PT90746B

PT90746B - Processo para a preparacao de compostos macrolidos e de composicoes farmaceuticas, veterinarias e pesticidas que os contem

Info

Publication number: PT90746B
Application number: PT90746A
Authority: PT
Inventors: Richard A Fletton; David Noble; Gordon C Lawrence; Michael John Dawson; Stephen Joseph Lane
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1988-06-03
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1994-10-31
Also published as: ATE144985T1; ES2094729T3; GR3022392T3; EP0345078B1; HU205390B; HUT57833A; AU3599789A; DK273189A; GB8813150D0; JPH0285289A; DE68927420D1; EP0345078A3; CA1318628C; AU628823B2; DD284049A5; KR900000368A; US5108992A; BR8902534A; DK273189D0; IE891747L

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 746

REQUERENTE: AMERICAN CYANAMID COMPANY, norte-americana, estabelecida em One Cyanamid Plaza, Wayne , New Jersey 07470, Estados Unidos da América.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSROS

MACROLIDOS E DE COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS, VETERINÁRIAS E PESTICIDAS QUE OS CONTEM

INVENTORES: Gordon C.Lawrence, Michael John Dawson.David Noble, Richard A. Fletton e Stephen Joseph Lane.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Inglaterra em 03 de Junho de 1988, sob o n^s. 8813150.3.

INPI. MOO. 113 RF 1C732

Descrição referente à patente de invenção de AMERICAN CYANAMID COMPANY, norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em One Cyanamid Plaza, Wayne, New Jersey 07470, Estados Unidos da América (inventores: Gordon C. Lawren ce, Michael John Dawson,

David Noble, Richard A. Pletton e Stephen Joseph Dane, residentes na Inglaterra), para, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS MACROLIDOS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, VETERINÁRIAS E PESTICIDAS QUE OS CONTEM»

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo processo para a preparação de novos compostos macrólidos e a composição que os contêm.

Na Descrição da Patente UK 2166456 da requerente descreve—se a preparação de uma classe de substâncias, que se designa como Antibióticos S541, que podem ser isolados de produtos de fermentação de uma nova espécie Streptomyces. Na Descrição da Patente UK 2176182 e na Descrição da Patente Europeia 215654 da requerente descrevem-se derivados de antibióticos S541 preparados a partir de Antibióticos S541

por procssso químicos e bioquímicos. Encontrou-se agora um grupo adicional de compostos que podem ser preparados a partir de compostos descritos na Especificação de Patente UK aci ma mencionada. Os compostos de acordo com a invenção têm também utilização particular como intermediários na preparação de outros compostos com actividade antibiótica.

Assim, de acordo com umdos aspectos da presente invenção proporcionam-se com a fórmula (l)

e os seus sais, na qual

R¹ representa um grupo metilo, etilo ou isopropilo cada substituido por um grupo hidroxilo ou R¹ é um grupo -(CH₉)nR^ ou um grupo (em que n é zero ou e R e um grupo escolhido de entre CHO e C0₂H);

Y¹ é -CH₂-, Y^ é -CH- e X representa — C— (em que R representa um átomo de hidrogénio ou um gruo “ o po OR (em que OR é um grupo hidroxilo ou um grupo hidroxilo substituido com até 25 átomos de carbono), e R representa um z 2 3 átomo de hidrogénio ou R e R juntamente com o átomo de carg bono a que estão ligados representam >-0=0, zC=CH₉ ou / C=5T0R , q , , ^ά em que R representa um atomo de hidrogénio, um grupo alquilo C^_g ou um grupo alcalino C^_g, e o’grupo zC=K0R esta na con figuração Έ ou -Y^3- -X-Y^- representa -CH=CH-CH- ou -0^-011=0-;

4- 8

R⁴ representa um grupo OR como acima definido e R^ representa um átomo de hidrogénio, ou R^ e R^ juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados represen

9a □ Q J rj t tam 70=0 ou >C=N0R , em que R e como acima definido para

RR^b representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo.

grupo R quando presente nos compose tos com a fórmula (I) pode representar um grupo acilo por exem em pio um grupo com a fórmula CO- ou R^^ OCO- ou R³^ OCSque rIO é um grupo alifático, aralifático ou aromático, por exemplo um grupo alquilo, alcenilo, cicloalquilo, aralquilo ou arilo, um grupo formilo, um grupo R¹^ que é como acima definido para R , um grupo E SO^- (em que R é alquilo C^-4 ^ou um grupo arilo C,- ,_η), um grupo sililo, um grupo acetal cícliθ 13 13 co ou acíclico, um grupo -CO(CH ) C0_oR (em aue R ^J é um átomo de hidrogénio ou um grupo como acima definido para R e n representa zero, 1 ou 2) ou um grupo R^ R^ HCO- (em que R^ e R podem cada um representar independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^_^).

Quando R¹⁰ ou R¹¹ são grupos alquilo, eles podem por exemplo ser grupos alquilo C^_g, por exemplo grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo t-butilo, ou n-bentilo em que os grupos alquilo podem também ser substituídos. Quando é um grupo alquilo substituido ele pode ser substituido com, por exemplo, um ou mais, por exem

pio dois ou três, átomos de halogéneo (por exemplos átomos de cloro ou de bromo), ou um grupo carboxi, alcoxi (p°^r exemplo metoxi, etoxi), fenoxi ou sililoxi. Quando R^x é um grupo alquilo substituido ele pode ser substituido por um grupo cicloalquilo por exemplo ciclopropilo.

Quando e R^^ são grupos alcenilo ou alcinilo, eles têm preferivelmente 2-8 átomos de carbono e quando e R¹¹ são grupos cicloalquilo, eles podem ser por exemplo cicloalquilo C·^^, como por exemplo cicloalquilo cicloalquilo P^{or exem}Pl° gnupos ciclopentilo.

Quando Ε^θ e são grupos aralquilo, eles têm preferivelmente 1-6 átomos de carbono no radical alquilo, e os grupos arilo podem ser carboxílicos ou heterocicli cos e contêm preferivelmente 4-15 átomos de carbono por exemplo fenilo. Exemplos desses grupos incluem fenilo g por exemplo grupos benzilo.

Quando R^^ e R^^ são grupos arilo, eles podem ser grupos carbociclicos ou heterociclicos e têm preferivelmente 4-15 átomo de carbono, por exemplo fenilo.

z 12

Quando R á um grupo R SC^^-» ele pode ser por exemplo um grupo metilsulfonilo ou p-toluenossulfonilo.

Q

Quando R representa um grupo acetal cíclico, ele pode ser por exemplo 5-7 membros no anel como no grupo tetrahidropiranilo.

Quando R representa um grupo sililo ou contem um substituinte sililoxi, o grupo sililo pode conter três grupos que podem ser iguais ou diferentes, escolhi dos de entre alquilo, alcelilo, alcoxi, cicloalquilo, aralquilo, arilo, e ariloxi. Esses grupos podem ser como acima defini dos e incluem particularmente metilo, t-butilo e fenilo. Exemplos particulares desses grupos sililo são trimetilsililo e t-butildimetilsililo.

g

Quando R representa um grupo -CO(CH₉)

3 13 S

CO₉R , ele pode ser por exemplo um grupo -COCO?R ou -COCH„CH₂C0₂R^±9 em que R^x? representa um átomo de hidrogénio úm grupo alquilo Cq__4 (por exemplo metilo ou etilo).

Quando R^ representa um grupo R^^ R^ NCO-, rI^ e R¹^ podem por exemplo ser cada um independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo ou etilo.

9a

Quando R e R representa um grupo alquilo θ ele pode ser por exemplo um grupo metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo ou t-butilo, e é preferivelmente um grupo metilo.

Qa

Quando R e R·⁷ representa um grupo alcenilo C^_g ele pode ser por exemplo um grupo alilo?

grupo R^ pode ser por exemplo -ch₂ch₂oh, -ch(oh)ch₅, -ch(ch₃)ch₂oh, ch₅c(oh)ch₃, -ch₂h, -ch₂co₂h ou -ch(ch₃)co₂h.

Os compostos com a fórmula (l) contendo um grupo acídico podem formar sais com bases adequadas. Exemplos desses sais incluem sais de metais alcalinos como por exemplo sais de sódio e de potássio.

Nos compostos com a fórmula (l) R^ representa preferivelmente -CH(CH^)CH₂0H, CH^Ç(OH)CH^ ou -ch(ch₃)co₂h.

R representa preferivelmente um grupo aciloxi (por exemplo um grupo acetiloxi) ou um grupo metoxi ou mais preferivelmente um grupo hidroxilo.

Um grupo importante de compostos com a 1 o fórmula (l) é aquele em que Y é -CH_O-, Y é -CH- e X represen r2 ² ta '^Z-C- . Os compostos particularmente importantes deste ti2 r po são aqueles em que R é um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi, etoxi ou acetiloxi e R é um átomo de hidrogénio ou e R^ juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados representam zC=O, ;xC=CH₂ ou >C=NOCH.

A actividade antibiótica dos compostos com a fórmula (I) podem, por exemplo, ser demonstrada pela sua actividade contra nematodos parasitários como por exemplo Caenorhabditis.elegans.

Os ectoparasitas e os endoparasitas infectam seres humanos e vários animais e são particularmente importantes em animais da pecuária como por xexmplo porcos, ovelhas, vacas, cabras e aves (por exemplo galinhas e perus), cavalos, coelhos, aves de caça, e aves de gaiola, e animais domésticos como por exemplo caãs, cobaias, macocos e hamsteres. A infecção parasítica do gado, conduzindo à anemia, má nutrição e perda de peso é uma causa importante de perdas económicas no mundo.

Exemplos de géneros de endoparasitas que infectam esses animais e/ou seres humanos são Ancylostoma, Ascaridia , Ascaris, Aspicularis, B-rugia, Bunostomum, Chabertia Capillaria, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Bracunculus, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Boa, Necator, Nematodirus, Nematospiroides (Heligomoroides), Nippostrongylus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Qxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema,

Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria e Wuchereria.

Exemplos de ectoparasitas que infectam animais e/ou seres humanos são ectoparasitas artrópodes como por exemplo insectos mordedores, mosca da uva, moscas, piolhos percevejos, insectos sugadores, carrapatos e outras espécies dípteras.

Exemplos de géneros desses ectoparasitas que infectam animais e/ou seres humanos são Ambylomma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Binognathus, Bucilia, Melophagus, Oestrus, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Stomoxys e Tabanus.

(i) têm também utilização no combate de pestes de insectos, acarinos e nematodos na agricultura, horticultura, florestas, saúde pública e produtos armazenados. As pestes do solo e de culturas de plantas, incluindo cereais, por exemplo (trigo, cevada, milho e arroz) vegetais (soja), frutos (por exemplo maçãs, vinhas e citrinos) bem como culturas de raízes (por exemplo beterraba, batatas) podem também ser tratadas com utilidade. Exemplos particulares dessas pestes são insectos dos frutos e áfidos tais como Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae e membros dó género Trialeuroides; nematodos como por exemplo membros do género Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne, e Panagrellus; lepidópteros como por exemplo Heliothis, Plutella e Spodoptera; insectos dos grãos como por exemplo Anth&nomus grandis e Sitophilus granarius; formigas da farinha como por exemplo Tribolium castaneum moscas como por exemplo a mosca doméstica; aranhas, como por exemplo aranha dos mineiros; Pear psylla; Thrips tabaci; baratas como por exemplo Blatella germânica e Periplaneta americana e o mosquitos como por exemplo Aedes aegypti.

De acordo com a invenção proporcionam-se assim compostos com a fórmula (I) como acima definida que podem ser utilizados como antibióticos. Em particular, podem ser utilizados no tratamento de animais e de seres humanos com infecçSes de endoparasitas, ectoparasiatas, e/ou fungos e na agricultura, horticultura, florestas como pesticidas para combater pestes de insectos, acarinos e nematodos. Eles podem também ser utilizados geralmente como pesticidas para combater ou controlar pestes em outras circunstâncias, por exemplo, em armazéns, edíficios ou outros lugares públicos ou locais das pestes. Em geral os compostos devem ser aplicados ao hospedeiro (animal ou ser humano ou a plantas ou outros vegetais) ou às próprias pestes no seu local de existência.

Os compostos da invenção podem ser formulados para administração de qualquer modo conveniente ou para medicina veterinária ou humana e a invenção inclui assim no seu âmbito composições farmacêuticas compreendendo um composto de acordo com a invenção adaptado para o uso em medicina humana ou veterinária. Estas composições podem apresentar-se para utilização de modo convencional com a ajuda de um ou mais veículos ou excipientes adequados. As composições da invenção incluem as que são especialmente formuladas para a utilização parentérica (incluindo administração intramamária), oral, rectal, tópica, implantações, oftálmicas, nasais ou genito-urinárias.

Os compostos com a fórmula (I) podem ser formulados para utilização em medicina humana ou veterinária de acordo com os processos gerais descritos na Especificação da Patente UK 2166436.

As dosagens diárias totais dos compostos da invenção utilizadas em medicina veterinária ou humana estarão adequadamente na gama de l-2000jug/kg de peso corpóreo preferivelmente de 50-1000^ug/kg e estas podem ser dadas em doses divididas, por exemplo 1-4 vezes ao dia.

Os compostos de acordo com invenção podem ser formulados de qualquer modo conveniente para utilização hortícula ou em agricultura e a invenção inclui assim no seu âmbito composições compreendendo um composto de acordo com a invenção adaptado para utilização hortícula e agricola. Essas formulações incluem tipos secos ou líquidos, por exemplo pós, incluindo bases de pós ou concentrados, pós finos, incluiú do pós solúveis ou molháveis, granulados, incluindo microgrânulos e grânulos dispersáveis, agregados, pós fluídos, emulsões como por exemplo emulsões diluídas ou concentrados emulsionáveis, soluções de imersão eomo por exemplo para imersão de raízes e de sementes, tratamento de sementes, agregados de sementes, concentrados de óleos, soluções oleosas, injecções, por exemplo injecções no caule, pulverizações, fumigações e nebulizações.

Geralmente estas formulações incluirão o composto em associação com um veículo ou diluente adequado. Esses veículos e diluentes são como descritos na Especificação da Patente UK 2166436.

Nas formulações, a concentração do material activo é geralmente de 0,01 a 990 e mais preferivelmente entre 0,010 e 400 em peso.

0s produtos comerciais proporcionados como composições concentradas para serem diluidas para uma concentração adequada, por exemplo de 0,001 a 0,00010 em peso para utilização.

A taxa a que se aplica o composto depen de de vários factores incluindo o tipo de peste envolvida e o grau de infestação. Contudo, em geral, é adequada uma taxa de aplicação de 10 g/ha até 10 kg/ha; preferivelmente de 10 g/ha a 1 kg/ha para controlo de mosquitos e insectos e de 50 g/ha até 10 kg/ha para controle de nematodos.

Para utilização em medicina veterinária ou para utilização hortícula e agrícola pode ser desejável utilizar um caldo de fermentação global, como fonte do composto activo. Pode ser também adequado utilizar um caldo seco ( contendo micélios) ou utilizar micélios separados do caldo e pasteurizados ou mais preferivelmente, secos, por exemplo por pulverização, liofilização ou laminagem. Se desejado, o caldo ou micélios podem ser formulados em composições incluindo veículos, excipientes ou diluentes convencionais como acima descrito .

Os compostos antibióticos da invenção podem ser administrados ou utilizados em combinação com outros ingredientes activos.

Em particular, o composto antibiótico da invenção pode ser utilizado em conjunto com outros compostos antibióticos. Este facto pode ocorrer, por exemplo quando se utiliza o caldo da fermentação global sem a separação pré—

na qual X, y\ Y², R^ e R^ são como acima definidos e R^ é um grupo metilo, etilo ou isopropilo, num meio adequado na presen ça de um micro-organismo ou uma enzima dele derivado ou uma preparação derivada de um micro-organismo contendo uma enzima susceptível de efectuar a conversão.

Os micro-organismos e os seus extractos adequados para uso no processo de acordo com a invenção podem ser identificados por ensaios preliminares de pequena escala concebidos para demonstrarem a capacidade de um micro-organismo ou de um seu extracto para converter os compostos com a fórmula (2) em compostos com a fórmula (l). A formação dos compostos com afórmula (l) pode ser confirmada por análise cr£ matográfica adequada, (por exemplo cromatografia líquida de alto rendimento) da mistura reaccional. Deslizou-se que micro-organismos do génus Streptomyces e seus extractos são particularmente adequados para utilização no processo de acordo com a invenção.

Os micro-organismos Streptomyces particulares para utilização no processo da presente invenção incluem estirpes de Streptomyces avermitilis, Streptomyces cirratus, Streptomyces halstedii, Streptomyces antibioticus, Streptomyces lavendulae, Streptomyces alboniger, Streptomyces

nellum, Pellicularia filamentosa, Aspergillus fumigatus,

Hyphode rma, roseum Aspergillus phoenicis, Aspergillus niger, Aspergillus giganteus, Glomerulus cingulata, Colletotrichum lini, Cochliobolus lunatus, Tieghemella orchidis, Cereospora kaki, Fusarium ciliatum, Fusarium lini, Pusarium oxysporum, Colletotrichum phomoides, Helminthosporium sativum, Giberella zeae, Leptoporus fissilis, Penicillium lilacinum e Nigrospora sphaerica. Um fungo particularmente adequado para utilização no processo de acordo com a invenção é Absidia cylindrospora♦

Exemplos de preparação de células para utilização no processo de acordo com a invenção incluem Phase olus vulgaris 1., Citrus paradisi, Nicotiana tabacum L., Coptis japonica, Digitalis purpurea e Dioscorea tokoro.

A bioconversão pode também ser efectuada utilizando um organismo contendo o material genético de um dos micro-organismos acima mencionados que participa na síntese do composto com a fórmula (l). Esses organismos podem ser obtidos utilizando técnicas de engenharia genética incluindo as referidas por D. A. Hopwood em Cloning genes para Antibiotic Biosynthesis em Streptomyces Spp.: Production of a hybrid antibiotic p409-413 em Microbiology 1985, Ed. L. Lieve, American Society of Microbiology, Washington D. C. 1985. Essas técnicas podem ser utilizadas de modo semelhante ao descrito anteriormente para clonar genes bisosintéticos antibióticos, incluindo os genes biosintéticos para a actinorodina (Malpartida, P. e Hopwood, L. A. 1984, Nature 509, p462-464), eritromicina (Stanzak, R. e Col., 1986, Biotechnology, 4, p229-232) e uma enzima importante envolvida na produção de penicilina e cefalosporina em Acremonium chrysogenum (Sansom, S. M. e. col. 1985, Nature, 318, pl91-194).

As enzimas adequadas para uso no proces;

so de acordo com a presente invenção podem ser derivados de uma grande gama de fontes. Os micro-organismos Streptomyces acima mencionados, representam, contudo, uma fonte particularmente adequada de enzimas suceptíveis de converter os coçipos13 -

tos com a fórmula (2) em compostos com a fórmula (l).

Numa realização prática do processo de acordo com a invenção, a conversão de um composto com a fórmula (2) num composto com a fórmula (l) pode ser efectuada introduzindo o composto com a fórmula (2) por exemplo num solven te adequado num meio de fermentação compreendendo um microorganismo de fermentação acima mencionado na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais minerais. As fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais minerais podem ser proporcionadas por nutrientes simples ou complexos. As fontes de carbono incluem geralmente glicose, maltose, amido, glicerol, molasses, dextrina, lactose, sacarose, frutose, ácidos carboxílicos, aminoácidos, glicéridos, álcoois, alcanos e óleos vegetais. As fontes de carbono compreenderão geralmente de 0,5 a 10% em peso do meio de fermentação.

As fontes de azoto incluirão geralmente farelo de soja, licores de tratamento de milho, solúveis destiláveis, extractos de levedura, farelos de algodão, peptonas, farelo de noz moida, extracto de malte, molasses, caseina, misturas de aminoácido, amoníaco (gás ou solução), sais de amónio ou nitratos. Podem também utilizar-se a ureia e outras amidas. As fontes de azoto compreenderão geralmente de 0,1 a 10% em peso do meio de fermentação.

Os sais minerais nutrientes que podem ser incorporados no meio de cultura incluem os sais geralmente utilizados susceptíveis de produzirem iSes de sódio, potássio, amónio, ferro, magnésio, zinco, níquel, cobalto, manganês, vanâdio, crómio, cálcio, cobre, molidénio, boro, fosfato, cloreto, e carbonato.

Pode adicionar-se um anti-espumante para controlar a humidificação excessiva e adicionar-se em intervalos como pretendido.

composto com a fórmula (2) num solven te como por exemplo um solvente orgânico miscível com a água (por exemplo um álcool como por exemplo metanol ou propan-2-ol

Quando se utilizam células de plantas como parte do processo de fermentação é desejável que a cultura seja efectuada utilizando um meio de plantas contendo um revelador de crescimento de células de plantas como por exemplo o ácido indole acético, ácido naftaleno acético, ácido indole butírico, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, cinetina ou benzilamino purina a uma temperatura entre 15 e 35^QC, sendo o valor do pH mantido na gama de 5,0 a 7,5. Os sais de amónio e nitratos também constituem as fontes preferidas de azoto pre. sente no meio de fermentação. A sacarose, frutose e glicose também constituem fontes preferidas de carbono presente no meio de fermentação.

Numa realização prática preferida adicional de acordo com a invenção, a conversão de um composto com a formula (2) num composto com a fórmula (l) pode ser efe£ tuada combinando e incubando um composto com a fórmula (2) por exemplo num solvente adequado (por exemplo um solvente orgânico miscível com a água como anteriormente definido) com uma preparação de uma enzima susceptível de efectuar a conversão, desejavelmente numa solução tampão, a, por exemplo, 02 a 602C, preferivelmente 202 _a 402C por exemplo cerca de 2820. A reacção será geralmente efectuada numa gama de pH de 3,5 a 8,5 por exemplo 5,5 a 7,5.

Se desejado, a reacção pode ser efeetujj da na presença de um co-factor como por exemplo NADH ou NADPH. Quando a reacção estiver completa, isto é, quando o composto com a fórmula (2) já não for convertido para o composto da invenção (como determinado por monitoração de extractos da mistu ra reaccional por cromatografia líquida de alto rendimento e espectroscopia uv a 238 nm) o produto é recuperado por isolamento e separação convencionais como descrito nas Especificações das Batentes UK 2166436 e 2176182.

A enzima a utilizar no processo da presente invenção pode ser preparada, por exemplo, por cultura de um microorganismo que produz a enzima num meio nutriente. As

condições do meio nutriente adequado e das condições de fermentação para a preparação da enzima incluem as anteriormente descritas para a preparação de um composto com a fórmula (l) a partir de um composto com a fórmula (2) na presença de um microorganismo. 0 tempo a que a actividade enzimatica necessá. ria atinge o valor máximo variará, obviamente, com o microorganismo utilizado, e, assim, o tempo de cultura óptimo é desejavelmente determinado independentemente para cada estirpe utilizada.

Para os microorganismos em que a enzima é extracelular, o meio de cultura líquida para o filtrado após a remoção das células globais pode ser utilizado como fonte do enzima. Quando a enzima está ligado às células ela pode ser utilizada para utilização por processos convencionais como por exemplo sonificação, moagem com pérolas de vidro, homogeneização, tratamento com enzimas líticos ou com detergentes, após suspensão das células num tampão adequado.

A preparação resultante, com ou sem remoção de resíduos de células, pode ser utilizada como fonte de enzima. Ê preferido, contudo purificar a enzima ainda mais por processos convencionais. A cromatografia descontínua ou de coluna com celuloses de permuta iónica ou absorvente de afinidade ou outros absorventes por exemplo hidroxilapatite, podem ser convenientemente utilizadas. Além disso, a enzima pode ser concentrada ou ser ainda mais purificada por técnicas de peneiro moleculares por exemplo por ultrafiltração ou dessalificação. Em geral, durante os procedimentos de purificação é desejável manter o valor do pH na gama de 3 a 11.

A enzima pode ser utilizada numa forma imobilizada, por exemplo por insolubilização ou arrastamento ou ser utilizada numa matriz adequada. Assim, pode ligar-se o extracto de enzima num polímero inerte, orgânico ou inorgânico fixado ou em fibra, ou numa membrana ou polímero como por exem pio gel de poliacrilamida, absorvido numa resina de permuta iónica, recticulada com um reagente como por exemplo o glutara.

ldeído, ou ocludida num envelope como por exemplo uma pérola. As enzimas imobilizadas podem ser utilizadas com vantagem nos processos descontínuos, após o que se pode reutilizar a enzima, e nos processos contínuos em que os substratos passam atra vés de uma coluna que contem a enzima imobilizada.

Num processo adicional, os compostos com a fórmula (l) em que OR é um grupo hidroxilo substituído podem ser geralmente preparados fazendo reagir o composto de

5- e/ou 23-hidroxi correspondente com um reagente que sirva para formar um grupo hidroxilo substituido, seguido se necessário da remoção de quaisquer grupos protectores presentes.

A reacção será em geral uma reacção de acilação, sulfonilação, eterificação, sililação ou acetalação, e a reacção pode ser efectuada de acordo com os processos gerais descritos na Especificação da Patente 2176182.

Num processo ainda adicional, os compos tos com a fórmula (l) em que R^ e R⁹ juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados representam >C=0 podem ser preparados por oxidação dos compostos 5-hidroxi corresponden4 z tes em que R e um grupo hidroxilo.

A reacçSo pode ser efectuada com um a agente oxidante que sirva para converter um grupo hidroxilo secundário e alílico num grupo oxo, obtendo-se assim um composto com a fórmula (l).

Os agentes oxidantes adequados incluem, por exemplo, óxidos de metais de transição, como por exemplo dióxido de manganês, e oxigénio atmosférico na presença de um catalizador adequado como por exemplo um metal finamente dividido por exemplo platina.

agente oxidante será geralmente utili zado em excesso em relação à quantidade estequiométrica.

A reacção pode convenientemente ser efectuada num solvente adequado que pode ser escolhido de entre uma cetona, por exemplo acetona; um éster, por exemplo, o

neto, por exemplo, hexano; um hidrocarboneto halogenado por exemplo clorofórmio ou cloreto de metileno; ou um éster, como por exemplo, acetato de etilo. As combinações destes solventes isolados ou com água podem também ser utilizados.

A reacção pode ser efectuada a uma tem peratura de entre -502C a +502C, preferivelmente de 02C a 502C.

Em outro processo de acordo com a inven ção pode preparar-se um composto com a fórmula (l) em que X representa o grupo >C=NOR^ e £⁹ é um grupo OR® ou R^ e R^ jun tamente com o átomo de carbono a que estão ligados represen₂ tam >0=0, ou X representa -C- , em que R é um atomo de hidrogénio ou um grupo 0R° e R^ é um átomo de hidrogénio ou R e R juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados representam >C=NOR^, ou -Y^-X-Y^- representa -CH =CH-CH- ou -CH„-CH=C- e R e R juntamente com o átomo de carbono a que

Q g estão ligados representamy C=NOR , mas incluindo os compostos em que R' é um grupo CHO, a partir dos compostos correspondentes a 5 e/ou 23-ceto com a fórmula (l) por reacção com um rea gente ^NOR^, (em que R^ é como anteriormente definido).

A reacção de oximação pode ser convenientemente efectuada a uma temperatura na gama de-20 a +1002C, por exemplo -10 a 502C. É conveniente utilizar o reagente q

H^NOR na forma de um sal, por exemplo um sal de adição de ácido como por exemplo um cloridrato. Quando se utiliza esse sal a reacção pode ser efectuada na presença de um agente ligante de ácido.

Os solventes que podem ser utilizados incluem álcoois (por exemplo metanol, ou etanol), amidas (por exemplo Ν,Ν-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida ou hexametilfosf oramida), éteres (por exemplo éteres ciclícos ou acíclicos como por exemplo tetrahidrofurano ou dioxano, e éteres acíclicos como por exemplo dimetoxietano ou éter dietílico),

nitrilos (por exemplo acetonitrilo), sulfonas (por exemplo sulfolano) e hidrocarbonetos como por exemplo hidrocarbonetos halogenados (por exemplo cloreto de metileno), bem como mistu ras de dois ou mais desses solventes. Pode também utilizar-se a água como co-solvente.

Quando se utilizam condições aquosas a reacção pode ser convenientemente tamponada com base, ácido ou tampão adequados.

Os ácidos adequados incluem ácidos inoi gânicos, como por exemplo ácido clorídrico ou sulfúrico, e ácido carboxílicos como por exemplo ácido acético. As bases adequadas incluem carbonatos e bicarbonatos de metais alcalinos como por exemplo bicarbonato, de sódio, hidróxidos como por exemplo hidróxido de sódio, carboxilatos de metais alcalinos como por exemplo acetato de sódio. Um tampão adequado é o acetato de sódio/ácido acético.

Deve notar-se que quando os compostos com a formula (1) em que Σ representa >.C=NOR e R e R junta.

mente com o átomo de carbono a que estão ligados representam 9a >C=NOR são preparados a partir daa 5,23-dicetonas correspondentes (isto é compostos com a fórmula (l) em que Σ repre4 5 senta >G=0 e R e R juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados representam ^C=0) e os grupos 7C=NOR^ e >C=NOR^^aserão os mesmos.

Num processo ainda adicional de acordo com a invenção pode preparar-se um composto com a fórmula (l) em que x representa o grupo 7C=0 (mas excluindo os compostos γ em que R é um grupo CHO) oxidando um composto com a fórmula

R² R⁵

X 2 (1) em que Σ representa -C- (em que R é um grupo hidroxilo e R é um átomo de hidrogénio), seguindo se necessário pela remoção de quaisquer grupos protectores presentes. A reacção pode ser efectuada com um agente que sirva para converter um grupo hidroxilo secundário num grupo oxo, obtendo assim um composto com a fórmula (l).

Os agentes oxidantes adequados incluem I

I quinonas na presença de água, por exemplo 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona ou 2,3,5,6-tetracloro-l,4-benzoquinona; um agente oxidante de crómio (VI) por exemplo dicromato de piridínio ou trióxido de crómio em piridina; um agente oxidante de manganês (IV), por exemplo dióxido de manganês em diclorometano; um N-halosuccinimida, por exemplo uma N-clorosuccinimida ou N-bromosuccinimida; um sulfóxido de alquilo por exemplo sulfóxido de dimetilo, na presença de um agente activante como por exemplo NjNJ-diciclohexilcarbodiimida ou um halogeneto de acilo, por exemplo cloreto de oxalilo; ou um complexo de trióxido de enxofre-piridina.

A reacção pode ser convenientemente efectuada por um solvente adequado que pode ser escolhido de entre uma cetona, por exemplo acetona, um éter, por exemplo éter dietilico, dioxano ou tetrahidro urano; um hidrocarboneto por exemplo hexano; um hidrocarboneto halogenado por exemplo o clorofórmio ou cloreto de metileno; ou um éster por exemplo acetato de etilo ou uma amida substituída por exemplo dimetilformamida. As comhinações deste solventes isolados ou com água podem também ser utilizados.

A reacção pode ser efectuada a uma tem peratura entre -802C e +502C.

Noutro processo de acordo com a invenção pode preparar-se um composto com a fórmula (l) em que X representa y 0=011^ (mas excluindo compostos em que R é um grupo CHO ou COOH) fazendo reagir o composto 23-ceto correspondente (isto é compostos com a fórmula (l) em que X representa 70=0) com um reagente de Wittig apropriado por exemplo um fosforano com a fórmula (R^a)^P=CH₂ (em que R^a é alquilo C^_g ou arilo por exemplo arilo monocíclico como por exemplo fenilo) seguindo se necessário de remoção de quaisquer grupos protectores presentes. Os solventes da reacção adequados incluem éteres por exemplo tetrahidrofurano ou éter dietilico ou um solvente aprótico dipolar por exemplo sulfóxido de dimetilo.

A reacção pode ser efectuada a uma tem peratura adequada por exemplo a O^C.

Num processo ainda adicional de acordo com a invenção pode preparar-se um composto com a fórmula (l) em que X representa -CH^- a partir dos compostos 23-OH corres^ pondentes (isto é compostos com a fórmula (l) em que X repreR² R⁵ ^2 3 z senta -C- em que R é um grupo hidroxilo e Re um átomo de hidrogénio, de acordo com os métodos gerais descritos na Especificação da Patente UK 2176182.

Num processo ainda adicional de acordo com a presente invenção pode preparar-se um composto com a fórmula (l) em que -Y¹-X-Y² representa -CH=CH-CH- ou -CH₂-CH= C- a partir de um composto 23-OH correspondente com a fórmula (l) utilizando procedimentos convencionais, como por exemplo, os descritos na Especificação da Patente Europeia 215654.

Os sais dos ácidos com a fórmula (l) podem ser preparados por processos convencionais, por exemplo tratando o ácido com uma base ou convertendo um sal em outro sal por permuta de iões.

Os compostos intermediários com a fórmula (2) em que Y^ é -CH_O-, Y² é -CH- e X representa

3 ^z

R,_{Z// 2}

-C- (em que R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OR® e R^ representa um átomo de hidrogénio ou R² e R^ juntamente com um átomo de carbono a que estão ligados representam >0=0) ou -Y¹-X-Y²- representa -CH=CH-CH- ou -CH₂-CH=C- são ou compostos conhecidos descritos nas Especificações da Patente UK 2166436 e 2176182 e Especificação da Patente Europeia 215654 ou podem ser preparados a partir desses compostos conhe. eidos por processos acima descritos.

Os compostos intermediários com a fórmula (2) em que Y^ é -CH₂~, Y² é -CH- e X representa >C=CH ou

C=N0r9 podem ser preparados a partir de compostos conhecidos com a fórmula (2) descritos na Especificação da Patente UK

2166436 e 2176182 utilizando os processos acima descritos para a preparaçao dos compostos correspondentes com a fórmula (l).

A invenção é ainda ilustrada com os seguintes Exemplos em que o composto com a fórmula (2) anterior em que R e isopropilo, Y é -CH₉-, Y é -CH-, X represen ta -C2 * 3 ζ z em que R é um grupo hidroxilo e R^J é um átomo de 4 5 hidrogénio, R é um grupo hidroxilo e R é um átomo de hidrogénio é referido como Factor A”. Os compostos de acordo com a invenção são designados com respeito ao Factor A. Todas as temperaturas são em ec.

Exemplo 1

Adicionou-se água esterilizada (5ml) a uma cultura de Streptomyces eurythermus ISP 5014 e utilizaram-se porções de 1 ml para inocularem 250 ml de frascos de agitação contendo o meio A (25 ml):

D-Glicose

Dextrose de Malte MD30E

Arkasoy 50

Molasses

KH₂P0₄

Carbonato de cálcio

Ácido/^-3-(N-Morfolino)propanasesulfónic/7 Agua destilada

2.5

25.0

12.5

1.5

0.125

1,25

21.0 como necessário

- 23 pH ajustado a 6.5 com H₂SO^ antes de tratamento com autoclaw.

Incubaram-se os frascos a 28SC durante dias agitador rotativo (250 rpm) e utilizou-se esta cultura com 2 dias de idade (100 ml) para inocular um fermentador de

contendo um Meio A (51). Continuou-se a incubação a 282C com arejamento (2 l/min.) e agitação (250 rpm) e, após 2 dias, adicionou-se uma solução do Factor A (2,5 g) em metanol (50 ml). Continuou-se a fermentação durante 7 dias, e removeu-se as células por centrifugação e extrairam-se com metanol. 0 sobrenadante aquoso, após remoção das células, foi ajustado a pH 2,0 com ácido clorídrico concentrado e extraiu-se com acetato de etilo. Evaporou-se o extracto de acetato de etilo, adicionou-se ao extracto de metanol das células e evaporou-se.

resíduo foi extraido com metanol (50 ml) e a solução resultante foi fraccionada (45 ml) após um ensaio prévio de 800 ml numa coluna de Sephadex LH20 (130 cm > 5 cm) em metanol. As fracções de 18 a 26 foram combinadas e evaporadas e o resíduo foi extraido com metanol/acetonitrilo/ dihidrogéno fosfato de amónio 0,1 M (10:2:2, 12 ml) e filtrou-se. Aplicou-se em seguida a solução a uma coluna de Spherisorb SS OLS-2 (250 mm x 20 mm) com a detenção a 255 nm como porções de 1,9 ml. Utilizou-se acetonitrilo/dihidrogéno fosfato de amónio 0,1 M (l:l) como eluente a um caudal constante de 25 ml/min. e recolheram-se os picos eluindo entre 12,2 e 12,8 min e entre 14,6 e 15,6 min para cada injecção e combina, ram-se fracções com tempos de eluição semelhantes.

material combinado com um tempo de

I eluição de 12,2-12,8 min foi diluido com um volume igual de I água feito regressar à coluna, eluido com acetonitrilo, evaporado e o resíduo foi liofilizado de acetona/ciclohexano para se obter um composto com a fórmula (l) em que R¹ é -CH(CH^)0H H

CHgOH, Y é -C^^-, X é -tí- , Y^ é -CH-, R^ é um grupo hidroxilo, R^ é um átomo de hidrogénio e R^ é um átomo de hidrogénio (19 mg) sob a forma de um sólido incolor.

Um aspecto de massa E.I. de baixa resolução tem um ião molecular a m/Z 628 e iões de fragmentos a

610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 281, 265, 151 e unidades de massa .

a cerca de (s; 3H), 1 3.3-3.6(m;

a cerca de

50.82(d7; 3H), 1.01 (d75 3H), 1.09(d7; 3H), 1.53- ί .68(s; 3H), 1.88(s; 3H), 2.7l(m; 1H), 3.27(m; 1H), 2H), 3.96(d6; 1H), 4.29(t6; 1H), 5.l6(d9; 1H).

25.05 MHz ¹³C NMR (CDCl^) tem sinais

6173.2	(s)	76.4	(d)
142.6	(d)	68.9	(d)
139.2	(s)	68.4	(? )
137.6	(s)	68.2	(?)
137.3	(s)	67.4	(?)
134.8	(s)	48.2	(t)
131.6	(d)	45.5	(d)
123.2	(d)	40.8	(t)
120.1	(d)	40.5	(t)
119.9	(d)	35.7	(?)
117.8	(d)	35.0	(d)
99.6	(a)	34.5	(t)
80.0	(s)	22.1	(q)
79.1	(d)	19.7	(q)
		16.6	(q)
		15.3	(q)
		13.9	(q)
		11.6	(q)

- 25 Por um processo semelhante, a adição do material com o tempo de eluição de 14,6—15,6 min produziu o composto com a fórmula (l) em que R¹ é CH^ÇÍOHjCH^, Y¹ é -CH₂~

X é -C- , Y² é -CH-, é um grupo hidroxilo, R^ é um átomo de hidrogénio e R^ é um átomo de hidrogénio (23,5 mg) sob a forma de um sólido incolor.

Um aspecto Ε. I. de massa com baixa resolução tem um ião molecular a m/Z 628 iões fragmentos a 610, 592, 574, 482, 464, 446, 425, 381, 354, 314, 151 e 95 unidades de massa.

250 MHz RMN (CDCl^) inclui sinais a cerca de $0.82 (d7j 3H), 1.00(d7; 3H), 1.52(s; 3H), 1.59(s; 6H), 1.84(s; 3H), 1.88(s; 3H), 3.28(m;lH), 3.73(dll; 1H), 3.96(d6; 1H), 4.29(t6; 1H), 5.56(s; 1H).

25.05 MHz ¹⁵C RMN (CDC1₃) tem sinais a cerca de 6173.0 (s), 142.5 (d), 139.l(s), 137.4 (s), 137.2 (s) 136.0(d), 134.4 (s), 123.1 (d), 119.9 (d), 117.8 (d), 99.5(s),

79.9	(s),	79.1	(d),	77.0	(d),	70.6	(s),	68.9	(d),	68.3	(?),
67.4	(d),	48.1	(t),	45.4	(d),	40.7	(t),	40.4	(t),	35.7	(?),
34.5	(t),	31.3	(q),	22.0	(q),	19.6	(q),	15.3	(q),	13.7	(q),
11.5	(q).

Exemplo 2

Adicionou-se o Pactor A (2,5 g) em sulfóxido de dimetilo (50 ml) a uma cultura de Streptomyces avermitilis ATCC 31272 que se desenvolveu de acordo com o método descrito no Exemplo 1 anteror. A fermentação foi continuada durante mais 5 dias e as células foram removidas por centrifugação .

(i) As células foram armazenadas em metanol durante 16 h e em seguida filtradas para produzirem 800 ml de filtrado. Adicionou-se água ao filtrado (até um peso específico de 0,90) e lavou-se a mistura com hexano e evaporou -se para se remover o metanol. Extraiu-se o resíduo aquoso com acetato de etilo e lavaram-se os extractos combinados de ace- 26 -

tato de etilo com água e evaporaram-se para se obter um óleo. Dissolveu-se o óleo em metanol/acetonitrilo/água (2:1:1, 7,5 ml), filtrou-se, e aplicou-se o filtrado a uma coluna de Sphe risorb S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm) com detecção a 238 nm em por ções de 2,5 ml. Utilizou-se o acetonitrilo/água (l:l) como eluente a um caudal constante de 30 ml/min e recolheram-se os picos eluindo entre 10,5-12,5 e entre 25,8-26,7 min para cada injecção e combinaram-se as fracções com tempo de eluição idênticos.

As fracções combinadas com tempo de eluição de 10,5-12,5 min foram evaporadas para remover o acetonitrilo e extraiu-se o resíduo aquoso com acetato de etilo e evaporou-se o extracto de acetato de etilo até à secura.

Diofilizou-se o resíduo de acetona/ciclohexano para se obter um composto com a fórmula (l) em que 0H_Z/ H

R¹ é -CH(CH,)CH„0H, Y¹ é -CH_O-, X é -C- , Y² ó -CH-, R⁴ é um grupo hidroxilo, R³ ó um átomo de hidrogénio e R° é um átomo de hidrogénio (29,6 mg) sob a forma de um sólido incolor que por análise de h.p.l.c. se verificou ser idêtico ao composto obtido no Exemplo 2 (ii) anterior que eluia entre 15,6 e 17 min.

As fracções combinadas com tempo de eluição de 25,8-26,7 min foram diluídas com um volume igual de água e feitas regressar a uma coluna de Spherisorb S5 ODS-2 (100 mm x 4,6 mm) eluindo com acetonitrilo. Evaporou-se o eluato e liofilizou-se o resíduo de acetona/ciclohexano para se obter um composto com a fórmula (l) em que R¹ é -CH(CH^)CH₂0H,

-i 0H/_Z/ q . !_

Y ó -CH^-, X e —C— , Y é -CH-, R⁴ θ um grupo metoxi, R⁵é um átomo de hidrogénio e R^ é um átomo de hidrogénio (4,4 mg sob a forma de um sólido.

Um espectro de massa E.I. de baixa ressolução tem um ião molecular a m/z 642 e iões de fragmento a

624, 606, 482,464,439,354,314, 281, 513, 263, 151 e 95 unidades de massa.

250 MHz ¹H RMN (CDCl^) deu sinais a cerca deô0.8l(d7; 3H), 1.0l(d7; 3H), 1.07(d7? 3H), 1.52(s; 3H), 1.66(s; 3H), 1.80(s; 3H), 2.7l(m; IH), 3.3l(m; IH), 3.50 (s; 3H), 3.96(d6; IH), 4.02(d6; IH), 4.95(m; IH), 5.39(m; IH).

(ii) 0 sobrenadante aquoso, após remoção das células, foi extraido com acetato de etilo e os extraç. tos foram evaporados para se obter um óleo. Lissolveu-se o óleo em acetonitrilo/dihidrogénio fosfato de amónio 0,1 M (2:1, 15 ml), filtrou-se a aplicou-se o filtrado a uma coluna de Spberisorb S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm) com detecção a 238 nm sob a forma de volumes de 4,5 ml. Utilizou-se o acetonitrilo/ dibidrogénio fosfato de amónio 0,1 M/água (5:5:1) como eluente a um caudal constante de 30 ml/min e os picos eluindo entre 11,2-12,6 min e entre 15,6-17 min de cada injecção foram recolhidos as fracções com tempo de eluição idênticos foram misturadas.

material misturado com tempo de eluição de 11,2-12,6 min foi evaporado para remover o acetonitrilo e extraiu-se o resíduo aquoso com acetato de etilo. lavaraç -se os extractos combinados de acetato de etilo com água, secaram-se, evaporaram-se e liofilizou-se o resíduo para se obter um composto com a fórmula (l) em que R¹ é -CH( CH, )C0 H, 0H,_z H 12

Y¹ é -CH₉-, X é -G- , Y² é -CH-, R^ é um grupo hidroxilo,

R^p é um átomo de hidrogénio e R° é um átomo de hidrogénio (13 mg) sob a forma de um sólido incolor.

Um espectro de massa E;I. de baixa ressolução tem um ião molecular a m/Z 642 e iões de fragmento a 624, 606, 514, 496, 478, 442, 425, 354, 327, 314, 295, 277,

151 e 95 unidades de massa.

I.v. (solução em CHBr^) mostrou bandas a cerca de 3500 (0H), 1720 (C0₂H) e 1696 (C0₂R) cm'¹.

250 MHz ^ΣΗ NMH (CDCl^) inclui sinais a cerca deS0.79(d7; 3H), 1.00(d7; 3H), 1.36(d7; 3H), 1.53(s;

3H), 1.68(s; 3H), 1.86(s; 3H), 3.27(m; IH), 3.46(m; IH), 3.94 (cL6; 1H), 4.29(d6; 1H), 4.96(m; 1H),

De modo semelhante, o material mistura, do com tempo de eluição de 15,6-17 min produziu um composto com a fórmula (l) em que R¹ é -CH(CH₃)CH₂0H, Y¹ é -CHg-, X é

-C- , Y^ é -CH-, R^ é um grupo hidroxilo, It é um átomo de hidrogénio e R^ é um átomo de hidrogénio (23 mg) sob a forma de um sólido incolor.

Um espectro de massa E.I. de baixa ressolução tem um ião molecular a m/Z 628 e iões de fragmento a 610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 281, 263, 151 e 95 unidades de massa.

250 MHz NMR aspectro inclui 'sinais a cerca deó0.8l(d7; 3H), 1.00(d7; 3H), 1.08(d7; 3H), 1.55(s; 3H), 1.69(s; 3H), 1.88(s; 3H), 2.7l(m; 1H), 3.27(m; 1H),

3.3-3.6(m; 2H), 3.96(d6; 1H), 4.29 (d6; 1H), 5.l6(d9; 1H).

Exemplo 3

Adicionou-se o Factor A (2,5 g) em metanol (50 ml) a uma cultura de Absidia cylindrospora NNR1 2796 desenvolvida de acordo com o processo do Exemplo 1 com a excepção de se ter utilizado o seguinte meio:

licor de milho	20.0
Meritose	10.0
óleo de soja	1.0
água destilada	como necessário

Ajustou-se o pH a 4,8-5,0 com hidróxido de potássio antes de tratamento em autoclave.

Continuou-se a fermentação nas mesmas

condições durante mais 5 dias e removeram-se as células por centrifugação. Extrairam-se em seguida as células com metanol (400 ml).

sobrenadante do líquido de cultura foi eveporado até 900 ml e extraido com acetato de etilo. Os extractos combinados de acetato de etilo foram evaporados e o resíduo dissolvido em metanol (cerca de 100 ml). Á suspensão resultante foi filtrada e o filtrado foi evaporado até â secura .

Evaporou-se o extracto metanólico de células para se obter um óleo que foi dissolvido em água e extraido com acetato de etilo. Adicionou-se em seguida o extracto de acetato de etilo combinado ao resíduo sobrenadante e secou-se a mistura.

Dissolveu-se o resíduo em clorofórmio/ acetato de etilo (3:1, cerca de 30 ml) e deitou-se numa coluna de Kieselgel 60 (Merck 5734, 100 ml) e fraccionou-se no mesmo solvente (20 ml). Combinaram-se as fracções 11-32 e evaporou-r -se até à secura. Eluiu-se então a coluna com acetato de etilo e evaporou-se a solução para se obter um sólido. Purificou-se o resíduo das fracções 11-32 em quatro porções por cromatogra. fia líquida preparativa de alto rendimento numa coluna de Spherisorb S5 OLS-2 eluindo com acetonitrilo/água (l:l) numa taxa de 30 ml/min com a detenção de 238 nm. Eluiu-se os picos resultantes entre 19,8 e 21,3 min de cada injecção e reuniram-se.

Diluiu-se o material reunido com tempo de eluição 19,8-21,3 min com um volume igual de água, fez-se regressar à coluna e eluiu-se com acetonitrilo. Evaporou-se o eluato para se obter um sólido que foi liofilizado de acetona/ /ciclohexano para se obter um composto com a fórmula (1) em que R¹ é -CH(CH5)CH20H, Y¹ é -CH2-, Σ é

0H , ς

R e um grupo hidroxilo, Ir é um átomo de hidrogénio e R é um átomo de hidrogénio (96,8 mg).

Um espectro de massa E.I. de baixa ressolução tem um ião molecular a m/Z 628 e Toes de fragmento a 610, 592, 500, 482, 464, 425, 354, 314, 313, 281, 263, 151 e 95 unidades de massa.

250 MHz ^H NMR (CDCl^) inclui. sinai.s a cerca de δ0.82(d7; 3H), 0.98(d7; 3H), 1.0l(d7; 3H), 1.54(s; 3H), 1.58(s; 3H), 1.68(s; 3H), 1.88(s; 3H), 2.7l(m; ÍH), 3.26 (m; ÍH), 3.96(d6; ÍH), 4.29(t6; 1Ξ), 4.97(m; ÍH), 5.20(d9; 1 H).

Um tratamento igual do eluato de aceta to de etilo de sílica mas com um solvente revelador de acetonitrilo :água (4:6) a 25 ml/min. produziu um pico eluindo entre 20,0-22,6 min. que, após descoberto, produziu um composto com a fórmula (l) em que R¹ é -CH(CH^)CH20H, Y¹ é -CH2~, X é

0H_Z/ .H ₂ , ,

-C- , Y é -CH-, IC é um grupo hidroxilo, R⁵ é um átomo de hidrogénio e R^ é um grupo hidroxilo (33,6 mg).

Um espectro de massa E.I. de baixa re_s solução tem um ião molecular a m/Z 644 e iães de fragmento a 626, 608, 590, 516, 498, 480, 462, 425, 354, 314, 151 e 95 unidades de massa.

250 MHz ^H NMR (CLCl^) inclui sinais a cerca de6O.84(d7; 3H), 1.0l(d6; 6H), 1.53(s; 3H), 1.87(s; 3H) 3.24(m; ÍH), 3.94(d6; ÍH), 4.03(dl0: ÍH), 4.14(dll; 1H), 4.24

(dll; ÍH), 5.0l(m; 1H), 5.18(m;
de	62.5 MHz
ó172.8	(s)
142.6	(d)
139.2	(s)
137.6	(s)
137.4	(d)

ÍH).

(CLCl^) deu mais a cerca

68.1	(? )
67.5	(? )
67.0	(?)
66.7	(t)
57.2	(t)

137.1	(s)	48.3	(t)
123.3	(d)	45.6	(d)
120.3	(d)	40.8	(t)
119.9	(d)	40.7	(t)
117.9	(d)	36.5	(d)
99.8	(s)	35.8	(? )
80.1	(s)	35.7	(?)
79.3	(d)	35.2	(d)
76.5	(d)	34.5	(t)
73.2	(t)	22.1	(q)
72.8	(t)	19.6	(q)
69.0	(d)	17.2	(q)
68.6	(d)	15.3	(q)
		14.0	(q)

Apresentam-se a seguir exemplos de pro cedimentos de acordo com a invenção. 0 termo Ingrediente Activo tal como utilizado anteriormente significa um composto da invenção.

Injecção parentérica de Multidose

Exemplo 1

	$ P/v	Gama
Ingrediente activo	2.0	0.1 - 6.0$ p/-
Álcool benzílico	1.0
Polisorbate 80	10.0
Glicerol formal	50.0
Água para injecção	até 100.0

Dissolve-se o ingrediente activo no polisorbato 80 e glicerol formal.

Adiciona-se o álcool benzílico e prefa -se a volume com água para Injecções.

Esteriliza-se o produto por processos convencionais, por exemplo, filtração estéril ou por aquecimento numa autoclave e embalagem asséptica.

Exemplo 2

	%p/z	Gama
Ingrediente activo	4.0	0.1 - 7.5% p/·
Álcool benzílico	2.0
Triacetato de glicerol	30.0
Propilene glicol	até 100.0

Dissolve-se o ingrediente activo em álcool benzílico e triacetato de glicerol.

Adiciona-se o propileno glicol e prefaz-se o volume. Esteriliza-se o produto por processos farmacêuticos convencionais, por exemplo, filtração estéril e embala-se assépticamente.

Exemplo 5

		Gama
Ingrediente activo	2.0	p/v 0.1 - 7.5% p/v
Etanol	36.0	v/v
Tensioactivo não-iónico
(p.e. Synperonic PE L44*)	10.0	p/v
Propileno glicol	até 100.0

Dissolve-se o ingrediente activo no etanol e tensio activo e prefaz-se a volume. Esteriliza-se o produto por processos farmacêuticos convencionais, por exemplo filtração estéril, e embala-se assépticamente.

* Marca registada da ICI

Exemplo 4

Ingrediente activo	2.0	p/v
Tensioactivo não-iónico
(e.g. Synperonic PE P68*)	2.0	p/v
álcool benzílico	1.0	p/v
Miglyol 840**	16.0	p/v
água para injecção	até 100.0

Gama

0.1 - 3.0% p/v

Dissolve-se o ingrediente activo no Miglyol 840. Dissolve-se o tensio activo não-iónico e álcool benzílico na maior parte da água. Prepara-se a emulsão adicionando a solução oleosa à solução aquosa homogeneizando-a com processos convencionais. Perfaz-se a volume. Prepara-se assepticamente e embala-se assepticamente.

* Marca registada de ** Marca registada de

Aerossol

Ingrediente activo Tricloroetano

Tri clo ro fluo ro me t ano

Diclorodifluorometano

ICI

Dynamit Nobel

Éjg/P·

0.1

29.9

35.0

Gama

0.01 - 2.0% p/p

Mistura-se ó ingrediente activo com tricloroetano e introduz-se no recipiente da aerossol. Purga-se a câmara superior com o propulsor gasoso e fecha-se a válvula em posição. Introduz-se o peso pretendido de propulsor líquido sob pressão através da válvula. Equipa-se com actuadores e cápsulas de protecção contra a poeira.

Comprimido

Processo de preparação - granulação húmida mg

Ingrediente activo 250.0 Estearato de Magnésio 4.5 Amido de milho 22.5 Amido glicolato de sódio 9.0 Bauril sulfato de sódio 4.5

Celulose microcristalina até um peso de comprimido de 450mg Adiciona-se quantidade suficiente de uma pasta de amido a 10$ ao ingrediente activo para se obter uma massa húmida adequada para granulação. Prepararam-se os grânulos e secam-se utilizando o secador de tabuleiro ou do leito fluidizado. Passa-se através de um peneiro, adicionam-se os ingredientes restantes e comprime-se para se obterem comprimidos.

Se necessário, revestem-se com película os núcleos dos comprimidos utilizando-se hidroxipropilmetil celulose ou outros materiais formadores de filmes semelhantes utilizando um sistema solvente aquoso ou não aquoso. Pode incluir-se um plastificante e um corante adequado na solução de revestimento com filme.

Comprimido veterinário para animal doméstico pequeno

Processo de fabricação - granulação seca

mg

Ingrediente activo 50,0

Estearato de magnésio 7,5

Celulose microcristalina até um peso do núcleo do comprimido de 75,0

Mistura-se o ingrediente activo com o estearato de magnésio e celulose microcristalina. Comprime-se a mistura em grânulos. Partem-se os grânulos fazendo-os passar através de um granulador rotativo de modo a obterem-se grânulos fluídos. Comprimem-se para se obterem comprimidos.

Os núcleos dos comprimidos podem ser a seguir revestidos com filme, se desejado, da maneira acima descrita.

Injecção veterinária intramamária

Ingrediente	activo	mg/dose 150mg	Gama 0.05 - l.Og
Polisorbate	60	3.0% p/p)	)
Cera branca	de abelha	6.0% p/p)	a 3g )	a 3 ou 15 g 1
óleo de amendoim	91.0% p/p)	)
		Aquece-se	o óleo	de amendoim, cera bran

ca de abelha e polisorbato 60 a 1602 C com agitação. Mantem-se a 1602 C durante duas horas e em seguida arrefece-se para a temperatura ambiente com agitação. Adiciona-se assépticamente o ingrediente activo ao veículo e dispersa-se utilizando um misturador de alta velocidade. Refina-se por passagem através de um moinho de colóides. Introduz-se assepticamente o produto em seringas de plástico esterilizadas.

Bólus veterinário de libertação lenta — 36 Gama

Ingrediente activo

Dióxido de sílico coloidal 2.0) Microcristalina ) Celulose a 100.0)

O.25-2g até necessário para o peso final

Mistura-se o ingrediente activo com o dióxido de sílico coloidal e celulose microcristalina utilizando uma técnica de mistura de alíquotas adequada para conseguir uma distribuição satisfatória do ingrediente activo no veículo. Incorpora-se no dispositivo de libertação lenta e obtem-se (l) uma libertação constante do ingrediente activo ou (2) uma libertação pulsada do ingrediente activo.

Solução oral veterinária

	$.,£/y	Gama
Ingrediente activo	0.35	0.01 - 2% p/·
Polisorbato 85	5.0
Álcool benzílico	3.0
Propileno glicol	30.0
Tampão de fosfato	a pH 6.0 -	6.5
Agua	até 100,0

Dissolve-se o ingrediente activo no Polisorbato 85, álcool benzílico e propileno glicol. Adiciona-se uma proporção de água e ajusta-se o pH a 6,0-6,5 com tampão de fosfato, se necessário. Perfaz-se ao volume final com água. Introduz-se o produto no recipiente de molhar.

Pasta oral veterinária

Gama

Ingrediente activo Sacarina de sódio

Polisorbate 85

Distearato de alumínio óleo de coco fráccionado

4.0 1 - 200 p/p

2.5

3.0

5.0 até 100.0

Dispersa-se o diestearato de alumínio no óleo de coco fraccionado e no polisorbato 85 por aquecimen to. Arrefece-se para a temperatura ambiente e dispersa-se a sacarina de sódio no veículo oleoso. Dispersa-se o ingrediente activo na base. Introduz-se em seringas de plástico.

Grânulos para administração veterinária em rações p/p Gama

Ingrediente activo 2,5 0,05-50 p/p

Sulfato de cálcio, hemi-hidrato até 100,0

Mistura-se o Ingrediente Activo com o sulfato de sódio. Preparam-se os so de granulação húmida. Seca-se buleiros ou de leito fluidizado adequado.

Solução veterinária de vasar

Ingrediente activo

Sulfóxido de metilo

Metil Isobutil cetona

Propileno glicol (e pigmento) grânulos utilizando o procesutilizando um secador de taIntroduz-se no recipiente p/v Gama

2.0 0.1 ate' 300

10.0

30.0 atá 100.0

- 38 Dissolve-se o ingrediente activo no sulfóxido de dimetilo e na isobutil cetona. Adiciona-se o pig mento e perfaz-se a volume com propileno glicol. Introduz-se no recipiente de vazar.

Concentrado Emulsionável

Ingrediente Activo 50g

Emulsionante aniónico 40g (e.g. sulfonato de fenilo CALX)

Emulsionante não-iónico 60g (e.g. Synperonic NP13)*

Solvente Aromático (e.g. Solvesso 100) até 1 litro.

Misturar todos os ingredientes, agita-se até se dissolver.

* Marca registada de ICI

Grânulos (a) Ingrediente Activo 50g

Resina de madeira 40g

Grânulos de gesso(20-60 malhas) até lKg (e.g. Agsorb 100A) (b) Ingrediente Activo 50g

Synperonic NP13* 40g

Grânulos de gesso (20-60 malhas) até lKg.

Dissolvem-se todos os ingredientes num solvente volátil por exemplo cloreto de metileno, adiciona-se a grânulos rodando no misturador. Seca-se para remover o solvent e.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê Processo para a preparação de um composto com a fórmula (l) •ch₂r'

R e dos seus sais, na qual R¹ é um grupo metilo, etilo ou isopro pilo cada um substituído por um grupo hidroxilo ou R^ é um grupo -(CHg^R' ou um grupo -CH(CH^)R , em que n é zero ou 1 e R⁷ é CHO ou C0_oH, ₉ ,

R, V

1 P '¹' A p

Υ^χ é -CH₉-, i é -CH- e X representa -CH- , em que ά é um átomo de hidrogénio ou um grupo OR é um grupo hidroxilo ou um grupo hidroxilo substituído com até 25 átomos de carbono, e R é um átomo de hidrogénio, ou R e R^ juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados representam ?C=0 >C=CH₉

9 9 ζ z ou 7C=NOR , em que R e um atomo de hidrogénio ou um grupo o alquilo C^_g ou alcenilo C^_g, e o grupo 7 C=NOR esta na configuração E, ou -Y^X-Y²- representa -CH=CH-CH- ou -CH -CH=C-,

4/8 5

R é um grupo OR como acima definido e Ir é um átomo de hi'45 z drogénio, ou R e R juntamente eom o atomo de carbono a que estão ligados representam ?C=0 ou 7C=NOR^^a, em que R^^a é como acima definido para R , e

R^ é um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxilo, caracterizado por se incubar um composto com a fórmula (
2) na qual X, Y¹, Y², R^ e R^ são como acima definidos e R^ é um grupo metilo, etilo ou isopropilo, num meio adequado na presença de um microorgânismo ou enzima dele derivada ou uma preparação derivada de um microorgânismo contendo uma enzima susceptível de efectuar a conversão, e opcionalmente em seguida, o 4 _Λ quando R e/ou R no produto fôr -OH, modificar-se o grupo hidroxilo para se obter um grupo hidroxilo substituido ou um com posto em que X é -CH₂~ ou -Y^X-Y²- é -CH=CH-CH- ou -CH₂-CH=Cou oxidar-se o grupo hidroxilo para se obter um grupo ceto e em seguida fazer-se opcionalmente reagir o composto ceto com h₂nor⁹.

- 2® Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por R^ ser -CH( CH^ JCHgOH, -C(OH)(CH₃)₂ ou -ch(ch₃)cooh.

- 3* Processo de acordo com a reivindicação 1 2

1, caracterizado por Y ser -CH„-, Y ser -CH- e X representar p X p

-C(R )(ír )- em que R é um átomo de hidrogénio ou um grupo •2 hidroxi, etoxi ou acetiloxi e Re um átomo de hidrogénio ou 2 3

R e R juntamente com o átomo de carbono a que estão ligados 4 t representam ?C=0, ?C=CH₂ ou>C=N0CH^, e R e grupo hidroxi, metoxi ou acetiloxi.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R^ ser -CH(CH^JCH^OH, Y^ ser -CH^-, X ser

-CR^R^- em que R é -OH e R^ é um átomo de hidrogénio, Y² ser

4 5 , ,

-CH-, R ser um grupo hidroxilo, R _Ser um atomo de hidrogénio e Εθ ser um átomo de hidrogénio,

R¹ ser -CH(OH)(CH₅)₂, Y ser -CH₂-, X ser -CR²R³- em que R² é -OH e

R é um átomo de hidrogénio, Y ser -CH-, R _eer um grupo hidroxilo, R^ _ser um átomo de hidrogénio e R^ ser um átomo de hidrogénio,

R¹ ser -CH(CH,)CH OH, Y¹ ser -CH -, X ser -CR²R³- em que R² é •2 j z ά p a

-OH e R é um átomo de hidrogénio, Y ser -CH-, R⁴ ser um grupo metoxi, R

5 6

R^ ser um átomo de hidrogénio e R ser um átomo de hidrogénio, R¹ ser -CH(CH3)CO2H, Y¹ ser -CH2~, X ser -CR²R⁵- em que R² é -OH e

R^ é um átomo de hidrogénio, Y^z ser -CH-, R⁴ ser um grupo hidroxilo, R ser um átomo de hidrogénio e R ser um átomo de hidrogénio, ou

R¹ ser -CH(CH3)C02H, Y¹ ser -CH2~, X ser -CR²R⁵- em que R² é -OH e
3 2 4Iv é um átomo de hidrogénio, Y ser -CH-, R ser um grupo hidroxilo, R^ ser um átomo de hidrogénio e R^ ser um grupo hidroxilo .

_ 5& _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade pesticida eficaz de um compos to quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

- 6& Processo para a preparação de uma composição veterinária caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade pesticida eficaz de um compo_s to quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em associação com um veículo veterináriamente aceitável.

- 7& Processo para a preparação de uma composição pesticida caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade pesticida eficaz de um composto quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em associação com um veículo pesticidamente aceitável.

A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 3 de Junho de 1988, sob o ne. 8813150.3.