PT86597B

PT86597B - Processo de reconstituicao in vitro de tecidos

Info

Publication number: PT86597B
Application number: PT8659788A
Authority: PT
Inventors: Claire Lugassy; Jean-Paul Escande
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1987-01-22
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1991-12-31
Also published as: CA1291433C; FR2610006B1; FR2610006A1; JPS63222685A; PT86597A; EP0278817A1

Description

PROCESSO DE RECONSTITUIÇÃO IN VITRO DE TECIDOS um tecido patológico colocado em cultura de acordo com o método de cultura sob rede compacta de cobertura sendo a referida população constituída, por um lado, por células patológicas diferenciadas e, por outro lado, por fibroblastos de dois tipos, os que provêm do estroma do tecido e os proceden tes da rede.

Processo de reconstituição in vitro de tecidos presente invento tem como objectivo um processo de reconstituição in vitro de tecidos em três dimensões.

screning das moléculas que podem servir de principio activo para um medicamento tendo em vista o tratamento de um tecido patológico é facilitado se se tiver à disposição culturas de células deste tecido que permitam uma experimentação in vitro. O método de primeira cultura de explantes de tecidos - conhecido agora sob a designação de método de cultura sob lattice compacta em cobertura - descrito por Claire LUGASSY, Odile ENJOLRAS e Jean-Paul ESCANDE (C.R. Acad. Sc. Paris, t. 301, Série III, No. 17, pp. 779-784, 1985) revelou constituir um auxiliar particularmente eficaz para este efeito.

Este método de primo-cultura de explantes de tecidos permite obter com um rendimento elevado uma rediferenciação dos fibroblastos provenientes das células postas em cultura, apresentando as células assim rediferenciadas as características habituais próprias ao seu tipo celular e multiplicando-se de um modo persistente durante pelo menos várias semanas. Este método consiste, antes da incubação, em recobrir os fragmentos do explante com uma matriz compacta formada por uma rede de colagénio contendo fibroblastos vivos.

Este método convém para a cultura de explantes preparados a partir quer de tecidos normais, quer de tecidos patológicos e especialmente neste caso de tecidos tumorais, quer se trate então de tumores

primitivos quer de metastases. Este método adapta-se muito particularmente à primeira cultura de explantes de melanomas malignos.

A preparação dos explantes faz-se de acordo com as técnicas do método anterior (C. AUBERT, Ann. Derm. Sypho., 102, (1), 1975; 59:62). Os explantes destinados a ser colocados em cultura são recolhidos, eventualmente dissociados em fragmentos e colocados sobre o fundo de um recipiente de fundo plano constituido por um material, tal como uma matéria plástica, sobre a qual possam adedr as células.

A matriz compacta, igualmente designada aqui a seguir pela expressão lattice é preparada de acordo com o método descrito por E. BELL et coll. (Proc. Natl. Sc. U.S.A., 76 (1979, 1274-1276). Mistura-se colagénio com fibroblastos na presença de um meio de cultura. Forma-se um gel que se contrai progressivamente sob a acção dos fibroblastos, visto que as células se ligam às fibras que se dispõem então numa rede. De tudo isto resulta uma matriz no seio da qual os fibroblastos estão vivos.

Os fibroblastos utilizados para a preparação da lattice podem ser de todas as origens. Os fibroblastos de origem vascular adaptam-se particularmente bem. De preferência, utilizam-se fibroblastos preparados a partir de um angioma. Os fibroblastos, após a sua colheita a partir dos tecidos que os contêm, podem ser mantidos em cultura por meio de passagens sucessivas até à sua utilização .

O colagénio utilizado é obtido a partir de tecidos conjuntivos, os tendões da cauda do rato constituem uma fonte fácil de utilização. Prepara-se uma so-5-

lução de colagénio liqeiramente ácida com o auxilio de ácido acético a 1 por 1.000 (v/v).

A solução de colagénio colocada num recipiente de fundo plano tal como uma placa de Petri, são adicionados de preferência simultaneamente os fibroblastos, um meio nutritivo que convenha ao metabolismo destas células assim como um agente neutralizante tal como a soda.

Quando se utilizam 5.10 fibroblastos para 2 ml de uma solução de colagénio a 1 mg/ml introduzidos numa placa de Petri com 6 cm de diâmetro, obtem-se, em 3 a 8 dias , uma lattice retraida cujas dimensões vão de 5 a 10 mm de diâmetro e 0,5 a 1 mm de espessura.

Este método de cultura dos explantes consiste pois em recobrir com uma lattice os explantes aderentes preparados tal como foi atrás indicado. O meio nutritivo é em seguida vertido de modo a banhar a lattice. Pode ser introduzida uma mistura gasosa particular que convenha ao metabolismo das células do explante e dos fibroblastos, composta por exemplo por ar adicionado com 5% de C0₂- O recipiente assim preparado é submetido a incubação a uma temperatura que convenha ao desenvolvimento das células que ele encerra e de preferência a 372C. O meio é em seguida renovado regularmente, por exemplo de cinco em cinco dias.

A requerente na continuação dos seus trabalhos acaba de demonstrar que é actualmente possível reconstituir tecidos em três dimensões, a partir de células que saem do conjunto formado por umalatticee por um explante de um tecido patológico colocado em cultura de acordo com o método de cultura sob lattice compacta de cobertura atrás descrita. Este é um resultado particularmen-6-

te importante que deveria permitir, pela observação dos tecidos reconstituídos e das populações celulares que deles provêm, nomeadamente ao precisar as potencialidades invasivas das células, orientar os estudos clínicos e aperfeiçoar a escolha dos medicamentos apropriados para o tratamento do tecido patológico em questão.

presente invento refere-se precisamente, de acordo com um primeiro aspecto, a um processo de reconstituição in vitro de um tecido em três dimensões, que consiste em submeter a uma incubação na presença de colagénio uma suspensão celular preparada a partir da população celular heterogénea saída do conjunto formado por uma lattice e um explante de um tecido patológico colocado em cultura de acordo com o método de cultura sob lattice compacta de cobertura.

A população celular heterogénea submetida à incubação de acordo com o invento compreende células diferenciadas patológicas e fibroblastos dos dois tipos, os que provêm, do estroma do tecido e os que provêm da lattice.

explante preparado provem de um tecido patológico. Este tecido pode ser nomeadamente um tumor. Pode então tratar-se de um tumor benigno ou maligno. 0 processo de acordo com o invento convém particularmente à reconstituição de melanomas malignos.

Partindo de um tecido patológico, a preparação dos explantes e a sua primeira cultura são feitas de acordo com o modo de realização atrás referido.

A cultura de um explante recoberto por uma lattice leva à saida de células que abandonam o conjunto formado pelo explante e pela lattice para o meio de

cultura e que se fixam sobre a parede do frasco. Esta saida é igualmente observada quando o conjunto formado pela lattice e pelo explante é transferido do recipiente onde se realizou a primeira cultura para um outro recipiente contendo um meio nutritivo novo colocado em seguida em incubação. É ainda observada esta mesma saida de células cada vez que se transfere o referido conjunto para um recipiente contendo um novo meio nutritivo.

As células que saem, seja qual for o momento em que saem do conjunto formado pela lattice e pelo explante quer à saida da primeira cultura do explante, quer após uma transferência do referido conjunto, constituem uma população heterogénea P1 compreendendo, por um lado, células diferenciadas e, por outro lado, células de aspecto fibroblástico, organizando-se as primeiras em colónias que repousam sobre um tapete constituído pelas segundas. A adição de um agente, tal como a tripsina, no frasco de cultura permite separar as células que aderem à parede do frasco. A população PI pode em seguida ser recolhida e posta em suspensão num meio nutritivo que convenha ao metabolismo das células que a constituem. Pode ser nomeadamente utilizado um meio tendo as caracteristicas do meio RPMI eventualmente completado pela L-glutamina, pelo soro de vitelo fetal e por um ou vários antibióticos. Após termos procedido à enumeração das células com o auxilio, por exemplo de uma câmara de Thoma, pode-se eventualmente ajustar o numero de células.

g Pode ser preparada, por exemplo, uma suspensão contendo 2.10 células por ml. A suspensão assim obtida é a suspensão Sl.

O colagénio produzido no processo do invento é obtido a partir de tecidos conjuntivos; os tendões da cauda do rato constituem uma fonte de utilização fácil. Prepara-se uma solução ácida de colagénio, estando o colagénio após extracção e purificação em solução por exemplo numa solução de 1 por 1.000 (v/v) de ácido acético. A solução de colagénio produzida pode conter de 0,1 a 5 mg de colagénio por ml, De um modo preferido, a solução contém 1 mg por ml.

Ά solução de colagénio colocada num recipiente de fundo plano, tal como uma placa de Petri, são acrescentados, de preferência simultaneamente, a suspensão Sl, do meio nutritivo assim como um agente neutralizante, tal como a soda.

Quando se utiliza uma suspensão Sl de 2.10 células por ml sob um volume de 0,5 ml, para

1,5 ml de uma solução de colagénio a 1 mg por ml numa placa de Petri de 6 cm de diâmetro, e na presença de um meio de cultura, tal como o meio RPMI, de 0,25 ml de NaOH 0,lM e de 0,45 ml de soro de vitelo fetal, obtém-se assim após 4 a 8 dias de retracção um disco irregular de 5 a 10 mm de diâmetro por 1 a 2 mm de espessura que é um tecido reconsti tuido em três dimensões. Este tecido (tecido TR1) preparado a partir da suspensão celular Sl é chamado de primeira gera ção. É possivel a partir deste tecido TR1 preparar em série outros tecidos reconstituídos.

O tecido TR1 colocado em cultura dá origem por migração para o meio de cultura a uma população celular P2 constituída igualmente por células patológicas diferenciadas e por células com aspecto fibroblástico. Esta população P2 colocada em incubação em presença de cola génio pode por seu lado ser utilizada para fabricar um ou vários tecido(s) TR2 dito(s) de segunda geração. Um tecido TR2 colocado em cultura dá então origem a uma população celular P3 que pode igualmente por seu lado ser utilizada par fabricar um ou vários tecido(s) TR3 dito(s) de terceira ger ção. Pode-se assim, repetindo as mesmas operações, preparar

uma série de tecidos reconstituídos em três dimensões.

Convém notar que, antes da adição de tripsina ou de um reagente equivalente num frasco contendo um tecido TR de enésima geração e a população celular η + 1 à qual ele deu origem, é possivel com o auxilio, por exemplo de uma pipeta, recolher o tecido TR e introduzi-lo num segundo frasco (recipiente) contendo o meio nutritivo. 0 tecido TR assim transferido pode então dar origem a uma segunda população celular n + 1. Cada uma das populações η + 1 pode ser utilizada para preparar um tecido TR da geração n + 1.

presente invento refere-se assim de acordo com um outro aspecto a um processo de preparação em série de tecidos reconstituídos, caracterizado pelas operações sucessivas que se seguem:

1. Incubação em presença de colagénio de uma suspensão celular preparada a partir da população celular heterogénea constituída por células patológicas diferenciadas e por células de aspecto fibroblástico provenientes de um tecido de primeira geração reconstituído de acordo com o processo do invento atrás descrito, até à obtenção de um tecido reconstituído de segunda geração.

2. Incubação na presença de colagénio de uma suspensão celular preparada a partir da população celular heterogénea constituída por células patológicas diferenciadas e por células de aspecto fibroblástico provenientes do tecido reconstituído de segunda geração obtida em 1, até à obtenção de um tecido reconstituído de terceira geração.

Se bem que a obtenção de um tecido reconstituído de quarta geração possa apresentar-se mais difícil, o presente invento refere-se igualmente a gualquer processo de preparação em série de tecidos reconstituídos, o que compreenderia ainda a repetição da operação 2, de modo tal que, partindo de um tecido reconstituído de geração n, se obtem um tecido reconstituído de geração n + 1.

O invento é agora descrito em detalhe no exemplo ilustrativo que se segue.

EXEMPLO

Preparação em Série de Melanomas Malignos Reconstituídos em Três Dimensões

1. Material

- Tumores

Os explantes tumorais utilizados provinham de quatro metastases cutâneas (MCI a MCIV) de melanomas malignos retirados de quatro doentes diferentes. Os melanomas foram cultivados pelo método de cultura sob lattice compacta em cobertura.

- Colagénio

Foi extraído colagénio do tipo I da cauda de ratos que foi preparado de acordo com a técnica conhecida (da qual se encontrará uma descrição em Proc. Nat. Acad. Sei. USA, Vol. 76, N° 8, 1979, p.1274), sob a f©rma de uma solução purificada aquosa a 1 por 1.000 (v/v) de ácido

acético contendo 1 mg de colagénio por ml.

~ ^Μθϊο de cultura completo

Utiliza-se meio RPMI 1640, comercializado pela Sociedade GIBCO, ao qual se adicionaram: 1% de L-glutamina, 15% (v/v) de soro de vitelo fetal (S.V.F.) e, por mililitro, 100 unidades, de penicilina e 100 mg de estreptomicina.

- Frasco (recipiente) de cultura

Foram utilizados frascos (recipien- tes) planos cujo fundo apresenta uma supaficie de 25 cm comercializados pela Société Falcon.

2. Modo Operatório

1. Preparação de melanomas malignos reconstituídos de primeira geração (MMR1)

A - Preparação da população de células P^

É preparada a partir dos tendões da cauda do rato uma solução de colagénio em ácido acético a 1 por 1.000 (v/v) contendo 1 mg/ml de colagénio.

Sao obtidos fibroblastos a partir de um angioma venoso humano evolutivo de adulto. Os fibroblastos são mantidos em cultura por passagens sucessivas e são utilizados entre a 9â e a 24â passagem.

As lattices são preparadas acrescentando, para cada uma delas, a 2 ml da solução do colagénio vertidos numa placa de Petri com 6 cm de diâmetro e simultaneamente:

- 2 ml de meio RPMI 1640 (G.E. MOORE et al., J. Am. Med, Assoe. 199, 8 (1967) 87-92) préviamente concentrado 1,73 vezes,

- 0,25 ml de NaOH 0,1 N,

- 0,45 ml de soro de vitelo fetal, e

- 0,50 ml de uma suspensão de fibroblastos em meio de McCoy 5a modificado (S. IWAKARA ET J. GRACE J. Med. 1164, 64, 2279) contendo 10^ células por ml.

Em 3 a 8 dias obtêm-se lattices retraidas cujas dimensões variam de 5 a 10 mm de diâmetro e 0,5 mm a 1 mm de espessura. Dois a três fragmentos de cada tumor são introduzidos num frasco de cultura do tipo Falcon de 25 cm , e são recobertos por uma lattice. São vertidos em cada frasco 2 ml de meio A, tendo o referido meio A a composição que se segue:

- meio RPMI 1640 adicionado de:

. 1% de L-glutamina, . 15% (v/v) no final de soro de vitelo fetal . anfotericina B (Fungizone R) à razão de 2 ,,5 ng por ml, . penicilina à razão de 100 unidades por ml, . estreptomicina à razão de 100 qg por ml.

Uma mistura gasosa A (ar mais 5% de CO₂) é nele introduzida e os frascos são em seguida colocados na estufa a 372C. Após 24 h de incubação para cada frasco, a quantidade do meio é completada até 5 ml. O meio é em seguida mudado de cinco em cinco dias. Em cada mudança, renova-se igualmente a mistura gasosa A. Cada frasco é inspeccionado diariamente ao microscópio. A duração da observação estendeu-se por 15 semanas. Em redor do conjunto explante-lattice, forma-se um tapete de células com aspecto fibroblástico do qual emergem colónias de células tumorais melanocitárias. Este conjunto de células constitui a população Pl. Estas células são obtidas quer em primocultura, quer após transferência e reposição em cultura num frasco novo do conjunto constituído pelo explante tumoral e pela lattice.

B - Preparação de uma suspensão celular 51

Verte-se no frasco contendo a população Pl 0,5 ml de uma solução de tripsina a 0,25% (p/v). A tripsina actua separando da parede do frasco (recipiente) células que a ela aderiram. Após um contacto com a tripsina de 10 minutos, interrompido pela adição de 5 ml de meio completo, as células são recolhidas no meio de cultura. A suspensão celular assim obtida é ajustada de modo a conter 2.10

celulas por ml (suspensão Sl).

C- Preparação de uma lattice a partir da suspensão Sl

Realiza-se uma lattice numa placa de Petri com 6 cm de diâmetro fazendo retrair o colagénio a 372C pela suspensão Sl nas condições que se seguem:

- solução de colagénio

1,5 ml

- meio de cultura completo ml

- NaOH, O,1M

- soro de vitelo fetal

0,450 ml

- suspensão Sl

0,50 ml *

Colocam-se em incubação 10 células em presença de 1,5 ml de uma solução de colagénio a 1 mg/ml.

D- Obtenção de um melanoma maligno reconstituído

Após 4 a 8 h de retracção a 37°C a lattice transforma-se numa massa celular que é a reconsti tuição de um melanoma maligno e a partir da qual se pode especialmente observar uma saida de células. 0 melanoma maligno assim reconstituído é chamado de primeira geração (melanoma MMR1).

2. Preparação em serie de melanomas malignos reconstituídos

O melanoma MMR1 obtido em 1C é transferido para um segundo frasco contendo meio de cultu ra completo e coloca-se este frasco em incubação a 37°C.

MMR1 dá origem por migração para fora da massa para o meio de cultura a uma população celular P2, constituída igualmente por células melanocitárias diferenciadas e por células com aspecto fibroblásti. co. A partir desta população P2, prepara-se uma suspensão g

S2 contendo 2.10 células por ml de acordo com o modo ope ratório aqui atrás indicado em IA.

Um melanoma maligno de segunda ge ração (MMR2) é então reconstituído a partir da suspensão S2 procedendo-se tal como foi atrás indicado em 1B e depois em 1C.

De uma maneira idêntica, a partir da suspensão S3 preparada a partir da população P3 igualmente constituída por células melanocitárias diferenciadas e por células com aspecto fibroblastico à qual dá origem o melanoma MMR2, é reconstiruído um melanoma maligno de terceira geração (MMR3).

3. Transferência dos melanomas malignos reconstituídos

Cada MMR é colocado em cultura até que as células às quais ele dá origem no frasco (reci piente) cheguem a confluir devido ao facto da sua proliferação. 0 MMR é então transferido e reposto num frasco (recipiente) novo contendo meio de cultura completo. A ope ração é renovada de 4 a 8 em 4 a 8 semanas em função da rapidez do crescimento celular.

4. Métodos de observação dos melanomas malignos reconstituídos e das populações celulares

Observação macroscópica

Por altura de cada transferencia, observa-se:

A retracçao , a aderencia e a pigmentação do MMR

A cor da massa centrifugada após recolha das células em confluência, o que permite azaliar a pigmentação celular.

Observação microscópica

As células provenientes dos MMR in vitro são observadas com o auxilio de um microscópio inverso do tipo Olympus (R) C.K. com contraste de fase.

5. Tratamento dos melanomas malignos reconstituídos tendo em vista o seu estudo histológico

Os fragmentos dos MMR incluidos em parafina são corados pela hemateina eosina de açafrão,

3. RESULTADOS

1. Melanomas malignos reconstituídos obtidos:

foram obtidos 9 MNR

3 a	partir	da metástase MC.I	(caso	I) ,
1	MMR	de	primeira	geração	(MMR	I	1)
1	MMR	de	segunda	geração	(MMR	I	2)
1	MMR	de	terceira	geração	(MMR	I	3)

-la partir da metástase MC II (caso II), ou seja:

MMR de primeira geração (MMR II 1)

-2a partir da metástase MC III (caso III) ou seja:

MMR de primeira geração (MMR III 1)

MMR de segunda geração ( MMR III 2)

3 a	partir da metastase MC IV (caso IV), ou seja:
1	MMR	de	primeira	geração	(MMR	IV	1)
1	MMR	de	segunda <	geração	(MMR	IV	2)
1	MMR	de	terceira	geração	(MMR	IV	3)

2. Observação macroscópica e microscópica do conteúdo dos frascos (ver quadro I)

A - MMR de primeira geração

- Observação macroscópica dos MMR I

I

QUADRO

Tapete fibrobástico	++ Depcis diminuição	++ sofrimento	++ diminuição	++ diminuição 1	4-	o	+1	+1	O
w

rO
P
0
§		o
-P		ω
		•I^-
U)		o
05		Q.
Ή	+		4-	+
c	4-	4-	+	4*	4-	4-	d-	+
'0	+	+	+	+	+	+	+	4-	+
·—1
0
u
							0		0
	0						p		+J
	P						ro		•rd
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	u				0
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n>	o	o	'0	0	03				b
u	b	b	ro	b		0		0	b
	b	b	i—1	c	Φ	u	3	o	ro 0
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	cr		»—í		OH	1-4		cr
	ε:				s:			ΕΞ
	ΕΞ 1	1	1	1	ΕΞ 1	1	1	Σ. 1	1

A Latisse preparada a partir da suspensão S1 é um disco translúcido com 6 cm de diâmetro. Após 4 a 8 dias de retracção, transforma-se num disco irr£ guiar e esbranquiçado com 5 a 10 mm de diâmetro por 1 a 2 mm de espessura. Em seguida pode continuar-se com a retracção. Ela forneceu, por exemplo, para o caso I, um tumor de 3 mm de diâmetro para o MMR1. A aderência ao frasco dos MMR1 colocados em cultura é importante. No decurso do tempo, apareceu progressivamente uma pigmentação. Esta permaneceu não homogénea e discreta para os MMR II e III 1; atingiu o castanho escuro para o MMR IV 1, o preto para o MMR II 1.

A massa celular obtida a partir da população P2 tinha uma côr castanho claro para o MMR I 1, castanho para os MMR II 1 e III 1, amarelado para o MMR IV 1.

- Observação microscópica das populações celulares PI e P2.

A população Pl, utilizada na pre paração dos MMR1, era constituída nos quatro casos I a IV por colónias tumorais melanocitárias diferenciadas visíveis a olho nú no frasco e associadas a um tapete de células com aspecto fibroblástico.

As células tumorais diferenciadas eram do tipo fibroide para o caso, I, em fuso mais globuloso para os casos II e IV, do tipo epitelioide para o caso III. Elas formavam colónias volumosas sem qualquer inibição de contacto.

* nos quatro casos I a IV, a primo-cultura de cada MMR1 deu origem a uma população P2 do mesmo tipo que a popu lação Pl, * Quando se realizaram as transferencias sucessivas para os MMR I 1, III 1 e IV 1, foi possível verificar, após respectivamente uma observação de 20 meses para o caso II, de 10 meses para o caso III 1 e de 6 meses para o caso IV 1, que as colónias que, desde o inicio eram menos volumosas, persistiram enquanto que o tapete de células de aspecto fibroblastico diminuía, * para o MMR II 1, foi possível verificar que as células se tornaram todas progressivamente células com aspecto fibroblastico, com crescimento lento e sinais de sofrimento (após seis meses). Neste caso apenas se realizou um MMR1 de primeira geração.

B— MMR de segunda geração

Foram realizados com as populações P2 provenientes respectivamente dos MMR I 1, III 1 e IV 1.

-Observação macroscópica dos MMR2

A retracção era menos importante que para os MMR1, em particular para o MMR III 2 em que o disco ficou atras flácido e com cerca de 2 cm de diâmetro. Do mesmo πιο do, a aderência ao frasco (íecipiente) estava diminuída, sobretudo para os MMR I 2 e III 2 que se deslocavam fácilmente,

A pigmentação permaneceu parcial, incidindo sobretudo sobre a periferia e a superfície superior livre dos

MMR, para os MMR I 2 e IV 2, completamente nula para o MMR III 2, a massa celular obtida a partir da população P3 era mais clara que a massa P2 e completamente branca para as células provenientes do MMR III 2.

-Observação microscópica das populações celulares P3

A população P3 proveniente de cada MMR2 era constituída por células tumorais que se multiplicavam a partir do MMR, mas as colónias disseminadas eram no seu conjunto menos volumosas, parecendo ter as células adquirido uma certa inibição de contacto.

As células com aspecto fibroblástico eram, após uma observação de respectivamente quatro me ses para o MMR I 2, dois meses para o MMR III e tres meses para o MMR IV 2, ainda, mais raras, limitadas ao contorno do MMR para os MMR I 2 e IV 2, completamente ausentes para o MMR III 2.

C-MMR de terceira geração

Puderam ser realizados com as populações P3 provenientes respectivamente dos MMR I 2 e IV 2, mas não com as populações P3 provenientes do MMR III 2 que de nenhum modo retraia o colagénio.

-Observação macroscópica dos MMR3

Para os MMR I 3 e IV 3, os fenómenos já observados acentuaram-se: retracção menos importante, aderência ao frasco (recipiente) diminuída, pigmentação fraca para o MMR IV 3 e nula para o MMR I 3.

- Observação microscópica das populações celulares P4

Observa-se sempre uma multiplicação de células tumorais a partir de cada MMR3, mas as colónias tumorais são no seu conjunto menos importantes. As massas obtidas a partir das populações P4 provenientes dos MMR3 apareceram ainda mais claras. Enfim, verificou-se apos uma observação de respectivamente tres meses para o MMR I 3 e de um mês para o MMR IV 3, que o tapete fibroblástico se rarificava para o MMR I 3 e que tinha mesmo desaparecido para o MMR IV 3.

3. Estudo histológico dos MMR

A presença de células volumosas, poliédricas, contendo um núcleo grande central e nucleolado (com nucléolo), entre as quais algumas eram muito pigmen tadas, era muito evocativa de uma proliferação melanocitária tumoral.

I

4. Comentários

As células provenientes da cultu ra sob lattice compacta em cobertura de explantes de melanomas malignos (metástases cutâneas) podem pois ser utilizadas para reconstituir in vitro, uma vez misturadas com colagénio, um tumor em três dimensões cuja evolução é facil de seguir. Os parâmetros mais interessantes a ter em conta são: a retracção, a pigmentação e a aderência. 0 seu estudo permite seguir in vitro as varias etapas de for mação do tumor melanocitário maligno.

As células provenientes dos MMR caracterizavam-se pela variabilidade das suas potencialidades para se multiplicarem, para se pigmentarem, para for marem colónias disseminadas no frasco de cultura à distancia dos MMR.

É possivel estabelecer uma ligação entre as caracterlsticas evolutivas de um MMR e as particularidades das células que são dele provenientes. No essencial, quanto mais a pigmentação do MMR se torna intensa, tanto menos a multiplicação celular e a migração sob a forma de colónias encontram facilidade de se realizar. Por outro lado, a importância no tamanho e no número das células torna-se menor à medida que o tapete de células de aspecto fibroblastico que lhes estava associado se rarifica. Estes fenomenos tornam-se mais caracteristicos ainda quando se estuda a reconstituição em serie de MMR.

É igualmente possivel encarar fac tores específicos e distintos que condicionam am particular as potencialidades de pigmentação, de multiplicação e de migração celulares.

Claims

lâ.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido em três dimensões, caracterizado por se submeter a uma incubação em presença de colagénio uma suspensão celular preparada a partir da população heterogénea proveniente do conjunto formado por uma rede e por um explante de um tecido patologico colocado em cultura de acordo com o método de cultura sob rede compacta de cobertura, sendo a referida população constituída, por um lado, por células patológicas diferenciadas e por fibroblastos de dois tipos, os que provêm do estroma do tecido e os pre cedentes da rede.
2â.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido em três dimensões de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o explante preparado ser proveniente de um tumor.
3â.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto do tumor a partir do qual provem o explante ser um tumor maligno.
4â.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto do tumor a partir do qual provem o explante ser um melanoma maligno.

I
5â.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto do colagénio ser utilizado sob a forma de uma solução purificada aquosa contendo de 0,1 a 5 mg de colagénio por ml.
6â.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido de acordo com a reivindicação 5, carac terizado pelo facto do colagénio ser utilizado sob a forma de uma solução contendo 1 mg de colagénio por ml.
7^a.- Processo de reconstituição in vitro de um tecido de acordo com qualquer uma das reivin θ dicações 4 a 6, caracterizado pelo facto de 2.10 células da população heterogénea proveniente da cultura de um melanoma maligno serem colocadas em incubação na presença de

1,5 mlde uma solução de colagénio a 1 mg/ml.
8^a.- Processo de preparação em serie de tecidos reconstituídos em três dimensões, carac terizado por se efectuarem as operações sucessivas que se seguem:

A- incubação na presença de colagénio de uma suspensão celular preparada a partir da população celular heterogénea, constituída por células patológicas diferenciadas e por células de aspecto fibroblástico, provenientes de um tecido reconstituído da primeira geração obtido de acordo com o processo de um qualquer uma das reivindicações 1 a 7, até

-2 7à obtenção de um tecido reconstituído de segunda geração.

B- incubação na presença de colagénio de uma suspensão ce lular preparada a partir da população celular heterogénea, constituída por células patológicas diferenciadas e por células de aspecto fibroblástico, provenientes do tecido reconstituído de segunda geração obtido em A, até à obtenção de um tecido reconstituído de terceira geração.
9^.- Processo de preparação em serie de tecidos reconstituídos de acordo com a reivindicação 8, caracterizado além disso por se efectuar a repetição da operação B, de tal modo que, partindo de um tecido reconstituído de geração n, se obtem um tecido reconstituído de geração n + 1.