PT89039B

PT89039B - Processo para a preparacao de l-ramnose

Info

Publication number: PT89039B
Application number: PT89039A
Authority: PT
Inventors: Peter Samuel James Cheetham; Stephen Edwin Meakins
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1993-02-26
Also published as: WO1989004831A1; EP0317036A1; GB8727221D0; PT89039A; JPH02502186A

Description

A presente invenção refere-se a um processo para a hidrólise de um glicosido que contenha ramnose numa posição terminal com vista a obter ramnose livre. A ramnose ê um intermediário valioso para a preparação, entre outros, de compostos farmacêuticos e essências, mas a ramnose anteriormente só era acessível com dificuldade e por meio de vias que não se podem considerar que envolvam somente matérias primas naturais e processos naturais. Alêm disso os processos conhecidos também em pregam materiais enzimãticos raros e/ou caros.

Os processos para obter ramnose livre a partir de material glicosido são conhecidos da técnica especia lizada anterior. 0 pedido de patente Japonesa JP-A-62/292 (Kanegafuchi Chem.Ind.Co.) descreve um processo para hidrolisar material de glicosido flavonoide por meio de aquecimento prolongado numa solução aquosa dum ãcido mineral forte, remoção dos compostos flavonoides residuais seguida da digestão da glicose associa da com enzimas ou bactérias e a recuperação da ramnose da solução resultante. Existe também o pedido de patente Japonesa JP-A 62/293 (Kanegafuchi Chem. Ind. Co.) que descreve um processo para a cisão selectiva da ligação de ramnosido de um composto flavonoide que contêm ramnose pela acção de uma enzima adequada numa solução aquosa a um pH baixo, ajustado pela adição dum ãcido mineral depois do que o composto flavonoide residual ê removido por precipitação, recolhendo-se a L-ramnose da solução resultante. Ambos os métodos envolvem ãcido mineral, condições extremas e a utilização opcional de enzimas específicas. São necessárias por consequência fases de purificação elaboradas para remover o ãcido mineral, as enzimas e os produtos de degradação indesejáveis. Também na publicação J. Agric. Food Chem. 29, N9. 6, (1981) 1299, se descreve o aquecimento próximo da ebulição de 3,2 g de naringina em 4,0 1 de ãgua da torneira que contêm 190 g de sucro se e um grama de ãcido cítrico, mas este produz meramente uma so lução de naringina em ãgua.

A presente invenção proporciona um processo natural para a preparação e para a recuperação de ramno se empregando reagentes naturais e condições suaves que dão L-ramnose pura realizando a hidrólise de um glicosido que tenha ramnose numa posição terminal numa solução aquosa de um ãcido or gânico, de preferência de um ãcido carboxílico. A hidrólise ê se guida de preferência da remoção de qualquer glucose libertada, assim se obtendo uma solução aquosa de ramnose a partir da qual se pode cristalizar a ramnose e separã-la. No sentido de minimizar as quantidades de glucose que podem ser removidas escolhem-se as condições de hidrólise que sejam selectivas e permitam a obtenção de altos rendimentos de ramnose, enquanto minimizam as quantidades de glucose libertada.

A hidrólise de produtos glicosidos de partida, tais como quercitina, naringina, hesperidina, neo-hespe ridina e rutina ou de material natural bruto que contenha estes compostos, como por exemplo produtos de desperdícios de limão e extractos brutos de arruda, alforva, resina de acãcia (tal como kordofan, talha, etc.), ramnolípidos microbianos e ramnopoli -sacarídeos microbianos p. ex. a partir de Xanthomonas Arcc 53159 pode ser convenientemente efectuada numa solução aquosa de

0,1 a 25% de um ãcido carboxilico que contenha de 1 a 6 átomos de carbono. Os ãcidos orgânicos adequados são ãcidos orgânicos de grau alimentar tais como ãcido cítrico, ãcido láctico, ãcido mãlico, ãcido succínico, ãcido acético, ãcido propionico, ãcido tartãrico, ãcido fumãrico, etc.. De preferência, devido â sua ac tividade e selectividade, usam-se os ãcidos acético e/ou propiõnico; para um processamento mais fãcil são também preferidos os ãcidos cítrico ou mãlico.

Para uma hidrólise eficiente ê desejã vel que se utilize o aquecimento por um período entre 1 a 10 horas a uma temperatura entre 80 e 1209 C. As temperaturas de reac ção a cerca de 1009 C podem ser convenientemente obtidas numa pa nela de pressão a pressões superatmosféricas. Sob estas condições obtêm-se virtualmente a libertação completa da ramnose, mas ainda ê necessário retirar algumas matérias primas não convertidas e compostos flavonõicos, p. ex. por filtração depois de arre fecimento.

hidrolisado assim obtido contêm ram nose normalmente junto com alguma glucose e algumas flavonas e glucosidos flavónicos e ãcido orgânico e de preferência ê posteriormente purificado para remover a glucose, a flavona e os glicosidos flavónicos e opcionalmente o ãcido orgânico.

Os métodos convenientes para isto são:

1. Fermentação selectiva da glucose com um microorganismo adequa do sob condições escolhidas para fermentar de preferência glu cose em vez de ramnose, produzindo-se etanol como produto secundário. Tais microorganismos são p. ex. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Dactobacillus delbruckii e Proteus bulgaris. De preferência a fermentação ê realizada a um pH de 4 a 4,5. Não se observou fermentação selectiva quando o pH do xarope era mais alto p. ex. pH 6,0. De preferência o microorganismo, em particular um fermento, foi imobilizado p. ex. em alginato de cálcio, que pode opcionalmente ser seco antes de ser usado para melhorar as suas propriedades mecânicas e de armazenamento, e o hidrolisado ê bombeado através de uma colu na carregada com o microorganismo imobilizado. Adicionalmente células livres ou células imobilizadas podem ser introduzidas numa reacção agitada de modo descontínuo. As actividades são de cerca de 1,9 e 3,4 g de ramnose livre de glucose por litro do conteúdo do reactor por hora respectivamente; e para células imobilizadas usadas numa coluna são de 22,4 g de ramnose livre de glucose/litro/hora. Alguns dos microorganismos são também capazes de fermentar o acido orgânico de modo que se obtêm uma solução virtualmente pura de ramnose. Também se pode precipitar o ácido orgânico sob a forma de um sal inorgâni co (especialmente do sal de cálcio) e separar-se. A maior par te da ramnose perdida ê metabolizada durante o início da fermentação. A variação da concentracção de açúcar no xarope não tem efeito no rendimento da ramnose, que ê cerca de 65% quando se removeu toda a glucose, mas a presença de concentrações baixas de glucose resulta num tempo de fermentação proporcionalmente mais baixo, e por conseguinte devera usar-se um caudal proporcionalmente mais alto. Rendimentos mais altos de ramnose podem ser obtidos se se aceitar alguma glucose residual p. ex. recuperações de 74%, 82% e 92,5% de ramnose respectivamente para 1%, 2% e 6% (p/p) de glucose residual. As células imobilizadas podem ser reutilizadas, mas as suas acti vidades podem decrescer com o tempo.

2. Em alternativa a glucose pode ser removida pela oxidação enzi mãtica selectiva da glucose a ácido glucõnico (usando oxidase de glucose e catalase), que ê subsequentemente precipitado sod a forma do seu sal de cálcio, em opção juntamente com o ãcido orgânico de grau alimentar, e removido. A glucose oxidase/catalase pode também ser usada na forma imobilizada. Preferem-se as fontes da enzima que são mais resistentes â inibição pelo produto. 0 momento em que a fonte de cálcio ê adicionada não ê crítico, na realidade pode estar presente junto com a glucose/catalase desde o princípio para precipitar o ãcido glucõnico â medida que este se forma, apesar de esta opção não ser a preferida. Pode usar-se também deidrogenase de glucoseem vez da oxidase de glucose. Podem obter-se rendimentos de ramnose atê 100% por este método eliminando completamente a glucose. O ãcido glucõnico é produzido como um produto secundário da glucose.

3. A oxidação selectiva da glucose a ãcido 5-cetoglucõnico por meio dum microorganismo adequado e recuperação em separado do

ãcido 5-cetoglucõnico e da ramnose. Um organismo preferido pa ra realizar esta oxidação ê a Gluconobacter oxydans. Este método contudo não funciona se a concentração de glucose na solução se situar acima de 6 a 7% (p/v) uma vez que a glucose ê inibidora para altas concentrações. Por conseguinte, somente de preferência se tratam por este método soluções de açúcar diluídas. Obtiveram-se rendimentos de ramnose isenta de gluco se até um máximo de 95% por este método. Também se produz o sal de cálcio do ãcido 5-cetoglucõnico como produto secundário.

4. Adsorção/absorção selectiva quer da glucose quer da ramnose p. ex. usando carvão activo para absorver de preferência a ramnose. Este método ê realizado de preferência usando o carvão duma forma cromatografica.

Por razões de processo, achou-se conveniente seleccionar um ácido orgânico na fase de hidrólise que não interfira com o processamento posterior, p. ex. pode-se seleccionar um ãcido orgânico que fermenta durante a fermentação da glucose. Isto simplifica a purificação e a recuperação posterior.

As fases de purificação opcional posterior compreendem o arrefecimento do hidrolisado para precipitar impurezas seguido pela absorção, precipitação de impurezas e cristalização de L-ramnose. Os absorventes e precipitantes prefe ridos são carvão activado e resinas permutadoras de iões tais co mo Amberlite XAD-4 (Amberlite ê uma marca registada) e polivinil polipirrolidona. Estudaram-se as relações entre dosagem e purifi cação e estabeleceu-se que os níveis de utilização óptimos eram de 3%, 17,5% e 5% respectivamente. 0 tratamento com carvão ê rea lizado dum modo óptimo em xarope quente a cerca de 809 C.

A ramnose natural assim obtida ê de elevada pureza e muito adequada para posteriores transformações com vista a compostos farmacêuticos e essências.

Em particular, este grau de ramnose pode ser convertido em essências tal como 2,5-dimetil-4-hidroxi-2,3-diidrofurano-3-ona.

A invenção ê ilustrada pelos seguintes exemplos:

EXEMPLO 1

Agitou-se a 1209 C durante 5 horas uma suspensão de naringina a 10% (p/p) numa solução aquosa de ãcido acético a 10% a pH 2,2. Depois de arrefecer e filtrar obte ve-se uma solução que contêm 100% da quantidade teórica de ramno se presente em naringina. (28,3 g ramnose/100 g naringina) e 25% da quantidade teórica de glucose. Analisou-se por hplc em comparação com um padrão de mono-hidrato de ramnose a 1% (p/p): mono-hidrato de glucose a 1% (p/p). Ajustou-se o pH desta solução a 4 por adição de Ca(OH)r para permitir a acção eficiente da oxidase de glucose. Tomou-se cuidado para não deixar chegar o pH acima de 6,0, caso em que a naringina se torna solúvel e não pode ser retirada por filtração com facilidade. O filtrado resultante foi tratado com 10% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (p. v.p.) e 5% (p/v) de carvão para remover quaisquer impurezas rema nescentes. Removeu-se a glucose usando oxidase de glucose em com binação com catalase. Da solução resultante ê possível obter cristais de ramnose por concentração e arrefecimento. Os resulta dos apresentam-se no quadro abaixo:

FASE PESO DE LICOR % DE RHA % DE GLU PESO DE RAMNOSE

em g			em g
INlCIO (NARINGINA) 120	28,3	31,0	33,96
pó		(presente	sob a for:
		de glicosido)
HIDRÓLISE 800	4,2	1,16	33,60
APÔS TRATAMENTO 1170	2,89	0,77	32,90
COM Ca(OH)₂
APÔS TRATAMENTO 843	3,47	0,94	29,28
COM PVP
APÔS TRATAMENTO 817	2,77	0,94	22,69
COM CARVÃO
APÔS TRATAMENTO 812	2,83	0,00	23,00
COM ENZIMA E CRISTALIZAÇÃO		(rendimento	global 68%

EXEMPLO 2

Aqueceu-se uma suspensão de naringína a 15% (p/p) numa solução aquosa de ãcido cítrico a 10% (p/p) a 1209 C durante três horas. Exactamente depois do arrefecimento adicionou-se hidroxido de cálcio para neutralizar o ãcido cítrico usado. Arrefeceu-se posteriormente esta mistura a 49 C antes de filtrar. 0 filtrado obtido continha 80% da quantidade teórica de ramnose presente na naringina e 55% da quantidade teórica da glucose. Tratou-se então este filtrado com carvão (1,5% p/p) a 809 C durante duas horas antes de ser refiltrado. Ajustou-se então o pH desta solução a 5,5 com a adição cautelosa de hidróxido de cálcio e incubou-se com oxidase de glucose (0,5% p/p) em combinação com catalase (0,5% p/p). Quando toda a glucose foi consu mida adicionou-se carbonato de cálcio (3,0% p/p). Levou-se então o pH da solução a 7,0 por adição de hidroxido de cálcio e removeu-se por filtração o gluconato de cálcio precipitado.

Aqueceu-se o filtrado obtido a 809 C durante duas horas com carvão e filtrou-se. Concentrou-se então esta solução até um quinto do seu volume original e adicionou-se a etanol a 26% (duas vezes o volume do concentrado obtido) o que fez precipitar quaisquer sais orgânicos ou proteínas deixados na solução. Depois da filtração evaporou-se o etanol para dar ramno se na forma de um pó branco amorfo.

Os resultados são apresentados no qua

dro abaixo: FASE PESO DE	LICOR %	DE RHA %	DE GLU PESO	DE RAMNOSE
em	g			em g
INÍCIO (NARING	UNA) 120	28,3	31,0	33,96
pó		(presente	sob a forma
			de glicosido)
HIDRÓLISE	800	3,37	2,56	27,00
APÔS TRATAMENTO	730	3,70	2,80	27,00
COM Ca(OH)₂
APÕS TRATAMENTO	715	3,70	2,80	26,45
COM CARVÃO
APÕS TRATAMENTO	700	3,40	0,00	23,80
COM ENZIMA
APÔS TRATAMENTO	658	3,10	0,00	20,34

COM CARVAO

APÔS TRATAMENTO 24,1 76,3

COM ETANOL E CRISTALIZAÇÃO

0,00 18,38 (rendimento global 54%)

EXEMPLO 3

Usando ãcido mãlico como no Exemplo 2 os rendimentos de ramnose e de glicose obtidos a seguir à hidrólise foram de 3,38 e de 3,10% (p/p) respectivamente e após purificação obteve-se ramnose pura com um rendimento de 69%.

EXEMPLOS 4-40

Ex. N9.	Fonte de	Ãcido usado %	Hidrólise % do rendimento teóricc	Ramn/G
ramnose	%
Ramn	Glu
4	Naringina	(10)	Acético (10)	100	38	2,5
5	Naringina	(15)	Acético (10)		33	2,0
6	Naringina	(20)	Acético (10)	80	26	3,1
7	Naringina	(40)	Acético (10)	67	15	4,5
8	Naringina	(40)	Acético (20)	84	24	3,5
9	Naringina	(10)	Cítrico (10)	100	92	1,1
10	Naringina	(10)	Cítrico (10)	96	73	1,35
11	Naringina	(10)	Mãlico (10)	100	67	1,5
12	Naringina	(10)	Mãlico (10)	96	50	1,7
13	Naringina	(10)	Tartárico (10)	100	86	1,2
14	Naringina	(10)	Láctico (10)	100	100	1,0
15	Naringina	(10)	Propiônico (10)	80	22	3,6
16	Naringina	(10)	Butyrico (10)	66	11	6,0
17	Naringina	(10)	Caproico (10)	34	3,5	9,7
18	Naringina	(10)	Caprylico (10)	11	0	-
19	Naringina	(10)	Glutâmico (10)	59	13	4,5
20	Naringina	(10)	Fórmico (10)	84	55	1,5
21	Naringina	(10)	Succínico (10)	75	27	2,8
22	Rutina	(10)	Cítrico (10)	95	100	0,95
23	Rutina	(10)	Cítrico (5)	68	70	1,0

Ex. N9.	Fonte de ramnose %	Ácido usado %	Hidrólise % do rendimen to teórico	Ramn/G
Ramn	Glu
24	Rutina (10)	Cítrico (1)	44	45	1,0
25	Rutina (10)	Tartárico (10)	37	40	0,9
26	Rutina (10)	Láctico (10)	71		-
27	Rutina (10)	Acético (10)	37	47	0,8
28	Rutina (10)	Propionic (10)	23	30	0.
29	Quercitrina (30)	Acético (10)	91	0	-
30	Resíduos de citrinos (10)	Cítrico (10)	75	80	0.
31	Resíduos de citrinos (10)	Málico (10)	82	85	1.
32	Resíduos de citrinos (10)	Tartãrico (10)	89	90	1.
33	Resíduos de citrinos (10)	Láctico (10)	60	60	1.
34	Resíduos de citrinos (10)	Acético (10)	31	35	0.
35	Casca de citrino doces (10)	s Citrico (10)	54	na	-
36	Casca de citrinos amargos (10)	Láctico (10)	54	na
37	Goma Kordof.(30)	Acético (10)	82	0	-
38	Goma Kordof.(30)	Propionico (10)	59	0	-
39	Goma Kordof.(30)	Cítrico (10)	100	⁰	-
40	Goma talha (30)	Cítrico (10)	100	o	-

EXEMPLO 41

A fermentação selectiva de glucose pre sente no hidrolisado de rutina purificada obtida de acordo com o Exemplo 17 foi realizada usando fermento de padeiro (Saccharomyces cerevisiae) imobilizado em pastilhas de alginato de cãlcio que são usadas em colunas, sendo o xarope continuamente bombeado através destas.

Misturou-se 60 g de pasta de fermento de padeiro com 40 ml de solução de alginato de sodio a 3% (peso

seco por volume) e deitou-se gota a gota numa solução aquosa de cloreto de cãlcio 0,1 M. Depois de 30 minutos de incubação à tem peratura ambiente, as pastilhas foram colocadas numa coluna de 100 ml e bombeou-se o substrato, ajustado o pH a 4,5 com ãcido cítrico através da coluna com um caudal de cerca de 0,05 volume da coluna/hora. Analisou-se o eluido para determinação dos açúca res por hplc. O tempo de vida operacional da coluna foi de cerca de duas semanas. A coluna ê tratada de modo que somente reste 1 a 2% da glucose remanescente que ê facilmente removida subsequen temente por cristalização da ramnose. A glucose fermentada converteu-se em álcool com um rendimento molar de 40%. 0 xarope de ramnose, essencialmente livre de glucose e contendo cerca de 20% p/v de ramnose foi tratado com carvão activo (20 g/l) para remover impurezas. 0 xarope (1 litro) foi concentrado num evaporador rotativo a uma temperatura de 60 a 709 C até cerca de 65% (p/v) e depois deixado arrefecer. Isolaram-se os cristais por filtração e depois secaram-se a 409 C. A quantidade dos cristais obtidos foi proporcional â concentração, que foi atê um mãximo de 70% (p/p), a cuja concentração a viscosidade do xarope se tornou excessiva e os cristais ficaram contaminados com glucose. O xaro pe das ãguas-mães foi concentrado outra vez por evaporação num evaporador rotativo atê cerca de 70% (p/p), deixado arrefecer e filtrou-se uma segunda fracção de cristais e seguidamente recris talizaram-se. O rendimento de cristais de monohidrato de L-ramno se pura isenta de glucose foi de 86% baseado na quantidade de ramnose presente no xarope original. A ramnose cristalina produzida por este método foi armazenada durante 4 meses a 209 C e não mostrou quaisquer sinais de deterioração.

EXEMPLO 42

Uma amostra do xarope de ramnose/glucc se preparado de acordo com o Exemplo 24 usando produtos de desperdício de limão que deram origem a 200 ml de xarope com 5% de açucares foi purificada usando p.v.p. e em seguida carvão, ajustou-se o pH a 6,5 e adicionou-se oxidase de glucose e catalase, 0,5 ml de cada. Incubou-se o xarope a 359 C atê toda a glucose

Π Λ

ter desaparecido, conforme determinado por análise de hplc, o que ocorreu após 72 horas. Adicionou-se então hidróxido de cálcio (20 ml, solução a 5% p/v) para precipitar o ácido glucónico sob a forma de gluconato de cálcio. A solução de ramnose pura re sultante foi decantada e filtrada através de adjuvante de filtra ção de terra de diatomáceas a fim de eliminar traços residuais de gluconato de cálcio e a ramnose foi recuperada com bom rendimento, 180 ml de solução de 2,62% p/v de ramnose i.e. 78,7% do rendimento teórico.

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43-48 ALÉM DE EXPERIÊNCIAS ILUSTRATIVAS

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EXEMPLOS 43-48

Repetiu-se o processo do exemplo ante rior com diferentes matérias primas e enzimas. Os resultados são apresentados no quadro abaixo. A velocidade da reacção foi principalmente dependente da concentração de flavonas e de flavonõides remanescentes.

Xarope inicial	Enzimas adicionadas	Tempo de incubação	Rendi- mento em ram nose
200 g/l glucose 200 g/l ramnose	4% (v/v) gluc oxidase (Biocon) 2% (v/v) catalase (BDH)	40 horas	92%
20 g/l glucose 50 g/l ramnose	0.4% (v/v) gluc oxidase (Biocon) 0.2% (v/v) catalase (BDH)	5 horas	90%
200 g/l glucose	4% (v/v) gluc oxidase (Sigma II)	a 20 g/l	97%
200 g/l ramnose	2% (v/v) catalase(BDH)	gluc 2 h.	100%
20 g/l glucose	0.4% (v/v) gluc oxida se (Sigma II)	5 horas	100%
50 g/l ramnose	0.2% (v/v) catalase (BDH)
200 g/l glucose 200 g/l ramnose	4% (v/v) gluc oxidase (Biocat) 2% (v/v) catalase (BDH)	30 horas	100%
20 g/l glucose 50 g/l ramnose	0.4% (v/v) gluc oxidase (Biocat) 0.2% (v/v) catalase (BDH)	5 horas	100%

BDH = ex British Drug Houses, Biocat = Biocatalysts tipo SF

EXEMPLO 49

A partir de vários exemplos dados anteriormente obteve-se uma mistura de ramnose e de glucose. De acordo com o exemplo presente converteu-se a glucose em ácido ce toglucónico que poderia ser facilmente separado da ramnose. Efec tuou-se a conversão com o organismo Gluconobacter oxydans. Preci

Ί O

pitou-se o âeido 5-cetoglucônico formado sob a forma do seu sal cálcico e a seguir recuperou-se. Diluiram-se 10 ml de um xarope de glucose/ramnose contendo 220 g/1 de glucose e 220 g/1 de ramnose com 87 ml de âgua, adicionaram-se 3% de carbonato de cálcio como tampão e para fornecer iões cãlcio. Ajustou-se o pH a 6,5. Adicionaram-se 1,2 g de células húmidas de Gluconobacter oxydans previamente cultivadas e levou-se a efeito a incubação a 309 C durante 72 horas com agitação moderada. Formou-se um precipitado de sal de cãlcio do ãcido 5-cetoglucõnico que se separou por fil tração junto com as bactérias. Por meio de nova separação obtive ram-se 2,0 g de ramnose e 2,0 g de ãcido 5-cetoglucõnico. Se se continuasse a fermentação para além do ponto no qual toda a glucose tinha sido convertida, então a ramnose teria sido metabolisada.

EXEMPLO 50

Separaram-se a glucose e a ramnose por adsorção da ramnose em carvão activado seguida de eluição da ramnose do carvão. Tratou-se uma solução preparada de acordo com o Exemplo 1 e concentrada, contendo 10% de ramnose e 12% de glucose por litro, com carvão activado em pó a 10% p/p. 0 carvão ad sorveu 11,8% de ramnose mas somente 3% de glucose. Conseguiu-se uma separação mais efectiva por repetição do processo.

Claims

REIVINDICA Ç Õ E S

- 1- Processo para a preparação de L-ramno se por hidrolisação das ligações glicosidicas num glicosido tendo ramnose numa posição terminal, caracterizado por o glicosido ser hidrolisado por aquecimento numa solução aquosa de um ãcido orgânico carboxílico a um pH entre 1 e 6, de preferência entre 1 e 3.

- 2- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ãcido orgânico carboxilico conter 1 a 6 ãtomos de carbono.

- 3- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a solução do ãcido carboxílico conter 0,1 a 25% (p/p) do ãcido carboxílico.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o glicosido ser escolhido no grupo consistindo rutina, naringina, quercitrina, goma de acácia, ramnolipido microbiano e ramnopolissacarido microbiano.

_ 1 K _

-5-Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o glicosido estar sob a forma de material citrino bruto.

- ζ- Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a hidrólise efectuar-se a uma temperatura entre 809 C e 1209 C.

- 7ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a hidrólise efectuar-se durante 1 a 10 horas.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a mistura reacional ser aquecida a uma pressão superatmosfêrica.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a hidrólise ser seguida de uma fase de purificação do hidrolisado.

- 10- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por qualquer glucose presente ser eliminada por fermentação do hidrolisado com um microorganismo, preferível mente com um fermento imobilisado, e um pH de 3 a 5.

- 11- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por qualquer glucose presente ser oxidado em ãcido glucónico ou ãcido 5-cetoglucônico, o qual ê depois removido .

- 12- -

Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a conversão ser realizada utilizando Gluconobacter oxidans.