eluição, continuou até não ser detectável qualquer absorção no U.V. A absorção do efluente liquido foi registada a 280nm por um sistema Uvicord II (LKB - Produkter). e as fracções foram recolhidas por um Golden Retríever (ISCO). Neste ponto foi introduzido um tampão contendo NaCl a 0,2 M preparado em tampão de partida. Como pode ser visto na Fig. 2A, é eluido um pico B. Contudo, algumas substâncias estavam ainda ligadas ao material de leito num tal grau que a eluição foi difícil mesmo com NaCl concentrado. Estas substâncias foram as que contribuíram para a côr acastanhada do DQ, ao passo que o pico A e o pico B estavam só ligeiramente corado ou completamente incolor» respectivamente. No passo seguinte de purificação, o pico B foi reunido e submetido a cromatografia de exclusão em gel sobre Sephadex G50 fina equilibrado com tampão de fosfato a M/50, pH 7,5, numa coluna K 16/70 eluida a um caudal de 10 ml/h.A perda de sal foi realizada sobre um melo de Sephadex G25 numa coluna K 16/40. A eluição foi realizada utilizando uma cabeça hidrostática de 50 cm. Como pode ser visto na Fig. 2B, o perfil de UV mostrou 3 picos. 0 pico C foi eluído no volume vazio (como determinado por Blue Dextran 2000, Pharmacia Fine Chemicals) e o pico E foi eluído no volume total da coluna (também determinado por cromato de potássio). 0 pico D foi bem separado do pico C e E, mas como pode ser visto na Fig. 2B, a presença de um ressalto índica que o pico D consiste em pelo menos duas substâncias.
Consequentemente, o pico D foi reunido e submetido a, uma nova separação sobre DEAE-celulose. As condições de partida foram as mesmas como na primeira experiência de permuta iónica, e como re69 94Θ
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-24sultado todo o material foi adsorvido à coluna. A eluição continuou agora com um gradiente de NaCl linear aumentando de 0 para 1 molar (preparado no tampão de partida) ao longo dos 300 ml. 0 resultado desta experiência é mostrado na fig 2c. Apareceram dois picos F e G, no perfil de U.V.. 0 F foi nitidamente separado numa substância única (secção 3.3) , mas o pico G não podia ser isolado uma vez que estava contaminado com F. De forma a investigar a homogeneidade do pico F, ele foi reunido, perdeu sal sobre Sephadex G25, e foi recromatografado numa experiência idêntica. Como pode ser visto na fig. 2D, só apareceu um pico simétrico (H) na posição do pico F.
Qualquer uma das fracções (também o extracto DQ) podem ser adlclonalmente purificadas como se segue.
A fracção H foi liofilizada e dissolvida em clorofórmío/metaηοΙ/Η,Ο (60:40:9, v/v/v). Foram então aplicados 200 mg, a uma coluna de HPLC (4,5x50cm), empacotados cora ácido silícico, Iatropérolas RS—8060 (Iatrom Labs Tokyo, Japan). Foi utilizada uma velocidade de bomba de 5 ml/min para bombear um total de 2 1 de solvente, recolhendo 200 fracções de 10 ml com um gradiente de cloro2 fórmío/metanol/H 0 (60:40:9 para 50:40:10). As fracções foram analisadas com a cromatografia de camada fina do modo seguinte. Foram analisados 2 ρ1 de cada uma das segundas fracções por revelação em placas de cromatografia liquida de camada fina (placas de TLC) (HPTLC, Merek, Bodman, Chemicals, Gíbbstown, NJ) em clorofórmio/ /metanol/CaCl2 a 0,2% (50:40:10, v/v/v) e foram determinados os glicósidos ao serem corados de verde com o reagente de anisaldeido ( ácido acético/ácido sulfúrico/para-anlsaldeido (98:2:1) ). 0 material de partida Qull A foi utilizado como uma referência para o valor de Rf. (ver figura 3, que mostra uma separação por HPTLC de : faixa 1, Qull A (fracção H)j faixa 2, BI; faixa 3, B2; faixa 4, B3; faixa 5, B4A; e faixa 6, B4B).
As fracções que comigraram com B2, B3 e B4B tendo valores de Rf idênticos foram reunidas e, analisadas com TLC para a pureza. Estas fracções era bruto devem ser normalmente cromatografadas duas
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-25vezes de forma a se tornarem suficientemente puras. As fracções BI e B4A são inactivas e por consequência não são adicionalmente separadas .
Os componentes assim enriquecidos foram posteriormente purificados numa coluna de HPLC (21,2x250 mm) empacotada com partículas de silica esféricas de 5 P (Zorbax Si, Dupont, Wilmington, DE). 40 mg de fracção B2, B3 ou B4B enriquecidas,dissolvidas em 1 ml de clorofórmio/metanol/H^O (60:40:9, v/v/v) foram colocadas na coluna. Foi utilizada uma velocidade de bomba de 3 ml/min para a bombear de um total de 0,9 1 de solvente, recolhendo 300 fracções de 3 ml com um gradiente de clorofórmio/ /metanol/H20 (60:40:9 para 50:40:10, v/v/v). As fracções foram analisadas, como acima, em placas de HPTLC de vidro unidas. As fracções purificadas foram reunidas e evaporadas até à secura num evaporador rotativo a (30qC, dessecadas e armazenadas a <-20qC. Foram utilizadas aproximadamente 20-25 séries deste passo de purificação, i.e. utilizando (20-25) x 200 mg = 4-5 g de material de partida Quil A, incluindo a re-cromatografia para preparar 1 g de fracção B3. O rendimento de B2 e B4B foi cerca de 40% do rendimento de B3.
Os componentes B2, B3, e B4B assim preparados foram analisados como se segue:
a) Espectrometria de Massa
Foram realizados os FAB-MS negativos, Fig 4 e os FAB-MS positivos (dados não mostrados) para a determinação dos pesos moleculares dos componentes da Quil A B2, B3, B4A e B4B purificados. Os dados mostrados na fig. 4 são preliminares e terão de ser re-adquiridos numa matriz de pH neutro tal como glicerol mais propriamente do que em trietánolamina que foi utilizada para os espectros mostrados na fig. 4. Isto é necessário porque tem sido demonstrada a instabilidade em alcáli extrema dos compostos, pH > 8,5. Os picos a m/Z 595,744 e 893 são causados pela trietánolamina da matriz e devem ser ignorados. A nossa fracção B4A, que não tem qualquer adjuvante ou capacidade de formação de partícula ISCOM, parece ser idêntica à descrita por Komori et al (para a estrutura, ver
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-26Fig. 10). Os picos correspondentes aos pesos moleculares dos três glicósidos, até aqui, mais importantes são a : m/Z 1988, B2; m/Z 2150, B3; e m/Z 1862, B4B.
b) RMN do 13C
As figs. 5 e 6 mostram duas regiões, do carbono alifático (8-45 ppm) e do carbono anomérico (90-115 ppm), respectivamente, 13 dos espectros de RMN do C para as fracções de tamanho total A, B2 (20 mg); Β, B3 (80 mg); e CB4B (40 mg). Todos os espectros foram obtidos no sistema de solvente, clorofórmio/metanol/água (30:60:8, v/v/v). A região triterpenóide está bem resolvida (8-45 ppm, Fig. 6) e foi parcialmente determinada como se vê na tabela
4.
Tabela 4
Atribuição do sinal de RMN do C parcial (ppm) para o segmento de cinco anéis da β-amirina de fracções B2, B3, e B4B (ver figura 5) obtido em clorofórmio/metanol/água (30:60:8, v/v/v) .
Carbono# | B2 | B3 | B4B | Referência |
C9a | -b | -b | -b | 45,5 |
CIO | 36,4 | 36,2 | 36,3 | 37,0 |
C12 | 122,5 | 122,2 | 122,5 | 123,1 |
C13 | 144,1 | 146,6 | 143,6 | 144,8 |
C14 | 41,5 | 41,8 | 41,9 | 41,6 |
C15 | 30,0 | 30,5 | 30,7 | 30,7 |
cie | 43,0 | 42,8 | 41,9 | 42,7 |
C20 | 30,7 | 30,6 | 30,6 | 30,7 |
C25 | 16,0 | 16,1 | 16,0 | 15,9 |
C26 | 17,7 | 17,3 | 17,6 | 17,6 |
C29 | 32,9 | 32,9 | 32,9 | 32,2 |
Numerado como | na figura | 5 | ||
Escondido sob | o sinal do | metanol | do solvente (confirmado com uma |
948
16167-18658-Fa/CS
-27experiència DEPT)
Estas determinações foram realizadas a partir do estudo de um largo número de espectros de referência obtidos em solventes variados e por análise dos sinais que são independentes do solvente, por uma comparação estatística (dados não mostrados). A fig. 6 mostra a região entre 80-148 ppm nos espectros dos trás compostos A, B2; Β, B3; e C, B4B, realçando os dois sinais do carbono de dupla ligação a 122 e 143 ppm correspondendo ao C-12 e C-13, respectivamente, no esqueleto da (3-amirina (fig. 10). A região do carbono anomérico, entre 90-115 ppm, mostra a presença de aproximadamente 9-10 sinais correspondendo à mesma quantidade de resíduos de açúcar nos compostos.
Conclusão: As diferenças estruturais podem ser identificadas entre as fracções: A, B2; Β, B3; e C, B4B, em ambas as regiões dos espectros correspondendo principalmente à região trxterpenóide e às porções oligossacáridas das moléculas, respectivamente. As quantidades exactas dos açúcares não podem ser determinadas neste ponto.
c) RMN do *H
A figura 11 demonstra o espectro do protão completo (0-10 ppm) e a fig. 12 o espectro do protão parcial (região anomérica),
4,0-6,0 ppm), respectivamente, das fracções: A, B2s Β, B3; e C,
B4B. Os espectros são obtidos a partir de amostras (~10 mg, s600 varrimentos) dissolvidas em DMSO. d. / D.O (98:2, v/v). No extremo Ο Δ esquerdo do espectro (fig.11), a 9,4 ppm, é observado o sinal do protão aldeido no carbono-24 (ver figura 5). A natureza de dupleto deste pico, um pico que é suposto ser um singuleto, uma vez que não tem protões vizinhos para se associar, oferece uma explicação para a invulgar região anomérica do complexo que é pobremente resolvida (como visto na na expansão, na fig. 12).
dupleto pode ser devido a um protão aldeído em dois compostos diferentes ou à presença de permuta química entre as duas populações diferentes da mesma molécula (este processo é suficientemente lento na escala de tempo da RMN para ser observado) explicando assim os diferentes integrais dos picos no dupleto às dife69 948
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-28rentes temperaturas como mostrado na Fig. 13 e na tabela 5.
TABELA 5
Temperatura em graus K | Desvio 1 | Desvio 2 | Diferença dos desvios | Parcela integral Desvio 1/Desvio 2 |
301 | 9,46 | 9,44 | 0,02 | 1,61 |
351 | 9,47 | 9,46 | 0,01 | 1,99 |
361 | 9,48 | 9,47 | 0,01 | 2,23 |
A figura 13 e a tabela 5 (acima) demonstram que o integral relativo dos picos varia com a temperatura e que os dois picos se movem para mais perto um do outro a uma temperatura mais elevada, indicando ambos que não podem ser duas moléculas diferentes mas antes duas populações diferentes da mesma molécula. Isto explicaria a região anoméríca do complexo por sugestão de que muitos protões anoméricos da molécula teriam duplas ressonâncias devido aos diferentes ambientes quimícos das duas populações. Contudo, o presente conjunto de dados Indica que as diferenças na glicosilação dos compostos podia proporcionar parte da explicação das suas diferenças estruturais (fig. 12), por demonstração da diferente quantidade de sinais dos protões anoméricos nos espectros. Os dados do FAB-MS para as fracções B2, B3 e B4B também não excluem a possibilidade formal de existirem duas moléculas de tamanhos similares, com propriedades fisico-quimicas muito similares que têm a mesma quantidade de açúcares mas que diferem nas posições de ligação e/ou na sequência.
Conclusão; Em geral, os espectros de RMN do a 1 dimensão das moléculas desconhecidas anteriores contendo 8-10 açucares não são suficientes para a determinação de protões e para a caracterização estrutural detalhada. Para a resolução de todos os sinais e para a realização de determinações apropriadas para todos os compostos, será necessário utlizar a técnica de RMN a 2 dimensões assim como degradar quimicamente os compostos para análise. 0 COSY e o TOCSY
948
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-29são ambos homonucleares (^H—1H) e heteronucleares <1H—13H) assim como o NOGSY. é mostrado na figura 14 o espectro de RMN de quantum duplo filtrado em correlação com o protão de fase sensível a 2 dimensões (DQFPSCOSY) para a fracção B3.
d) Sumário dos dados estruturais
A conclusão dos dados gerados até aqui é a de que as fracções activas que têm actividade adjuvante e capacidade de formação da partícula ISCOM na Quíl A contém saponinas triterpenóides glicosíladas únicas que diferem umas das outras em ambas as suas partes triterpenóíde e glicano. Elas tém uma estrutura aproximada semelhante à descrita na Fig. 10 e consistem num esqueleto esteróídal de cinco anéis do tipo β-amirina e contém 8-11 resíduos de açúcar. Exemplo 7
0,1 mg de colesterol foram misturados com H-colesterol (lOmg/ml dissolvido em MEGA a 20% em H20) e 0,5 mg de B2 ou B3 ou B4B ou suas misturas. 0 volume foi ajustado a 0,5 ml e a mistura foi dlalisada contra PBS numa preparação tratada com molibdato de amónio (técnica de coloração negativa). As preparações dialisadas foram analisadas quanto à presença de complexo com estrutura lscom , por microscopia electrónica (ME) e centrifugação analítica por gradiente. Em ME a estrutura lscom é caracterizada por uma partícula semelhante a caixa com um diâmetro de 40 nm composta por subunidades com estrutura anular com um diâmetro de 12 nm. Para os estudos de sedimentação a amostra é colocada sobre um gradiente de sacarose (10-50%) e centrifugada durante 18 horas, a + 10qC num rotor 41, 14 TST, a 40 000 rpm. 0 gradiente é recolhido em 18 fracções (fracção 1 = o fundo e fracção 18 = o topo). Por locali3 zação da actividade do H - colesterol no gradiente, pode-se dizer a constante de sedimentação e ver se foram preparados complexos.
B4B forma estruturas íscom típicas como colesterol mas não tem actividade adjuvante potente.
B2 não forma estruturas semelhantes a íscom com o colesterol mas liga-se ao colesterol conjuntamente com ο B4B, ο B2 forma estruturas semelhantes a iscom com o colesterol. 0 B2 tem uma
948
16167-18658-Fa/CS
-30fraca actividade adjuvante.
B3 liga-se ao colesterol mas não em estruturas a Iscom.Com ο B4B, ο B3, à semelhança do B2, estruturas semelhantes a iscom com o colesterol actividade adjuvante.
Claims (10)
- REIVINDICAÇOES la - Processo de preparação de uma matriz, que não é uma vesícula lipídlca e sem quaisquer antlgénios Intencionais ou determinantes antígénlcos compreendendo pelo menos um lipldo e pelo menos uma saponlna para utilização como um agente imunomodulante, caracterizado por se solublllzar pelo menos um esterol num solvente, se adicionar a saponlna ou saponinas, se adicionarem também opcionalmente os outros adjuvantes e lípidos, após o que o solvente pode ser removido por exemplo por diálise, ultraflltração, filtração em gel ou electroforese, ou ser diluído.
- 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se solubílízar o esterol e a saponlna nos lípidos e/ou adjuvantes .
- 3a Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a matriz compreender pelo menos um lipldo, pelo menos uma saponlna e pelo menos um adjuvante.
- 4a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a matriz compreender um esterol, de preferência colesterol, uma ou mais saponinas, um ou mais adjuvantes e um ou mais lípidos adicionais.
- 5a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por a saponlna ser uma trlterpeno-eaponlna, especialmente Quil A ou um ou maís dos seus componentes.
- 6a - Processo de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizado por a matriz compreender um ou maís compostos lmunomodulantes.
- 7a - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por a matriz ter uma estrutura esférica aberta constituída por sub-unidades circulares ou partes da estrutura esférica sob microscopia electrónica e uma constante de sedimentação de cerca de 12-22S.
- 8a - Porcesso de preparação de saponinas triterpenóldas derivadas de Quillaja Saponaria-Molina do tipo Beta Amyrin com69 94816167-18658-Fa/CS-328-11 porções hidrato de carbono que têm as características seguintes :a) a substância B2 tem um peso molecular de 1988, um espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) do carbono 13b) a substância B3 tem um espectro de RMN do carbono 13140 130 120 110 1ÓÕ90 80PPM69 94816167-18658-Fa/CSPPMc) a substância B4 B tem um espectro de RMN do carbono 13 peso molecular de 1862, umPPMPPMPPM69 94816167-18658-Fa/CS-34caracterizado por compreender a extracção da casca da Quillaja Saponaria Molina com água, a diálise do extracto aquoso, a liofilização do dialisado, a sujeição da matéria liofilizada a filtração em gel sobre Sephadex G-50 e a subsequente cromatografia de permuta aniónica fraca sobre DEAE-celulose, a eluição dos produtos com cloreto de sódio 0,2 M em condições neutras (pH) e a sua separação por cromatografia repetida sobre silica gel.
- 9a - Processo de preparação de uma vacina, caracterizado por compreender incorporar uma matriz preparada de acordo com as reivindicações 1-7, com um ou mais antigénios e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 10a - Porcesso de preparação de um conjunto para utilização em medicina humana ou veterinária, caracterizado por compreender misturar pelo menos uma matriz preparada de acordo com as reivindicações 1-6 com uma ou mais substâncias imunomodulantes e um veiculo farmaceuticamente aceitável num compartimento.
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