PT91589B - Metodo para detectar biopolimeros, por meio de hibridacao in situ, em uma unica fase - Google Patents

Description

RESEARCH DEVELOPMENTFDUNDATION

MÉTODO PARA DETECTAR BIOPOLÍMEROS, POR MEIO DE HIBRIDAÇÃO IN SITU. EM UMA ÚNICA FASE

Antecedentes da Invenção

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a área dos ensaios de hibridaçSo in situ utilizáveis na detecção de uma a cinco cópias de ácido nucleico-alvo por célula. Este método de ensaio aumenta de um modo significativo a sensibilidade de detecção dos ácidos nucleicos comparado com outros métodos conhecidos. Além disso, este método de hibridação é rea lizado com muito maior rapidez do que outros ensaios in situ já existentes. A presente invenção também proporciona um méto^ do para a detecção rápida e sensível de ácidos nucleicos e proteínas na mesma célula. Proporciona-se um conjunto para numa única fase simples proceder ao ensaio in situ da fixação/hidridação.

2. Descrição da técnica anterior

A hibridação in situ proporciona uma técnica para a determinação e quantificação de biopolímeros tais como f

os ácidos nucleicos (DNA e RNA) e proteínas nos tecidos ao nível de uma única célula. Estas técnicas de hibridação podem detectar a presença ou ausência de genes específicos nos tecidos ao nível de uma única célula. Os processos de hibridação in aitu podem também ser utilizados para detectar a expressão do produtos genéticos ao nível de uma única célula.

Pela aplicação de sondas de ácido nucleico específicas (RNA ou DNA), podem-se detectar marcadores genéticos nos estados de infecção ou outros estados de doença. Certas doenças genéticas são caracterizadas pela presença de genes que não estão presentes nos tecidos normais. Outros estados de doença são caracterizados pela expressão de RNAs ou produtos de tradução de RNA (isto é,péptidos ou proteínas) que não são expressos em células normais. Alguns estados de doença são caracterizados pela ausência de certos genes ou por acções genéticas ou pela ausência ou alteração de expressão de produtos genéticos ou de proteínas. Também se têm utilizado sondas de anticorpos específicos para biopolímeros antigénicos-alvo para a identificação da presença de proteínas virais ou de produtos genéticos.

Métodos correntes permitem a detecção destes marcadores,mas são relativamente demorados e de sensibilidade limitada. As técnicas de hibridação são baseadas na capacidade de um DNA e RNA de cadeia única emparelhar (ou hibridar) com um cordão de ácido nucleico complementar. Esta reacção de hibridação permite α desenvolvimento de sondas específicas que podem identificar a presença de genes específicos (DNA) , ou sequências polinucleotídicas ou a transcrição e ejç pressão daqueles genes (mRNA).

Os métodos de hibridação ern solução que requerem a destruição da célula e o isolamento dos ácidos nuclei^ cos da célula referida para se realizar a reacção de hibridação sacrificam a integridade celular, a resolução espacial e a sensiblidade de detecção. A hibridação in situ permite a detecção de sequências de RNA e DNA em células individuais. A hibridação in situ gera uma maior sensibilidade do que a hibridaçâo em solução por eliminação da diluição de um genealvo particular, ácido nucleico ou de proteína pelos RNA e DNA circundantes e estranhos de outras células. A hibridação in situ também permite a detecção simultânea de substâncias múltiplas, isto é, de genes, ácidos nucleicos ou de proteínas em células individuais, permitindo a identificação de uma dada célula que exprime um gene celular ou uma sequência virai. Além disso, uma vez que a análise por hibridação in situ é realizada e quantificada para células individuais,sâo necessárias amostras e reagentes mínimos.

Antes da presente invenção, os processos de hibridação in situ eram apenas capazes de detectar ácidos nucleicos presentes em mais de dez cópias por célula. Estes processos requeriam múltiplas fases e pelo menos 4 horas a 14 dias para a sua realização.

Resumo da presente invenção

Constitui um objecto da presente invenção proporcionar um processo rápido e sensível de hibridação in situ capaz de detectar polinucleótidos presentes numa con

V.

centração baixa, da ordem de 1 a 5 cópias por célula.

É ainda um objecto da presente invenção pro porcionar um processo rápido e sensível de hibridação in situ capaz de detectar mais do que uma molécula-alvo numa célula individual.

É um objecto da presente invenção proporcio nar um processo de hibridação in situ que se possa realizar em cerca de 5 minutos a 4 horas.

É ainda um objecto da presente invenção pro porcionar um processo de hibridação in situ que possa quantificar 1 a 5 moléculas de ácido nucleico por célula.

, Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar um processo de hibridação in situ que possa detectar simultaneamente biopolímeros múltiplos.

Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar um processo de hibridação in situ que po£ sa realizar-se numa única fase.

É ainda um objecto da presente invenção proporcionar um processo de hibridação in situ que seja realizável em células em suspensão.

Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar um processo de hibridação in situ que po^s sa eliminar a necessidade de imobilização de células ou de tecidos num suporte sólido antes da análise.

É também um objecto da presente invenção pro porcionar um processo de hibridação in situ capaz de introdu—

zir uma sonda em células vivas, mantendo a viabilidade das células e o registo da ocorrência de hibridação por meios químicos ou físicos ou pelo efeito de uma ou mais propriedades bio^ lógicas da célula ou dos seus componentes.

É ainda um objecto da presente invenção ser capaz de detectar simultaneamente e distinguir entre o DNA, o RNA e a proteína de um mesmo gene numa mesma célula utilizando-se o processo de hibridação in situ.

Constitui ainda um objecto da presente invenção proporcionar um Kit de ensaio em uma fase para hibridaçao in situ.

A presente invenção proporciona um método para a detecção de biopolímeros em células individuais ou em secções de tecido, quer em solução, quer após a deposição de um suporte sólido. A optimização de cada componente deste pr<> cesso tal como proporcionado pela presente invenção permite um ensaio de hibridação sensível e rápido que se pode realizar numa única fase. As moléculas biopoliméricas-alvo podem ser quantificadas num nível de 1 a 5 moléculas por célula. Este ensaio de hibridação pode utilizar-se para detectar níveis de polinucleótidos em células tais como células da medula óssea e do sangue periférico, em tumores, em secções de tecido ou em células cultivadas em tecido. 0 processo de hibridação da presente invenção pode detectar polinucleótidos em células individuais com a sensibilidade de 1 a 5 moléculas por célula em um tempo mínimo de 5 minutos a 4 horas. Este processo também permite a detecção simultânea de mais do que uma sequência t‘ polinucleotídica diferente numa célula individual. A presente invenção também permite a detecção de proteínas e polinucleótidos na mesma célula.

De um modo resumido, células, querem suspen s3es de uma única célula, quer em cortes de tecido, podem ser depositadas em suportes sólidos tais como em lâminas de vidro. Alternativamente, as células são colocadas numa suspensão de células individuais de cerca de 10^ a 10^ células por ml. As células são fixadas por um fixador escolhido de forma a proporcionar a melhor resolução espacial das células e a eficiên cia de hibridaçâo óptima.

Em seguida, a hibridaçâo realiza-se na mesma solução em que se efectua a fixação. Esta solução contém um fixador e um agente caotrópico tal como a formamida. Também se inclui nesta solução um agente de estabilização híbrido tal como uma solução concentrada de cloreto de lítio ou de acetato de amónio, um agente tampão, DNA e/ou RNA ribossómico de peso molecular baixo (com a dimensão de 50 bases) para diminuir a ligação não específica e um agente de formação de poros para facilitar a penetração da sonda nas células. Também se podem incluir inibidores de nuclease tal como complexos ribonucleosí dicos de vanadilo.

Adiciona-se a solução de hibridaçâo uma sonda para hibridar com um polinucleótido-alvo. A sonda mais preferida é uma sonda anti-sentido de cadeia única. Utiliza-se para a hibridaçâo de RNA celular uma sonda com o comprimento aproximado de 75 a 150 bases. Para a hibridaçâo de DNA celular, utiliza-se uma sonda com aproximadamente 15 a 50 bases. Pode-se utilizar uma sonda de anticorpos para ligar a um antigene ou a uma proteína-alvo. A solução de hibridação que contem a sonda é adicionada numa quantidade suficiente para cobrir as células quando se utilizam células imobilizadas. Quari do se utilizam células em suspensões,adiciona-se um concentra do de três vezes de cocktail de hibridação. Alternativamente, podem re-suspender-se as células na solução de híbridos. Em seguida, incubam-se as células a uma temperatura determinada durante pelo menos 5 minutos. A sonda utiliza—se numa concentração elevada, pelo menos cerca de 1 pg/ml de mistura híbrida a fim de se obterem resultados óptimos neste espaço de tempo.

As sondas podem ser marcadas de um modo detectável antes da reacção de hibridação. Alternativamente, pode seleccionar-se um marcador detectável que se liga com o produto de hibridação. Podem marcar-se as sondas com qualquer grupo detectável para utilizar-se na prática da presente invenção. Este grupo detectável pode ser qualquer substância que tenha uma propriedade física ou química detectável. Estas marcas detectáveis têm sido bem desenvolvidas no campo dos imunoensaios e, de uma maneira mais geral, qualquer marca aplicável nestes métodos pode ser utilizada na presente invenção. Particularmente úteis são os grupos enzimaticamente activos tais como as enzimas /~ver Clin. Chem. , 22 (1976) 1243/, substratos de enzimas (ver memória descritiva da patente de invenção Britânica No. 1 5^8 74l), coenzimas (ver patentes de invenção norte-americanas N?s 4 230 797 e 4 238 565) θ inibidores de enzimas (ver patente de invenção norte-americana No. 4 134 agentes fluorescentes /~ver Clin. Chem., 25 (1979) 353/

792);

cromoforos; agentes luminescentes tais como os agentes qui— mioluminescentes e bioluminescentes £ver Clin. Chem.. 25 (1979) 512/; ligandos de ligação específica; pares de inter3 35 32 acção proximal; e radioisótopos tais como ^JH, ^JS, P, ¹²⁵I e ^1!,C.

A invenção deste pedido de patente de invenção proporciona um meio para realizar as fases de fixação, pré—hibridação, hibridação e detecção, normalmente associadas com o processode hibridação in situ, todas numa única fase. Modificando-se os componentes desta solução de fase única, deve utilizar-se uma temperatura conveniente para a realização da reacçâo de hibridação. Além disso, esta aplicação proporciona um ensaio de hibridação que se pode realizar com célu las viáveis ou células não viáveis em solução. Em qualquer caso, o ensaio é rápido, necessitando apenas 1 a 5 minutos para se completar, é sensível, podendo detectar mesmo 1 a 5 moléculas de polinucleótido numa célula.

Admite-se que os melhores resultados da presente invenção se devem ao facto de se impedir a precipitação dos constituintes celulares em mRNA ou a modificação covalente de mRNA, a desestabilização da ligação de sub-unidade de RNA ribossómico e a promoção da acessiblidade de mRNA de comprimento completo para a formação de híbrido pela indução de cadeia única no RNA e/ou DNA celulares. A presente invenção resultou da descoberta pelos inventores da forte correlação entre o RNA celular de cadeia única e a rápida cinética de hibridaçâo que proporciona um processo de ensaio altamente sensível.

Ζ .*

Num aspecto, a presente invenção proporciona um método simples para determinar as condições de fixaçâo/pré-hibridação/hibridação/detecção óptima para qualquer tipo de tecido, de tal maneira que: (l) se podem detectar moléculas individuais, (2) será preservada a morfologia celular e (3) é reduzido o tempo de reacção total a um período de 5 minutos a 4 horas. Resumidamente, a fim de prever as condições óptimas para se obter esta hibridação rápida e sensível, um espécime celular em amostras múltiplas ou em suspensão ou depositado em lâminas de vidro, são expostos primeiro a um agente de fixa ção e subsequente a uma solução de hibridação.

agente de fixação é escolhido no grupo constituído por etanol a 95 7 /ácido acético a 5 7 / etanol a 75 7 /ácido acético a 20 7 / metanol a 50 7/ acetona a 50 7 ^e formaldeído a 10 ^/metanol a 90 7 (todos v/v). Outros agentes de fixação úteis serão evidentes para os técnicos nesta matéria, desde que o fixador escolhido permita pelo menos uma modificação de 70 7 de polinucleótidos de cadeia dupla para poli, nudeótidos celulares de cadeia única, mantendo, embora, as relações espaciais celulares. A duração de exposição ao agente fixador é de 1 a l80 minutos, de preferência 1 a 30 minutos e ainda mais preferencialmente de 20 minutos. A temperatura do processo de fixação está compreendida de preferencia entre -20°C e 50°C e mais preferencialmente é de 20°C. A exposição subsequente a etanol a 70 ^>/água a 30 7 durante 0,5 minuto a 20 minutos a uma temperatura compreendida entre -20°C e 30°C pode ser utilizada se as amostras forem conservadas antes da hibridação.

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A solução de hibridação consiste em um agente de desnaturação caotrópica, um agente tampão, um agente de formação de poros, um agente de estabilização de híbridos, nucleótidos não específicos e uma sonda específica de um alvo. 0 agente de desnaturação caotrópico /Robinson, D. W., e Grant,

M.E..J. Biol. Chem. 24l (1966) 4030; Hamaguchi, K.,e Geiduscheck, E.P., J. Am. Chem. Soc. 8^4 (1962) 1329^ é escolhido no grupo constituído por formamida, ureia, tiocianato, guanidina, tricloroacetato, tetrametilamina, perclorato e iodeto de sódio. Pode-se utilizar qualquer agente tampão que mantenha um pH pelo menos de 7,0 a 8,0.

agente de formação de poros é, por exemplo, um agente detergente tal como Brij 35, Brij 5θ, dodecil, TM sulfato de sodio, CHAPS Triton X-100. Dependente da localização do biopolímero alvejado, escolhe-se o agente de formação de poros, de modo a facilitar a penetração da sonda no plasma ou nas membranas nucleares ou estruturas dos compartimentos celulares. Por exemplo, o Brij 35 a 0,05 ou Triton X-100 a 0,1 $ permitirá a penetração da sonda na membrana plasmática mas não na membrana nuclear. Alternativamente, o desoxicolato de sódio permitirá que a sonda atravesse a membrana nuclear. Assim, a fim de restringir a hibridação aos biopolímeros cito^ plásmicos-alvo, evitam—se agentes de formação de poros na membrana nuclear. Esta localização subcelular selectiva contribui para a especificidade e sensibilidade do ensaio eliminando a hibridação de sondas com sequências nucleares complementares, quando o biopolímero alvo está localizado no citoplasma. Outros agentes que não sejam agentes detergentes, tais como agentes fixativos, podem servir para este efeito.

Além disso, uma sonda biopolimérica pode também seleccionar-se de modo que o seu tamanho seja suficientemente pequeno para atravessar a membrana plasmática da célula,mas demasiado grande para passar através da membrana nuclear.

Agentes de estabilização de híbridos tais como sais de catiões mono e divalentes são incluídos na solução de hibridação para promoverem a formação de ligações de hidrogénio entre as sequências complementares da sonda e os seus biopolímeros-alvo. De preferência, utiliza-se cloreto de lítio ou acetato de amónio numa concentração compreendida entre 0,15 Μ θ 1,5 M; mais preferencialmente,a concentração de cloreto de lítio é de 0,8 M.

A fim de impedir a ligação não específica das sondas de ácido nucleico, adiciona-se à solução de hibridação ácidos nucleicos não relacionados com os biopolímerosalvo, numa concentração 100 vezes superior à concentração da sonda.

Os espécimes sâo retirados após cada uma das fases anteriores e analisados para observação da morfologia celular, que é comparada com células frescas não tratadas, utilizando-se um microscópio de contraste de fase. A condição determinada para manter a morfologia celular e a resolução espacial nas várias estruturas subcelulares tão próxima quanto possível da das células frescas não tratadas é escolhida como óptima para cada fase.

Além disso, os ácidos nucleicos celulares

são corados com corante diodeto de propídio a cerca de 50 ^Aig/ /ml. Este corante tem uma característica específica de emissão fluorescente (verde a cerca de U80 nm), quando o ácido nucleico é de cadeia simples e emite num comprimento de onda diferen. te (cerca de 615 nm, vermelho) quando o ácido nucleico é de ca deia dupla. 0 corante utilizado pode depender de a sequência-alvo para o ensaio em questão ser de RNA ou de DNA. Se o ensaio for para detectar números de cópias baixos de DNA, então o corante de detecção de DNA utilizado será o alaranjado de acridina, tetra-hidrofurano, o verde de metilo, a pironina Y ou o azulo B e o DNA nuclear será analisado para a quantidade de formação de cadeia única ou de cadeia dupla. Se, pelo contrário, o ensaio se utiliza para detectar números de cópias baixos de RNA, então utilizam-se corantes de RNA tais como acridinas, azinas, xantenos, oxazinas e tiazinas e o RNA citoplásmico é analisado para a determinação do grau de forma ção de cadeia única ou de cadeia dupla. Independentemente de o ensaio ser utilizado para analisar o RNA ou DNA, as condições óptimas são alcançadas quando o ácido nucleico a detectar é submetido a uma variação de 70 $ de cadeia dupla para cadeia única. Quando a variação da estrutura secundária do ácido nucleico de cadeia dupla para cadeia única alcança pelo menos 70 $ e não há diminuição da quantidade total de fluores cência, então as condições foram ajustadas de acordo com a presente invenção e permitirão a hibridação óptima e a detecção de mesmo l/a 5 moléculas de ácido nucleico alvo numa célula individual. Além disso, o tempo necessário para a hibridaçâo óptima pode determinar-se a partir do tempo necestaá—

rio para pelo menos 70 % de ácido nucleico celular se transformar em cadeia única.

No aspecto mais preferido, o ensaio de hibri^ dação da presente invenção proporciona um método para o ensaio de biopolímeros numa amostra de células tendo as membranas substancialmente intactas que consiste numa fase única de incu bação das células com uma solução de fixaçâo/hibridação que contém uma sonda de RNA de cadeia única e detecção subsequente da quantidade de sonda hibridada com o ácido nucleico alvo. Em seguida as amostras são lavadas e a quantidade de ácidos nuclej^ cos alvo determinada por quantificação, quer por fotografia com microscópio capaz de detectar fluorescência, quer por leitura directa da fluorescência com o sistema de análise de imagem, tal como um conjunto Meridan ACAS 470 (Meridian Instruments, Okemos, Michigan).

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 representa as temperaturas óptimas da hibridação in situ em uma sé fase.

A Figura 2 representa a cinética da reacção de hibridação in situ em uma só fase.

A Figura 3 representa as modificações na estrutura secundária de RNA celular em função da eficiência da reacção de hibridação in situ.

A Figura 4 representa a detecção de oncogenes em sangue periférico normal por hibridação in situ em uma só

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t /

A Figura 5 representa a detecção de oncogenes em amostras de tecido sólido por hibridação in situ em uma só fase.

A Figura 6 representa a detecção de HIV num indivíduo de alto risco assintomático soro-negativo com hibridação in situ em uma so fase.

A Figura 7 representa a mática da fluorescência de células após uma só fase.

A Figura 8 representa a dos resultados de hibridação in situ en

A Figura 9 representa a análise digital autohibridação in situ em análise quantitativa ι uma só fase.

reacção de hibridação in situ em uma só fase realizada em células em solução.

representa uma mancha de Southern.

representa um dot blot de RNA.

representa a detecção por hibrie de vírus de síndroma de imuno— de citomegalovírus (CMV) em sancom sarcoma de Kaposis.

representa a detecção por hibridação in situ em uma só fase de oncogenes na linha de células K562.

Descrição pormenorizada da invenção

Tratamento das amostras

1. Células/tecidos em suporte sólido

A t igura 10

A Figura 11

A Figura 12 dação in situ em uma sd fa deficiência humana (HIV) ou gue periférico de um doente

A Figura 13

Num aspecto desta versão do processo de hibri dação in situ em uma só fase da presente invenção, os espécimes po dem ser depositados num suporte sólido. Os espécimes constituem qualquer material que seja composto de células ou que contenha células ou fracções de células. As células podem ser células vivas ou mortas, desde que o biopolímero-alvo (DNA,

RNA ou proteína) esteja inalterado e não danificado e possa ser detectado. 0 espécime deve conter células com membranas substancialmente intactas. Ainda que não seja necessário que todas as membranas da estrutura celular estejam intactas, as membranas devem estar suficientemente preservadas para permitir: a retenção do biopolímero-alvo, a introdução da sonda de detecção no sítio do biopolímero-alvo e a preservação da antigenicidade de quaisquer componentes de membrana-alvo.

As técnicas para a deposição dos espécimes no suporte sólido dependerão do tipo de célula ou de tecido e po dem incluir, por exemplo, seccionamento padrão de tecidos ou smearing ou citocentrifugação de suspensões de células simples.

Muitos tipos de suportes sólidos podem ser utilizados na prática da presente invenção. Os suportes que se podem utilizar incluem, mas não estão limitados a, vidro, fita Scotch (3M), nylon, gene Screen Plus (New England Nuclear) e nitrocelulose. De preferência, utilizam-se as lâminas de vidro de microscópio. A utilização destes suportes e o processo para a deposição de espécimes é óbvio para os téc^ nicos nesta matéria. A escolha do material de suporte dependerá do processo para a visualização de células e do processo de quantificação utilizados. Alguns materiais de filtra- ι6 ção não têm espessura uniforme e portanto a retracção e a intumescência durante os processos de hibridaçâo in situ nâo são uniformes.

Além disso, alguns suportes com autofluorescência interferirão com a determinação do nível badxo de fluoresçên cia. As lâminas de microscópio de vidro são muito preferidas como suporte sólido, uma vez que têm uma relação sinal/rúído elevada e podem ser tratadas de modo a reter melhor o tecido.

Também se pode utilizar a presente invenção para a detecção de biopolímeros em células em suspensão. Inde pendentemente de o espécime de célula estar em suspensão ou em suporte sólido, o processo de hibridaçâo realiza-se utilizando-se uma só solução de hibridaçâo que também fixa as célu las. Esta fixação é realizada na mesma solução e durante a reacção de hibridaçâo. Pode escolher-se o agente de fixação no grupo constituído por quaisquer agentes de precipitação ou agentes de reticulação utilizados isoladamente ou em associa ção e podem estar em meio aquoso ou não aquoso. 0 agente de fixação pode ser escolhido no grupo constituído por soluções de formaldeido, álcoois, soluções de sais, cloreto mercúrico, cloreto de sódio, sulfato de sódio, dicromato de potássio, fosfato de potássio, brometo de amónio, cloreto de cálcio, acetato de sódio, cloreto de lítio, acetato de césio, acetato de cálcio ou acetato de magnésio, nitrato de potássio, dicro. mato de potássio, cromato de sódio, iodeto de potássio, iodato de sódio, tiossulfato de sódio, ácido pícrico, ácido acético, paraformaldeído, hidróxido de sódio, acetonas, clg rofórmio, glicerina, timol, etc. De preferêndia, o fixador

incluirá um agente que fixe os constituintes celulares através de uma acção de precipitação e tenha as características seguintes: o efeito é reversível, a morfologia celular é mantida, a antigenicidade dos constituintes celulares preten didos é mantida, os ácidos nucleicos são retidos na localização apropriada das células, os ácidos nucleicos não são mo dificados de tal forma que se tornem inaptos para formar híbridos de cadeia dupla ou de cadeia tripla, e os constituintes celulares nâo são afectados de tal modo que inibam o pr<) cesso de hibridaçâo do ácido nucleico com todas as sequêcias alvo presentes. A escolha dos agentes fixadores e dos processos de fixação pode afectar os constituintes e a morfo logia celular; estes efeitos devem ser específicos do tecido. De preferência, os fixadores para aplicar na presente invenção são escolhidos no grupo constituído por etanol, etanol/áci_ do acético, metanol e metanol/acetona, fixadores que permitem a eficiência de hibridaçâo máxima com uma boa preservação da morfologia celular.

Os agentes fixadores mais preferidos para a prática da presente invenção incluem o etanol entre 10 e 40^, metanol, acetona ou as suas associações. Estes fixadores proporcionam uma boa preservação da morfologia celular e preservação e acessibilidade de antigenes e eficiência de hibridação elevada.

Simultaneamente, o componente fixador da solução pode conter um composto que fixa os componentes celulares para reticulação destes materiais conjuntamente, por exemplo, glutaraldeído ou formaldeído. Embora este agente

5»

- 18/reticulante deva satisfazer todas as exigências citadas anteriormente para o agente de precipitação, ele é de um modo geral mais aderente e proporciona aos componentes das células e da membrana protecção ou vedação, mantendo, portanto, as earacteristicas anteriormente citadas. Os agentes reticulantes quando se utilizam estão de preferência a menos de 10^ (v/v).

Os agentes reticulantes, embora conservem a ultra-estrutura, frequentemente reduzem a eficiência de hibri^ dação; eles formam redes que retêm os ácidos nucleicos e os antigenes, tornando-os inacessíveis às sondas e aos anticorpos. Também alguns modificam covalentemente os ácidos nucleicos, impedindo a subsequente formação de híbridos.

Tipicamente, utilizam-se o etanol entre 20 % e 30 %, a formalina a 5 θ a acetona a 5 % como um agente fixador para a maior parte dos tecidos, incluindo o sangue periférico, a medula óssea, a mama, o pulmão, as secções cer viçais, o músculo esquelético e cardíaco e o olho.

Tratamentos de pré-hibridação

De acordo com a presente invenção, não é necea sária a fase de pré-hibridação. 0 bloqueamento da ligação não específica da sonda e a fácil penetração da sonda pode realizar-se na solução de fixaçâo/hibridação.

Hibridaçõe s

A hibridação do ácido nucleico constitui um processo em que duas ou mais cadeias de imagens no espelho ou opostas de DNA, RNA, oligonucleótidos, polinucleótidos ou qualquer das suas combinações se reconhecem uma à outra e se ligam entre si através da formação de ligações, quer espontâneas, quer induzidas quimicamente, correntemente uma ligaç3o de hidrogénio. 0 grau de ligação pode controlar-se com base nos tipos de ácidos nucleicos que se juntam e a extensão da ligação correcta tal como é definida pelos ácidos nucleicos normais que se juntam e a extensão da ligação correcta tal como é definida pelas regras químicas normais de ligação e emparelhamento. Por exemplo, se na ligação de formas de duas cadeias 9 dos emparelhamentos são correctos ao longo de uma cadeia de comprimento 10, diz-se que a ligação tem uma homologia de 9θ %·

As sequências de ácido nucleico celular são detectadas pelo processo de hibridação molecular. A sonda deve ser marcada de modo a permitir a detecção de quais quer sequências de ácido nucleico celular complementares pre sentes nas células individuais.

Na presente invenção o termo hibridação também significa a ligação de um anticorpo com um antigenealvo.

Tipos de sondas

Uma sonda define—se como DNA, RNA ou oligonucleótidos ou polinucleótidos de material genético que consiste em DNA ou em RNA e anticorpos. O DNA ou RNA podem ser compostos por bases de adenosina, uridina, timidina, guanina, citosina, ou qualquer dos seus derivados químicos naturais ou artificiais. A sonda é capaz de se ligar com uma sequência genética celular.alvo imagem no espelho ou complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, cor rentemente através da formação de ligações de hidrogénio. A extensão da ligação é referida como a quantidade de acasalamento permitido na ligação ou no processo de hibridação; a extensão da ligação da sonda com as sequências celulares alvo também se referem ao grau de complementaridade para as sequências alvo. 0 tamanho da sonda é ajustado de modo a formar híbridos estáveis no nível desejado de emparelhamento incorrecto, correntemente, para detectar o emparelhamento incorrecto de uma única base requere-se uma sonda de aproximadamente 12 a 5θ bases. Sondas maiores (de 50 bases até dezenas de milhares de bases) são mais frequentemente usadas quando o nível de emparelhamento incorrecto é medido em termos de percentagem total de similaridade da sonda e da sequência genética celular-alvo. 0 tamanho da sonda também pode variar de modo a permitir ou a impedir que a sonda penje tre ou se ligue com várias regiões do material genético ou da célula. Identicamente, o tipo de sonda (por exemplo, usan do RNA versus DNA) pode realizar estes objectivos. 0 tamanho da sonda também afecta a velocidade de difusão da sonda e probabilidade de encontrar uma ligação-alvo celular, etc. Correntemente utilizam-se sondas de DNA de cadeia dupla (dsDNA)_? DNA de cadeia simples (ssDNA) ou de RNA para na reacção de hibridação quando o alvo é constituído por sequências de oligo^ nucleótidos.

As sondas de ácido nucleico podem ser prepa21

radas por uma diversidade de métodos conhecidos. As sequências de DNA de cadeia dupla purificadas (dsDNA) podem marcar-se intactas pelo processo de nick translation ou por extensão da iniciador aleatório. A capacidade das sondas de cadeia dupla para se hibridarem com ácidos nucleicos imobilizados nas células está comprometida pela capacidade das cadeias complementares se hibridarem entre si em solução antes da hibridação com os ácidos nucleicos celulares. As sondas de DNA de cadeia simples (ssDNA) não apresentam esta limitação e podem pro duzir-se por síntese de oligonucleótidos, pela utilização do fago M13 de cadeia simples ou por derivados plasmídicos deste fagoou por transcrição inversa de uma matriz de RNA purificado. 0 uso de sondas de RNA de cadeia simples (ssRNA) nas reacções de hibridação proporciona potencialmente maiores relações de sinal/ruído do que a utilização quer de sondas de DNA de cadeia dupla, quer de cadeia simples. Independentemente de a sonda de dsDNA, a ssDNA ou a ssRNA utilizadas na reacção de hibridação deve haver meios para detectar a formação de híbridos. Os meios para detectar a formação de híbridos utilizam uma sonda marcada com alguns dos tipos de marcadores detec táveis.

As sondas de anticorpo são conhecidas. A desi£ nação sonda de anticorpo significa um anticorpo que é específico para e se liga com qualquer antigene-alvo. Estes antigenes-alvo podem ser um pêptido, proteína, hidrato de carbono ou qualquer outro biopolímero ao qual se liga um anticorpo es— pecificamente.

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Sistemas de detecção

Os marcadores detectáveis podem ser qualquer molécula que seja detectável. Correntemente os marcadores detectáveis utilizados são marcadores radioactivos que incluem, 32 l4 125 3 35 mas não estão limitados a, P, C, I, H e S. Podem ser incorporados nucleótidos marcados com biotina nos DNA, o RNA por nick translation, meios enzimáticos ou químicos.

As sondas biotiniladas são detectáveis após a hibridação utilizando-se a anidina/estreptavidina, conjugados fluorescentes, enzimáticos ou de ouro coloidal. Os ácidos nucleicos podem tam bém ser marcados com outros compostos fluorescentes, com derivados fluorescentes imunodetectáveis ou com análogos da bio — tina. Também se podem marcar os ácidos nucleicos por meio de ligação com uma proteína. Também se podem utilizar ácidos nucleicos em ligação cruzada com histona Hl radioactiva ou fluorescente, enzimas (fosfatase alcalina e peroxidases), ou proteínas de ligação de cadeia simples (ssB). Para aumentar a sensibilidade da detecção do ouro coloidal ou de produtos de peroxidase, pode-se utilizar numerosos processos de reforço ou amplificação com soluções de prata.

Também se pode utilizar um processo imunocitoquímico de fluorescência indirecta /~Rudkin e Stollar,

Nature 265 ϊ (1977) 472; Van Prooijen et al. Exp. Cell. Res. 141 (1982) 3977. ^rormam-se anticorpos policlonais contra híbridos RNA-DNA injectando animais com poli(rA)-poli(dT). Sondas de DNA hibridaram com células in situ e detectaram-se híbridos por incubação com anticorpo para híbridos de RNA-DNA.

J

De acordo com a presente invenção, preferem-se as sondas de cadeia simples. As sondas podem ser marcadas directamente por ligação de uma molécula detectável intercalada com agentes fluorescentes ou por ligação covalente da son da com esses agentes fluorescentes. A sonda pode marcar-se com mais do que uma molécula do marcador detectável.

Tamanho e concentração das sondas tamanho de uma sonda afecta a sua velocidade (.. de difusão, a velocidade de formação de híbridos e a estabilidade dos híbridos. De acordo com a presente invenção, para se detectar RNA celular-alvo, sondas pequenas (entre 5θ © 150 bases), fornecem um sistema mais sensível, rápido e estável. Preparou-se uma mistura de sondas pequenas (50 a 150 bases) que abrangia o comprimento total do biopolímero-alvo a detectar. Por exemplo, se o biopolímero-alvo tiver 1.000 bases de comprimento, deverão utilizar-se cerca de 10 a 20 sondas dife rentes de 50 a 100 bases na solução de híbrido para cobrir completamente todas as regiões do biopolímero-alvo.

Para detectar DNA celular-alvo, sâo utilizadas sondas ainda mais pequenas (15-50 bases).

A concentração da sonda afecta vários parâmetros da reacção de hibridação in situ. São utilizadas concen trações altas para aumentar a difusão, reduzir o tempo da reacção de hibridação e saturar as sequências celulares dispo^ níveis. De acordo com a presente invenção, a reacção está com pleta após 5 minutos. Para se obter uma velocidade de reacção rápida^mantendo—se as relações de sinal/ruído elevadas, as concentrações de sonda preferidas são 1-10 yUg/ml. De preferên cia, utilizam-se sondas com uma concentração de 2,5 /ig/ml.

Solução de hibridação e temperatura

A solução de fixação/hibridação da presente invenção consiste num agente fixador (descrito anteriormente) num agente caotrópico, habitualmente cloreto de lítio 0,8 M, Tris-acetato 0,1 M, pH 7,4, cerca de 50 ^g/ml de DNA de peso molecular baixo e 50 ^ug/ml de RNA ribossómico com a dimensão de cerca de 50 bases e Triton X-100 a 0,1 %. Adiciona-se uma sonda de RNA de cadeia simples a esta solução antes das incubações com as células-alvo. A sonda pode apresentar pelo menos 15 a 20 bases, de preferência 75 a 150 bases, e estar marcada com um marcador detectável tal como um agente fluorescente. A temperatura mais preferível como óptima para a hibridação está compreendida entre 50° e 55°C. Contudo, podem-se utilizar temperaturas compreendidas entre 15° θ 80°C que dependem dos constituintes e das concentrações da solução de fixação/hibridação.

Tratamentos pós-hibridação e detecções

A presente invenção não necessita de fases de lavagem antes das detecções de híbridos. Se as sondas são TM marcadas com Photobiotin , então a avidina ou a estreptavidina fluorescente, complexos enzimáticos ou de ouro coloidal podem-se adicionar directamente às lâminas que contém o cocktail de hibridação e incubarem-se durante 20 minutos à temperatura ambiente ou durante 10 minutos a 37°C ou durante 5 minutos a 55°C. Esta fase constitui uma vantagem significativa sobre todas as técnicas de hibridação anteriores devido ao tempo poupado na eliminação de várias fases de lavagem pós-hibridação e o necessário bloqueio de sítios de ligação não específicos de avidina/estreptavidina; isto resulta na não diminuição do sinal ou no aumento do ruído. Se as sondas são marcadas directamente com agentes fluorescentes, não é necessária qualquer fase de detecção posterior.

A seguir à fase de detecção de estreptavidina/avidina ou directamente após a reacção estar completa, o espécime é lavado com grandes volumes de 2 x SSC/Triton X -100 a 0,1 %. A solução pode conter RNase A e TI à temperatura ambiente. Esta lavagem pode ser muito rápida (cerca de 5 minutos) ou suficientemente longa para uma circulação suave contínua ou corrente de volume suficiente (cerca de 200 ml por cm de área de células) de solução passada sobre as células. Isto pode ser seguido por lavagens com maior rigor (concentrações salinas menores tais como pelo menos 0,1 x SSC e/ou temperaturas mais elevadas até 65°C). Como a área das células fica húmida, em seguida os suportes são secos e recobertos por qualquer método convencional.

2. Células e tecidos em suspensão

Preparação de células

As amostras de tecido são fraccionadas à parte por meios físicos, químicos ou enzimáticos numa suspensão de células individuais. As células são colocadas numa solução de

PBS mantida para a osmolalidade celular com albumina de soro bovino (BSA)] com uma concentração de 10^ a 10^ células por ml. As células em suspensão podem fixar-se e processar- se posteriormente, fixarem-se e processarem-se imediatamente ou não se fixarem nem se processarem no sistema de hibridação in situ da presente invenção.

Realização da fixação/hibridação

Adiciona-se uma solução simples aos tecidos/ /células (a seguir designados por espécime). Esta solução con tém o seguinte: um fixador moderado, um agente caotrópico, uma sonda de ácido nucleico (sonda de RNA ou DNA previamente marcada) e/ou uma sonda de anticorpo, sais, agentes detergeri tes, agentes tampão e agentes bloqueantes. A incubação desta solução realiza-se a 55°θ durante 20 minutos.

fixador é constituído por um fixador consi derado óptimo para o tipo de células particular a analisar (por exemplo, existe um fixador óptimo para a medula óssea e para o sangue periférico, embora este tecido contenha nume rosos tipos diferentes de células). O fixador é usualmente uma associação de fixadores precipitantes (tais como os álcoois) e fixadores reticulantes (tais como os aldeídos), com a concentração do fixador reticulante muito baixa (menos de 10 $>) . Habitualmente a solução contém entre 10 e 40 % de etanol e 5 % de formalina. A concentração e o tipo de agente de preci^ pitaçâo e de agente reticulante pode variar, conforme a sonda e as exigências de restrição da sonda, assim como a temperatura apropriada para a hibridação. Os agentes de precipitação e reticulantes habitualmente utilizados estão representados no Quadro 1

I Ή

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Efeitos de fixadores específicos de tecidos 'tíCetfi. I (0 Ο Φ C o 4) o o O ιηχ iPi« +>

co /3\ cm + \±7 + l ra O ra c o o o rH < -p

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- 28.

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I ί

τ

Ο cocktail de hibridaçâo contém um agente ^f desnaturante, usualmente formamida a 30 (v/v), mas também se podem utilizar eutros agentes caotrópicos tais como iodeto de sódio, ureis, etc. Além disso, alguns agentes de precipitação e/ou fixadores reticulantes também possuem propriedades de de£ naturação moderada; estas propriedades podem-se utilizar em conjunto com a desnaturação principal, quer de um modo aditivo, quer sinérgico. 0 cocktail de hibridaçâo pode construir-se, de preferência, para permitir apenas a formação de híbridos RNA-RNÀ ou RNA-DNA. Isto obtém-se por ajustamento da concentra ção dos agentes de desnaturação com a concentração de sais (principalmente a série de catiões monovalentes do Grupo I dos metais conjuntamente com o ião amónio) e ainda com a temperatura de hibridaçâo utilizada. Isto permite a hibridaçâo selectiva da sonda com RNA ou DNA celular ou simultaneamente com

RNA e DNA com sondas distintas. Isto permite ainda o fornecimento de sondas numa solução pré-misturada que apresenta as con dições óptimas para gerar um sinal e minimizar o ruído enquanto simultaneamente fixa optimamente a morfologia das células/tecidos.

Detecção de híbridos

A sonda do cocktail de hibridaçâo pode ser marcada antes da reacção de hibridaçâo. 0 marcador pode ser de um dos muitos tipos citados anteriormente. Se a sonda é marcada TM , com Photobiotin , os híbridos podem detectar-se pela utilização de um conjugado de estreptavidina/avidina (s/a) com uma , TM molécula fluorescente tal como FITC, rodamina, Texas Red , etc., ou com um conjugado S/A com uma enzima ou S/A marcado com um metal pesado tal como o ouro coloidal. Especificamente, uma solução que contém o conjugado de estreptavidina é adicionada directamente ao cocktail de hibridação sobre as células após terminar a reacção de hibridação. As células são incubadas nesta solução durante 5 minutos à temperatura de 55°C. Podem-se utilizar temperaturas mais elevadas de hibridação com tempos mais longos. 0 tempo de reacção de hibridação poderá variar, dependendo da composição do cocktail de hibridação que contém o fixador (tipo e concentrações dos agentes preci pitantes e/ou dos agentes reticulantes), agentes tampão, ^aS^eR tes formadores de poros, agentes desnaturantes e agentes de es tabilização de híbridos. Identicamente, a temperatura pode variar como referido anteriormente.

Alternativamente, as sondas podem ser marcadas directamente com um corante ou com uma molécula fluoresTM cente tal como Pontamine Sky Blue por incubação da sonda de ácido nucleico juntamente com o corante (1:10, proporções em peso:peso) e permitindo ligar/intercalar o corante. Em seguida, a sonda é precipitada da solução e o excesso do corante não ligado retirado por lavagens repetidas com etanol a 70%. As sondas podem também marcar-se directamente e covalentemente por incubação de moléculas de cadeia dupla (RNA-RNA, RNA-DNA ou DNA-DNA) com marcadores que se ligarão covalentemente aos ácidos nucleicos. Após as condições de incubação sob as quais a reacção teve lu^ar, as cadeias são separadas e cada cadeia separada é utilizada como uma sonda. A concentração da sonda na solução é habitualmente de 2,5 jJg/ml_? ainda que se possa utilizar dentro dos limites de 0,01-10 jig/ml. A concentração da sonda afectará a cinética da reacção e pode afectar a sensibilidade do ensaio, assim como a relação sinal/ruído.

Se a sonda é marcada directamente com um marcador enzimático ou é detectada utilizando-se um sistema enzimático detectável secundariamente, então esta reacção pode realizar-se antes das fases de lavagem. Após a incubação, o espécime com o agente tampão apropriado para a enzima, a lâmina é incubada com o substrato para a enzima sob condições espe cificadas pelo fabricante ou fornecedor da enzima.

Lavagem para eliminação de ruído

As células podem ser depositadas em lâminas ou centrifugadas para formarem um grânulo após a reacção (s) de fixação/hibridação/detecçâo. Em seguida, a sonda não ligada é lavada para se libertar das células numa fase de lavagem uti lizando—se uma solução de 0,1 x S5C (l ^x SSC = cloreto de sódio 0,15M e citrato de sódio 0,015M, pH 7,^) com Triton X-100^^ a 0,1$. Como solução de lavagem usa-se um total de 1-200 ml por lâmina de microscópio (isto é, para separação de cerca de 100.000 células ou por secção de tecido de cerca de 1 cm ). A concentração e o tipo de agentes de estabilizaçSo/desnaturaçSo de híbridos e de agentes de formação de poros pode variar depen dendo do tipo de células de sonda e do nível aceitável de emparelhamento incorrecto do híbrido.

Resultados obtidos

Quando as células são depositadas em lâminas, os resultados são visualizados normalmente num microscópio fluorescente quando se utilizarem sondas fluorescentes marcadas directa ou indirectamente. Alternativamente, os resultados podem ser analisados automaticamente num sistema de análises . TM de imagem de fluorescência tal como ACAS 470 Vorkstation que é produzido pela Meridian Instruments. Se nas sondas se utilizaram outros tipos de marcadores, os meios de detecção variarão de acordo com estes.

Quando as células são mantidas em solução, podem-se obter resultados utilizando-se um circuito citométrico para registar a quantidade de fluorescência por célula, o que representa a quantidade de híbrido por célula. Alternativamente, o sinal total numa amostra celular pode ser determinado utilizando um dispositivo tal como um contador de cintilação de líquidos (por radioactividade) ou uma placa microtituladora de quimioluminescência/fluorescência para esses marcadores .

Análises dos resultados da velocidade de hibridações in situ, sensibilidade e quantificação de hibridações in situ método da presente invenção requer entre 5 minutos e 4 horas para se completar com uma sensibilidade da ordem de 1 a 5 moléculas de biopolímeros-alvo por célula. Isto resulta de uma associação de pelo menos três factores: l) os constituintes celulares não são precipitados irreversivelmente nos ácidos nucleicos, 2) a fixação foi optimizada para o tecido particular utilizado e 3) a cinética da reacção é mais rápida para concentrações altas de sonda, simultaneamente com o processo de fixação e a temperaturas elevadas.

número de cópias de mRNA por célula pode avaliar-se a partir do número de grânulos das células quando as sondas utilizadas são radioactivas. Com detecçães de fluorescência ou enzimáticas,uma avaliação relativa da fluorescência ou dos produtos corados precipitados permite a estimativa do número de cópias de mRNA.

Habitualmente, a aproximação do número de cópias é mais fácil após fotografia manual, filmagem e compara ções das imagens fotográficas.

A quantificação de sinais radioactivos ou fluorescentes obtidos após hibridações in situ pode ser automatizada mediante a utilização de um sistema de análise de ima

TM gens tal como o Meridian ACAS 470 Workstation

Detecção simultânea de biopolímeros múltiplos

A presente invenção permite a detecção simultânea de diferentes substâncias (tais como mRNAse proteínas) nas mesmas células. Isto pode realizar-se por uma de duas vias. Primeiro, sondas múltiplas contendo cada uma um único marcador (por exemplo, etiquetas fluorescentes A, B e

C, em que a luz emitida por cada uma tem um comprimento de onda detectável diferente) são todas adicionadas conjuntamente às soluções de hibridação. “lternativamente, pode realizar-se uma reacção de hibridação e detecção com uma sonda e marcador, eliminar—se por lavagem a sonda que não reagiu residual e o marcador sob condições isentas de nuclease e realizar-se outra reacção de hibridação. Este processo repete-se tantas vezes quantas as necessárias.

Detecção simultânea de DNA e RNA para o mesmo gene

A presente invenção permite a detecção simul tânea de DNA e RNA (e proteínas) para o mesmo gene determinada e concorrentemente dentro da mesma célula. Isto realiza-se por uma das duas vias. Primeiro, sondas múltiplas contendo cada uma um marcador único (por exemplo, etiquetas fluorescentes ”A,

B e C que emitem com diferentes comprimentos de onda detec táveis) são todas adicionadas conjuntamente com a solução de fixação/hibridação. Alternativamente, realiza-se uma reacção de fixaçSo/hibridação/detecção com uma sonda e marcador, lava-se a sonda que nâo reagiu residual e o marcador sob condições isentas de nuclease e realiza-se outra reacção de fixação/hibridação . Este processo repete-se tantas vezes quantas as necessárias.

Quando se detecta tanto o DNA como o RNA, a selecção de tipo de sonda torna-se importante. Quando o biopolímero-alvo celular é RNA, utilizou-se no ensaio uma sonda de DNA de cadeia simples antx-sentido. Se o DNA-alvo celular for o biopolímero a detectar, deverá utilizar-se no ensaio uma son da de RNA de cadeia simples no sentido da cadeia. A selecção desta sonda e a selecção e concentração de componentes da solu ção de fixação/hibridação deverá permitir apenas a formação de híbridos de RNA-DNA. Portanto,a sonda pode ligar-se apenas ao biopolímero celular-alvo; outros ácidos nucleicos serão inerentemente impedidos de interferirem com a reacção de ensaio.

A presente invenção pode apresentar-se sob

Ζ a forma de um Kit. 0 Kit da presente invenção é utilizado para detectar a presença de um biopolímero-alvo específico num espécime. Este Kit inclui o seguinte:

1. Uma solução que contém um cocktail de fixação/hibridação e uma ou mais sondas marcadas.

De preferência, esta solução conterá etanol a 15 a bO formamida a 25 a bO formaldeído a 0 a 10^, cloreto de lítio 0,1 a 1,5M, Tris-acetato 0,05 a 0,5M (pH 7-θ), Triton X-100 a 0,05^ a 0,15 20 /ig/ml - 200 yug/ml de um ácido nucleico não específico que não reaja com a sonda(s) e 0,1yUg/ml a 10yUg/ml de uma sonda de cadeia simples directamente marcada com uma molécula de referência.

De preferência, esta solução conterá etanol a 30 formamida a 30 %, formaldeído a 5 cloreto de lítio 0,8M, Tris-acetato 0,1 M (pH 7,4) Triton X-100 a 0,1 $>, 50 jig/ml de RNA ribossómico cortado e dimensionado para cerca de 50 bases e 2,5 jug/ml de uma sonda de cadeia simples directamente marcada com uma molécula de referência fluorescente.

Esta solução e as sondas devem ter uma medida pré-definida e earacteristicas identificadas e reactividades com células e sequências-alvo.

2. Meios e instruções para realizar a referida reacçâo de hibridação in situ da presente invenção .

Alternativamente, o Kit pode também incluir:

1. Um segundo sistema de referência detectável que de verá reagir com a sonda ou com o híbrido-alvo da sonda.

2. Soluções de reserva concentradas para serem diluídas suficientemente para se preparar soluções de lavagem.

3. Quaisquer componentes mecânicos que sejam necessários ou úteis para pôr em prática a presente inven ção, tal como um suporte sólido (por exemplo, uma lâmina de microscópio), um dispositivo para fixar as células ao referido suporte ou um dispositivo para auxiliar as incubações ou lavagens de espécimes .

4. Uma película fotográfica ou uma emulsão fotográfica que registe os resultados dos ensaios realiza dos de acordo com a presente invenção.

Outra versão deste Kit pode incluir uma solução de sondas encapsuladas em lipossomas ou microesferas, como descrito nso exemplos 10 e 11,

Os exemplos que se seguem são apresentados para ilustração e não se entendem como limitando a invenção em qualquer sentido. Em todos os exemplos, as percentagens são em peso, no caso de sólidos, ou em volume, no caso de líquidos e todas as temperaturas são expressas em graus Celsius, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1

Preparação de sondas

A. Geral

Podem-se preparar sondas de RNA ou de DNA, uti^ lizáveis na presente invenção, de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na matéria ou podem obter-se de qualquer origem comercial. As sondas de RNA podem preparar-se por métodos descritos por Green et al. Cell 32 (1981), 68l. Podem preparar-se sondas de DNA por métodos conhecidos, tais como o descrjL to por Rigby et al. J. Mol. Biol. 113 (l977), 237. As sondas oligonucleotídicas sintéticas podem preparar-se como descrito por Kallace et al. Nucleic Acids Res. (197^), 35^3. As sondas utilizáveis na presente invenção têm que apresentar as seguintes características:

1. Especificidade para a molécula-alvo.

2. Pelo menos 15 pares de bases de comprimento, de preferência 75 a 15θ pares de bases.

B. Preparação de sondas de RNA

Obteve-se fragmentos subgenómicos dos genes c-myc, c-sis ou c-abl na Amercham Inc. (catálogos n?s RPN.1315X, RPN. 1324X e RPM.1325X, respectivamente). Num aspecto da presente invenção, utilizou-se sondas no sentido da cadeia dos genes c-my c, c-abl e c-sis. A sonda c-my c utilizada era um clone genómico de 1,3 kb Clal/EcoRI da extremidade 3' do gene c-myc ^/“Dalla-Favera, et al. Science 219 (1983), 96^7. A sonda c-abl era derivada de um subclone do gene c-abl humano, um fragmento EcoRl/Bam Hl que correspondia à região de hibridação de c-abl 5’ £de Klein et al. Nature 300: (1982), 765/.

A sonda c-sis era um fragmento Bam HI do clone L33 que correspondia à extremidade 3' de c— sis ^Josephs et al., Science 219 (1983), 5θ3/. As sondas HIV e EBV obtiveram-se e foram preparadas como descritas em Dewhurst et al., FEBS Le11.

213 (1987), 133. A sonda CMV foi de scrita em Gronczol, et al., Science 224 (1984), 159« Estes DNAs plasmídicos de matriz foram transcritos e descritos por Green et al, Cell 32 (1981), 68l. 0 tamanho e a quantidade de RNA foram confirmados por electroforese através de um gele de agarose de desnaturação como descrito por Thomas Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 77 (1980), A

5201, e por espectrofotometria efectuada a 2Ó0 e Α^θθ. Preparou-se uma sonda de DNA beta-actin, como descrito por Cleveland, et al., Cell 20 (1980), 95, e marcaram-se as sondas de

TM

RNA com Photobiotin como descrito por Bresser e Evinger—Hodges_? Gene Anal. Tech. (1987)_? 89, incorporados aqui como referência. Alternativamente, as sondas foram marcadas direc tamente com a intercalação de um composto fluorescente tal _z TM como o brometo de etidio, mitramicina, Pontamine Sky Blue ou iodeto de propídio por incubação do ácido nucleico e do corante conjuntamente durante a noite à temperatura ambiente nas preparações de 1:10 (w/w) (ácido nucleico/corante).

No outro método de marcação, adicionou-se DNA de peso molecular baixo com uma concentração 100 vezes superior à sonda e precipitaram-se todos os polinucleótidos por

8-

adição de l/3 de volume de acetato de amónio 10M e 2-^2 volume de etanol a 95 $. Recolheram-se os ácidos nucleicos por centrifugaç3o e ressuspenderam-se em água com uma concentração de 1 pg/til de sonda e conservaram-se a -70°C até à utilização.

C. Preparação de sondas de anticorpo

São conhecidas pelos especialistas na matéria sondas de anticorpo específicas para antigenes como vírus ou seus determinantes específicos, péptidos e proteínas derivadas de uma variedade de origens, radicais de hidratos de carbono e uma grande variedade de biopolímeros. Os métodos para a preparação destes anticorpos também são conhecidos.

Resumidamente, podem preparar-se anticorpos policlonais por imunização de um animal hospedeiro com um antigene. De preferência, administra-se o antigene a um hospedeiro por via subcutânea, com uma semana de intervalo, seguido de uma dose de rappel um mês após a última dose semanal. Subsequentemente, recolhe—se o soro, precipitam-se os anticor pos do soro e marcam—se detectavelmente por métodos convencio nais .

Os anticorpos monoclonais podem preparar—se de acordo com qualquer dos métodos conhecidos. A fusão entre células de mieloma e células de baço de dadores imunizados tem-se revelado um método com sucesso para a produção de linhas de células contínuas, de células de hibridoma geneticamente estáveis, capazes de produzirem grandes quantidades de anticorpos monoclonais contra antigenes-alvo, tais como, por exemplo, tumores e vírus. Os anticorpos monoclonais podem preparar-se, por exemplo, pelo método descrito na patente de invenção norte-americana No. 4 172 124, por Koprowski et al., ou de acordo com a patente de invenção norte-americana No. 4 196 265, por Koprowski et al.

Os processos para a marcação de anticorpos são os métodos convencionais conhecidos.

Exemplo 2

Efeitos da temperatura sobre a hibridação

Desenvolveram-se as células K 562 (ATCC CCL 243) em solução salina equilibrada de Hank (lIBSS) suplementada com soro de vitela fetal a 10 7· As células em divisão foram depositadas sobre lâminas de vidro por citocentrifugação . Fixaram—se/hibridaram-se as células com várias concentra ções de etanol (10 7t 15 7, 20 7_f 25 7 ^e 30 7) ^e com ácido acético glacial a 5 7t formamida a 35 7, formalina a 5 7i cloreto de lítio 0,8M, Triton X-100 a 0,1 7, 100 /jg/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na Sigma Chemical Company) e 2,5 yig/ml de sondas de DNA ou de

RNA anti-sentido de c-myc , c-abl ou c-sis marcadas com Photo^ TM biotin . As sondas de RNA anti-sentido preparam-se de acordo com a descrição do Exemplo 1. As reacções de hibridação realizaram-se a diversas temperaturas compreendidas entre 4° e 80°C. Após a incubação às temperaturas desejadas, durante duas horas, detectou-se a formação de híbridos. Para detectar a hibridação, adicionaram-se a este espécime complexos de es — treptavidina-fluoresceína ou de rodamina com uma concentração dupla da recomendada pelo fabricante. Após a incubação à tem peratura ambiente durante 30 minutos, os espécimes foram lava dos cuidadosamente (com 1 a 200 ml por cm de área celular) com 0,1 x SSC contendo Triton X-100 a 0,1 A cada espécime adicionou-se uma gota de solução de glicerol a 100 $/2x PBS a 50/50 (v/v). Registou-se a fluorescência emitida por cada célula em cada lâmina hibridada a diferente temperatura, por meio de um microscópio de fluorescência Nikon, com ligaçSes de tubo fotomultiplicador. Analisaram-se, aproximadamente,

300 a 800 células por lâmina. Os resultados numéricos obtidos, que correspondiam à quantidade de fluorescência proveniente de cada célula, foram representados graficamente como a fluorescência relativa em função da temperatura de hibridação.

Os resultados que se representam na Figura IA demonstram que as temperaturas de hibridação de 25° a 55°C proporcionam a maior fluorescência relativa correspondente à maior parte da formação de híbridos na presente hibridação in situ desta invenção, com os reagentes especificados anteriormente e suas concentrações, quando os híbridos formados nas células são de RNA-DNA.

Os resultados apresentados na Figura 1B demons tram que as temperaturas de hibridação compreendidas entre 25°C e 55°C podem ser utilizadas na reacção de hibridação quando se formam nas células híbridos DNA-DNA.

Exemplo 3

Cinética de hibridação in situ

Desenvolveram-se células K 562 (ATCC =$= CCL

-41-243) em solução salina equilibrada de Hank (BSS) suplementada com soro de vitela fetal a 10 #. As células em divisão foram depositadas sobre lâminas de vidro por citocentrifugaçâo. As células fixaram-se/hibridaram-se com etanol a 30 %, formamida a 35 formalina a 5 λ¹, cloreto de lítio 0,8 M, Triton X-100 a 0,1 %, 100 ^ug/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na Sigma Chemical

Company) e 2,5 yug/ml de sonda de RNA anti-sentido de c-myc,

T>1 c—abl ou de c-sis marcada com Photobiotin . As sondas de

RNA anti-sentido foram preparadas de acordo com a descrição do Exemplo 1.

A Figura 2 representa a relação entre o tempo de hibridação e a quantidade do sinal fluorescente observado nas células. As reacções de hibridação realizaram-se com diversos tempos que variam entre 5 minutos e 96 horas. Após in cubaçâo a 55°C durante o tempo desejado, detectou-se a formação de híbridos. Para se detectar a formação de híbridos, adi_ cionaram-se a cada espécime complexos de estreptavidina-fluoresceína ou de rodamina com uma condentração dupla da recomen dada pelo fabricante. Após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, lavaram—se cuidadosamente os espécimes p

com 0,1 x SSC/Triton X-100 a 0,1 % a 1-200 ml por cm de área celular. Adicionou-se a cada espécime uma gota de uma solução de glicerol a 100 %/2 x PBS a 50/50 (v/v). Utilizando- se um microscópio fluorescente Nikon com ligação de tubo fotomultiplicador, registou-se a fluorescência emitida por cada célula em cada lâmina hibridada, a cada tempo diferente. Analisa ram-se por lâmina aproximadamente 300 a 800 células. Os resul tados numéricos obtidos indicando a quantidade de fluorescência proveniente de cada célula foram representados graficamente como a fluorescência relativa versus o tempo de hibrida ção. A Figura 2 demonstra que a reacção de hibridação está essencialmente completa após 5 a 10 minutos sob as condições da presente invenção.

Exemplo 4

Modificações da estrutura secundária de RNA celular

Desenvolveram-se células HLÓO (ATCC φCCL 24o) em solução de Hank BSS suplementada com soro fetal de vitela a 10 %. Recolheram-se as células e depositaram-se sobre lâmji nas de microscópio de vidro por citocentrifuração. Secaram-se as células ao ar sobre lâminas de vidro e armazenaram-se à temperatura ambiente até à utilização. Fixaram-se as células com um dos diferentes fixadores para este tipo de experiência. Os fixadores típicos deverão incluir etanol a 70 %, etanol a 95 $/ácido acético glacial a 5 etanol a 75 ácido acético glacial a 20 metanol a 100 acetona a

100 $, acetona a 50 metanol a 50 , paraformaldeído a

Fo, paraformaldeído a 2 formaldeído a 10 % /metanol a

F>. Após a fixação das células nestes fixadores com um tem po e temperatura apropriados, retiraram-se as lâminas do fixador e coraram-se com Giensa-Wright ou hematoxilina e eosina por métodos convencionais de laboratório. A morfologia celu lar foi avaliada por comparação do grau de preservação da mor fologia após fixação com a morfologia antes da fixação. Os fixadores que não retiveram eficazmente a morfologia visual

- U3 -

foram arbitrariamente classificados como +1.

Os fixadores que retiveram eficazmente a morfologia celular foram arbitra riamente classificados de +1 a + Z+, representando +4 a preservação morfológica celular mais eficaz. A segunda avaliação para a preservação eficaz das células por estes fixadores realiza-se quando apropriado pera detectarem antigenes celulares. Neste caso, retiraram-se as células dos fixadores e incubaram-se com um anticorpo específico para um dado antigene celular-alvo. De novo, os agentes fixadores que mantiveram eficazmente a antigenicidade dos componentes celulares foram classificados arbitrariamente como + 4, enquanto os fixadores que não mantiveram eficazmente a preservação dos an tigenes celulares foram classificados com valores inferiores e os piores como +1. Os agentes fixadores que foram classificados como +3 ou + Λ, de acordo com a preservação da morfologia celular e/ou preservação do antigénicidade celular, foram utilizados nas fases seguintes. Fixaram—se lâminas recentes com células não tratadas com estes agentes fixadores e incubaram-se numa solução de hibridação que continha forma mida a 50 4 x SSC, fosfato de sódio 0,1 M, (pH 7,4), Triton X-100 a 0,1 $, 100 ^ig/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na Sigma Chemical ^uompany). Não se incluiu qualquer sonda biopolimérica nesta solução.Incu baram-se as células numa solução de hibridação a uma temperatura compreendida entre 50° - 55°O durante 5» 10, 15, 20, 30,

4$, 60, 90 e 120 minutos. Depois de se completar esta fase de hibridação, lavaram-se as amostras de células^ com 1 a 2 ,

200 ml por cm por area celular, com cada uma das soluções /

seguintes que continham Triton X-100 a 0,1 2 x SSC, x SSC, 0,5 x SSC, 0,1 x SSC. Em seguida, avaliou-se a amostra celular como anteriormente para a preservação da mor fologia celular e/ou preservação da antigenicidade celular.

A amostra de células foi em seguida outra vez avaliada por coloração das células com iodeto de propídio a 50 ^g/ml. O iodeto de propídio cora nas células os ácidos nucleicos de cadeia única e os ácidos nucleicos de cadeia dupla. Quando este corante cora ácidos nucleicos decadeia dupla ou ácidos nucleicos de cadeia única, tem espectros de emissão característicos diferentes sob a excitação do ultravioleta. Também se corou uma lâmina com uma amostra de células não tratadas.

A quantidade total de fluorescência emitida foi determinada sobre a amostra de células não tratadas utilizando-se um microscópio de fluorescência Nikon com ligação a um tubo fotoam plificador. Registaram—se 300 a 1 000 células com a quantidade total de fluorescência gerada a partir de RNA de cadeia dupla contido no citoplasma. Esta avaliação representa um nível de linha de base para a fluorescência total do citoplasma; isto é, o RNA total no citoplasma e o RNA presente num estado de cadeia dupla a 100 fi. As lâminas retiradas dos vários fixadores e dos vários processos de hibridação e tempos foram analisadas de uma forma idêntica. Em todos os casos é importante escolher a fixação e as condições e tempo de hibridação que mantenham a mesma quantidade de fluorescên cia no citoplasma da célula. Durante a hibridação, a fluore_s cência emitida pelo RNA do citoplasma da célula devida à colo ração com iodeto de propídio alterar-se-á. 0 esquema de emis são diminui de acordo com o grau de cadeia dupla de RNA. Simultaneamente, o comprimento de onda da emissão que reflecte a quantidade de RNA de cadeia única no citoplasma começará a aumentar. Quando a fluorescência total no citoplasma devida ao RNA permanece constante e a quantidade de fluorescência devida à quantidade de RNA de cadeia dupla no citoplasma dimi. nuiu aproximadamente de 70 embora a quantidade de fluorescência correspondente ao RNA de cadeia única no citoplasma aumente num valor igual, então as condições obtidas são as que permitirão a detecção de 1 a 5 moléculas de RNA no citoplasma. 0 tempo da reacção de hibridaçâo necessário para obter esta variação de cadeia dupla para cadeia única do RNA no citoplasma é o reflexo do tempo necessário para uma reacção de hibridaçâo real para detectar 1 a 5 moléculas por célu la de RNA.

Especificamente, na Figura 3, a quantidade relativa de RNA da cadeia dupla está representada graficamente no fundo da escala. X medida que o RNA no citoplasma se transforma em cadeia dupla, as curvas deslocam-se para a direita. Quanto maior a variação do grau de cadeia dupla em relação à cadeia simples do RNA no citoplasma, maior o deslo camento das curvas, da direita para a esquerda. 0 eixo vertical representa o número de células contadas. Por outras palavras, se se contarem 300 a 1 000 células, a grande maioria destas cairá numa área particular da cadeia dupla. Enquari to algumas células apresentam maior grau de cadeia dupla e outras menor grau de cadeia dupla, a análise poderá representar-se por uma curva em forma de sino. No lado direito da figura mostram—se os diversos tratamentos realizados. 0 resultado da coloração das células não tratadas com iodeto de propídio não está representado. Contudo, após o tratamento de células HLÓO com diversos agentes fixadores, o grau de cadeia dupla de RNA celular permanece essencialmente constante. Ainda que se realize um tratamento de pré-hibridação que inclui um tratamento com protease, não existe alteração essencialmente na quantidade de RNA de cadeia dupla. A curva na Figura 3 que corresponde ao tratamento com protease tem a mesma localização que a curva correspondente ao tratamento de fixação. Aquela não se deslocou, nem para a esquerda nem para a direita. Contudo, após 15 minutos numa solução de hibridação, a curva que representa a quantidade de RNA de cadeia dupla deslocou-se pelo menos de 70 fé para a esquerda.

Isto corresponde a uma alteração de pelo menos 70 fé da quantidade de material no citoplasma da célula que se transformou em cadeia única. Comparando este gráfico com a Figura 2, conclui-se que após 15 minutos no cocktail de hibridação, não apenas se obteve 70 fé de RNA no citoplasma de cadeia única, mas, como se observa na Figura 2, 70 % da reacção de hibridação estão completos.

Exemplo 5

Detecção de oncogenes em células de sangue periférico

Incubaram-se 10 ml de células de sangue periférico humano, à temperatura de 37°C, numa solução de oxalato de amónio a 1,2 fé (215 mOs), para lisar os glóbulos vermelhos. Centrifugaram-se os glóbulos brancos a 3 000 rotações por mi47 -

nuto durante 10 minutos numa centrífuga clínica. 0 grânulo celular foi, em seguida, lavado com 10 ml de PBS e ressuspenso em PBS. As células foram depositadas por citocentrifugaçâo sobre lâminas de vidro previamente limpas e secou—se ao ar duraii te 5 minutos. Fixaram—se e hibridaram-se as células numa solução constituída por etanol a 30 %/ácido acético glacial a 1 formamida a 30 $, cloreto de lítio a 0,8 M, Tris-acetato a 0,1 M (pH 7,4), Triton X-100 a 0,1 %, 100/ig/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na Sigma Chemical Co.) e 2,5yug/ml de c-myc, c-sis ou c-abl,

TM sondas de RNA de anti-sentido marcadas por Pontamine Sky Blue .

Prepararam-se as sondas de RNA anti-sentido como descrito no Exemplo 1. Após incubação durante 10 minutos à temperatura de 55°C, detectou-se a formação de híbridos.

Em seguida, lavaram—se cuidadosamente os espé^ 2 ciraes (l a 200 ml por cm de área celular) com uma solução que continha Triton X-100 a 0,1 0,1 x SSC. Adicionou-se uma gota de solução de glicerol a 100 % / 2 x PBS a 5θ/5θ (v/v) a cada espécime. Fotografaram-se os espécimes com uma película de alta velocidade (Kodak EES 135, PS 8θθ/ΐ 6θθ) a 1 6θθ ASA para 5 segundos de exposição num microscópio Nikon Photophot com uma amplificação de 400x, utilizando-se uma associação de filtros-padrão para transmissão de luz fluorescente .

A Figura 4 representa os resultados de estu dos de hibridação in situ da expressão de três oncogenes dife^ rentes no sangue periférico (PB). A Figura 4a representa

a detecção do gene c-abl. 0 painel B representa os resultados de hibridação in si tu com uma sonda c-sis. 0 painel C representa um resultado típico, quando se efectua a hibrida ção de células com uma sonda c-myc.

Exemplo 6

Detecção de oncogenes em tecido sólido

Quatro secções congeladas de 4 mícron de espessura de tecido mamário humano proveniente de amostras reti radas por biópsia cirúrgica foram montadas em lâminas de vidro previamente limpas.

Fixou-se o tecido e hibridou-se durante 20 minutos por incubação à temperatura de 55°C com um cocktail de fixação/hibridação (uma fase) contendo etanol a 20 %, formaraida a 30 %, cloreto de lítio a 0,8 M, Tris-acetato 0,1 M (pH 7,4), 50 /Jg/ml de DNA de esperma de arenque desnaturado de peso molecular baixo, 50 fiig/ml de RNA ribossómico cortado e dimensionado para 50 bases e Triton X-100 a 0,1 %. AdicioTiM naram-se sondas de RNA marcadas com Pontamine Sky Blue (como descrito no Exemplo l) ao coktail de hibridação numa concentração de 2,5 /Jg/ml. Aos brancos nâo se adicionou qualquer sonda. Lavaram-se as lâminas à temperatura ambiente em 2 x SSC que continha Triton X-100 a 0,1 %, 100 yUg/ml

RNase A (Sigma) e soluções de SSC diluídas sequencialmente até à lavagem final com 0,1 x SSC (1-200 ml por cm de área celular).

A detecção das sondas marcadas realizou-se por fotografia com um microscópio Nikon Photophot com capa49 cidade para fluorescência utilizando-se uraa película Kodak Ektachrome EES-135 (PS 8θθ/ΐ 6θθ) para uma exposição e proces sarnento a 1 600 ASA. Utilizou-se sistematicamente uma exposição de 10 segundos para permitir uma comparação directa entre uma fotografia e outra.

A Figura 5 representa os lesultados do ensaio de hibridação in situ de mRNA e a localização da expressão de SIS/PDGF-B nos componentes epiteliais do carcinoma da mama (Figura 5, painel SIS-AS). Utilizou-se como controlo positivo uma reacção de hibridação in situ com uma sonda de RNA c-myc anti-sentido (Figura 5, painel MYC) ; a hibridação in situ com uma sonda de RNA c-sis de sentido (Figura 5, painel SIS-S) foi utilizada como controlo negativo. Os aspectos histolc? gicos comparáveis estão representados no último painel da direita. Estão ilustrados dois casos de carcinoma ductal infiltrante.

Exemplo 7

Detecção de HIV em sangue periférico humano

Incubaram-se 10 ml de sangue periférico humano à temperatura de 37°C em uma solução de oxalato de amónio a

1,2 % para lisar os glóbulos vermelhos. Os glóbulos brancos humanos foram centrifugados a 3 000 rorações por minuto, duran te 10 minutos, numa centrífuga clínica. 0 grânulo de células foi, em seguida, lavado com 10 ml de PBS e ressuspenso em PBS. Depositaram-se as células por citocentrifugação em lâminas de vidro previamente limpas e secaram-se ao ar durante 5 minutos. Fixaram-se as células e hibridaram-se numa solução constituída /

por etanol a 25 formamida a 30 %, formalina a 5 cloreto de lítio 0,8 M, Tris-acetato 0,1 M (pH 7,M> Triton X-100 a 0,1 ?£, 100 yug/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na Sigma Chemical Co.) e 2,5 pg/ml de sondas de RNA de cadeia de sentido e de cadeia anti-sentido TM de HIV marcadas com Pontamine Sky Blue . Prepararam-se as son das de RNA como se descreveu no Exemplo 1. Após a incubação durante 10 minutos, à temperatura de 55°C, detectou-se a formação de híbridos.

Lavararn-se os espécimes cuidadosamente (l-200

9 ml de cm de área celular) com a solução seguinte: Triton X-100 a 0,1 %/0,l x SSC. Adiei onou-se uma gota de solução de glicerol a 100 %/2 x PBS, 50/50 (v/v) a cada espécime, antes de se cobrir o espécime e examinar ao microscópio. Os espécimes foram fotografados com película de alta velocidade (Kodak EES 135» PS 800/l 6θθ) a 1 600 ASA durante 5 segundos de expg sição com um microscópio Nikon Photophot com ampliação de 400x, utilizando-se uma associação de filtros-padrão para a transmissão da luz fluorescente. A Figura 6 representa a detecçao das sequências HIV em sangue periférico humano. Na Figura 6, o painel AS-HIV representa a hibridaçâo com um coktail contendo sondas de RNA de HIV anti-sentido; o painel da Figura 6 de S-HIV demonstra que não se detecta hibridaçâo quando se utilizaram sondas de RNA de HIV de sentido. A presente hibridaçâo in situ desta invenção detectou HIV em vários doentes infectados por vírus, enquanto os controlos negativos foram brancos.

Exemplo 8

Quantificação do número de moléculas de biopolímero-alvo

Desenvolveram-se células K5Ó2 (ATCC =$= CCL 243) em meio de Hank's BSS suplementado com soro de vitela fetal a 10 7 . Três dias depois da última mudança de meio, as células foram distribuídas para uma densidade de 10^ células por 0,3 ml de meio recente. Uma hora depois, preparou-se lâminas de réplica 60 por deposição de 50 000 a 100 000 células numa lâmina por citocentrifugação. Recolheu-se o resto das oélulas e extraiu—se destas RNA e DNA pelo método do cloreto de césio e guanídio (GuSCN/CscI) ^Chirgwin et al. Biochemjs try 18 (1979) 52947.

Dado que a linha de células apresentava uma população relativamente homogénea, purificou-se o RNA extrají do e utilizou-se para determinar o número de cópias estimado para cada espécie de RNA analisada; isto é, pode fazer-se uma estimativa do número de moléculas de cada gene presente em cada célula a partir de uma série de experiências de con trolo conhecidas pelos especialistas na matéria. Estas experiências de controlo para determinar o número de moléculas por célula inclui o seguinte: manchas de Northern, dot blots de RNA, Quick-blots ‘ , Cytodots ¹ , experiência de saturação de cópia única e experiências de concentração da solução versus tempo de hibridação (análise Rot-|,„ ) (Hames,

B.D. e Higgins, S. J. em Nucleic Acid Hybridization: a practical approach, Oxford-Washington, D.C. IRL Press, 1986.

Fixaram-se as células nas lâminas e hibrida-

ram-se numa solução constituída por etanol a 25 $, formamida a 30 $, formalina a 5 $, cloreto de litio 0,8 M, Tris-acetato 0,1 Μ (pH 7Λ), Triton X-100 a 0,1 $, 100 ^g/ml de DNA de peso molecular baixo (DNA de esperma de arenque obtido na

Sigma Chemical Co.) e 2,5 ^ig/ml de uma sonda de RNA anti-sen TM tido marcada com Pontamine Sky Blue . Utilizaram-se sondas de RNA de sentido e anti—sentido dos genes seguintes: c-abl, c-sis, c-myc ou de vírus de Epstein Barr (EBV). Prepararam-se as sondas como se descreveu no Exemplo 1. Após incubação durante 10 minutos, â temperatura de 55°C, detectou-se a for mação de híbridos.

Em seguida, lavaram-se os espécimes cuidado2 s samente (l-200 ml por cm de área celular) com 0,1 x SSC con tendo Triton X-100 a 0,1 $. Adicionou-se uma gota de uma soljj ção de giicerol a 100 $/2x PBS a 50/50 (v/v) a cada espécime e colocou—se uma lamela No. 1 sobre as células antes do exame ao microscópio.

A fluorescência emitida por cada célula traduz o número de moléculas fluorescentes que reagiram com a sonda e se ligaram a esta; a quantidade de sonda que reagiu em uma célula constitui indicativo do número de biopolímerosalvo presentes na célula. Para medir a fluorescência de cada célula analisaram-se as lâminas utilizando-se a ACAS 470

TM f \ .

Workstation da Meridian Instruments (Okemos, Ml), 0 mstru mento Meridian, como a maior parte dos sistemas que processam imagens, excita a fluorescência presente numa amostra e em seguida capta a luz emitida quer sob a fnrma de um sinal digital, quer de um sinal analógico. Este sinal é digital num instrumento Meridian. A quantidade de sinal pode ser representada por diferentes cores. Na Figura 7» este é ilus trado pelas cores atribuídas pelo instrumento aos sinais emitidos de diferentes intensidades. Quando estas cores são representadas sobre uma célula, como na Fig_ura γ_{f a} quantidade de localização subcelular do biopolímero-alvo e da son da hibridada pode ser observada.

A quantidade total de sinal de fluorescência por célula também se pode detectar e analisar. A partir de experiências de controlo utilizadas anteriormente para determinar o número de moléculas de mRNA que correspondem a genes diferentes nas células K562 , obtiveram-se valores conhe eidos (mínimos, máximos, médias e desvios-padrão) para o número de moléculas de cada tipo de RNA por célula. Estes valo res são utilizados como dados de entrada na análise instrumen tal de Meridian de dados e são observados como o eixo horizon tal da Figura 8. 0 eixo vertical representa o número de célu las. As diversas colunas representam o número de células (eixo vertical) que possuem um dado número de moléculas (eixo horizontal) de biopolímero-alvo. A Figura 8 demonstra que o mRNA do gene c-myc estava presente ao nível menor nas céljj las K562 (cerca de 1 a 10 moléculas). 0 mRNA do gene c-sis estava presente em cerca de 1 a 20 moléculas. 0 mRNA do gene c-ab1 está presente em muito maior número de moléculas por célula,variando entre cerca de 20 e 55 moléculas.

Exemplo 9

Hibridação in situ de mRNA de células em suspensão

Desenvolveram—se células K'562 (ATCC 4J: CCL 243) em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) suplementada com soro de vitela fetal a 10 Três dias depois da última mudança de meio, as células foram disseminadas para uma densidade de 10^ células por 0,3 ml de meio fresco. Uma hora depois, as células foram centrifugadas a 3 000 rpm numa ceri trífuga clínica e ressuspensas a uma concentração de 10^J a 10^ célulaspor ml em HBSS isento de soro. Em seguida as célu las foram processadas por um dos métodos seguintes:

1. Fixação de células

Fixaram-se as células em solução constituída por etanol a 45 $/formalina a 5 $>. Isto realizou-se por adição de igual volume de uma solução de etanol a 90 ^/formalina a 10 % numa amostra igual de células. As células devem ser conservadas nesta solução à temperatura de 4°C pelo menos durante vários dias. Para realizar a reacção de hibridação in situ adjL cionou-se um volume igual de uma solução constituída por formamida a 6θ %>, acetato de amónio 4>[, Tris-acetato 0,2 M (pH 7,4), 100 jjg/ml de RNA ribossómico cortado e dimensionado para 50 bases e 5 pg/ml de uma sonda de RNA marcada directamente com fluoresceína, preparada e marcada como se descreveu no Exemplo 1, à suspensão celular, Após incubação à temperatura de 55°C, durante 30 minutos, as células foram aglomeradas por centrifugação a 3 000 rpm numa centrífuga clínica. 0 grânulo celular foi lavado três vezes com HBSS. Na lavagern final ressuspenderam-se as células a cerca de 75 000 células por 0,3 ml. A detecção de formação de híbridos realizou-se após a deposição das células em lâminas de vidro por citocentrifugação.

Adicionou-se uma gota de uma solução a 50/50 (v/v) de glicerol a 100 ^/2 x PBS a cada espécime e colocou-se uma lamela No. 1 sobre as células antes do exame ao microscópio. Pode-se utilizar, alternativamente, um instrumento de fluxo citométr_i co para a detecção da formação de híbridos.

A fluorescência emitida por cada célula cons titui uma indicação do número de moléculas fluorescentes que reagiram ou se ligaram à sonda; a quantidade de sonda que reage nas células é, portanto, visualizada e registada por fotomicroscopia utilizando-se um microscópio de fluorescência Nikon Photophot. Os espécimes foram fotografados em película de alta velocidade (Kodak EES135, PS800/1 600) a 1 600 ASA para uma exposição de 10 segundos e uma amplificação de 400x, utilizando-se associações de filtros-padrão para a transmissão da luz fluorescente.

Apresentam-se os resultados na Figura 9, painéis 1-4. Sabe-se que as células K562 expressam sequências de ácido nucleico de mRNA-alvo que correspondem aos oncogenes c-abl, c-sis e c-myc. A detecção do gene c-abl está representada no painel 1, como luz emitida a partir das células; a detecção do gene c—sis está apresentada no painel 2 e a detecção do gene c-myc no painel 3· 0 painel 4 mostra que o plano de base é negativo quando a sonda é incluída na reacção de hibridação in situ.

2. Sem fixação das células antes do ensaio da hibridação in situ

Para realizar a reacção da hibridação in situ.

adicionou-se a suspensão celular igual volume da solução seguinte: uma solução constituída por etanol a 35 %, formamida a 55 formalina a 5 acetato de amónio 4m, Tris-acetato 0,2 M (pH 7,4), 100yUg/ml de RNA ribossómico dividido e dimensionado para 50 bases e 5 ^Jg/ml de uma sonda de RNA anti-sentido marcada directamente com fluoresceína, preparada e marcada como descrito no Exemplo 1. Após incubação à temperatura de 37°C, durante 20 minutos, aglomeraram-se as células por centrifugação a 3 000 rotações por minuto numa centrífuga clínica. Lavou-se o aglomerado celular três vezes com HBSS.

Na lavagem final ressuspenderam-se as células a cerca de 75 000 células por 0,3 ml. A detecção da formação de híbridos realizou-se após a deposição das células em lâminas de vidro por meio de citocentrifugação. Adicionou-se uma gota de uma solução a 5O/5O (v/v) de glicerol a 100 ^/2 x PBS a cada espé cime e cobriu-se cóm uma lamela No. 1 antes do exame ao micro_s cópio. Pode-se utilizar, alternativamente, para a detecção da formação de híbridos um citómetro de fluxo.

A fluorescência emitida por cada célula cons titui uma indicação do número de moléculas fluorescentes que reagiram com a sonda; a quantidade de sonda que reagiu com as células foi, portanto, visualizada e registada por fotomicros copia utilizando-se um microscópio de fluorescência Nikon Photophot. Fotografaram-se os espécimes com película de alta velocidade (Kodak EES 135, PS 8θθ/ΐ 6θθ) a l600 ASA para uma exposição de 10 segundos e com uma ampliação de 4θθχ, utilizando-se associações de filtros-padrão para a transmissão de luz fluorescente.

Apresentam-se os resultados na Figura 9, painéis 5 a 8. Sabe-se que as céLulas K562 expressam sequências de ácido nucleico de mRNA-alvo que correspondem aos oncogenes c-abl, c-sis e c-myc. A detecção do gene c-abl está representada no painel 5 como a luz emitida pelas células; a dete_c ção do gene c-sis representa-se no painel 6 e a detecção do gene c-myc no painel 7. 0 painel 8 mostra que o plano de fundo é negativo quando não se inclui sonda no ensaio de hibridação in situ.

Exemplo 10

Hibridação in situ de mRNA em células em suspensão: Hibridação de sequências de HIV em células viáveis

Desenvolveram-se separadamente células T provenientes da linha de células H9 (ATCC =|=CRL85^3) que continham a estirpe pBHIO de HIV, a linha de célula K562 e a linha de células HLÓO, em meio constituído por solução salina equilibrada de Hank suplementada com soro de vitela fetal a 10 7· Decorridos três dias após a última mudança de meio, dissemina ram—se as células para uma densidade de 10^ células por 0,3 ml de meio fresco. Decorrida uma hora, agregaram—se as células por meio de uma centrífuga clínica a 3 000 rpm e ressus5 6 penderam-se a uma concentração compreendida entre 10 e 10 células por ml em HBSS isento de soro.

Prepararam-se sondas de RNA de sentido e anti-sentido como se descreveu no Exemplo 1 e marcaram-se com Photobiotin . Em seguida, encapsularam-se as células em vesi58 cuias de lipossomas de fase inversa de evaporação de acordo com o método de Szoka Biochemistry 75 (1978), 419^. Submeteram-se os lipossomas a filtração estéril e guardaram-se a uma temperatura de 4°C durante quatro semanas, antes de se utilizarem .

Para se realizar a reacção de hibridação in situ, adicionaram-se REVs à amostra das células e submeteram-se a uma incubação de 30 ou 6θ minutos à temperatura de 55°C ou 37°C, respeetivamente. Em seguida, centrifugaram-se as células a 3 000 rpm durante 10 minutos. 0 aglomerado de cé_ lulas foi lavado uma vez com HBSS, centrifugado de novo e res suspenso em HBSS suplementado com soro a 10 em seguida, deixou-se prosseguir o desenvolvimento das células à temperatura de 37°C sob uma atmosfera de dióxido de carbono a 5 fi em ar.

Se as sondas que se adicionaram às células reconheceram e se ligaram a um gene celular-alvo específico que corresponde ao vírus HIV, a função deste gene celular-alvo deve ter sido alterada. Para analisar o êxito da ligação com a sonda de uma sequência virai-alvo em uma célula viva, anali— saram-se as propriedades biológicas específicas associadas com a presença do vírus activo numa célula. Os resultados destes ensaios biológicos estão resumidos no Quadro 2. Utilizaram-se células H9 que continham o isolado pBHIO de HIV como controlos positivos (HIV +). Como controlos negativos utilizaram-se células H9, células HLÓO e células K5Ó2 não infectadas (HIV-). Não se observaram diferenças entre as três linhas de células que constituíam os três controlos negativos no que dizia respeito a qualquer das propriedades analisadas. A formação de sincícios foi classificada por exame microscópio ern uma base relativa:-, ausência de sincícios; +, alguns sincícios detectáveis; +++, observação de muitos sincícios.

As alterações na actividade da transcriptase inversa virai foram avaliadas relativamente às células que não receberam sonda. Os antigenes virais HIV foram detectados por imunofluorescência indirecta. Os anticorpos dirigidos para estes antigenes forain fornecidos por Cellular Products, Inc. Prepararam-se RNA e DNA pelo método GuSCN/CsCl. Prepararam-se dot-blots e hibridaram-se com sondas genómicas completas de DNA de cadeia dupla marcadas com P (ds-DNA). As condições de hibridação e lavagem eram suficientemente restritivas para excluírem apenas a detecção de rRNA e de outras sequências retrovirais endógenas humanas. Expuseram-se os filtros as películas durante um período suficiente para detectar sequên cias de cópias individuais. A classificação baseou-se numa escala arbitrária com células HO infectadas como o nível mais alto de controlo (+++).

Os REVs que continham sondas de HIV anti-sen tido estão referidos no Quadro como fármaco.' Os REVs que continham sondas HIV de cadeia de sentido como controlo nega tivo estão referidos no quadro como Fármaco Análogo. Os REVs que não continham sonda estão

Ausência de Fármaco.

referidos no quadro como /

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Quadro 2 resume os resultados que demons tram que o processo de hibridação in situ permite introduzir e provocar a formação de híbridos entre uma sonda e uma sequen cia de mRNA-alvo específico e que a sonda anti-sentido introdu zida inibirá a activade do mRNA-alvo. Estes ensaios biológicos incluíram a inibição da formação de sincícios, a inibição de enzimas e de proteínas virais, bem como a detecção de RNA e DNA virais. A formação de sincícios constitui um processo em que células infectadas por vírus tendem para se aglomerarem conjuntamente em massas muitinucleadas aparentemente muito grandes. A ausência da formação de sincícios nas células tratadas com o fármaco indicou que a sonda era libertada e hibridada com sequências celulares-alvo específicas, bloqueando, portanto, a formação dos sincícios. A enzima transcriptase inversa é uma enzima específica de vírus. Uma diminuição maior do que 99 % da actividade desta enzima nas células infectadas por vírus, acompanhada de ausência de produção de outras proteínas virais, também demonstra o êxito da inibição da expres são do fenótipo virai pela hibridação da sonda de RNA anti-sen tido com o mRNA celular das células infectadas.

Exemplo 11

Hibridação in situ de mRNA de células em suspensão: Hibridação de sequências HIV de células provenientes de doentes infectados com vírus

Diluíram-se 10 ml de sangue humano periférico proveniente de doentes com SIDA, complexo relacionado com a SIDA (ARC) ou indivíduos sero-positivos assintomáticos com

2 ml de HBSS e cobriram—se com uma soluçSo de Ficoll-HypaTM que . Centrifugou-se a amostra para separar as células mono nucleares.

Retiraram-se estas células e colocaram-se em cultura estéril com meio de crescimento constituído por HBSS suplementado com soro humano a 10 % /soro de vitela fetal a 5 Substituiu-se o meio da cultura de três em três dias. Desenvolveram-se as linhas de células K562 e HLÓO em cultura com HBSS que continha soro de vitela fetal a 10 %. Três dias após a última mudança de meio, as células foram disseminadas

- a uma densidade de cerca de 10^ células por 0,3 ml de meio fresco. Decorrida uma hora, aglomeraram-se as células em uma centrífuga clínica a 3 000 rpm e ressuspenderam-se a uma concentração de 10^ a 10^ células por ml em meio HBSS isento de soro.

Prepararam-se sondas de RNA de sentido ou anti-sentido de HIV como descrito no Exemplo 1 e marcaram-se TM com Photobiotin . Encapsularam-se, depois, as sondas em vesículas lipossómicas de fase inversa de evaporação (REVs), de acordo com o método de Szoka, Biochemistry 75 (1978), 4194.

Submeteram-se os lipossomas a filtração estéril e conservaram-se à temperatura de 4°C até quatro semanas, antes de utilização .

Para realizar a reacção de hibridação in situ, adicionaram-se os REVs às amostras de células e incubaram-se durante 30 minutos ou 6θ minutos a 55°O ou a 37°C, respectivamente. Em seguida, aglomeraram-se as células por centri fugação a 3 000 rpm durante 10 minutos. 0 aglomerado celular

foi ressuspenso em HBSS suplementado com soro a 10 ^c'o e deixaram-se as células continuar o seu desenvolvimento.

Quando se adicionam as sondas às células e se ligam a um gene celular específico-alvo nas células que correspondem ao vírus HIV, a função deste gene celular-alvo altera-se. Para determinar o êxito da ligação da sonda com uma sequência viral-alvo em uma célula viva, analisaram-se as propriedades biológicas específicas associadas com a presença de vírus activo na célula. Os resultados destes ensaios biológicos estão resumidos no Quadro 3. Os REVs que continham sondas de HIV anti-sentido estão referidos no Quadro como Fármaco. Os REVs que continham sondas de HIV de cadeia de sentido, cons tituindo o controlo negativo, são referidos no Quadro como Fármaco análogo. Os REVs que não continham sondas estão referidos no Quadro como Ausência de Fármaco. 0 Quadro 3 resume a observação biológica que demonstrou que a presente invenção é capaz de introduzir e provocar a formação de híbridos entre uma sonda e uma sequência de mRNA-alvo específica. Estes ensaios biologicos incluem a observação da formação eventual de sincícios. E porque os vírus relacionados com HIV tendem a inibir a proliferação de células, o aumento da proliferação ce lular com o tratamento pelo Fármaco demonstrou ainda o sucesso da libertação de sondas de RNA e da hibridação com mRNA ein células viáveis. A transcriptase inversa é uma enzima espe cífica de vírus. Uma diminuição superior a 93 $ na actividade desta enzima nas células infectadas por vírus, conjuntamente com a ausência de outras proteínas virais,também demonstra o sucesso de inibição da expressão do fenótipo virai.

A Figura 10 demonstra que as células que nâo contêm as sequências-alvo emparelhadas com as sondas contidas nos REVsnão são alteradas, assim como o seu teor de DNA, pela presente invenção. A Figura 10 representa os resultados de uma mancha de Southern de células K562 tratadas com REVs que contêm sondas de cadeia de sentido (pistas Al e Bl) ou REVs que contêm sondas de cadeia anti-sentido (pistas A2 e B2). A terceira pista em ambas as colunas A e B constitui um controlo positivo conhecido por conter sequências que reagem tan to com as sondas de sentido como com as de anti-sentido. Isso demonstra que a sonda se degradou e não provoca uma modificação no DNA celular quando o REV liberta a sonda em uma célula que nâo contém uma sequência-alvo de emparelhamento.

A Figura 11 demonstra que as células que não contêm sequências-alvo de emparelhamento para a sonda con tida nos REVsnâo são alteradas no seu conteúdo de RNA. No pai^ nel superior (HIV) as células K562 que foram tratadas com a sonda de sentido (pista A) ou com a sonda anti-sentido (pista B) não contêm qualquer novo RNA celular correspondente à sonda ou ao seu parceiro complementar. A terceira pista (C) representa um controlo positivo conhecido por conter sequências que nâo reagem nem com as sondas de cadeia de sentido nem com as de anti-sentido, demonstrando que a sonda está degradada e nâo provoca uma alteração no RNA celular quando o REV liberta a sonda em uma célula que não contém uma sequência-alvo de emparelhamento.

agentes terapêuticos do vírus da SIDA

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Detecção de HIV e de CMV em sangue periférico humano

Exemplo 12

Incubou-se 10 ml de sangue periférico humano proveniente de um doente com sarcoma Kaposis, à temperatura de 37°C,em uma solução de oxalato de amónio a 1,2 $ para lisar os glóbulos vermelhos. Centrifugaram-se os glóbulos brancos a 3 000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga clínica. 0 aglomerado celular foi lavado, em seguida, com 10 ml de PBS e ressuspenso em PBS. Prepararam-se várias réplicas em lâminas por deposição de 50 000 - 100 000 células por meio de citoceri trifugaçâo em lâminas de vidro previamente limpas. Adiciona^ ram-se a estas células 20^dl de solução de hibridação constituída por etanol a 30 formamida a 30 formaldeído a 5 Ί⁰·, cloreto de lítio 0,8 M, Tris-acetato 0,1 M (pH 7,4), 100yjg/ /ml de DNA de peso molecular baixo, Triton X-100 a 0,1 $ e

2,5 yjg/ml de mistura híbrida de quatro sondas de RNA de sentido e anti-sentido de HIV ou uma sonda de RNA anti-sentido

TM de CMV marcada directamente com Pontamine Sky Blue . Preparam-se as sondas como se descreveu no Exemplo 1. Após incuba ção durante 10 minutos à temperatura de 55°C, lavaram-se cui dadosamente os espécimes (l-200 ml por cm de área celular) com 0,1 x SSC contendo Triton X—100 a 0,1 Adicionou-se uma gota de solução a 50/50 (v/v) de glice rol a 100 £/2x PBS a cada espécime. Fotografaram-se os espécimes com película de alta velocidade (Kodak EES135, PS 8θθ/ΐ 6θθ) com uma exposição de 5 segundos num microscópio Leitz com uma ampliação de 400x, utilizando-se uma associação de filtros-padrão para

- í 7

transmissão da luz fluorescente.

A Figura 12 representa no painel BRANCO os resultados quando não se adicionou sonda à solução de hibridação; o painel HIV, quando se adicionaram quatro sondas de HIV de cadeia anti-sentido; o painel SENTIDO, quando se adicionaram quatro sondas de HIV de sentido,e o painel CMV, quando se adicionou uma sonda CMV de anti-sentido. Detectaram-se os dois vírus (HIV e CMV) associados â infecção no sarcoma de Kaposis por uma hibridaçâo in situ em uma fase da presente invenção.

Exemplo 13

Detecção de oncogenes na linha de células K5Ó2

Desenvolveram-se células K562 (ATCC CCL243) em meio HBSS suplementadas com soro de vitela fetal a 10 $>.

Uma hora depois da mudança de meio, prepararam-se várias répli^ cas de lâminas por deposição de 50 000-100 000 células numa lâmina por citocentrifugação. Adicionaram-se a estas células 20 ^/ul de solução de hibridaçâo constituída por etanol a 20 formamida a 30 %, formaldeido a 5%, cloreto de lítio 0,8 M, Tris-acetato 0,1 M (pH 7,^), 100 ,/ig/ml 8e DNA de peso molecular baixo, Triton X-100 a 0,1 % e 2,5 yug/ml de uma sonda de

RNA anti-sentido c—myc, c—sis ou c-abl marcada directamente TM com Pontamine Sky Blue ‘ . Preparam-se as sondas como se descreveu no Exemplo 1. Após incubação durante 10 minutos à temperatura de 55°C, lavaram-se cuidadosamente os espécimes (l2 χ \

-200 ml por cm de area celular) com 0,1 x SSC que continha Triton X-100 a 0,1 $. Adi cionou-se uma gota de uma solução a

1

50/50 (v/v) de glicerol a 100 7/2 x PBS a cada espé cime e colo cou-se uma lamela N? 1 sobre as células antes do exame ao microscópio. Obtiveram-se fotografias como se descreveu no Exem pio 12.

A Figura 13, Painel D, representa os resultados de uma solução de hibridação quando não se adicionou sonda o painel A, quando se adicionou uma sonda anti-sentido c-abl; o painel C, quando se adicionou uma sonda anti-sentido c-myc e o painel B, quando se adicionou uma sonda anti-sentido c-sis 0 processo de hibridação in situ em uma fase da presente invenção detectou três oncogenes conhecidos por se exprimirem nesta linha de células. 0 painel D representa o controlo negativo e constitui o branco.

Um especialista na matéria compreenderá facilmente que a presente invenção é bem adaptada à realização dos seus objectivos e a obtenção das finalidades e das vantagens referidas, assim como os que lhes são inerentes. Os componentes, métodos, processos e técnicas descritos são presentemente representativos de aspectos preferidos e são conside rados como exemplificativos e não como limitativos do âmbito da presente invenção. Aos especialistas na matéria ocorrerão alterações e outras utilizações, as quais estão abrangidas pelo espírito da presente invenção e estão definidas pelo âmbito das reivindicações apensas.

Claims (18)

1. RE IVINDICAÇÕES

   1. - Método para analisar biopolímeros que permite detectar pelo menos entre 1 a 5 biopolímeros por célula em uma amostra com membranas substancialmente intactas, caracterizado pelo facto:

   de se fazer contactar, sob condições de hibridação a amostra referida antes com um meio contendo um agente de precipitação, um agente reticulante, um agente de desnaturação, um agente de estabilização de híbridos, um agente tampão, um agente de formação de poros em membrana selectivo e pelo menos uma sonda nucleotídica pelo menos substancíalmente complementar de uma sequência nucleotídica específica a detectar;

   de se incubar a amostra citada antes com esse meio na presença de pelo menos um marcador emissor de energia; e de se detectar por meio desse marcador a formação de duplex.
2. 2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se ligar o marcador citado antes à sonda também citada antes.
3. 3. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar o marcador citado antes após a formação completa de duplex.
4. 4.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o marcador citado antes no grupo constituido por marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, marcadores enzimáticos e radiomarcadores.

   5.- - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se escolher o marcador referido antes, entre avidina e estreptavidina. 6.- - Método de acordo com a reivindicação 1,

   caracterizado pelo facto de se escolher o agente de precipitação citado antes no grupo constituido por etanol, metanol, acetona, formaldeído e suas associações.
5. 7, - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o agente reticulante, citado antes no grupo constituido por paraformaldeido, formaldeído, suberimidato de dimetilo e etildimetil-amino-propilcarbodiimida.
6. 8. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o agente de desnaturação citado antes no grupo constituído por formamida, ureia, iodeto de sódio, tiorianato, guanidina, perclorato, tricloroacetato e tetrametil-amina.

   -719.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o agente de estabilização de híbrido citado antes, no grupo constituído por cloreto de sódio, cloreto de lítio, cloreto de magnésio, sulfato férrico e acetato de amónio.
7. 10 .-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o agente de formação de poros no grupo constituído por éter laurílico 23, éter cetílico 20, octilfenoxipolietoxietanol, sulfonato de [3—(3— -colamidopropil)-dimetilamónio]-l-propano, desoxicolato e sulfato de dodecilo.
8. 11 .-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o biopolímero ser RNA.
9. 12 .-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o biopolímero ser DNA.
10. 13 .-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o biopolímero ser um antigénio.
11. 14.-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de analisarem dois biopolímeros simultaneamente na mesma amostra.

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    -7215 .-Método de acordo com. a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de pelo menos um biopolímero ser um polinucleótido e um segundo biopolímero ser um antigénio.

    16. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo : facto de se utilizar uma temperatura compreendida entre 15 °C e 80°C. 17. - Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo 3 facto de se utilizar uma temperatura compreendida entre 50 °C e 55°C. 18. - Método de acordo com a reivindicação 1,

    caracterizado pelo facto de se completar em cerca de 4 horas.
12. 19 .-Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o biopolímero citado antes no grupo constituído por um RNA, um DNA, um gene virai, um oncogene e um antigénio.

    20 . - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o biopolímero citado antes ser oncogene. 21. - Método de acordo com a reivindicação 1,

    caracterizado pelo facto de o biopolímero citado antes ser um vírus.

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    -7322,-Processo para analisar a presença de um biopolímero em uma amostra celular suspeita, caracterizado pelo facto de se utilizar um conjunto ou estojo constituído por uma solução de hibridação contendo um agente de precipitação, agente reticulante, um agente de desnaturação, um agente de estabilização de híbrido, um agente tampão e um agente de formação de poros de membrana selectivo.
13. 23 .-Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de o conjunto ou estojo também incluir uma sonda seleccionada de forma a hibridar com o biopolímero suspeito, citado antes, se pretende, para formar um complexo de hibridação.
14. 24 .-Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o conjunto ou estojo também conter meios para se fazer contactar a sonda, citada antes, com a amostra suspeita, também citada antes, para formar o complexo de hibridação e meios para se avaliar a presença e/ou a extensão da presença dessa sonda marcada.
15. 25 .-Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o conjunto ou estojo incluir a sonda, citada antes, marcada de uma forma detectável.
16. 26.- P rocesso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o conjunto ou estojo incluir ainda um marcador detectável capaz de detectar a formação de um híbrido.
17. 27.-Processo para analisar a presença de um biopolímero em uma amostra celular suspeita, caracterizado pelo facto de se utilizar um conjunto ou estojo constituído por uma solução de hibridação contendo 30 % de etanol, 30 % de formamida, 5 % de formaldeído, 0,8 M LiCl, 0,1M Tris-acetato, pH 7,4, 0,1 % de octilfenoxipolietoxietanol, 50 pg/ml de RNA ribossómico cortado e dimensionado para 50 bases e 2,5 ug/ml de uma sonda de cadeia simples marcada directamente com uma molécula referenciadora fluorescente.
18. 28 .-Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o conjunto ou estojo incluir também como suprimento, uma sonda escolhida por forma a hibridar com o biopolímero suspeito, citado antes, se presente, para formar um complexo de hibridação.

    29 . - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de a sonda citada antes ser marcada de um modo detectável. 30 . - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de se utilizar um conjunto ou estojo

    que inclui também um marcador detectável capaz de detectar a formação de híbridos.

    um

    -7531 .-Método de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de se detectar a formação de híbrido quantitativamente.