PT91411B - Processo para a producao melhorada de metabolitos secundarios usando genes biossinteticos agrupados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 91411

REQUERENTE:

G1ST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1,2611 XT Delft, Países Baixos.

EPÍGRAFE:

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE METABOLITOS SECUNDÁRIOS USANDO GENES BIOSSINTÉTICOS AGRUPADOS”

INVENTORES:

Martinus Antonius Mathilda Groenen, Annemarie Eveline Veenstra, Pieter Van Solingen, Bertus Pieter Koekman, Lucia Helena Maria Van Der Voort, Juan Francisco Martin, Santiago Gutierrez, Bruno Diez, Emílio Alvarez, José Luis Barredo e Christiana Esmahan.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Patente Europeia em 11 de Agosto de 1988 e em 21 de Abril de 1989, sob os N°s. 88201714.8 e 89201044.8, respectivamente.

INPI. MOO. 113 R F 18732

Descrição referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2611 XT Delft, Países Baixos, (inventores: Martinus Antonius Ma_ thilda GROEEN , Annemarie Eveli. ne VEENSTRA, Pieter VAN SOLINGEN, Bertus Pieter KOEMAN e Lu_ cia Helena Maria VAN DER VOORT, residentes na Holanda e Juan Francisco MARTIN, Santiago GUTIERREZ, Bruno DIEZ, Emilio AL. VAREZ, José Luis BARREDO e Christiana Esmahan residentes na Espanha, para PROCESSO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE METABOLITOS SECUNDÁRIOS USANDO

GENES BIOSSINTÉTICOS AGRUPADOS

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE METABOLITOS SECUNDÁRIOS USANDO GENES BIOSSINTÉTICOS AGRUPADOS

INTRODUÇÃO

Domínio Técnico domínio da presente invenção diz respeito ao isolamento e à utilização de genes biossintéticos reunidos em aglomerados para a produção de metabolitos secundários .

Antecedentes e literatura relevante

Como resultado dos melhoramentos na estirpe clássica, a produção de penicilina aumentou enormemen. te nas ultimas quatro décadas. Estes melhoramentos da estirpe clássica foram inicialmente baseados em tratamentos mutagénicos aleatórios de Penicillium chrysogenum e selecçao subsequen_ te dos mutantes que produzem mais penicilina. 0 desenvolvimen to de técnicas de clonagem contudo introduziu uma nova ferramenta potencialmente mais poderosa para uma melhoria adicional da produção de penicilina neste fungo.

A penicilina é produzida pelo fungo filamentoso £. chrysogenum em várias fases enzimáticas (por exemplo E. Alvarez et al., Antimicrob. Agents Chemother. 3 1 (1987) pp. 1675-1682). Estas fases sao apresentadas na Figura 1. Ao longo da presente memória descritiva entende-se por genes directamente envolvidos na via biossintética, aqueles genes que codificam para as enzimas activas em várias fases que conduzem à produção de um metabolito secundário. Deste modo, no caso da produção de penicilina G ou V, os genes que codifi_ cam para as enzimas estão representados na Figura 1. A prime i_ ra reacçao é a formaçao do tripeptídeo _c ^f-(L-<T-aminoadipil)-L- cisteinil-D-valina a partir de ácido K-amino-adípico, cisteína e valina. A enzima que é responsável por esta reacçao e a sintetase de ACV (daqui em diante referida como ACVS), uma enzima multifuncional de grande dimensão. 0 tripeptídeo e ciclizado pela acçao da sintetase de isopenicilina N (daqui em diante referida como IPNS) ou da ciclase. 0 produto de reacçao é a isopenicilina N, um composto que contém a estrutura de anel de ^-lactama tipica e que possui actividade antibacteriana. A fase final na formaçao de penicilina consiste na troca da cadeia lateral do ácido TÍ-aminoadípico da isopenicilina N por uma cadeia lateral mais hidrofóbica. As cadeias laterais hidrofóbicas geralmente usadas na produção industrial sao quer o ácido fenilacético, dando como resultado a penicilina G, quer o ácido fenoxiacético, dando como resultado a penicilina V. Foi sugerido que a troca da cadeia lateral era uma

reacçao catalisada por uma única enzima (A.L. Demain (1983) in: A.L. Demain e N.A. Solomon (ed), Antibiotics containing the (3-lactam structure I. Springer Verlag, Berlin; pp. 189-228). Contudo, e também possível uma reacçao de duas fases que envolve o 6-APA como intermediário (E. Alvarez et al. , vi. de supra). A enzima que foi identificada como estando envolvi da na reacçao final é a acilCoA;6-APA-aci1transferase (daqui em diante referida como AT; esta enzima foi purificada até à homogeneidade (E. Alvarez et al., vide supra). 0 envolvimento duma segunda enzima, catalisando a transformaçao de IPN em 6- +

-APA, nao pode ainda ser confirmada nem excluída.

Nao é claro se uma ou mais reacçoes enzimáticas limitam a velocidade no processo da biossíntese da penicilina e se assim fôr, quais as fases enzimáticas que estão envolvidas.

Uma vez que a via biossintética da penicilina começa com três ácidos aminados, os quais cada um por sua vez participam em outras vias metabólicas, as fases reguladoras nessas vias irao também influenciar a biossíntese da penicilina. Por outro lado, a produção de penicilina e sujeita a um complexo mecanismo de repressão catabolica das fon. tes de carbono e à regulaçao da fonte de azoto (J.F. Martin ¹ et a 1 . In: H. Kleinkauf, H. von Dhren, H. Donnauer and G Nese. i! man (eds), Regulation of secondary metbolite formation. VCH

Ver1aggese11schaft, Weinheim (1985), pp. 41-75). Podem também estar envolvidas neste tipo de regulaçao proteínas reguladoras. Estas proteínas reguladoras e as proteínas reguladas por elas, sao definidas como estando indirectamente envolvidas na via biossintética de um metabolito secundário, neste caso a penicilina .

Até recentemente, apenas tinha sido clonado e sequenciado o gene de uma so das enzimas activas na via biossintética para a penicilina G, a sintetase de isopenji cilina N (IPNS) ou ciclase (L.G. Carr et al., Gene 48 (1986) pp. 257-266), usando o gene correspondente de Acremonium chry sogenum (S.M, Samson et al. Nature 318 (1985) pp. 191-194).

Este gene foi clonado e identificado purificando a proteína IPNS, determinando a sequência de ácidos aminados amino-term nal, preparando um conjunto de oligodesoxirribonucleótidos de acordo com esta sequência e sondando um banco genómico de cos_ mideos com estes oligodeoxyribonucleótidos misturados (S.M. Samson, vide supra).

Os genes isolados que codificam para a IPNS tanto de Penicillium chrysogenum como de Acremonium chrysogenum têm sido usados para melhoramento das estirpes.

Em Penicillium chrysogenum demonstrou-se uma actividade enzimática melhorada; contudo nao se encontrou qualquer estimulação da biossíntese de penicilina (P.L. Skatrud et al . , Póster presentation 1987 Annual meeting of Society of Industrial Microbiology, Baltimore, August 1987, resumo publicado in SIM News 37 (1987) pp. 77). Em Acremonium chrysogenum têm sido ob_ tidos resultados semelhantes (J.L. Chapman et al , (1987), in: Developments in Industrial Microbiology, Vol 27 G. Pierce (ed), Society of Industrial Microbiology; S.W. Queener , 4th ASM conference on the Genetics and Molecular Biology of Indus_ trial Microorganisms, Bloomington, Outubro de 1988, as actas serão publicadas em 1988).

Por conseguinte, até agora nao tinha sido obtida qualquer evidencia de que o gene de IONS pudesse ser usado para obter um aumento na produção de penicilina ou de cefalosporina por ampliaçao de genes.

Foi descrito que a biossintese dos antibióticos de í3-lactama é submetida a repressão pela glucose (J.F. Martin e P. Liras, TIBS 3_ ( 1985), pp. 39-44). Esta repressão pela glucose foi inequivocamente estabelecida para a formaçao do tripeptídeo pelo ACVS e para a actividade dos IPNS (Revilla et al., J. Bact. 168 (1986). Para a aciltransfe rase, por outro lado, os dados sao menos convincentes. Revilla et al (vide supra) referem que a AT nao é submetida a repressão pela glucose, mas outros dados sugerem que a actibidade de AT está ausente, ou pelo menos diminuída, na presença da

glucose (B. Spencer e T. Maung, Proc. Biochem. Soc. 1970, pp. 29-30).

Nao se conhece em que fase da expres. sao é exercida a repressão pela glucose; esta repressão tanto se pode dar no nível da transcrição como no nivel da traduçao. Se se aplica a primeira regulaçao, as diferenças em níveis de RNAm entra as culturas que produzem e as que nao produzem podem ser utilizadas para isolar os referidos genes implicados na biossintese da penicilina. Este método para o isolamento de genes implicados na biossintese de metabolitos secundários e o objecto do nosso pedido de patente que aguarda aprovaçao intitulado Processo para a identificação e de utilização de genes biossintéticos ou de regulaçao para a produção melhorada de metabolitos secundários depositado no mesmo dia que o pedido presente e que e aqui dado como reproduzido.

A reunião em aglomerados de genes da biossintese de antibióticos foi descrita para Streptomycetes. Alguns exemplos consistem na reunião em aglomerados de genes implicados na biossintese de actinohodina por S_. coelicolor (F. Malpartida e D.A. Hopwood, 1984, Nature 309 , 462-464) ou na biossintese de tetracenomicina C por S.. glaucescens (H. M_o tamedi and C.R. Hutchinson, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 84, 4445-4449).

Nos fungos, a organizaçao genetica dos genes da biossintese de β-lactamas têm sido investigada por análise genética de mutantes danificados na biossintese da penicilina. Em Aspergillus nidulans, foram identificados quatro locais que estavam aplicados na biossintese da penicilina (npe A, B, C e D); estes locais foram posicionados em quatro diferentes grupos de ligaçao (isto é cromossomas), v i z . VI, IV, III, e II, respectivamente (J.F. Makins et al., 1980, Advances in Biotechnology 51-60; J.F. Makins et al , 1983,

Journal of General Microbiology 129, 3027-3033). Em Penicillium chrysogenum foram identificados cinco locais (npe V, W,

X, Y e Z); estes locais foram posicionados em três grupos de ligaçao, viz. I (npe W, Y, Z) e dois outros que contem npe V e npe X, respectivamente (P.J.M. Normansell et al, 1979, Jour

nal of General Microbiol. 112, 113-126; J.F. Makins et al , 1980, vide supra). Verificou-se que as mutações que afectam a anzima do fecho do anel (IPNS ou ciclase; npe; W) e a enzima da permuta da cadeia lateral (aciltranferase , npe V) estão em grupos de ligaçao separados. Deste modo, os dados genéticos preveem que pelo menos alguns dos genes da biossíntese estejam espalhados sobre os genomas fúngicos, e a reúniao em agl£ merados de por exemplo os genes de ciclase e de aciltransfera se nao é definitivamente de prever com base nestes dados.

RESUMO DA INVENÇÃO

Apresentam-se genes aglomerados da biossíntese de antibióticos. Estes genes aglomerados sao utilizados com vantagem para a melhoria da produção de antibióti^ cos em microorganismos e para o isolamento de outros genes ini plicados na biossíntese de antibióticos. A invenção é exempli. ficada com a produção melhorada de penicilina em Penicillium chrysogenum, com o isolamento de outro(s) gene(s) biossinteti_ cos aglomerados e com a expressão de genes da biossíntese de penicilina aglomerados Acremonium chrysogenum.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Figura 1

A via biossintética para a penicilina G ou V em £. chrysogenum é apresentada esquematicamente.

Figura 2

Mapa fisico dos clones lambda G2 e B21 que contêm o aglomerado dos genes QlPNS com AT].

E = EcoRI; B = BamHI; H = HindIII; S = Sail; Sa = Saci;

Sp = Sphl; P = PstI; X = Xhol; Xb = Xbal; Hp = Hpal;

N = Ncol e Bg = Bgill [WWWWWl = braço direito do bacteriófago lambda EMBL3 (9 kb) _I = braço esquerdo do bacteriófago lambda EMBL 3 (20,3 kb)

Figura 3

Sequência nucleotídica e sequência deduzida de ácidos amilados do gene de aciltransferase de chrysogenum.

Figura 4

cional	do	vector	de	Um clonagei	total de restrição	e	um mapa	f un-
m cosmídeo	, pPSO7 .
Figura	5
				Um	local de	restrição	e	um mapa	f un-
cional	de	pPS47 .
Figura	6
				Um	local de	restrição	e	um mapa	f un-
cional	de	pGJOl A	e	B.
Figura	7
				Um	local de	restrição	e	um mapa	f u n-
cional	de	pGJO2 A	e	B.
Figura	8
				Um	local de	restrição	e	um mapa	f un-

cional do cosmídeo HM193 (nem todos os locais presentes estão indicados neste mapa, a linha a tracejado indica uma região menos bem caracterizada).

Figura 9

Representação gráfica da produção de penicilina por hospedeiros transformados quer com pPS47 (L////Z?) quer com pGJO2 A (Ç\ \ \ \ ~]) .

DESCRIÇÃO DAS FORMAS ESPECIFICAS DE CONCRETIZAÇÃO

De acordo com a presente invenção, identificam-se fragmentos de ADN que incluem sequências que sao monocistrónicas ou policistrónicas. De genes(s) codifica- 7 do(s) pelas sequências sao traduzidos em enzimas relacionadas com a produção de metabolitos secundários ou de outros produtos de interesse comercial. Estas sequências de interesse sao identificadas por comparaçao com sequências de ARN isoladas de um organismo competente para produzir o metabolito secunda rio, no qual os genes de interesse sao activamente expressos, e um microorganismo no qual a expressão é silenciosa. Deste modo e possivel obter fragmentos de ADN que codificam um ou mais genes que sao expressos diferencialmente e que estão envolvidos na formaçao de um produto de interesse comercial.

termo expresso diferencialmente é usado através da sua aplicaçao para expressão do gene ou dos genes de interesse que sao especificamente activos somente sob certas condiçoes definidas e que está ausente (o que significa na presente memória descritiva estar presente a um bají xo nível de 5% ou inferior comparado com a fase activa) sob outras condiçoes igualmente bem definidas.

A ausência de expressão pode ser resultado de repressão ou da falta de indução da expressão do gene, de mutaçao ou de outros acontecimentos que têm como resultado o silêncio da transcrição do gene(s) de interesse. 0 ADN que é isolado pode resultar de uma selecçao a partir de um banco de genes, quer seja de um banco genómica quer um ban co que contém ADNc contido por exemplo num vector lambda ou num vector de clonagem cosmídico ou num vector de expressão. Pelo emprego de uma sonda de ADNc enriquecida por sequências expressas durante a biossintese de metabolitos secundários, podem ser identificados híbrido positivos no banco para mani pulaçao subsequente a fim de permitir a preparaçao de constru. çoes de expressão para as enzima(s) associadas com a produção do metabolito secundário. Por conseguinte procede-se a uma busca num banco de genes de um microorganismo usando duas sori das de ADNc, uma das quais é enriquecida em sequências do estado activo de transcrição e a outra e derivada da situaçao de silêncio de transcrição. Por comparaçao e subtracçao, e possivel isolar os clones que contêm gene(s) que sao activamente expressos somente sob as condiçoes activas definidas.

método é exemplificado pelo isolamento de genes envolvido na biossíntese de um metabolito secundário, mais especificamente de penicilina, usando duas soji das de ADNc, a partir de micélio cultivado em lactose (produtor) e micélio cultivado em glucose (nao produtor).

Pela aplicaçao do referido método, surpreendentemente, os genes da biossíntese de penicilina aglo. merados, que codificam para a ciclase e para a aciltransferase foram isolados a partir de P.· chrysogenum (cf. o nosso pedido de depositado simultaneamente, vide supra). Esta informa, çao pode ser usada vantajosamente no isolamento de outros genes a partir da referida via biossintética de antibióticos pje la aplicaçao da técnica de movimentação conhecida na especialidade. Este útimo método encontra uma utilização particular nos casos em que os genes de interesse nao estão expressos di. ferencialmente, em que a enzima codificada pelo gene resiste à purificação que é necessária para o isolamento do gene pelo método genética inversa ou em que outros métodos conhecidos na especialidade de isolamento de genes nao conseguem produzir o gene que interessa.

A expressão reunião em aglomerados e usada ao longo do presente pedido de patente para a presença de dois ou mais genes com uma função relacionada (por exemplo envolvimento numa via biossintética de um metabolito secundário) num fragmento de ADN que e clonável num vector de clonagem cosmídeo, nao estando presentes outros genes nao relacionados entre eles.

referido aglomerado pode representar a situaçao natural ou, num outro aspecto da presente invenção, pode ser introduzido artificialmente por combinação de dois ou mais genes relacionados num fragmento de ADN, usari do técnicas conhecidas na especialidade.

A aplicaçao com sucesso do uso dos aglomerados de genes da biossíntese de penicilina para o isolamento de outros genes da biossíntese de penicilina sao aqui exemplificados pelo isolamento por deslocação do gene que codifica para a sintetase de ACV.

Para além disso, a reunião em aglome rados de genes da biossintese de penicilina foi usada vantajo. samente para a amplificaçao dos genes da ciclase e da aciltransferase em .P . chrysogenum, dando como resultado um aumento de produção de penicilina.

As sequências de ADN identificadas devem conter pelo menos um gene, de preferência dois ou mais genes, que codificam para uma enzima de biossintese de antibiótico e/ou uma proteina reguladora da via biossintética com. pleta, ou mais geralmente qualquer proteína que se encontra implicada de qualquer modo, quer positivo quer negativo, na biossintese do referido antibiótico.

As construções que actuam positivamente, quando devidamente introduzidos num microorganismo hos. pedeiro adequado, aumentam a eficiência das vias biossintéticas operativas na produção de microorganismos que produzem $lactamas por aumento da dosagem do gene ou por expressão mais elevada do gene. Por outro lado, podem ser isoladas construções que têm um efeito negativo na produção de antibiótico (p.e. formaçao de produtos secundários). Estas construções sao utilizados para inactivar o gene que actua negativamente por substituição do gene ou por outros métodos com efeito semelhante. Ambas as utilizações dao como resultado rendimentos mais elevados do antibiótico pretendido durante a produção in_ dustrial. Este método é exemplificado por microorganismos que produzem β-lactama para a produção de antibióticos, particularmente penicilinas, e encontra particular aplicaçao nestes casos. De preferência, o bloco integrado de expressão (cassje te4 de expressão) incluirá genes que codificam para enzimas que catalizam fases que limitam a velocidade ou genes que codificam para proteínas reguladoras para a indução de transcri. çao ou quaisquer outros.

método exposto para alem disso pro_ porciona sequências para as quais o produto codificado nao e conhecido, mas verifica-se que a sequência proporciona uma me. lhoria do rendimento de um produto pretendido. Estas sequências sao referidas como genes crípticos, o que significa se

quências que se podem obter por métodos de isolamento aqui descritos, sequências estas que abrangem genes para os quais nao é ainda atribuível qualquer função conhecida. Estes genes sao caracterizados por serem doseados e/ou expressos em quantidades mais elevadas nos microorganismos hospedeiros transformados em comparaçao com os seus hospedeiros nao transforma, dos. Para além dos genes crípticos, da IPNS e da aciltransferase, do nosso pedido de patente depositado simultaneamente (vide supra), a presente invenção proporciona o gene que codi. fica para a primeira enzima da via biossintética de penicilina, cefalosporina e cefamicina, nomeadamente a sintetase de J-( L-cX-aminoadipil )-L-cisteinil-D-valina , referida seguidamen. te na presente memória descritiva como ACVS.

No referido pedido de patente deposi^ tado simultaneamente mostrou-se que um gene críptico denomina do Y proporciona uma melhoria na biossíntese da penicilina. A presente invenção proporciona um aumento de produção de penicilina pela amplificaçao do aglomerado dos genes de IPNS e de AT .

Os microorganismos utilizados na pre sente invenção incluem tanto procariontes como eucariontes, incluindo bactérias, tais como as pertencentes ao grupo taxonómico dos Actinomycetes ou dos Flavobacterium, ou fungos (i n. cluindo leveduras), pertencentes aos géneros Aspergillus , A_cremonium ou Penicillium.

Em dependência da origem dos fragmeji tos, é possível construir vários blocos integrados de expressão, quer genómicos ou de ADNc , quer procarióticos ou eucario ticos. Com ADN genómico ou de uma bactéria, o fragmento que contém uma região de codificação monocistronica ou policistro nica pode incluir a sua própria região de regulaçao de inicio de transcrição bem como uma região de terminação de transcrição e sinais de traduçao apropriados, por exemplo uma sequência de Shine-Delgarno e codoes de paragem. Quando o ADN genó. mico é de um fungo, normalmente apenas um gene esta associado com uma região de regulaçao de início de transcrição, de tal modo que cada gene possui a sua própria região de regulaçao do início de transcrição independente. Quando se utiliza ADNc, e necessário proporcionar uma região de regulaçao de início de transcrição apropriada, dependendo do organismo hospedeiro usado para a expressão subsequente.

Os genes de interesse podem ser obti dos aleatoriamente a partir de um banco de genes (por exemplo, um banco genómico ou de ADNc) de uma estirpe que produz í -lac. tamas com elevado rendimento ou do seu antepassado de tipo selvagem, ou podem ser seleccionados de entre o subconjunto que contém genes que podem ser limitadores de velocidade na biossíntese de antibiótico. Genes especialmente valiosos incluem os genes que sao expressos especificamente durante a biossíntese de antibióticos, incluindo os genes que codificam para enzimas biossintéticas de /--lactamas conhecidas na especialidade, por exemplo sintetase de tripeptídeo (ACVS), cicia se (IPNS), aciltransferase (AT), epimerase, expandase, hidroxilase, transacetilase, transcarbamoilase e metoxilase. De preferência doseiam-se ou expressam-se genes em elevadas quaii tidades que codificam tanto para a sintetase de isopenicilina N como para a aciltransferase, dando como resultado elevados rendimentos do antibiótico pretendido no fungo transformado.

Sera de interesse para os especialis tas na matéria que o gene(s) a serem expressos num hospedeiro que produz uma f^-lactama possam conter a sua própria sequência de promotor nativa que é reconhecida por uma polimerase de ARN da célula hospedeira, ou possam ser ligados a qualquer ojj tro promotor adequado, p.e. o de um gene biossintético de ílactama diferente ou o de um gene glicolítico tal como quinase de fosfoglicerato, deidrogenase de fosfato de gliceraldeido, isomerase de fosfato ou a do factor de elongaçao de trans. lacçao, Ef-Tu, ou similares.

Um tai promotor pode ser utilizado para influenciar a regulaçao da expressão de um ou de vários genes que codificam para as referidas enzimas. Isto conduzira a uma produção aumentada do antibiótico depois da transformação, uma vez que a produção da penicilina e agora possível sob condiçoes em que na estirpe de hospedeiro nao transforma12 da nao levam a produção de penicilina, por exemplo, enzimas glicoliticos sao expressas na presença de glucose, enquanto a produção de penicilina, por outro lado, é reprimida na presen, ça de glucose (J.F. Martin, vide supra). Submetendo a expressão dos genes biossintéticos da penicilina à regulaçao de um promotor de um gene glicolítico, os genes podem também ser ex. pressos na presença da glucose e deste modo a penicilina pode ser produzida mais cedo na fermentação, quando uma alta concentração de glucose é necessária para a produção de uma quan tidade suficiente de micélio. Também o marcador de selecçao pode ser mantido sob a regulaçao deste promotor.

Para a transformaçao de Penicillium, empregam-se construções que incluem pelo menos um marcador pa. ra a selecçao de células transformadas e, de preferência, para reforçar a conservação do ADN integrado. Contudo, de prefe. rência o vector inclui uma sequência de ADN conhecida por aumentar a eficiência de transformaçao. Um exemplo de uma sequên cia de ADN com esta propriedade é o elemento ans, isolado a partir de Aspergillus nidulans (cf. Ballance and Tutner, Gene 36 (1985) pp. 321-331). 0 nosso pedido de patente depositado simultaneamente (vide supra) proporciona uma sequência de ADN, isolada a partir de um genoma de .P. chrysogenum, que foi iden. tificada como uma sequência com um efeito semelhante ao efeito da sequência ans. Uma vez que esta sequência e nativa em relaçao a .P. chrysogenum, pode ser usada para aumentar as e f i. ciências de transformaçao em P. chrysogenum. A sequência de ADN abrange o gene pyrG de _P. chrysogenum e pode ser usado quer isoladamente, em combinação com um hospedeiro de pyrG , caso este em que a citada sequência de ADN proporciona tanto a selecçao de transformantes como o efeito de aumento da transformação (cf. EP-A-260762), quer em combinação com um outro marcador de selecçao, por exemplo um gene que codifica para resistência a uma biocida, tal como fleomicina. Neste ultimo caso a selecçao de transformantes e o efeito de realce da transformaçao sao proporcionados por duas sequências separadas de ADN e a unica função do elemento pyrG e de relçar as frequências de transformaçao.

Marcadores úteis para a selecçao de clones de transformantes podem ser genes biossintéticos homólogos ou heterólogos capazes de complementar uma necessidade auxotrifica da célula hospedeira, causada por um desfeito na via metabólica para um ácido aminado, por exemplo arginina, para um precursor de um nucleótido, por exemplo uracilo, e si. milares.

gene estrutural que proporciona o marcador para selecçao pode ser nativo em relaçao ao hospedei^ ro Penicillium de tipo selvagem ou um gene estrutural heterólogo que é funcional no hospedeiro. Por exemplo, genes estruturais que codificam para uma enzima numa via metabólica podem ser derivados de Penicillium ou de outros fungos filamentosos, por exemplo Aspergillus, Neurospora, Podospora, ou de leveduras, em que o gene estrutural é funcional no hospedeiro Penicillium e complementa a auxotrofia para prototrofia.

gene estrutural complementar pode ser derivado de uma via metabílica, tal como a sintese de purinas ou de piramidinas (nucleosidos) ou de ácidos aminados.

De interesse particular sao os genes estruturais que codificam para enzimas na via da pirimidina, por exemplo o gene que codifica para a enzima descarboxilase de orotidina-5'-fosfato (pyr4). Outros genes de interesse sao os genes biossintéticos de ácidos aminados, por exemplo transferase de ornitina-carba_ moílo (ar q B) e liase de arginino-succinato (ar q4 ) . 0 uso dos marcadores de selecçao anteriormente referidos e proporcionado por EP-A-260762.

Em vez de marcadores auxotroficos, podem ser usados marcadores de fermentação, tais como a capacidade do uso de amidas como unica fonte de carbono ou de azo. to, a cultura em vários açúcares, por exemplo em galactose, ou semelhantes .

Para além disso, podem ser usados os genes que codificam para a resistência a biocidas, tais como higromicina, gentamicina, fleomicina, glifosato, bialafos, e similares.

Sao proporcionadas construções que

-14contêm a sequência de interesse e que pode incluir outras fun^ çoes, tais como sistemas de replicaçao em um ou em vários hos_ pedeiros, por exemplo em hospedeiros de clonagem e/ou hospedeiros alvo para expressão do metabolito secundário; um ou mais marcadores para selecçao em um ou em vários hospedeiros, como indicado acima; genes que realçam a eficiência da transformação; ou outra função especializada.

A construção conterá pelo menos um gene, de prefeência dois ou mais genes. A construção pode ser preparada pelos meios convencionais isolando outros genes pr£ tendidos dum hospedeiro adequado, sintetizando todos ou alguns dos genes ou as suas combinações. De modo semelhante os sinais de regulaçao, as regiões de início de transcrição e de traduao e as regiões de terminação podem ser isoladas de uma fonte natural, podem ser sintetizados ou podem ser obtidas por combinações destes métodos. Os vários fragmentos podem ser subme tidos a digestão por endonucleases (restrição), a ligaçao, a mutagénese in vitro, a reparaçao por iniciadores ou a técnicas semelhante. As varias manipulações sao bem conhecidas na literatura e podem ser utilizadas para atingir fins específicos .

Os vários fragmentos podem ser combi_ nados, clonados, isolados e sequênciados de acordo com as téc. nicas convencionais. Depois de cada manipulaçao o fragmento de ADN ou a combinação de fragmentos podem ser inseridos no vector de clonagem, o vector pode ser transformado num hospedeiro de clonagem, por exemplo em E.. coli, o do hospedeiro de clonagem pode ser cultivado e lisado, o plasmídeo pode ser isolado e o fragmento pode ser analizado por análise de restri. çao ou por sequênciaçao , suas combinações ou por operaçoes si. milares. 0 E. coli pode também ser usado como hospedeiro para a expressão de genes de interesse com o objectivo de produzir elevadas quantidades de proteína.

Podem ser utilizados vários vectores durante o decurso do desenvolvimento e a transformaçao da célula hospedeira. Estes vectores podem incluir vectores de cio. nagem, vectores de expressão e vectores que proporcionam a in.

tegraçao no hospedeiro ou o uso de ADN simples para transformação e integração.

vector de clonagem será caracterizado, na sua maior parte, por um marcador para selecçao de um hospedeiro que contém o vector de clonagem e opcionalmente uma sequência de estimulação de transformaçao , pode ter um ou mais poliligantes, ou sequências adicionais para inserção, se; lecçao, manipulaçao, facilidade de sequenciaçao, excisao ou similares .

A inserção de uma construção que inclui a região de início de transcrição e de traduçao e as regiões de terminação pode normalmente ser conseguida por meio de vectores de expressão; em alternativa a construção pode li. gar uma ou ambas as regiões de regulaçao, que serão fornecidas pela expressão do vector na inserção da sequência que codifica para o produto proteico.

ADN que codifica para as enzima(s) de interesse pode ser introduzido num hospedeiro Penicillium de acordo de forma substancial com o procedimento descrito em EP-A-260762 .

A transformaçao eficiente de Penicil 1 ium e proporcionada para produzir transformantes que têm um ou mais genes estruturais capazes de expressão, particularmen te integrados no genoma do hospedeiro (integrantes). Sao sepa. radas construções de ADN que permitem a selecçao de células hospedeiras transformadas. Sao utilizadas condiçoes para a transformaçao as quais têm como resultado uma elevada frequên_ cia de transformaçao para deste modo assegurar a selecçao e o isolamento dos hospedeiros transformados que expressam o gene (s) estrutural de interesse. Os transformantes resultantes proporcionam a manutenção estável e a expressão do ADN integrado, é de notar que o hospedeiro transformado de acordo com a presente invenção pode ser usado como estirpe inicial nos processos de melhoria de estirpe em vez de se usar uma transformaçao de mediaçao de ADN, por exemplo, fusão de protoplastos, emparelhamento em massa e mutaçao. As estirpes resultantes sao consideradas como fazendo parte da presente invenção.

Os genes com interesse para serem introduzidos por transformaçao podem formar uma parte integral do vector de transformaçao, mas será muitas vezes mais conveniente proporcionar estes genes num vector separado na mistura de transformaçao, introduzindo deste modo os referidos genes por cotransformaçao em conjunto com o vector selectivo, o que e um processo razoavelmente eficiente em fungos filamentosos (P.J. Punt et al., Gene 56 (1987) pp. 117-124;

K. Wernars et al, Mol. Gen. Genet. 209 (1987) pp. 71-77; I.E. Mattern et al., Mol. Genet. 210 (1987) pp. 460-461).

Como resultado da transformaçao have ra pelo menos uma cópia do gene(s) com interesse, frequentemente duas ou mais, normalmente nao excedendo cerca de 100, mais habitualmente nao excedendo cerca de 10. 0 numero dependera acima de tudo de se empregar integração ou manutenção episomal estável, do número de cópias integrado e de a constru_ çao que se pretende preparar ser submetida a amplificaçao e de factores semelhantes.

Sao conhecidos na especialidade vários métodos para o isolamento de gene de interesse a partir de um banco genómico de espécies seleccionadas (por exemplo Maniatis et al. , Molecular cloning, 1982, a laboratory manual). Usamos o método de busca diferencial para o isolamento de genes implicados na biossíntese da penicilina. Com este fim, isolou-se ARNm a partir do micélio cultivado em lactose (produtor) e cultivado em glucose (nao produtor). Uma sonda de ADNc marcada foi sintetizada a partir das duas populações de ARNm, e depois de enriquecimento da sonda de ADNc correspondente ao produtor (por eliminação de todos os ADNc's que hibridam com ARNm que nao produz) isolaram-se clones genómicos que hibridam somente para a sonda ADNc que produz. Os por. menores do procedimento sao dados no Exemplo 2. Verificou-se que um grande numero de clones assim isolados codificam para a enzima de biossíntetase da penicilina sintetase de isopenicilina N (IPNS ou ciclase).

Para além disso, verifica-se estarem presentes entre os clones seleccionados algumas cópias do ge17

ne que codifica para a enzima de permuta da cadeia lateral (aciltransferase) . Esta somente o gene IPNS nao resulta numa produção melhorada de penicilina (Skatrud et al, vide supra).

A presente invenção, para além disso, proporciona aplicações vantajosas do isolamento do aglomerado de genes fIPNS mais ATI no isolamento de outro(s) gene(s) indicado(s) na biossíntese de antibióticos de β-lactama por cro. mossoma de deslocação (isto é, a técnica para isolar, partindo de um clone recombinante, outros clones recombinantes que sao adjacentes ao clone de partida e que contêm informação so breposta a partir do genoma). Isto é exemplificado pelo isola, mento de um clone cosmídico, com base em homologia com o gene de IPNS e pela complementaçao usando o referido clone cosmídi. co de mutantes nao produtores conhecidos por conter actividades enzimáticas codificadas pelo aglomerado de genes IPNS mais AT . Por conseguinte, a aglomeraçao dos genes IPNS e AT foi aplicada com sucesso para isolar outro gene implicado na biossíntese da penicilina, nomeadamente o gene de ACVS. 0(s) referido(s) gene(s) de ACVS é também reunido no aglomerado de genes QlPNS mais ATj e está presente no cosmídeo HM193. A fim de definir claramente a presente invenção, faz-se referencia a Figura 8, que representa um mapa físico do referido cosmideo. Para alem disso o clone cosmídico foi depositado na CBS sob o número 179.89. Deverá entender-se que a figura 8 indica as posiçoes aproximadas dos locais de clivagem da enzima de restrição, conforme determinado em experiências de medição usando electroforese em gel de agarose, e nao se tem necessariamente o intuito de mostrar todos os locais de restrição possíveis presentes no ADN representado. A presença de outro gene no cosmídeo HM193, por exemplo que codifica para uma pro teína reguladora, ainda nao pode ser excluído. Estando isolado o gene que codifica para ACVS, a via biossintética da penj^ cilina (cf. Fig. 1) foi clonada e pode ser introduzida em qua_l quer microorganismo, por exemplo numa levedura.

A presente invenção é para além disso exemplificada pela transformaçao de Penicillium chrysogenum com genes que sao especificamente expressos sob condiçoes nas

quais o antibiótico é sintetizado, e que codificam para prod.u tos genicos que catalisam reacçoes biossintéticas que levam aos referidos antibióticos.

Uma destas enzimas, a aciltransferase (daqui em diante referida como AT), catalisa a fase final na biossintese da penicilina, isto é a permuta da fracçao de aminoadipilo da isopenicilina N com um percursor da cadeia la. teral de acilo hidrifobica, por exemplo ácido fenilacético ou ácido fenoxilacético, dando assim origem a penicilina G ou a penicilina V, repectivamente.

Apresenta-se o gene de aciltransf era. se de P^. chrysogenum, incluindo a sequência de acido nucleico mutações conservativas, em que as sequências codificam para as mesmas sequências de ácidos aminados, mas podem ter até 30% de bases diferentes, ou mutações que nao sao conservativas, em menos que cerca de 10%, mais usualmente menos que ce£ ca de 5%, e de preferência nao mais de 1% dos ácidos aminados sao substituídos ou eliminados, e há menos de 5% de ácidos aminados inseridos, sendo a percentagem baseada no número de ácidos aminados de ocurrência natural. Para além disso podem ser utilizados como sondas para a produção de anticorpos fra^ mentos dos dois ácidos aminados que codificam para a enzima, normalmente de pelo menos cerca de 9 codoes, mais normalmente de pelo menos cerca de 15 codoes, bem como os seus produtos de expressão ou semelhantes. As sondas podem ser usadas para identificar a enzima em outras espécies pelo emprego de ácidos nucleicos para hibridaçao ou dos anticorpos para identifjl caçao das proteínas de reacçao cruzada.

Outra enzima, a ACVS, cataliza a pri. meira fase na biossintese dos antibióticos de í-lactama penicilina, cefalosporina e cefamicina, isto é a condensação de três ácidos aminados, ácido L-K-aminoadípico, L-cistei_na e L-valina, no tripeptídeo ( L-jX-aminoad í p i lo )-L-cisteini 1-D-valina. 0 gene de ACVS e proporcionado sob a forma do cosmideo HM193. Partes deste cosmídeo ou o cosmídeo completo, pode ser usado como uma sonda de hibridaçao a fim de identificar os fragmentos de ADN em outras espécies que também codificam

para a enzima ACVS. 0 clone pode também ser usado em experiên. cias in vitro de suspensão por hibrido de traduçao, através das quais se isola como uma primeira fase uma populaçao de ARNm que tem uma homologia suficiente em relaçao ao clone para hibridar com este. A segunda fase consiste no isolamento da referida populaçao de ARNm e na subsequente traduçao numa proteina funcional, usando sistemas de transcrição in vitro conhecidos na especialidade. A proteína assim isolada pode por exemplo ser usada para testes de actividade ou para a prjo duçao de anticorpos.

isolamento dos genes da AT e Y e outros genes biossintéticos permite a identificação de elemen_ tos reguladores dos genes individuais tais como um promotor, uma sequência activadora a montante (SAM), um terminador e s_i milares. Isto pode ser conseguido por comparaçao de sequência dos genes entre eles proprios e por comparaçao com a sequência como e obtida para o gene biossintético de sintetase de isopenici1ina N e outros genes referidos. Esta última compara çao, contudo, pode apresentar a natureza específica da regula çao da expressão do gene do grupo de genes biossintéticos de penicilina .

A identificação de um tal elemento regulador biossintético de penicilina leva à identificação de proteínas reguladoras específicas por meio de técnicas nor. mais como retardamento de gel, ligaçao cruzada, rasto de ADN e similares. 0 isolamento de proteína reguladora específica por cromatografia de afinidade tem como resultado a clonagem do gene que codifica para a referida proteina e a subsequente manipulaçao num hospedeiro adequado.

Pela utilização do gene da AT, do ge^ ne da ACVS, do gene Y e de outros genes biossintéticos de penicilina clonados, podem ser projectadas e sintetizadas enzimas modificadas. Estas modificações darao como resultado mod_i ficaçao das caracteristicas das enzimas, tal como uma mudança nos valores optimos de pH ou de temperatura, uma mudança na estabilidade ou uma mudança na especificidade do substrato.

As estirpes hospedeiras, transformadas com genes que codifi20

cam para estas enzimas modificadas, podem ser programadas para realizar a síntese de antibiótico sob condiçoes diferentes ou para sintetizar antibióticos alternativos, por exemplo ampicilina em vez de penicilina.

Num outro aspecto da presente invenção, os genes clonados podem ser usados para transformar as estirpes hospedeiras que nao possuem naturalmente estas enzimas. É conhecido que em Streptomyces e em Acremonium nao ocor. re a enzima AT, enquanto que por outro lado em Penicillium nao ocorrem os genes das enzimas biossintéticas da cefalosporina e da cefamicina. A introdução de tais genes nos hospedei, ros dara como resultado a biossíntese de cefalosporina ou de cefamicina por Penicillium ou de penicilina ou cefalosporinas com uma cadeia lateral hidrofóbica por Acremonium. Este facto é exemplificado também pela expressão do aglomerado de genes

IPNS mais AT de Penicillium chrysogenum em Acremonium chrysogenum .

É evidente a partir dos resultados seguintes que a produção de metabolitos secundários pode ser grandemente aumentada utilizando processos de selecçao que permitem a identificação de sequências de ADN associadas com a produção de um metabolito secundário. Usando métodos de sujj tracçao em sequências especificas de identificação associadas com a produção de metabolitos secundários, é possível isolar e identificar o ARNm e o ADNc para ser usados como sondas. As. sim, verifica-se que fragmentos que contêm genes crípticos, que ainda nao tenham uma função conhecida, apresentam uma pro duçao de metabolitos secundários grandemente aumentada e pode ser utilizados para transformar um hospedeiro para a produção do metabolito secundário. Este processo e especificamente exemplificado para penicilina.

Adicionalmente, um gene de aciltrans ferase de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em várias vias, como uma enzima para a modificação de compostos de ^-lactama, como uma marca, como uma fonte de um antige^ ne para a produção de anticorpos para aciltransferase, como uma fonte para uma sequência de promotor, como uma fonte para

expressar quantidades elevadas de proteina para cristalizaçao como um molde para mutagénese in vitro para obter uma enzima com características modificadas, etc. A introdução do gene da AT no aglomerado de genes IPNS mais AT conduz a uma grande melhoria da produção de penicilina em transformantes. Para alem disso, o genótipo aglomerado foi utilizado para o isolamento de outro(s) gene(s) implicados na biossintese da penici^ lina, nomeadamente do gene que codifica para a ACVS. A introdução do aglomerado de genes em Acremonium chrysogenum tem co mo resultado a expressão de um aglomerado de genes e na produ. çao de penicilina por Acremonium chrysogenum.

Para além disso, e proporcionado um clone cosmídeo que contém o gene que codifica para a ACVS. Es_ te gene, tal como o gene que codifica para a AT, encontra utjí. lizaçao nas aplicações anteriormente mencionadas. É possível que outros genes (reguladores) estejam presentes no cosmideo HM193.

Todas as publicações e pedidos de pa. tente referidos na presente memória descritiva sao aqui inco£ poradas por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente forem especificamente e individualmente indicadas para ser incorporadas por referência.

Apezar de a invenção precedente ter sido descrita com todo o pormenor por meio de ilustrações e exemplos com intuitos de clareza e compreensão, sera rapidamente evidente para os especialistas no assunto a luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem que se ultrapasse o espírito ou âmbito das reivindicações em apêndice.

Os exemplos apresentados em seguida destinam-se a ilustrar a invenção sem limitar o seu âmbito.

EXPERIMENTAL

EXEMPLO 1

Construção de um banco genómico de Penicillium chrysogenum

Construíu-se um banco genómico de Penicillium chrysogenum (ATCC 28089) substancialmente de acor do com os processos conhecidos na especialidade (T. Maniatis et al., (1982), Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory, N.Y.). 0 ADN cromossómico foi extraí do de Penicillium chrysogenum pela formaçao de protoplastos a partir do micélio como descrito previamente em EP-A-260762.

Os protoplastos foram também então lisados por diluição da suspensão isotónica (KC1 0,7 M) ) com quatro volumes de tampão TES (Tris-HCl 0,05 M pH 8,0, EDTA 0,1 M, NaCl 0,15 M). Ao lisado juntou-se lauril-sulfato de so dio a 12 e a mistura foi incubada a 55°C durante 30 minutos. Depois de uma extracçao com fenol e duas extracçoes com cloro, formio, o ADN foi precipitado com etanol, seco e dissolvido em tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A solução de ADN foi então tratada com 100 ,,.g/ml de RNase a 37°C durante 1 hora e a seguir com proteinase K a 200 .g/ml a 4 2 ° C durante 1 hora. A solução foi extraída uma vez com fenol e duas vezes com clorofórmio. Um volume igual de isopropanol foi deitado por cima da fase aquosa e o ADN foi recolhido na interface r£ dando a volta com uma vareta de vidro. Depois de seco o ADN foi dissolvido em tampao TE. 0 peso molecular duma preparaçao g

de ADN assim obtida foi de cerca de 10 . 0 ADN foi parcialmen. te digerido com Sau3A, ligado a EMBL de 3 braços desf osf orila. do cortado com BamHI (Promega Biotec, Madison WI, USA), e empacotado em capsídeos de bacteriófago lambda usando o Package^ ne System de Promega Biotec. Todas as reacçoes foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante excepto no que se refere a reacçao de empacotamento que foi realizada a 22°C durante 2 a 3 horas. Os bancos foram amplificados por inoculação em placas dos fagos empacotados, incubaçao durante

a 8 horas a 37°C e eluiçao dos fagos SM (NaCl 0,1 M, MgSO^ 0,01 M, Tris HC1 na 0,01%) por placa de Petri.

usando 0,05 M

4ml de tampao pH 7,5, gelatiEXEMPLO 2

Isolamento de genes expressos especificamente durante a biossintese da penicilina usando um processo de separaçao diferen ciai .

Os genes que sao expressos específica ou predominantemente durante a biossintese da penicilina foram identificados sondando o banco genómico do Exemplo 1 com sondas de ADNc marcadas sintetizadas em moldes de ARNm ex. traídos de micélio produtor (cultivado em lactose) e nao produtor (cultivado em glucose), seleccionado os clones que dao predomonantemente um sinal positivo com a sonda (+) anterior.

Isolaram-se ARNs mensageiros de culturas com 3 ou 6 dias no meio de produção (cf. Exemplo 3) (prj2 paraçao +) ou no mesmo meio com a lactose substituída por glu. cose (preparaçao -). 0 micélio foi recolhido por filtraçao, congelado em azoto líquido e homogeneizado e o ARNm foi isola, do usando o método de isotiocianato de guanidinio como descr.i to por T. Maniatis et al. (vide supra).

Sintetizaram-se ADNc's e marcaram-se para uma actividade específica alta com P^[-d ATP contra as duas populações de ARNm numa mistura reaccional de 30 ,ql

que contém
12,5	mM	MgCl2
50	mM	Tris-HCl pH 8.3
100	mM	KC1
125	mM	DTT
2	u/fA	RNasin
500	ZtM	dGTP
500	/(xM	dCTP
500	;<M	dTTP

25		dATP
0,1	zxg/ml	BSA
100-200	tig/ml	poli A+RNA
50-60	ug/ml	o 1 i g o ^^12 — 18
1,2	U / II 1	transcriptase inversa
1,67	Ci/ ..-,1	[d-32pJ dATP

nos quais o PoliA⁺ ARN e oligo-dT foram misturados separadamente, aquecidos a 100°C durante 1 minuto e arrefecidos em água gelada antes de adicionar à mistura reaccional. Depois de

1.5 horas de incubaçao a 42°C, adicionaram-se 5 /^1 de dATP mM e continuou-se a incubaçao durante 30 minutos. Subsequen. temente, a mistura reacional foi levada a 20 mM em EDTA, mM em NaOH (volume final 100 ^.ij.) e aquecida a 65°C. Depois de 1 hora de incubaçao adicionaram-se 5 nl de Tris-HCl 1 M pH 8,3, 40 χ;1 de HC1 0,01 N, 7 g de ADN de timo de vitela, 100 pi de tampao TES (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, SDS a 1% pH 7,5) e 200 1 de acetato de amónio 5 mM e precipitou-se o ADN com

800 1 de etanol durante 16 horas a -20°C.

Separou-se o precipitado por centrifugação, lavou-se com etanol a 70%, secou-se e dissolveu-se em 32,5 nl de tampao TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). A pre^ paraçao de ADNc (+) foi então enriquecida nas sequências expressas especificamente durante a biossíntese da penicilina por dois ciclos sucessivos (cascatas) de hibridaçao contra uma preparaçao de ARNm (-) numa mistura reacional de 75 ‘.'.1 que contém

32.5 _/U1 ( + ) ADNc xJL (-) ARNm (1 ^g/_Al) „1 1M NaP0₄ pH 6.8

1,5 _Λ1 10% SDS ₍.l 0.5 M EDTA

Depois de incubaçao durante 16 horas a 68°C, adicionaram-se 102 de água (concentração final de fosfato 170 mM) e passou-se a mistura através de uma coluna

de hidroxilapatite equilibrada em fosfato 170 mM a 68°C. Sob estas condiçoes, os ácidos nucleicos de dupla cadeia ligam-se a coluna enquanto que os ácidos nucleicos de cadeia simples sao eluídos. Recolheu-se o eluído, dialisou-se contra tampao TE durante 1,5 horas e precipitou-se com etanol depois da adi. çao de 4 ^_Lg de ADN veículo (timo de vitela). Repetiu-se este processo e o ADNc final nao ligado foi usado directamente como uma sonda para efectuar uma busca no campo genómico de uma estirpe de Penicillium como se segue:

Inoculou-se uma amostra do banco amplificado do Exemplo 1 sobre 5 cápsulas de Petri de modo a que cada cápsula contivesse 1500 placas. As placas foram transferidas em duplicado para filtros Genes Screen Plus (New England Nuclear) de acordo com as recomendações do fabricante. Sondou-se um conjunto de filtros com a preparaçao de ADNc (+) enriquecida marcada; o conjunto duplicado foi sondado com o ADNc (-) para comparaçao.

As placas positivas foram purificadas e submetidas a uma segunda selecção. Por este meio, foram seleccionadas 96 placas que deram um sinal predominantemente positivo com a sonda ADNc (+).

Os ADNs dos fagos recombinantes que tinham dado um sinal forte ou moderado na selecção inicial fjo ram marcados com _e f_oram usados como sondas para efectuar uma busca de manchas em Northern de ARNs de Penicillium isola, dos a partir de micélio produtor e nao produtor, a fim de estabelecer os níveis de expressão sob ambas as condiçoes. Por este meio os clones recombinantes foram divididos em três gru. pos :

Classe 1 contém genes expressos dum modo elevado durante a biossíntese da penicilina e e exemplificada pelos clones * G2 e B21 * B9, L5 e G5 * LI 2 * K9

Classe 2 expressa de modo moderado, exemplificado por * C12 * P3 e Kll * B13 * B20

Classe 3 expressa fracamente, exempli ficado por * G3 * G1 * Kl6 * LIO * B23

Os mapas físicos destes fagos recombinantes sao apresentados na Figura 2. Os clones G2 e B21 deram um sinal de hibridaçao positivo quando sondados com uma sonda específica de sintetase de isopenicilina N (S.M. Samson et al., vide supra). Surpreendentemente, parece que os mesmos clones também hibridam com uma sonda específica de aciltranfe rase (ver Exemplo 5).

EXEMPLO 3

Purificação da aci1transferase.

A estirpe Penicillium chrysogenum (ATCC 28089) foi inoculada (a 2 x 10^ conídeos/ml) num meio de inoculação complexo contendo líquido de maceraçao de milho (20 g/1); solúveis de destilaria (20 g/1); sucrose (20 g/1); CaCO^ (5 g/1) (pH antes da esterilização 5,7). Depois de 36 horas de incubaçao a 25°C e a 250 rpm, a cultura obtida foi usada para inocular vinte volumes de meio de produção complexo contendo: sólidos de maceraçao de milho (35 g/1); lactose (25 g/1); fenilacetato de potássio (2,5 g/1); MgS0^.7H₂0 (3 g/1); KH₂P0^ (7 g/1); óleo de milho (2,5 g/1); CaCO^ (10 g/1). Depois da continuação da incubaçao por mais 48 horas,

recolheu-se o micélio por filtraçao e lavou-se o bolo de filtro quatro vezes com NaCl 0,15 M frio.

Suspenderam-se 200 g (peso húmido) de micélio em 700 ml de tampao de Tris-HCl 0,05 M (pH 8) contendo ditiotreitol 5 mM (daqui por diante referido como tampão TD) e desintegrou-se o micélio num desintegrador Braun (Braun, Melsungen, R.F.A.) usando esferas de vidro Ballotini (Sigma tipo V, 450 a 500 ^m de diâmetro) por periódos de 30 s a intervalos de 15 s com refregiraçao num banho de etanol/gelo se co. 0 extrato foi em seguida centrifugado durante 30 minutos a 20 000 x g. Esta e todas as fases seguintes foram realizadas a 4°C. Adicionaram-se lentamente a 640 ml de extrato 27 ml de uma solução de sulfato de protamina a 10% p/v em Tris-HCl 0,05 M a pH 8. Depois de agitar durante 45 minutos o ácido nu. cleico precipitado foi removido por centrifugação a 20 000 x g e o sobrenadante foi fraccionado por precipitação com sulfato de amónio enquanto se mantinha o pH da solução a 8,0 durante as adições de sulfato de amónio. A fracçao que precipitou entre 40% e 55% da saturaçao foi dissolvida em tampao TD que continha sulfato de amónio 1 M e aplicada a uma coluna de fenilsefarose CL-4B (1,8 x 16 cm) equilibrada com o mesmo tampão TD a uma velocidade de 5 ml/min até nao se libertarem mais proteínas nao ligadas.

Em seguida a aciltransferase foi eluída da coluna com etileno -glicol a 40% em Tris-HCl 0,05 M a pH 8,0.

As fracções eluídas foram analizadas para detecçao de actividade de aciltransferase por incubaçao a 25°C numa mistura reacional que contém fenilacetilcoenzima A 0,2 mM, ácido 6-aminopenicilânico 0,2 mM, ditiotreitol 5 mM, Tris-HCl 0,1 M a pH 8,0 e extrato de enzima num volume final de 200 1. Depois de 10 minutos a reacçao foi interrompida por adição de 200 ^ul de metanol. Centrifugaram-se as amostras a 5000 x g e a penicilina G foi analizada no sobrenadante por métodos convencionais, microbiológicos ou cromatograficos .

As fracções activas da coluna de fenilsefarose foram reunidas e aplicadas numa coluna de Sephacel-DEAE (1.5 x 20 cm) equilibrada com tampao e eluíu-se a aç_

tividade de aciltransferase com um gradiente de NaCl (0 a 0,25 M) linear em tampao TD a uma velocidade de fluxo de 0,25 ml/min. As fracçoes activas reunidas foram precipitadas com sulfato de amónio a 70% e o sólido foi dissolvido em 3 ml de tampao TD e aplicado numa coluna de Sefadex G-75 (de grao grosseiro) (2,6 x 70 cm) equilibrada com tampao TD. A aciltranferase foi eluída usando tampao TD com um caudal de 9 ml/h e foi recolhida na última parte das fracçoes eluídas com um pico simétrico de proteína que corresponde ã actividade da aciltransferase. A purificação final foi de 258 vezes.

EXEMPLO 4

Determinação da sequência de ácidos aminados aminoterminal de aci1transferase e projecto das correspondentes misturas de sondas de oligonucleotido.

A preparaçao enzimática, obtida como descrito no Exemplo 3, foi feita correr num gel de SDS-PAGE (U.K. Laemmli, Nature, 227 (1970) pp. 680 ff) (acrilamida a 13%, 50 <wA).

Separou-se uma banda de 29 kD (cerca de 10 de proteína) do gel de SDS e transferiu-se por electroforese e proteína para uma membrana de PCGM-2 (fibra de vidro impregnada de polibreno , Jansen, Beerse, Bélgica), usando uma unidade de mancha N0 VA Multiphor II (LKB; 0,8 mA/ciZ; 90 min; tampao de electrodo de borato de sodio 5 mM a pH 8,0). Depois de realizada a mancha, a membrana de PCGM foi lavada quatro vezes com uma solução contendo NaCl 25 mM e borato de sodio 10 mM a pH 8,0 e foi seca ao ar. A banda de proteína absorvida por PCGM assim obtida foi analisada para determinação da sequência N-terminal de ácidos aminados, usando um sequenciador de fase gasosa (Applied Biosystems modelo 470 a). Foi determinada a sequencia seguinte:

thr-thr- ala-tyr-cys-gln-leu-pro-asn-gly-ala 1eu-gln-gly-glnasn-trp-asp

De acordo com a parte sublinhada da sequência de ácidos amina dos, sintetizaram-se os seguintes conjuntos de oligodesoxirri. bonucleótidos:

T

A C A T T

5' CA GG CA AA TGGGA 3’

G A G C C

G

A sequência aminoterminal de ácidos aminados de uma banda de 10 kD presente algumas vezes na preparaçao foi também determinada, mas nao foi usada para a cons truçao de uma sonda de oligodesoxirribonucleotido. A sequência obtida é:

Met-Leu-His-Ile-Leu-X-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-Glu-His-Gly-Ser-Ala-Ala-Lys-Ala-Val-Ile-Ala.

EXEMPLO 5

Identificação do gene da aci1transferase

ADN de vários clones do Exemplo 2 foi digerido com a endonuclease de restrição Sail , os fragmen. tos foram separados num gel de agarose a 0,7%, transferidos para Genescreen Plus e hibridados com as misturas de oligonucleotidos do Exemplo 4 marcadas na extremidade por [_ J. Os clones que davam um sinal positivo foram mapeados por analise de restrição usando métodos normais. Dois mapas físicos repre sentativos derivados dos fagos recombinantes, lambda B21 e lambda G2, sao apresentados na figura 2. A mistura de oligode. soxirr ibonucleotidos híbrida especif icamente com o subfragmen. to EcoRI/HindIII indicado no mapa. Este e os fragmentos adjacentes foram reclonados em pTZ 18/19 (United States Biochemical Corporation) e submetidos a análise de sequência de núcleo, tidos. A sequência determinada e a sequência de ácidos aminados deduzida sao apresentadas na figura 3.

A sequência amino-terminal de ácidos aminados de uma banda de 10 kD também presente na preparação foi determinada e verificou-se corresponder a uma sequência de ADN a montante da sequência de 29 kD. Por conseguinte, a AT é provavelmente sintetizada sob a forma de uma proteína de 40 kD. Esta noção é confirmada pelo comprimento do mensageiro de AT, que foi demonstrado ser de 1500 bases (semelhantes ao ARNm de sintetase de isopenicilina N que codifica para uma proteína de 38 kD), tomando assim em consideração as regiões nao traduzidas de 3' e 5' de 100 bases.

As sequências de ácidos aminados das proteínas de 29 kD (que foram extendidas para Thr-Thr-Ala-Tyr. - Cys-Gln-Leu-Pro-Asp-Gly-Aia-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Tr p - As p- Phe. -Ser-Ala-Thr-Lys-Gln-Ala) e de 10 kD relevaram a presença de dois introes. Um terceiro intrao é postulado com base na composição bruta em ácidos aminados de proteína de 10 kD (97 resíduos) e na sequência de consenso para os seus limites (D.J. Ballance, Yeast 2 (1986) pp. 229-236). A presença do terceiro intrao foi confirmada por extensão de iniciador e hibridaçao de mancha de Northern usando sondas oligonucleotídicas a partir de regiões de codificação e de nao-codificaçao.

EXEMPLO 6

Construção de pPS47 gene da quinase de fosfogiicerato (pgk) foi isolado a partir dum banco genómico de Penicillium por métodos normais (Maniatis; Exemplo 1), usando o gene de levedura correspondente (Hitzeman et al., vide supra) como uma sonda de hibridaçao.

promotor pgk de _P. chrysogenum foi clonado em pTZ18R como um fragmento HindIII de 1,5 Kb e selec cionou-se um clone que tivesse a orientação desejada.

Subsequentemente, o gene da resistên cia a fleomicina foi clonado num local de BamHI do poliligante deste clone sob a forma de um fragmento BamHI - BglII de

1,0 kb, isolado a partir de pUT702 (Cayla, Toulouse Cedex, France). 0 promotor de pgk foi fundido ao gene de resistência de fleomicina em concordância de quadro por fecho extiro do ciclo da sequência a ser apagada usando um oligonucleótido com a sequência:

5'-GGA ACG GCA CTG GTC AAC TTG GCC ATG GTG GGT AGT TAA TGG TAT G-3'

Para além disso, este oligonucleótido introduz um local NcoI na posição de ATG (sublinhado).

EXEMPLO 7

Construção de um vector de transformaçao com uma elevada eficiência de transformaçao (pPS 54).

No sentido de obter uma frequência de transformaçao de P. chrysogenum que e suficientemente elevada para permitir a introdução de genes por transformaçao ou cotransformaçao com o objectivo de complementar ou de amplifi. car genes nao seleccionáveis envolvidos em biossintese de lactamas, e desejável incluir no vector de transformaçao uma sequência de realce de transformaçao (cf. ans em Aspergillus, D.J. Ballance e G. Turner, gene 36 (1985) pp. 321-331). Surpreendentemente, uma sequência de estimulação de transformaçao que é funcional em J?. chrysogenum está presente num fragmento de ADN que contém o gene py r G de .P. chrysogenum. Este fragmento de ADN forma parte de um fragmento parcial de Sau3A de 4 kb, clonado no local BamHI de plasmídeo pUC 13 (J. Messing, in Meth. Enzymol. 101 (Acad. Press, 1983) pp. 20 e segs.) Este plasmídeo é referido por pUC13 : :pyrG daqui por diante (ver EP-A-260762 e Figura 6).

fragmento EcoRI de 2,4 Kb foi incluído num plasmídeo (pPS47) que contém o gene de resistência ã fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus sob a regulaçao do promotor de quinase de fosfoglicerato (pgk) a partir

de P. chrysogenum.

pyrG na frequência abaixo :

A construção resultante é pPS 54.

efeito estimulador do fragmento de de transformaçao é apresentado no Quadro 1

Quadro 1 plasmídeo pPS 47 (fleo^R) pPS 54 ( f 1 e o ^R , pyrG) transforraantes/^g de

186

ADN

EXEMPLO 8

Verificação biológica e bioquímica da identidade dos clones AT

A identidade dos clones AT foi verificada por complementaçao de um mutante negativo em relaçao a aciltransf erase de JP. chrysogenum Wis 54 - 1255, npe 8.

Cotransformaram-se 2 x 10? protoplas. tos de um derivado que necessita de uracilo de estirpe Wis 54 - 1255 npe 8, Wis 54 - 1255 npe 8 pyrG (CBS 512.88) com uma mistura de 5 g do plasmídeo selectivo pUC 13:: pyrG e 15 yg,g de ADN de B21 lambda como descrito previamente (ΞΡ-Α-260762).

Obtiveram-se algumas centenas de transformantes dos quais se separam os conídios e depositaram em placas no meio de produção complexo do Exemplo 1 numa densidade de uma a dez colónias por cápsula de Petri. Depois de três dias de incubaçao a 25°C, as placas foram cobertas com uma suspensão de esporos de uma estirpe de um indicador de Bacillus subtilis sensível ã penicilina e incubadas todas a noite a 30°C para determinar a dimensão das zonas de inibição no campo bacteriano.

A maior parte dos transformantes (75%) apresentavam halos muito pequenos, semelhantes na dimen sao aos da estirpe receptora pyrG npe 8 nao produtora da peni. cilina. Os restantes 25% mostravam largas zonas de inibição

comparáveis as da estirpe de tipo selvagem, Wis 54-1255. Concluíu-se que a primeira classe recebeu somente o plasmídeo se lectivo pUC 13: : pyrG, enquanto o último tinha recebido tanto o pUC::pyrG como o lambda B21, que restabelece a produtividade da penicilina.

Para vários clones transformantes dos dois grupos o nível de actividade de AT em extratos isentos de células foi determinado como se segue: recolheu-se micelio depois de dois dias de incubaçao como descrito no Exemplo 3, lavou-se, congelou-se em azoto líquido e pulverizou-se. Para cada análise, suspenderam-se 2,5 g de micélio triturado em tampao de fosfato de potássio 50 mM (pH 8,0) contendo ditiotreitol 5 mM e EDTA 5 mM (volume final 12,5 ml) e agitou-se durante 25 minutos. 0 extrato isento de células foi obtido por centrifugação da suspensão (5 minutos a 1000 x g).

Analizou-se a actividade AT por incu baçao de 2 ml de extrato livre de células com 0,1 ml de ditio. treitol (10 mg/ml), 0,2 ml de ácido 6-aminopenicilânico (10 mg/ml) e 0,2 ml de solução de fenilaceti1-coenzima A (20 mg/ ml) a 25°C.

Depois de 15 ou 30 minutos, a reaçao foi interrompida por adiçao dum volume igual de metanol e ceji trifugou-se a amostra (20 minutos a 5000 x g). 0 sobrenadante foi em seguida analisado para determinar a penicilina G for ma da por métodos cromatográficos conhecidos na especialidade (HPLC). Os resultados dum ensaio típico sao apresentados no Quadro 2 abaixo. Estes dados mostram que nas estirpes transformadas (3) e (4) o nivel da actividade de AT é aumentada 2 a 3 vezes para além da do tipo selvagem de acordo com a dosagem aumentada do gene.

aglomerado de IPNS mais AT foi sub. clonado em pPS54, dando origem a pGJOl A e B. Um fragmento Sa1I de 5 Kb foi neutralizado pela acçao de uma polimerase T4 de ADN e ligado no local HindIII singular de pPS54, depois do tratamento deste vector com polimerase T4 de ADN.

CN

Quadro

	Η <	Pá ο X	Ο	ζ Pá
X	χ	X	κ	X
Ο	ο	<	x-	X
		Ο	<	Η
Ο	X	<	ο	X
X	<	S	1—1	Ο
X	1—1	1—I	Pá	03
Σ	X	X	X
Ο	ο	X	X	X
ζ	ο	X	X	Q

C	03	ο	X
Ο		X	<33	ο
<c		ο		Η
ζ	-	X	X	X
Pá	<	X	ο	ζ
ο	Ζ	ο		X
X	*—1			S
	χ
X	Ε—
	ο
ζ	Pá
χ	X
X	X
χ	Ω
ο	X
	Ζ
03
χ	X			X
Q	ο	X		ο
<	X	X	1/3	Η
Ω		ο	r—4	X
1—1		X		ζ
ζ		X	X	X
X		ο	ο	Σ

&S X ο ο

Cx. Ο 00 ω

0μ & I—I Η ΟΟ ω

*·}$ <σ ο

φ

AJ

Μ φ

4J

Ο

C

CÚ

ϋ)

ϋ) ca α, la ο σ' cn <σ οο ά »—ι Ο ο

Ό

C0

Ε

X	X					J-4
Η		ca				Ο
Η	Η	Ό				u-i
X	X	Χ5				cn
		ε		Ε	Ε	C
·.	.·	ca	1—»	Φ	Φ	C0
X	X	γ—I	CN	-σ	-ο	ί-Ι
1—4	ι—4		CQ	•Η	•Η	4-)
		ω
Ο	Ο	3				Ο
XD	33	ι—1				ca
Ο.	CX	Ο.				c

X	σ'
co				00
♦				o
CN				X
r—4	E	E	E	X
LA	Φ	Φ	Φ
	Ό	Ό	Ό	X
00	•H	•H	•H	X
CQ				E-1
O				<
z—s	Z-X		z~s
i—4	CN	CA		X

Ο

4-1 ca $-1

4-»

X φ

ο

C

Η <

φ

Ό

CO I >

por mutaçao

4J ca 1—I Φ Ρ φ

Ό ca ο *σ >

•Η ·Η > 4-J

Η (J

4-J α ο c ca ·η

-χ- -Κ35

EXEMPLO 9

Aumento da produção da penicilina numa estirpe hospedeira transformada com o gene críptico Y

Para mostrar o efeito dos genes aqui identificados como envolvidos na produção da penicilina, a do. sagem genetica de um destes genes foi aumentada numa estirpe hospedeira de Penicillium. Para este fim o gene Y, contido em clones lambda B9, L5 e G5, foi subclonado sob a forma de um fragmento BamHI-Sphl de 3,0 Kb em pPS47. A construção resultante, pRH05, foi utilizada para transformaçao de P. chrysogenum Wis 54-1255 (ATCC 28089) e isolaram-se clones resistentes a fleomicina. Vários clones foram testados para produção de penicilina em balões de Erlenmeyer agitados.

Os resultados obtidos para um transformante isolado sao apresentados no Quadro 3 sequinte.

Quadro 3 estirpe produção relativa de penicilina

ATCC 28089 100

ATCC 28089::pRH05 122

A dosagem génica aumentada do gene Y no transf ormante, por comparaçao com o hospedeiro nao-trans. formado, foi confirmada por análise de mancha de Southern.

POr consequência, a dosagem génica aumentada do gene Y, um ge^ ne críptico, isolado pelo método da presente invenção, resulta num substancial aumento na produção de penicilina.

A dimensão da transcrição para o gene Y foi determinada por hibridaçao de mancha de Northern: a transcrição tem cerca de 1,0 Kb de comprimento.

EXEMPLO 10

Aumento na produção de penicilina por um hospedeiro transformado com pGJO2A

Para estudar o efeito na produção de penicilina do aglomerado de genes fIPNS mais ΑΤΊ, em oposição ao gene da IPNS isolado (vide supra), transformaram-se 2x10? protoplastos da estirpe ATCC 28089 (=Wis54-1255) com pGJ02A (Fig. 6) usando o processo conforme descrito no pedido de patente Europeia EP-A-260762. Os transformantes foram seleccionados usando uma concentração de fleomicina de 30 ^g/ml. Cerca de uma centena de transformantes e de um número semelhante de transformantes de comparaçao (transformados somente com o vector pPS47) foram analizados no que respeita à capacidade de produção usando a análise biológica como descrito no Exemplo 7. Vinte e seis transformantes que produziram um halo com um diâmetro que era significativamente maior que o dos transformantes de comparaçao foram analisados no que respeita a ca pacidade de produção em balões de agitaçao. A produção de penicilina destes transformantes foi comparada com a media da produção de penicilina de oito transformantes de comparaçao: a média de produção de penicilina dos vinte e seis transformantes é de 182 acima da média de produção dos transformantes de comparaçao, tendo-se verificado que dois transf ormantes se leccionados produzem cerca de 402 mais penicilina que a media dos transformantes de comparaçao. Ê dada uma representação grafica na Figura 9. Por conseguinte, o agregado de genes QIPNS mais AT3. foi sucessivamente aplicado na melhoria de estirpes de _P . chrysogenum.

EXEMPLO 11

Construção de um banco de cosmídeos de Penicillium chrysogenum

Isolou-se ADN cromossómico de P.. chrysogenum e tratou—se como descrito no Exemplo 1. Depois

de digestão parcial do ADN isolaram-se fragmentos com uma dimensão de 20 a 35 Kb e ligaram-se ao vector cosmídico pPS07 digerido por BAmH I (ver EP-A-0260762; cf. Figura 4) usando protocolos normais (por exemplo Maniatis et al, vide supra).

A mistura de ligaçao foi empacotada in vitro e o fago lisado foi transduzido em E^. coli HB101 (ATCC 33694), usando outra vez métodos conhecidos na especialidade. Cultivaram-se colónjL as transductantes frescas em 10 ml de caldo L (por litro 10 g de NaCl, 10 g de triptona Bacto e 5 g de extracto de levedura Bacto) sob selecçao por ampicilina. Isolou-se ADN cosmídico e verificou-se a presença do ADN inserido por digestão com Eco RI. A inserção que continha cosmídeos foi armazenada em placas de microtitulaçao a -20°C.

EXEMPLO 12

Isolamento do cosmídeo HM193, que contém o gene da IPNS

Para isolar clones cosmídicos que contêm o gene de IPNS e uma grande quantidade de regiões adja. centes, o banco cosmídico do Exemplo 12 foi submetido a uma busca para seleccionar clones que contêm o gene da IPNS. Utilizou-se um banco cosmídico, por oposição ao banco de fagos lambda do Exemplo 1, porque sao conhecidos vectores na especia lidade que contêm inserções maiores (20 a 40 Kb) do que os vectores lambda (9 a 23 Kb). Como sondas foram usados dois oligonucleótidos baseados na sequência de ácidos aminados N-terminal do gene da IPNS de £. chrysogenum: 5-TTC GGC GAT AAC ATG GAG-3' e 5'-TTC GGC GAT AAT ATG GAG-3'. As sondas foram marcadas usando técnicas normais conhecidas na especialidade (por exemplo Maniatis et al, vide supra).

Foram isolados cosmídeos que hibridam com as sondas e confirmou-se a presença do gene da IPNS por subclonagem, analise de sequencia e comparaçao dos dados para a sequência citada em L. Carr et al (vide supra). Na Figura 8 é apresentado um mapa físico preliminar do cosmideo HM193 corn pleto. 0 clone cosmídico contém cerca de 23 Kb de ADN a mon38 tante do gene da IPNS; o clone so parcialmente se sobrepoe com clones lambda B21 e G2 (cf. Figura 2).

EXEMPLO 13

Complementaçao de mutantes nao produtores utilizando o cosmídeo HM193

Para investigar a presença de outros genes para além do conhecido gene da IPNS no cosmídeo HM193 (CBS 179.89), o referido cosmídeo foi co-transformado com pGJO2A numa outra estirpe npe. Demonstrou-se que a estirpe npe 5 (CBS 178.89) apresenta actividade de IPNS e a de AT e nao apresenta a actividade de ACVS. Para excluir a complementaçao baseada na introdução apenas do gene da IPNS, foram tam bém analisados transformantes somente com a construção pGJO2A A tranasformaçao foi realizada conforme descrito anteriormente e analisaram-se co-transformantes utilizando a analise bio. lógica como descrito atras. Os resultados sao apresentados no Quadro 4 .

QUADRO 4 estirpe n^a de (co)transf. n⁹ de (co)transf. % analisado com halo npe5 31 npe5::pGJ02A 72 npe5::pGJ02A+HM193 19

0* 0 1* 1.3

26 * a estirpe npe5 tem uma frequência de inversão de cerca de

1,5 7o.

Os dados do Quadro 4 indicam que o cosmídeo HM193 é capaz de complementar a mutaçao da estirpe npe5 , enquanto que o plasmideo pGJ02A nao complementa esta mu

taçao. Por conseguinte, outro(s) gene(s) implicado(s) na bios sintese de penicilina foi (foram) identificado(s) a partir do do gene da IPNS. Este gene está presente no mesmo cosmídeo que contém ainda parte do aglomerado de genes (~IPNS mais ATj e portanto está presente a uma distância de menos de 23 Kb do aglomerado de genes [IPNS mais AT^·

EXEMPLO 14

Prova bioquímica e biológica da presença do gene da ACVS no cosmídeo HM193

Para investigar se um dos genes no cosmídeo HM193 codifica para a ACVS, determinou-se a activida. de de ACVS na estirpe npe5, em transformantes desta estirpe apenas com construções pGJO2A e em cotransformantes de npe5 com pGJO2A e o cosmídeo HM193.

As estirpes foram cultivadas durante 48 horas em meio de produção que continha lactose e acido fenoxiacético a 0,75%. Prepararam-se extractos de células livres e a actividade de ACVS foi determinada essencialmente como descrito por Van Liempt (H. Van et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), pp. 3680-3684). Fez-se a extracção com tampão A duraji te 30 minutos. A quantidade de valina marcada usada na analise foi de 12,5 /aCí e a reacçao foi interrompida depois de 30 minutos. Precipitou-se a mistura reacional como descrito e subsequentemente aplicou-se a colunas Poropak Q. As colunas foram lavadas com 2 ml de tampao para equilibrar e eluídas com 2x1 ml de metanol. 0 conteúdo de ACV foi quantificado por HPLC. In jectaram-se amostras de 100 numa coluna de RP18 e eluiram-se com metanol a 10% em KH^PO^ 50 mM a pH 6,00 que contém DTT 0,1 mM ã temperatura ambiente. 0 caudal foi de 1,0 ml/min e a detecçao foi efectuada com um detetor de cinti^ lação de Berthold LB503 empregando uma célula de 200 0 pico marcado com o tempo de retenção idêntico ao do tripeptideo reduzido foi recolhido e a quantidade de marcador foi determinada por contagem num analisador de cintilação de liqui40 do (Packard).

Os resultados sao apresentados no Quadro 5. Enquanto que nao foi possível detectar qualquer actividade de ACVS em extratos isentos de células preparados a partir de npe 5 e a partir do seu transformante com pGJO2A TIPNS mais ATj, extractos isentos de células preparados a par. tir do co-transformante com pGJO2A e HM193 continham activida. de de ACV. Nos concluímos que a actividade de ACVS foi restau rada na estirpe npe5 pela introdução do cosmídeo HM193. A aná. lise de polipeptídeos presentes nos extratos isentos de células por electroforese em gel de poliacrilamida de dodecil-su.1 fato de sodio revelou a presença de uma banda de 250 kDa nas últimas estirpes enquanto que esta banda estava ausente nas primeiras estirpes. A enzima ACVS de k_. Nidulans tem um peso molecular de cerca desta dimensão (Van Liempt vide supra) e nós inferimos um peso molecular semelhante para a enzima de

Penicillium.	Assim	concluímos	que aquele	cosmídeo HM193 con
tém o gene de	ACVS.
Quadro 5
		dpm x 10	3
estirpe		+ATP	-ATP 250	kDa polipeptídeo
Wis 54-1255		490,8	nd	+
npe5		3,3	nd	-
npe5 : pGJ02A		2,5	nd	-
npe5:pGJ02A +	HM193	261,3	1,1	+

n.d. = nao determinado

EXEMPLO 15

Transformação de Acremonium chrysogenum

Num balao de Erlenmeyer agitado com deflectores de 250 ml juntaram-se 50 ml de meio MMC (por litro:

SCSBBHpsw

31,6 de sucrose; 2,2 g de glucose; 3 g de CaCO^; 0,5 g de so — lidos de maceraçao de milho; 7,5 g de L-asparagina; 0,22 g de acetato de amónio; 15 g de Kl^PO^; 21 g de K HPO^; 0,75 g de Na^SO^; 0,18 g de MgSO^ . 7H₂0; 0,06 g de CaCl^; e 1 ml de solução de sais (por litro 13 g de Fe(NH^)₂(SO^ ) ₂ ’ 6H₂0; 3 g de ZnS0^*7H₂0; e 0,8 g de CuS0^’5H₂0)) e inocularam-se com duas placas de esporos, cultivadas durante seis dias num meio de esporulaçao de Le Page-Campbell (por litro: 1 g de glucose;

g de extrato de levedura; 0,5 g de NaCl; 10 g de CaCl₂; e 20 g de agar; pH=6,8). As culturas foram incubadas durante 24 a 30 horas a 28°C, agitando-se a 200 rpm. Recolheu-se o micélio por filtraçao através de um filtro de nylon (poros de 25

m) e a agua em excesso foi removida por expressão entre papeis de filtro. O micélio isolado foi resuspendido em tampao TPC a 50 mg/ml (NaCl 0,8 M; MgSO^ 0,02 M; tampao de fosfato de potássio a 50 mM, pH=7) com DTT 10 mM; o micélio foi incubado com agitação a 28°C durante 90 minutos. Recolheu-se o mi_ célio por centrifugação (5 min a 2500 rpm; centrífuga de bancada) e resuspendeu-se a cerca de 25 mg/ml em TPC que continha 2 mg/ml de Novozym (TM). A suspensão foi incubada com agi^ taçao durante 2 a 5 horas a 28°C. Os protoplastos foram filtrados através de um filtro de nylon de 25 ,u,m e isolados por centrifugação (5 min a 2000 rpm; centrífuga de bancada). A massa de protoplastos foi lavada três vezes com NaCl 0,8 M.

Os protoplastos foram resuspendidos em 10 ml de tampao NMC (NaCl 0,8 M; CaCl₂ 50 mM; MOPS 10 mM a pH=7), centrifugados e resuspendidos em cerca de 5 x o volume do agregado solido de

Q tampão NMC (cerca de 10 protoplastos/ml) e adicionou-se 0,1 vol. de tampão CCM (NaCl 0,8 M; CaCl₂ 50 mM; MOPS 10 mM pH=7; 18% de polietilenoglico (PEG), Sigma). Para cada transformação adicionou-se ADN e 100 ^1 de suspensão de protoplasto ao fundo de um tubo de 10 ml, misturou-se a suspençao cuidadosamente e guardou-se em gelo durante 20 min. Adicionaram-se 500 p. de tampão CCM a cada tubo e a mistura foi conservada duran te outros 20 min. à temperatura ambiente. A mistura de transformação foi diluida com 600 ytl de tampao NMC e depositada em placas de TSA-sucrose (S.W. Queener et al , 1985, Microbiology

(ASM), pp. 468-472) contendo 10 ^g/ml de fleomicina. As placas foram incubadas a 28 C durante 2 a 6 dias. Os transforman tes foram inoculados em placas que continham fleomicina; depois da cultura os esporos foram generados em meio de esporulaçao de Le Page-Campbell.

EXEMPLO 16

Complementaçao de um mutante de Acremonium chrysogenum nao produtor e produção de

Penicilina por transformantes deste

A estirpe N2 de Acremonium chrysogenum (Shirafuji et al, 1979, Agric. Biol. Chem., 43 , 155-160; J.L. Chapman et al., Developments in Industrial Microbiology, vol. 27, p. 165, Editor G. Pierce, 1987, Society for Industrial Mycrobiology; F.R.Ramos et al., FEMS Microbiology Letters 35 ( 1986) p. 123) foi transformada como descrito no Exem pio 15 com o fago lambda G2 (Figura 2) contendo o aglomerado de genes £IPNS mais ATJ de P.. chr ysogenum. Usou-se pPS47, que contém o gene de resistência à fleomicina, como uma construção selectiva na experiência de cotransformaçao. A estirpe N2 tem uma mutaçao no gene da IPNS (Shirafuji et al, vide supra) e deste modo nao produz qualquer cefalosporina C.

Isolaram-se cotransformantes e ensaiaram-se cotransformantes para verificar se eram produtores. Isolaram-se clones que produzem antibiótico com uma frequência de cerca de 25%, o que indica que o gene da IPNS de P^. chr ysogenum está a ser expresso em A.. chry sogenum e que a enzima de P.. chrysogenum pode substituir funcionalmente a enzima de A_. chr y so genum . Inocular am—se transf ormantes em meio so_ lido de produção complexo de Caltrider e Niss (1966; Appl. Mi. crobiol. 14, 746-753) com ou sem ácido fenilacético, incubou-se a 27°C durante 5 dias e os antibióticos produzidos foram analizados contra Micrococus luteus que é muito sensível à pej nicilina G mas insensível à cefalosporina C (pelo menos ate 10 /xg/ml) e contra E.. coli ESS2231 que é uma estirpe supersen

sivel à cefalosporina C mas menos sensível à penicilina G. Pa. ra Micrococcus luteus e E.. coli ver: J.M. Luengo et al., J. Antibiotics 39 , 1565 (1986), M.J. Lopez-Nieto et al. , Appl. Microbio. Biotechnol. 22 , 343 (1985), G. Revilla et al., J. Baceteriol. 168, 947 (1986). Os resultados de vários transfor. mantes analisados sao apresentados no Quadro 6. A comparação do antibiótico activo contra 14. luteus produzido na presença e ausência de ácido fenilacético (AFA) indicou que em muitos deles há uma forte estimulação da produção de antibiótico por AFA, sugerindo que a penicilina G estava sendo produzida. 0 antibiótico produzido na ausência de AFA representa penicilina N ou isopenicilina N; ambos os compostos possuem uma actividade de antibiótico forte. Um transformante seleccionado foi cultivado num meio de produção líquido (Caltrider and Niss 1966, vide supra) suplementado com 0,8 mg/ml de AFA.

A penicilina G formada foi isolada por extracçao com éter dietílico, depois da fase aquosa ter sido ajustada a pH 2 usando ácido fosfórico.

A penicilina G pode ser extraída usando uma fase orgânica devido à sua cadeia lateral hidrofóbji ca (AFA). A cef alosporina C (que possui uma cadeia lateral hi_ drofílica (ácido y-aminoadípico)) nao e extraída para a fase orgânica.

Depois da separaçao da fase orgânica, esta é por sua vez extraída com tampao de fosfato de potássio 0,1 M de pH 7,0; esta extracção tem como resultado a transcri çao da penicilina G para a fase aquosa.

A fase aquosa continha actividade de antibiótico conforme verificado por análise biológica; M. luteus era mais sensível que E.. coli para esta actividade. Foi possível destruir a actividade por incubaçao com penicilinase comercial (Difco) específica para a penicilina. Estes resulta, dos indicam que realmente a penicilina G e formada pelo trans. formante. Para além disso, uma amostra da fase aquosa foi a na. lisada por HPLC; os resultados desta análise (tempo de retenção, perfil de eluiçao) identificam o composto antibiótico co_ mo penicilina G. Um ensaio semelhante usando caldo de fermen44

taçao da estirpe hospedeira N2 mostrou que nenhuma actividade de antibiótico estava presente e assim que nenhuma penicilina G tinha sido formada por esta estirpe. Por conseguinte, também o gene da AT de .P. chrysogenum é expresso em .A. chrysogenum e a capacidade de produzir penicilina G, que é normalmente limitada às espécies Penicillium e Aspergillus, foram trans feridas para A_. chrysogenum por transformaçao com o aglomerado de genes IPNS mais AT de .P. chrysogenum.

Quadro 6 diâmetros de zona em análise biológica*

Tr an s f orman te	M. luteus	E. coli
+ AF A	-AFA	+ AFA	-AFA
1	36	24	29	29
2	29	23,5	22	13
3	28	11,5	30	30
4	21	18	28	27
5	34	29	10	7
6	20	14	10	7
7	22	16	19	17,5
8	43	36	29	28
*nota: o diâmetro	de zona é	proporcional	ao logaritmo	da quan.
tidade de	antibiótico	que está presente.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - I^a Processo para a preparaçao de uma construção de ADN caracterizado por se incorporarem pelo menos dois genes que estão envolvidos directa ou indirectamente na via biossintética da produção de um metabolito secundário.

   -2^aProcesso de acordo com a reivindica^ çao 1 caracterizado por se incorporar um gene seleccionado de entre o grupo de genes que codificam para a síntese de isopenicilina N (IPNS), a aciltransferase (AT) e a ACVS (sintetase

   X de cj - ( L-<X-aminoadi pil)-L-cis t einil-D-vai ina ) .

   - 3^a Processo de acordo com a reivindica, çao 1 caracterizado por se incorporar pelo menos uma combinação dos genes que codificam para a sintetase de isopenicilina N (IPNS) e a aciltransferase (AT) ou uma combinação dos genes que codificam para a sintetase de isopenicilina N (IPNS), a aci1transferase (AT) e a ACVS.

   - 4^a Processo de acordo com a reivindica, ção 1 caracterizado por a construção de ADN obtida ser pGJO2 A, pGJO2 B ou HM 193.

   - 5^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por se incorporar um fragmento de ADN que complementa uma mutaçao de tipo nao produtor

   Processo para a preparaçao de um vector que contém uma construção de ADN preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por se incorporar um marcador para a selecção num hospedeiro que pro duz o referido metabolito secundário e/ou uma sequência para melhorar a eficiência de transformaçao do referido vector no referido hospedeiro.

   - 7^a Processo para a preparaçao de um hospedeiro transformado caracterizado por se utilizar na trans formaçao uma construção de ADN preparada de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1 a 6.

   - 8^a Processo de acordo com a reivindica, çao 7 caracterizado por o referido hospedeiro ser um Penicil1i um , As per g i11u s , Acremonium, ou um Actinomicete, de preferência Penicillum chrysogenum.

   - 9^a Processo para o isolamento de genes biossintéticos de penicilina diferentes dos genes que codificam para a sintese de isopenicilina N (IPNS) e a aciltransfe— rase (AT) caracterizado por compreender as fases de:

   (a) isolamento de uma construção contendo pelo menos um gene que codifica para a sintetase de isopenicilina N (IPNS), a aciltransferase (AT) ou a ACVS; e (b) utilização de técnicas de deslocamento de cromossomas para isolar uma construção de ADN contendo um outro gene directa ou indirectamente envolvido na biossíntese da penicilina.

   - 10^a Processo para a preparaçao de uma construção de ADN caracterizado por se incorporar um gene obtido de acordo com o processo da reivindicação 9.

   - 11^a Processo para a preparaçao de um hospedeiro transformado caracterizado por se utilizar na transformaçao uma construção de ADN preparada de acordo com o processo da reivindicação 10.

   - 12^a Processo para a obtenção ou para a elevaçao da produção de um metabolito secundário num hospedei, ro microbiano caracterizado por compreender as fases de:

   preparaçao de construções de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5;

   transformaçao de um candidato a hospedeiro com es tas construções de ADN;

   clonagem dos transformantes resultantes; e identificação de clones que produzem o referido metabolito secundário num nível mais elevado do que o referido candidato a hospedeiro.

   - 13^a Processo para melhorar o rendimento de um metabolito secundário antibiótico por compreender as fa. ses de :

   cultura de um hospedeiro transformado contendo uma cópia extra de uma sequência contendo pelo menos dois genes que codificam para uma proteína directa ou indirectamente envolvida na via biossintética da produção de um metabolito secundário antibiótico dando como resultado uma produção mais elevada do referido antibiótico; e isolamento do produto antibiótico resultante.

   A requerente reivindica as priorida. des dos pedidos de patente europeia apresentados em 11 de Agosto de 1988 e em 21 de Abril de 1989, sob os n²s.88201714.8 e 89201044.8, respectivamente.

   Lisboa, 9 de Agosto de 1989 0 AGENTE OríClAL DA PROPEIEDADE L'.D ISTUIAJL