PT86588B

PT86588B - Processo para a utilizacao de um sistema de vectores cassete para a expressao de codoes abertos em celulas eucarioticas

Info

Publication number: PT86588B
Application number: PT8658888A
Authority: PT
Inventors: Hans-Ulrich Bernard; Tilmann Oltersdorf; Klaus Seedorf
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-01-24
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 1991-12-31
Also published as: DK31288A; EP0276730A2; DK31288D0; FI880259A; AU1071188A; EP0276730A3; PT86588A; DE3702116A1; JPS63196294A; FI880259A0

Description

Memória descritiva

A invenção refere-se a um sistema multifacetado de vectores cassete que possibilita a transcrição e translacçao de codoes abertos (ORF) em células eucarióticas superiores e que permite, devido a uma origem de replicação E.coli, a selecção e amplificaçao em células de

E.coli. Os sistemas até agora conhecidos para a preparação de proteínas de fusão nao permitiam na medida desejada fazer previsões sobre as proteínas de fusão obtidas, em particular no caso da expressão de um ORF num CDNA ou em exoes virais ou genómicos sem sinais de iniciaçao de translacçao em especial sem codão de início ATG.

FM ·

A invenção esclarece-se com as fi guras apresentadas em anexo:

A figura 1, apresenta esquematicamente o sistema de vectores cassete de acordo com a invenção, em que P é o promotorr, T a iniciaçao de translacçao, L uma região de plilinguagem e S o sinal de junção de poliadenilação e em que o círculo simples simboliza o fragmento PouII-EcoRI de pBR322 com o gene resistente à ampicilina (Amp^r) e a origem de replicaçao (ori). 0 segmento assinalado na zona da região de polilingua gem representa o DNA a construir com o ORF a exprimir.

A fifgura 2 representa na região superior o plasmídeo p297 no qual a região 323 bp é substituída pela sequência de UNA ordenada na parte inferior, obtendo-se o plasmídeo pATG. Neste plasmídeo podem introduzir-se-como se indica a título de exemplo- nos locais indicadaos, por um lado um fragmento 670 bp - DNA com o promotor de citomegalovirus humano (MCMV) e, por outro lado, um fragmento 57-59 bp com uma região de polilinguagem, estando as três variantes desta região de polilinguagem numa configuração tal que o codao de iniciaçao ATG contido na zona enquadrada esteja sempre no codao de uma sequência de DNA a introduzir numa região de polilinguagem.

A figuera 3, mostra finalmente a sequência de DNA das giões mencionadas para os três vectores de expressão reamicodifiP0RFEX11-13 e, em noácidos, isto é, baixo, as respectivas sequências de a região N-terminal das proteínas cadas por estes vectores.

Os diferentes aspectos da invenção encontram-se definidos nas reivindicações. No que se segue ilustram-se de forma mais detalhada alguns aspectos particulares da invenção.

Em primeiro lugar descreve-se a cons truçao dos vectores de acordo com a invenção, de onde ressalseja necessário entrar para o especialista, a larga gama de variaçao, sem que lhados.

possibilidades de em pormenores deta0 fragmento pBR 322-PouII-EcoRI com 2295 bp (pares de bases), que representa apenas, por exemplo, uma determinada sequência de DNA de um plasmídeo de E.coli com origem de replicaçao e marcador de selecçao, liga-se com o fragmento SV40-BglII-PouII com 323 pb, que contêm o early-BamHI-BglII com 848 pb que contém o sinal de junção da região de t-antigene. Esta construção completa-se com um fragmento SV40-EcoRI-BamHI com 746 bp com a região de poliadenilaçao tardia”. 0 plasmídeo p297 assim obtido (figura 2) corresponde na sua construção aos plasmídeos pSV2 conhecidos (Mulligan e Berg, Science 20g (1980) 1422-1427).

extremos concavos now e os extremos de ligaçao blunt sições BamHI eliminadas, -II-BglII com o promotor bp, que se representa deo pATG, A região de 10 de à região de início SV40-T-antigene.

corta-se com BamHI, os enchem-se com a ajuda de polimerase de Kleconvexos ligam-se de novo com compostos end.

plasmídeo na

A partir deste plasmídeo, com as posubstitui-se então o fragmento PouSV40 por um oligonucleótido com 34 figura 2. Obtém-se assim o plasmíbp enquadrada na figura corresponNo plasmídeo pATG pode substituir-se a região desde a posição de corte Sphl atê ã posição de corte Kpnl por promotores eucarióticos desejados. 0 mais sini pies é proceder de modo a obter um fragmento com ambos os extremos convexos por meio de um promotor, por exemplo por enchimento com a ajuda de polimerase de Klenow, em que se introduz o fragmento convexo na posição de corte Smal do vector puC18 ou puC19 e se corta depois como fragmento Sphl-Kpnl e se liga ao correspondente plasmídeo pATG cortado.

Escolhendo-se por exemplo o immediate early promotor de HCHV (Boshardt et al., Cell 41 (1985) 521-530; EP-A 0 173 177) como fragmento HincII-AvalI com 656 bp (556bp para além do cap site) e procedendo-se como descrito anteriormente, obtém-se desse modo o vector de expressão pORFEXIO.

Uma outra concretização vantajosa da invenção consiste ne escolha do promotor heat drock-protein 70 regulador de calor da Drosophila (hsp; steller, H., Dissertation 1985, Universidade de Heidelberg) na forma de um fragmento EcoRI-HindIII com 335 bp (85 bp para além do cap-site da mRNA). Por meio da introdução, acima descrita, no plasmídeo pATG obtém-se o plasmídeo de expressão pORFEX2O.

introduzir-se que

Hind III, de início ATG modo vectores pORFEXIO e 20 podem

Nos plasmideos sequências de DNA nas posiçoes de corte BglII possuem um ORF no codao correcto para o codao presente de expressão de servem ainda como vectores de de acordo com a invenção, de leitura desviados (frame

Estes plasmideos representam deste acordo com a invenção.

Estes partida para em especial para shift) .

outros vectores os que têm codoes

Em vez do iniciador de translacçao SV40-T-antigene pode também introduzir-se uma outra região correspondente, nomeadamente com vantagem por permuta do fragmento Kpnl-BglII dentro do oligonucleótido sintético no plasmídeo ATG.

No lugar da região BglII-hindIII no oligonucleótido sintético no pATG pode introduzir-se o agen te de polilinguagem modificado pUC18, cuja região 5'- está representada na figura 3. As sequências reproduzidas na figura 3 começam com o codao de início ATG, que esta na figura na zona enquadrada. As posiçoes de corte BglII são idênticas ã posição BglII que, na direcçao da figura

3’- é vizinha

à zona enquadrada referida. Por modificação da região na figura 3 entre as posiçoes de corte BglII e EcoRI obtém-se o afastamento gradual do codao de de início ATG.

leitura em relação ao codao

Ê claro que o agente de polilinguagem pUC18 modificado é, por exemplo, uma região de polilinguagem que pode ser substituída por sequências de DNA de efeito análogo. Podem assim construir-se proteínas com um determinado terminal N-. Estas construções permitem a introdução de genes estruturais que apresentam, por exemplo, o seu próprio codao de início. Além disso podem codificar-se determinadas sequências de aminoácidos N-terminais, por exemplo para sinais de transporte (von Heijne, G., Eur. J. Biochem. 133 (1983)17-21).

As construções de acordo com a invenção nao contêm qualquer codao ATG antes da inserção sintética. Deste modo garante-se um consumo muito eficiente deste tripleto ATG em células eucarióticas. Assim, se se introduzir por exemplo um fragmento de DNA na posição de corte HindIII dos vectores pORFEXll - 13, pode então dizer-se com segurança que a expressão ocorre a partir do codão ATG naquele dos três vectores em que o ORF no codao de leitura se liga com o codao ATG.

Uma condição necessária promotor é que o promotor tenha sido construí do na orientação correcta. No caso do fragmento HCMV pode verificar-se a orientação com base Bgll assimetricamente ordenadas e no caso do motor hsp pela posição de corte YhOI.

pressão e que o para uma exdo promotor nas 3 posiçoes fragmento do pr£

Como gene estrutural a experimentar pode utilizar-se por exemplo o gene bacteriano resistente con. tra a higromicina (Hm ), bem como um outro gene que codifique para a cloranfenicol-acetiltransferase bacteriana (CAT). Sao

particularmente significativos os vectores de acordo com a iii vençao para a expressão de proteínas virais, em especial de proteína humana papillomvirus (HPV), por exemplo do tipo 6, 11,16 ou 18, que após transfecção de linhas celulares de rato ou humanas não dão transcrição ou dao apenas uma transcrição imprecisa, de modo que, por exemplo com anticorpos contra proteínas de fusão de Ecoli nao se podem encontrar proteínas nos vectores o ORF para a proteína E7 de HPV18, rato uma expressão traii (transient expression) da proteína E7, que constitui pode lovirais. Se se introduzir por exemplo, com a invenção, após transfecção de L-fibroblastos siente cerca de 2% da quantidade total de proteína e que se calizar como componente do citoplasma.

de de acordo obtém-se

Em comparaçao com as células Hela, que contém 10 a 50 cópias endrogénicas de HPV18 (Schwarz et al., Nature 314 (1985) 111-114), obtém-se uma expressão superior por um factor de cerca de 100.

Nos exemplos seguintes esclarece-se mais em pormenor a invenção

Exemplo 1

A partir do plasmídeo pSV2CAT (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 1044-1051) corta-se o fragmento com o gene CAT, por meio de HindIII e Hpal, que no sentido ascendente contém mais 36 nucleótido e no sentido des^ cendente apresenta um segmento genético com o sinal de junção SV40 (que corresponde ao segmento BglII-Hpal de p297).

vector pORFXIO abre-se com HindIII e Hpal e o fragmento respectivo liga-se ao gene CAT, obtendo-se o plasmídeo pORFEXIO-CAT. Este possui, antes do codáo de início CAT-ATG, um outro codao ATG, mas num outro codao de leitura. Este plasmídeo activa por isso apenas uma expressão reduzida pelo factor 20.

Ο plasmídeo pORFEXIO-CAT corta-se por isso com Kpnl e HindIII e o fragmento grande assim obtido liga-se com o oligonucleótido sintético AGCTTGTAC na presença de dATP. Obtém-se assim o plasmídeo pORFEXIO-CAT- -ATG. Este plasmídeo activa em comparaçao com pSV2CAT- uma expressão de CAT mais elevada cerca de um factor 5.

TABELA 1

Plasmídeo % de cloranfenicol transformado

-		0
pSV2CAT		12,4
pORFEXIO-CAT		3,0
pORFEXIO-CAT-	ATG	60,9

Exemplo 2

Bernard et al., Exp. Cell Res. 158 (1985) 237-243, descreveram fragmentos BamHI-HindIII que contém o gene bacteriano resistente à higromicina (Hm^r) em todos os três codões de leitura. Estes fragmentos introduzem-se como fragmentos BamHI-HindIII no pORFEXIO, que se cortou com HindIII e BamHI. A transfecção em células-L dá origem, 2 semanas e selecçao contra a higromicina apenas clono p0RFEX10-Hm24, a colónias ao plasmídeo de partida pHMR272 anterior). As poucas e pequenas _P0RFEX10-Hml9 rior ao codao bem formadas que (Bernard et al., colónias no caso a um segundo codao ATG exteapos no caso do correspondem referência do clono bela 2.

devem atribuir-se de leitura. Os resultados apresentam-se na Ta7

Plasmídeo

TABELA 2

Número de colónias pHMR272 pORFEXIO pORFEXIO-Hmló p0RFEX10-Hml9 pORFEX10-Hm24 p0RFEX10-Hm24*

290 (pequeno)

220 * orientação invertida

Exemplo 3

P 36 25 257.3 nas

No registo de patente alema propoem-se construções de vectores semelhantes, região de polilinguagem está deslocada por pasde modo que o gene a expri

sos mir denações no codao de leitura correcto.

quais uma , de uma posição de nucleótido, aí introduzido fica automaticamente numa destas três orIntroduzindo-se no vector pEXIO-mer o ORF para a proteína HPV18-E7, o obtido codifica para uma proteína de fusão na qual, na posia proteína (cadeia çao de se encontra transiçao entre a proteína MS2 e a seguinte sequência de DNA

CTG AAT

EcorI está no mesmo codao

EX11 ou 13.

vector

HPV18-E7 codificante):

GGA TCC GTC

BamHI

Na sequência de EcoRI o tripleto AAT de leitura queem pORFEX12, mas nao em pORF mesmo é válido para o tripleto TCC na posição de corte BamHI.

Uma vez que ao cortar-se com BamHI se obtém o mesmo extremo convexo como com BglII, podem ligar-se os vectores pORFEXIO e pORFEX2O depois de cortados com BglII com as sequências cortadas com BamHI, estando as últimas também ordenadas em codoes de leitura correctos.

Transfectando-se células-L com os vectores assim obtidos assim obtidos, obtém-se uma transient expression da proteína de fusão codificada, que abrange a maior parte da proteína HPV18-E7. Após lisagem das células e análise western blot com anticorpos, que sao mencionados no registo de patente referido atrás, encontra-se a proteína esperada nas células que foram infectadas com pORFEXIO, 12 e 20 (no último caso após heat shock), mas nao nas células que foram infectadas com pORFEXll e 13 ou nas célula que continham construções com a orientação do promotor HCMV invertida.

Em células Hela com 10 a 50 cópias endogénicas de HPV18 encontrou-se, por meio de anticorpos de coelho contra a proteína de fusão HPV18-E7, uma pequena banda para uma proteína 12,5 kDa, isto é, da ordem de grandeza esperada. Uma análise quantitativa por meio de contagem de cintilação das bandas E7 mostrou que as células-L infectadas, com 2% em média de proteína E7 em relação ao to. tal de proteína celular, continham uma quantidade 100 vezes superior à das células Hela, que apenas tinham 0,01% do total de proteína celular como proteína E7.

Por meio de immunestaining pôde mostrar-se que a proteína E7 se localiza no citoplasma.

Condiçoes do processo;

Cultivaram-se fibroblastos LTK- de rato num meio Eagle modificado de acordo com Dulbecco (DMEM) suplementado com soro de vitela fetal a 10%,

HEPES 10 mM (pM 7,4) e 100 ug/ml de penicilina/estreptomici_

DNA colocaram-se diâmetro, 24 horas e adicionaram-se 10 que continha 200 pg/ml Após 5 horas 2 vezes com DMEM

tampao de

Para a transfecçao θ células numa cápsula de 10 cm transiente” de de

3.10 mais tarde lavaram-se 2 vezes com DMEM pg de DNA-plasmídeo em 2 ml de DMEM, de DMEM-Dextran (0,5 mDa) e 0,lM de cloroquina de incubaçao a 37°C lavaram-se as células e cultivaram-se depois, durante 48 horas, plemento acima mencionado plasmídeo com o promotor hsp, de 5 horas a 42°C, após

No caso em que efectuou-se em se um o tempo de incubação

DMEM com o introduziu um heat shock suA análise das células transfectadas, por meio de um teste de CAT, efectuou-se com 5 pg de proteí_ na, que se trata com cloranfenicol- C de 62,5 uCi (Gorman et al., referência acima indicada).

Para a impnocitoqpímica colocaram-se as células 24 horas após a utilização do DNA em recipientes de vidro tratados em autoclave. 24 horas depois lavaram-se os recipientes com uma solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato. As células fixaram-se durante 5 minutos em metanol gelado e durante 2 minutos em acetona. A imunocitoquímica efectuou-se com antisoro de coelho contra a proteína de fusão MS2-HPV18-E7 (registo de patente alemao P 36 26 257.3; Seedorf, K., Disertação, Universidade de Heidelberg, 1986) e com um sistema de detecção usual no mercado Os recipientes incubaram-se primeiro durante 1 hora com os anticorpos referidos numa diluição de 1:50 a 1:200, lavaram-se 3 vezes com uma solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato, incubaram-se durante 1 hora com um anticorpo biotinil-anti-coelho, lavaram-se novamente e incubaram-se durante 1 hora com um complexo de estreptavidina-biotinil-peroxidase (diluição 1:100). Como substrato para a reacçao corada utilizou-se 3-amina-9-etilcarbazole a 0,02% em tampao de acetato 50 mM (pM 5,2 com peróxido de hidrogénio a 0,93%. Todas as incubações se efetuaram a 37°C

Claims

- I^a Processo de engenharia genética em que se utiliza um sistema de vectores cassete, contendo

a) um segmento de um plasmídeo de E.coli com um início de rje plicaçao activo na E.coli e um marcador de selecçao,

b) segmentos permutáveis, activos em células eucarióticas s_u periores, nomeadamente b^) um promotor, b ) um iniciador de translaçao b^) um agente de polilincagem, b^) um sinal de junção e b ) um sinal de poliadenilaçao, podendo também dois destes segmentos permutáveis apresentar-se como unidades permutáveis em conjunto, caracterizado por se ligar o fragmento pBr 322-PvuII-EcoRI de 2295 pb (pares de bases) com o fragmento SV40-Bgl II-Pvu II de 323 pb e em seguida com o fragmento SV40-Bam HI-Bgl II de 848 pb, completando-se pelo fragmento SV40-EcoRi-Bam HI de 746 pb, obtendo-se o plasmídeo p 297, e se cortar este com Bam HI, se encherem os extremos convexos com polimerase de Klenow e se ligarem de novo os extremos concavos e se substituir, no plasmídeo obtido, o fragmento Pvu II-Bgl II por um oligonucleótido com 34 pb, obtendo-se o plasmídeo p ATG com as sequências de DNA (cadeia codificante)

ATG GAT AGA TCT (I) ATG GAT AGA TCT c (2) ATG GAT AGA TCT cc (3)

em que o tripleto ATG no extremo 5’ das sequências (1) (2) e (3) constitui o único codão de início de translacçao, colocado funcionalmente depois do promotor, e quências (1), (2) e (3) do agente de em que se liga às se3 polilincagem b .

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o segmento do plasmídeo de E.coli ser o fragmento 2295 bp pBr 322 Pvu II- EcoRI.

- 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o promotor ser o promotor hsp da proteína-70 Drosophila- heat Shock”.