PT86117B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais antigram negativos - Google Patents

Description

Investigações realizadas nos Estados Unidos da América mostraram que as septicemias provocadas por bactérias gram-negativas estão em aumento constante. Um estudo clínico realizado por Ziegler em 1982 evidenciou o melhora mento terapêutico conseguido pela seroterapia no tratamento des tas septicemias gram-negativas e dos choques endotoxínicos.

Os anticorpos monoclonais (AcM) po dem substituir a seroterapia no tratamento destas afecçÕes.

A endotoxina das bactérias gram-ne gativas é um lipopolisacárido antigénico (LPS).

Os anticorpos dirigidos contra a parte antigene 0 (ou O-cadeia lateral) do LPS são específicas, ao mesmo tempo, para a espécie e para o tipo de bactéria. Pelo contrário, os anticorpos dirigidos contra a região lípido A-nucleo da endotoxina da bactéria são susceptíveis de reagir com diferentes géneros de bactérias gram-negativas. Com efeito, a

- 1 _ parte lípido A-núcleo é relativamente constante nas bactérias gram-negativas.

Os anticorpos monoclonais capazes de reagir com as bactérias gram-negativas de géneros diferentes têm sido descritos num largo número de referências.

Podem citar-se os pedidos de licen ça PCT η.® WO 84/04458 e WO 85/01659 bem como o pedido de licen ça europeia n.fi 174.204.

pedido PCT WO 84/04458 utiliza como antigene a endotoxina de mutantes rough sem o antigene 0 e eventualmente sem uma parte dos açúcares do núcleo para obter esta ausência de especificidade. 0 pedido refere igualmente que é possível utilizar endotoxinas completas que se degradam parei almente para obter uma estrutura simplificada do antigene, do gé nero da endotoxina dos mutantes rough.

Com efeito, os LPS possuem um polo hidrúfobo do lado do lípido A e um polo hidrófilo do lado do an tigene 0.

Em meio aquoso, estes LPS associam -se numa estrutura micelar, com a parte lípido A ao centro e o antigene 0 dirigido para o exterior das micelas.

A parte antigénica comum aos diferentes géneros está assim escondida e, não estando exposta, não pode gerar anticorpos não específicos. Ê por esta razão que é necessário um LPS incompleto.

Adoptou-se esta mesma aproximação no pedido WO 85/01659 que utiliza como antigenes endotoxinas do tipo LPS de mutantes rough. Este pedido descreve nomeadamente uma mistura de diferentes anticorpos monoclonais murinos que pro tege contra o choque endotoxínico provocado por Escherichia Coli J5 (Ec J5).

Contrariamente à ideia original, a requerente obteve AcM que reagiam com bactérias gram-negativas de diferentes géneros, utilizando como antigene uma endotoxina . completa de bactérias smooth, compreendendo assim a respecti2

_ va parte antigene 0.

Por este motivo, o presente pedido tem como objectivo um processo de preparação de anticorpos mono clonais de mamíferos, dirigidos contra a parte lípido A-núcleo das endotoxinas das bactérias gram-negativas de diferentes gene ros, caracterizado por o antigene que serve para a imunização da célula imunocompetente ser um lipopolisacârido completo de u ma bactéria gram-negativa, cuja parte lípido A-núcleo está exte riorizada.

Por LPS completo, entende-se a endotoxina que compreende a parte lípido A, a parte núcleo e a to talidade ou a maior parte da parte antigene 0.

Quando se diz que a parte lípido A-núcleo do LPS está exteriorizada quer-se dizer que a parte lí pido A-núcleo do LPS, normalmente não exposta ao contacto com as células imunocompetentes, se encontra exposta e possui por isso a capacidade de estimular os linfécitos B.

LPS pode ser originário de qualquer espécie de bactéria gram-negativa, mas de preferência de bactérias dos géneros Klebsiella, Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, Bacteroldes, Serratia ou Proteus, em especial do gé nero Klebsiella e em particular de Klebsiella pneumonias bem co mo de Escherichia coli.

Nas condiçães preferenciais de execução do processo acabado de mencionar, o LPS tem uma estrutu ra LPS-LAP. Por LAP entendem-se:

Proteínas associadas ao lípido A (Morrison: The Joumal of Immunology Vol. 119, n.2 5, Nov.1977, pag. 1790 e Handbook of Endotoxin Vol. 1, Chemistry of Endotoxin, Ed. RIETSCHEL ELSEVIER (1984), pag. 339 e seguintes: The protein component of bacterial endotoxins).

Os LPS-LAP podem preparar-se de acordo com os métodos descritos na literatura. Os LPS-LAP preferidos são aqueles cuja preparação se descreve nas licenças euro \ peias n.fis 49182 e 115988, nas quais se encontam referidos como

glicoproteínas.

Estes podem preparar-se, nomeadamente, por cultura dos microorganismos até desenvolvimento completo, lisagem dos gérmens, de preferência enzimática e depois química, secagem do lisado, extracção dos lípidos com solventes, de preferência com acetona e depois com metanol, suspensão do lisado em água, desprotidação física, de preferência por centri fu.gação, ultrafiltração da solução, sob pressão, de preferência com um ultrafiltro de limiar de corte de 3oo.ooo, precipitação com um halogeneto de amónio quaternário, concentração da camada sobrenadante, de preferência com ultrafiltros de limiar de corte de 5ooo a loo.ooo e precipitação dos LPS-LAS desejados por meio de um alcanol de baixo peso molecular.

Os processos de preparação de anti corpos monoclonais, in vivo e in vitro, são conhecidos da literatura, nomeadamente nas licenças PCT WO 84/04458 e 85/01659 acima referidas.

Contrariamente aos processos anteriores, a imunização efectua-se com um LPS completo, mas cuja parte lípido A-núcleo está exteriorizada. Por exemplo, injectam -se ratos por via parenteral (sub-cutânea, intramuscular ou intraperitoneal) com uma ou várias injecçães de LPS-LAP à dose preferencial de 1 mg por kg, em presença ou não de um adjuvante como o adjuvante de Freund. Aâministra-se uma última injecção por via intravenosa três dias antes da colheita das células do baço para hibridação.

As chapas seguintes; fusão com células de mieloma, detecção dos hibridomas que segregam anticorpos dirigidos contra o antigene de imunização, conservação dos hibridomas, clonagem, produção dos anticorpos, efectuam-se de a cordo com os métodos conhecidos.

pedido presente tem igualmente como objectivo um processo para a preparação de anticorpos mono clonais de origem murina ou humana, bem como os hibridomas que segregam os referidos anticorpos, nomeadamente os designados por Dg 1/, 6 D^, 12 Bg, ΒγΒ^, E22 Hg e HyAg.

Os anticorpos monoclonais prepara dos de acordo com a invenção têm utilização terapêutica com fins curativos ou preventivos, em seres humanos e animais. Por isso, o presente pedido tem também como objectivo um processo para a preparação das composições farmacêuticas que contêm os AcM referidos.

Os anticorpos monoclonais prepara dos de acordo com a invenção podem também utilizar-se para fins de diagnóstico, para a detecção, identificação ou doseamento das bactérias gram-negativas, da endotoxina das bactérias gram-negativas ou da parte lípido A-núcleo da endotoxina das bactérias gram-negativas. 0 presente pedido tem ainda como objectivo um processo para a preparação de composições para diagnóstico destinadas à detecção, identificação ou doseamento dos antigenes acima mencionados·

Os anticorpos monoclonais preparados de acordo com a invenção podem utilizar-se igualmente para a purificação de produtos que contêm a parte antigénica não específica das bactérias gram-negativas. 0 presente pedido tem asi sim ainda como objectivo um processo para a preparação de compo. sições destinadas à purificação de produtos que contêm a parte antigénica não específica das bactérias gram-negativas, caracte rizadas por incluirem os anticorpos monoclonais mencionados.

As linhas celulares hibridomas:

D^, 12 Bg, Dg B^, foram depositadas em 5 de Novembro de 1986 na Collection Nationale de Culture de Microorganismes” (CNCM-Instituto Pasteur) em Paris, sob os n.2s I 618, I 619 β I 620.

As linhas celulares hibridomas seguintes: ΒγΒ^ (anti E. Coli, reagindo também com Serratia e Iteeu domonas aeruginosa), EggBg e H^Ag (anti Enterobacter) foram igualmente depositadas em 9 de Novembro de 19θ7 na “Collection Nationale de Culture de Microorganismes” (CNCM-Instituto Psteur), sob os n.2s 1-711, 1-712 e 1-713, respectivamente.

A estirpe de Klebsiella pneumoniae CIP 52145 foi depositada pela requerente na CNCM sob o n.fi I 163, a 25 de Junho de 1961.

A estirpe de Escherichia coli

0111 é bem conhecida, nomeadamente 0 seu mutante J5 e foi de positada por diversas sociedades em diversas colecções de micro organismos.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a presente invenção sem contudo a limitarem.

Exemplo 1

I. Preparação dos antigenes

1) Preparação da biomassa

A cultura efectua-se em fermentador de 15 litros num meio:

Caldo tripto - caseína soja

Hidrolisado triptico de caseína 17g/1

Peptona papaínica de soja 3g/1

Cloreto de sódio 5g/1

Fosfato bipotássico 2,5g/1

Dextrose 2,5g/1 ajustando o pH a cerca de 7,3 após sementeira com a estirpe lio filizada conservada em meio de gel posta em suspensão em líquido fisiológico.

2) Recuperação dos germens

Ao fim de 15 horas de cultura, cen trifugam-se os gérmens durante 30 minutos a 11.500 g, lavam-se 2 vezes com uma solução apirogénica de Nacl a 9% e tomam-se num litro de água destilada esterilizada apirogénica.

3) Lisagem

Aquecem-se então os gérmens a 70°C durante 1 hora e meia. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, efectua-se a lisagem por adição de 1,25 g de ácido etile nodiaminatetraacético, de 1 g de mercurotiolato de sódio e 8 ml de lisosima de albumina (lOOg/litro).

Deixa-se a solução h temperatura ambiente durante 8 dias e liofiliza-se em seguida.

4) Preparação do antigene

Adicionam-se em seguida 5 litros de acetona ao pó bacteriano e agita-se durante 1 hora e meia. Após

decantação, filtra-se o p6 através de vidro sinterizado tipo G2 e seca-se a 40° C, durante 16 horas, sob pressão reduzida.

Trata-se em seguida o pó com 51 de metanol durante 1 hora e meia, sob agitação. Filtra-se o resíduo e seca-se como indicado anteriormente.

Os gérmens assim tratados, tomam-se em água (20 g/litro) e mantêm-se sob agitação durante 16 ho ras a + 4° 0.

Centrifuga-se então a suspensão du rante 45 minutos a 11.500 g e purifica-se a camada sobrenadante por ultrafiltração através de uma membrana Hollow Fiber Amicon ^ΗΛοο· antigene é constituído pela frac ção retida nestas membranas e lava-se com 40 volumes de água pu rifiçada por permuta e filtra-se através de uma membrana de 0,22 microns.

Terminada esta ultrafiltração, cen trifuga-se a solução durante 15 minutos a 11.500 g e liofiliza-se em seguida.

de:

Este processo permitiu a preparação dos antigenes (ver Quadro I) a partir

Proteus

Proteus

Proteus vulgaris mirabilis morganii estirpe estirpe estirpe

CIP

CIP

CIP

54160 A 234

A 231.

Biterobaeter cloacae estirpe Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes

CIP 6085

CIP 6086

CIP 6023.

Para

estirpe CIP 52168 estirpe Klebsiella pneumoniae CIP 52145, o antigene foi ainda tratado como indicado nos exemplos 1 e 2 da licença europeia η.δ 49182 (tratamento com brometo de acetiltrimetilamónio, centrifugação, etanol, diálise, liofilização e filtração em gel), ou no exemplo 1 da licença eu ropeia n.2 0115988.

QUADRO 1

Rendimentos em gramas por litro de cultura

	estirpe	gérmens	antigene
Proteus vulgaris	CIP 54160	10,44	0,05
mirabilis	CIP A 234	13,6	0,23
morganii	CIP A 231	4,7	0,06
Enterobacter cloacae	CIP 6085	12	1,54
Enterobacter aerogenes	CIP 6086	12,7	0,64
Enterobacter aerogenes	CIP 6023	13,1	1,8
Escherichia coli	CIP 52168	4,23	0,08
Klebsiella pneumoniae	CIP 52145	10	0,36

II. Imunização pelo antigene isolado de Klebsiella pneumonias

Imunizou-se um rato BALB/C de Ôsema nas de idade, injectando-se por via parenteral ao dia zero e 21, 20 mcg do antigene descrito na licença francesa n.2 2.540.136 e depois 10 mcg do mesmo antigene ao dia 35; 3 dias depois desta última administração procedeu-se à remoção do baço.

III. Preparação dos linfócitos do baço

Tritura-se o baço num triturador e ajusta-se a suspensão celular a 10 x 10^ células por mililitro, no meio de Dulbecco.

IV. Preparação do Mieloma SP^/O-Ag 14

Centrifuga-se uma cultura de células SP₂O em fase de crescimento, lava-se e toma-se em seguida no meio de Dulbeco na razão de 8 x 10^ celulas/ml.

V, Fusão

Centrifugam-se 15 x 10^ células SPgO e 50 x IO⁸ linfócitos do baço de rato durante 5 minutos a

1.100 tr/mn. Elimina-se a camada sobrenadante e_t no resíduo ce lular, adiciona-se gota a gota 1 ml de polietilenoglicol 1000 a 45$ (Merck 9729). Esta operação efectua-se ã temperatura ambiente durante exactamente um minuto.

Durante o minuto seguinte dissocia -se o resíduo celular com a ponta de uma pipeta. Adiciona-se em seguida, gota a gota, 2 ml de meio de Dulbecco à razão de 1 ml por minuto e depois 18 ml de meio de Dulbecco contendo soro de vitela fetal (10 $ final) à razão de 4,5 ml por minuto.

Homogeniza-se a suspensão celular com a pipeta e deposita-se numa caixa de Petri de 8 cm de diâmetro.

Cultivam-se estas células a 37° C num incubador humificado contendo 8$ de C0_o. Após 18 horas de cultura, ajusta-se a suspensão a 2,5 x 10³ células/ml em meio de Dulbecco contendo 10 $ de soro de vitela fetal e distribui-se esta suspensão celular numa placa de 24 orifícios (COSTAR) à razão de 0,4 ml por recipiente.

Após 6 horas de cultura a 37° C em atmosfera saturada de humidade contendo 8$ de COg, adiciona -se em cada recipiente 1 ml de meio de selecção cuja fórmula é a seguinte:

Meio de Dulbecco (Gibco 041 1965) 90 ml

Soro de vitela fetal	10 ml
Penicilina	100 U/ml
Estreptomicina	100 mcg/ml
Glutamina	2 mM
Piruvato	1 mM
Hipoxantina	5 x 105 M
Azaserina	105 M

Efectua-se a cultura das células nas mesmas condiçães que anteriormente indicado. Todas as semanas se adiciona mais 0,2 ml de meio de selecção fresco. Após

cerca de 2 semanas» assim que se distinguem colónias a olho nú, retira-se a camada de cultura sobrenadante em cada recipiente.

VI. Deteecão dos hibridomas secretores

Detectam-se os hibridomas secreto res dirigidos contra a substância que serviu de ultimo rappel na imunização do rato, submetendo as camadas sobrenadantes referidas a um teste Elisa em relação a este antigene. Colocam-se 250 microlitos duma solução do antigene em tampão de carbonato/ bicarbonato por 9,6 - 0,05 M em cada um dos recipientes de uma placa microelisa de 96 orifícios em imulon (Dynatech. 92430 Mames la Coquette). Após 18 horas de incubação a + 4° C em câ mara húmida, esvaziam-se os recipientes do seu conteúdo e lavam-se duas vezes com a mesma solução tampão.

Colocam-se 300 microlitros de solução de albumina de soro bovino (BSA Signa Chemical Co St Loiãs MO) a 0,1% no tampão de carbonato. Após duas horas de in cubação em câmara húmida a 37° C, elimina-se o líquido e efectuam-se 3 lavagens com o tampão BPS (pH 7,4; 0,01 M) contendo 0,5 % de Tween 20.

As camadas sobrenadantes com os hibridomas a testar diluem-se no tampão PBS Tween e colocam-se, ã razão de 200 microlitros por orifício, e põe-se a incubar du rante 18 horas a + 4^o C.

Após 4 lavagens com PBS Tween dos anticorpos antiimoglobulinas de rato, marcados com fosfatase alcalina, diluem-se em PBS Tween contendo 0,1 % de albumina de soro bovino e colocam-se em seguida h razão de 200 microlitros por recipiente.

Após duas horas de incubação à temperatura ambiente seguidas de 4 lavagens, adicionam-se 200 microlitros de fosfato de para-nitrofenilo (Sigma) (1 mg/ml em tampão de dietanolamina a pH 9,8).A reacção entre o enzima e o seu substrato continua-se durante meia hora à temperatura ambiente, interrompendo-se em seguida por adição de 50 microlitros de uma solução de hidróxido de sódio 3 M.

Uma reacção positiva traduz-se per

_ uma coloração amarela, cuja densidade óptica se pode medir a 405 nm.

VII. Conservação dos hibridomas secretores

Os hibridomas cujas camadas sobrenadantes contêm o anticorpo desejado pãe-se em cultura em meio de Dulbecco contendo 10 % de soro de vitela fetal, primeiro em placas de 24 orifícios e depois em caixa de Petri.

Quando o número de células for suficiente, ajusta-se a suspensão celular a cerca de 4.10^ células por ml de soro de vitela fetal contendo 10$ de sulfóxido dimetíI lico (HÍSO). Os híbridos assim condicionados conservar-se-ão em azoto líquido.

VIII. Clonagem

Os hibridomas retidos são clonados em seguida de acordo com o método das diluiçães limitadas de mo do a seleocionar espeoificamente cada um dos clonos secretores dos anticorpos referidos.

Nesta altura, a secreção dos anticorpos mede-se nas camadas sobrenadantes da cultura pelo teste Elisa citado anteriormente em VI.

Os clonos retidos deste modo conser vam-se em azoto líquido.

I ^Ix· Produção dos anticorpos a) Produção no rato

Injectam-se por via intraperitoreal 6.1O”5 células secretoras em ratos BALB/C que receberam 15 dias antes 0,5 ml de pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano), 10 a 15 dias após a injecção das células clonadas removem-se os ascites” e centrifugam-se em seguida a 2000 t/mn.

líquido de “ascites” deste modo utiliza-se directamente nas análises Elisa (vide parágrafo VI anterior) e na detecção da actividade terapêutica destes anticor pos nos estados de choque endotoxínico no rato (vide parágrafo XIII).

. b) Produção in vitro.

* A produção efectua-se igualmente in

_ vitro em balões ou em ferment adores.

X. Caracterizado dos anticorpos monoclonais

a) Determinação do isotipo dos anticorpos monoclonais.

A identificação do isotipo dos an ticorpos monoclonais presentes nas camadas sobrenadantes de cul tura efectuou-se por um método de difusão dupla em gelose (Ouchterlony) com a ajuda de imuno soros anticadeias ligeiras ou pesadas de imunoglobulinas de rato, dirigidos contra os IgM, IgA, IgGp IgG_2a, IgG₂b* ^IgG3 ^^ver <l^{uadro ιχ})·

b) Especificidade antigénica

I Testou-se este especificidade em relação a diferentes fracçÕes isoladas de Klebsiella pneumonias de entre as descritas licenças francesas n.2s 2.171.907, 2.462.477, 2.490.496 e 2.574.429 bem como ao lipopolissacárido de Klebsiella pneumonias.

Os resultados encontram-se no qua dro II (Exemplo 1).

XI. Separação e purificação dos anticorpos monoclonais

a) Os anticorpos presentes nas camadas sobrenadantes das culturas efectuadas in vitro ou nos líquidos de ascites” precipitam-se com sulfato de amónio a 45% e dissolvem-se em seguida num tampão Tris, H01 50 mM. Esta solução cromatogra fa-se em seguida numa coluna de DEAE Sephadex previamente equi

I librada com o mesmo tampão. A fracção não retida na coluna con tém as imunoglobulinas do isotipo G.

b) Pode fazer-se uma purificação dos anticorpos dos diversos isotipos G por cromatografia em Sepharose proteína A ou em Ultragel proteína A.

Neste método, a camada sobrenadan te de cultura celular ou o líquido de ascites”,coloca-se directamente numa coluna contendo o imuno absorveu te num tampão fosfato.

As imunoglobulinas dos tipos M e  não são retidas enquanto que os IgG se fixam à proteína A, obtendo-se a eluição selectiva IgGj, IgG_2a, 1^, IgG^ por la . vagens sucessivas da coluna com tampões como os descritos na — 12

técnica de Ey (P.L Ey et al (1973). Immunochemistry, 15·, pag. 429 - 436).

As características (especificidade, isotipos, actividade neutralisante do choque endotoxínico) das imunoglobulinas assim purificadas analisam-se como descrito nos pontos VI, X e XIII.

XII. Preparação do imunoabsorvente e sua utilização

Os anticorpos purificados fixam-se em esferas de Sepharose (Pharmacia) ou de Ultragel (IB?) previamente activadas com brometo de cianogénio ou com um epôxido. Os antigenes como os descritos nas licenças francesas 2.490.496 e 2.574.429 ou fragmentos destes purificamr-se por cro matografia de afinidade nos suportes sólidos assim preparados.

XIII. Utilização terapêutica destes anticorpos modelo escolhido para evidenciar este efeito inspira-se no descrito por Galanos (1979, Proc. NatL.Acad.Sci.USA, 76, n.2 11, pag. 5939-5943. Injectam-se ratos por via intravenosa com 0,2 ml de líquido de ascites contendo os anticorpos e três horas mais tarde, por via intravenosa, com a endotoxina de Klebsiella pneumoniae mistura da com 8 mg de galactosamina. Paralelamente, a um lote testemunha de animais, administra-se em vez do líquido de ascites contendo o anticorpo, o mesmo volume de um líquido de ascites de rato que recebeu a célula SP₂/0-Agl4.

Os resultados exprimem-se em núme ro de animais sobreviventes.

(Ver quadro II (Exemplo 1))

QUADRO II

Exemplo 1: Protecção no choque endotoxínico

Anticorpos monoclonais dirigidos contra Klebsiella pneumoniae

Número de animais sobreviven Célula Isotipo Especificidade Grupo ^ΐβ8 Grupo tratado testemunha

6D5 IgG₃ 10/10 0/10

B 6 IgGj core 10A0 0/10

Exemplo 2: Os animais imunizam-se com o anti gene de Escherichia coli.

I. Preparação dos antigenes (ver exemplo 1).

II. Imunização com o antigene de Escherichia coli

Imuniza-se um rato BALB/C de oito semanas de idade, injectando por via parenteral aos dias zero e 21, 50 mcg e 20 mcg respectivamente de bactérias mortas por aquecimentoj ao dia 35 efectua-se uma injecção dos antigenes purificados 1PS-1AP, à razão de 20mcg por ratoj 3 dias após es te rappel remove-se o baço.

III. Preparação dos linfócitos de baço

Tritura-se o baço num triturador e ajusta-se a suspensão celular a 10.10 células por mililitro em meio de Dulbecco.

IV. Preparação do mieloma SP^/O-Ag 14

Centrifuga-se uma cultura de célu las SPgO em fase de crescimento, lava-se e toma-se depois em meio de Dulbecco à razão de 8 x 10^ células/ml.

V. Fusão

Centrifugam-se 15 x 10^ células g

SPgO e 50 x 10 linfócitos de baço, durante 5 minutos a 1.100 tr/mn. Elimina-se a camada sobrenadante e, ao resíduo celular, adiciona-se gota a gota 1 ml de polietilenoglicol 1000 a 45 $ (líerck 9729)· Esta operação efectua-se à temperatura ambiente e dura exactamente um minuto.

Durante o minuto seguinte dissocia -se o resíduo celular com a ponta de uma pipeta. Em seguida, junta-se gota a gota 2 ml de meio de Dulbecco, à razão de 1 ml por minuto e depois 18 ml de meio de Dulbecco contendo soro de vitela fetal (10 $ final), à razão de 4,5 ml por minuto.

Homogeniza-se a suspensão celular com a pipeta e coloca-se numa caixa de Petri de 8 cm de diâmetro.

Estas células cultivam-se a 37° 0

num incubador humidificado contendo 8% de COg. Após 18 horas de cultura ajusta-se a suspensão a 2,5 x 10^ células/ml em meio de Dulbecco contendo 10% de soro de vitela fetal e distribui-se esta suspensão celular numa placa de 24 orifícios (COSTAR), à razão de 0,4 ml por recipiente.

Após 6 horas de cultura a 37° C em atmosfera saturada de humidade, contendo 8% de COg, adiciona-se a cada recipiente 1 ml de meio de selecção cuja fórmula é a seguinte:

Meio de Dulbecco (Gibco 320 1965)	90 ml
Soro de vitela fetal	10 ml
Penicilina	100 U/ml
Estreptomicina	100 mcg/ml
Glutamina	2 mM
Piruvato	1 mM
Hipoxantina	5.1O“5M
Azaserina	10“?M

As células cultivam-se nas mesmas condições que as indicadas anteriormente. Todas as semanas, adicionam-se mais 0,2 ml de meio de selecção fresco. Após cerca de 2 semanas, assim que se distinguem colónias a olho nu, reti ra-se a camada sobrenadante de cultura em cada recipiente.

VI. Deteccão dos hibridomas secretores

Detetam-se os hibridomas secretores dos anticorpos dirigidos contra a substância que se utilizou no último rappel* da imunização do rato, submetendo estas camadas sobrenadantes a um teste Elisa em relação a este antigene. Colocam-se 250 microlitros de uma solução do antigene em tampão de carbonato/bicarbonato a pH 9,6 -0,05 M, em cada um dos recipientes de uma placa microelisa de 96 orifícios em imu lon (Dynatech. 92430, Mames La Coquette). Após 18 horas de in cubação a + 4° C em câmara húmida, esvaziam-se os recipientes do seu conteúdo e lavam-se duas vezes com a mesma solução tampão.

Colocam-se cerca de 300 microlitros de solução de albumina de soro bovino (BSA Signa Chemical Co St Louis MO) a 0,1 % no tampão de carbonato. Após duas ho- 15

_ ras de incubação em câmara húmida a 37° C, remove-se o líquido e efectuam-se três lavagens com o tampão PBS (pH 7,4; 0,01 M) contendo 0,5 % de Tween 20.

Diluem-se as camadas sobrenadantes dos hibridomas a testar em PBS Tween e colocam-se, à razão de 200 microlitros por recipiente, e põe-se a incubar durante 18 horas a + 4^o C.

Após 4 lavagens com PBS Tween, os anticorpos antiimunoglobulinas de rato, marcados com fosfatase alcalina, diluem-se em PBS Tween contendo 0,7$ de albumina de soro bovino, e colocam-se depois à razão de 200 microlitros ^F por recipiente.

Apôs duas horas de incubação à tem peratura ambiente seguidas de 4 lavagens, adicionam-se 200 microlitros de fosfato de para-nitrofenilo (Signa) (1 mg/ml em tampão de dietanolamina a pH 9,8). A reacção entre o enzima e o seu substrato prossegue durante meia hora à temperatura ambi ente, interranjendo-se em seguida por adição de 50 microlitros de uma solução de hidróxido de sódio 3M. Uma reacção positiva traduz-se por uma coloração amarela cuja densidade óptica se pode medir a 405 nm.

VII. Conservação dos hibridomas secretores

Os hibridomas cujas camadas sobre | nadantes contêm o anticorpo desejado cultivam-se em meio de Dul becco contendo 10 % de soro de vitela fetal, em primeiro lugar em placas de 24 orifícios e depois em caixa de Petri.

Quando o número de células a permitir, ajusta-se a suspensão celular a cerca de 4.10^ células por ml de soro de vitela fetal contendo 10 % de sulfóxido dimetílico (DMSO). Os híbridos assim condicionados conservam-se em azoto líquido.

VIII. Clonagem

Os hibridomas retidos clonam-se on seguida de acordo com o método das diluições limitadas de modo a seleccionar especificamente cada um dos clonos secretores dos * anticorpos referidos.

Nesta altura, mede-se a secreção dos anticorpos nas camadas sobrenadantes de cultura segundo o teste Elisa mencionado anteriormente em VI.

Os clonos retidos deste modo conservam-se em azoto líquido.

ΙΣ. Produção dos anticorpos

a) Produção no rato

Injectam-se por via intraperitoreal 6.10^ células secretoras em ratos BALB/C que receberam 15 dias antes 0,5 ml de Pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano); 10 a 15 dias depois da injecção das células clonadas removem-se os ascites e centrifugam-se depois a 2000 t/mn.

líquido de ascites assim recolhido utiliza-se directamente para as análises Elisa (vide para grafo VI anterior) e para a detecção da actividade terapêutica destes anticorpos nos estados de choque endotoxímico no rato (vide parágrafo XIII).

b) Produção in vitro

A produção pode também efectuar-se in vitro em balões ou em fermentadores.

X. Caracterização

Esta especificidade testou-se ainda em relação ao exemplo 1 para o LPS de Escherichia coli de diferentes serotipos (DIFCO), de Serratia marcences (SIGKA), de Klebsiella pneumoniae (LIST), de Klebsiella pneumoniae 01íK2 (CIP 52145), de Pseudomonas aeruginosa 06 (CIP 59-39), 011 (CIP 59-44), 012 (CIP 59-45) preparados por nós próprios de acordo com a técnica descrita por 0. Westphal (Z. Naturforsch. 1952, 7b, 148-155).

Os resultados do quadro IV mostram certos anticorpos (D^B^, D^B^, D^Dg, DgB^, DgAg) reconhecem os LPS de diferentes serotipos de Escherichia coli e que outros (DgB^, D-qA^, ΒγΒ^) são ainda capazes de reconhecer LPS de outras enterobacterias com os de Serratia ou de Klebsiella (quadro IV A).

anticorpo ΒγΒ^ reage fortemente com os LPS de Pseudomonas aeruginosa de serotipos 06, 011, 012 bem como com os gérmens inteiros dos mesmos serotipos, bem como do serotipo Μ (P. aeruginosa ATOC 21636) (quadro IV B).

XI. Separação e purificação dos anticorpos monoclonais

a) Os anticorpos presentes nas camadas sobrenadantes das culturas efectuadas in vitro ou nos líquidos de ‘'ascites precipitam-se com sulfato de amónio a 45 1° e dissolvem-se em seguida num tampão Tris, HC1 50 mM. Esta solução cromatografa-se em seguida numa coluna de DEAE Sephadex previamente equilibrada com o mesmo tampão. A fracção não retida na coluna contém as imunoglobulinas do isotipo G.

b) Pode fazer-se uma purificação dos anticorpos dos diversos isotipos G por meio de cromatografia em Sepharose proteína A ou em Ultragel proteína A.

Neste método, a camada sobrenadan te de cultura celular ou o líquido de ascites coloca-se dire£ tamente numa coluna contendo o imunoabsorvente num tampão de fosfato.

As imunoglobulinas dos tipos M e A não são retidas, enquanto que os IgG se fixam à proteína A, obtendo-se a eluição selectiva de IgGp vagens sucessivas da coluna com tampães como os descritos na técnica de Ey (P.L. Ey et al (1978), Imunochemistry, 15, pag. 429-436).

As características (especificidade^ isotipos, actividade neutralizante do choque endotoxínico) das imunoglobulinas assim purificadas analisam-se como descrito nos pontos VI, X e XIII.

XII. Preparação do imunoabsorvente e sua utilização

Os anticorpos purificados fixam-se em esferas de Sepharose (Pharmacia) ou de Ultragel (IBF) previa mente activadas com brometo de cianogénico ou com um epóxido.Os antigenes como os descritos nas licenças francesas 2.490.496 e 2.574.429 ou fragmentos destes purificam-se por cromatografia de afinidade com os suportes sólidos assim preparados.

IgG_2a» ^IS^G2b» ^IgG3 ^por - 18 -

XIII. Utilização terapêutica destes anticorpos

O modelo escolhido para evidenciar este efeito inspira-se no descrito por Galanos (1979). Proc. Natl.Acaà.Sci. USA, 76, n.2 11, pag. 5939-5934. Injectam-se por via intravenosa ratos BgDgPj. com 0,2 ml de líquido de ascites” contendo os anticorpos e depois, três horas mais tarde por via intravenosa, com a endotoxina de E.C. misturada com 8 mg de galactosamina. Paralelamente injecta-se um lote testemunha de ani mais, em vez do líquido de ascites contendo o anticorpo, o mesmo volume de um líquido de ascites de rato que recebeu a célula SPg/0-Agl4.

Os resultados exprimem-se em número de animais sobreviventes. (Ver quadro III (Exemplo 2)).

QUADRO III

Exemplo 2: Protecção no choque endotoxínico.

Anticorpos monoclonais dirigidos contra

Escherichia coli.

Número de ratos sobreviventes

Célula Isotipo Especifica Grupo Grupo do Tratado Testemunha

IgG₃ LPS rough 10A0

1/LO.

A célula DgB^ segrega uma imunoglo bina de acção protectora no choque endotoxínico.

HIBRIDOMAS ANTI-LPS DE E.COLI REACTIVIDADE EK ELISA EM RELAÇÃO A VÁRIOS LPS

1 S1 «o w H · E S A A «	+ + +	1	1	1	1	Λ +	1	Λ +
H A CM θ θ ri o o p • pm W H 00 A CM W H Pt O A	+ + +	+ +	+	$	+ + +	+ + +	+	+ + +
H O O 00 o o p • Pm w h r- , O CM ÇQ f“4 □ ° 5	1	1	+ + +	1	+ + +	+ + +	1	+ + +
H A O O ia O O M • Pm W H ia Ρ LA § °	ί	< +	+ + +	+ +	+ + +	+ + +	$	+ + +
H A o o í O O P • Pm ffl Η H P H τη H Pi o UI	1	+ + +	+	+ + +	+ + +	+ + +	< +	+ + +
• E4 M ra H E A A	$	1	1	1	+	+	1	Λ +
a σ\ • ’ί· Μ Η (Μ ra Ρη ο A Ρ	1	1	•	1	1	Λ +	1	1
Η θ' g Ο θ* • Ο Ρ Μ W ια Pi Α	+ · + +	+ + +	Λ +	+ + +	+ + +	+ ί	+ + +	+ + +
	rn Ρ t— Ρ	ΙΑ Ρ d· Ρ	ΙΑ Ρ tA Ρ	<Μ Ρ ΙΑ Ρ	Ρ u> Ρ	ã <ο Ρ	CM -< cn Ρ	tA «t Η Α Ρ

v ai oHavnO

- 20 ·

Exemplo 3i

Imunizam-se os animais com os antigenes de Proteus ou de Enterobacter (quadro I) (ver os exemplos 1 e 2 para os pontosj I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII,

IX, XI, XII).

X. Caracterização

A especificidade dos anticorpos testou-se em relação aos antigenes preparados a partir das estirpes de Proteus ou de Enterobacter. 0 anticorpo E-qB^ reconhece os antigenes preparados a partir de 3 estirpes de Proteus (quadro V), o anticorpo HyAg reconhece os antigenes preparados a partir das 3 estirpes de Enterobacter (quadro VI).

QUADRO IV B

Hibridoma

Reactividade em Elisa em relação a Pseudomonas aeruginosa

·»

I !I j j Gérmens inteirosi ¹ P. aeruginosa ref .â I ¹ | iJ i serotipo ! ^{on? 59}·³⁹ ! ^{0IP 59}·⁴⁴ I ^{0IP 59}·⁴⁵!<

ιI

II

I

II

II l Anticorpos B^B-,I l ' ^Ji

Ii

1L

011 +++

I

I ί

I +

I

I +++ · ι

L

012

21636

Μ +++

QUADRO V

Hibridomas anti-Proteus

Reactividade em Elisa em relação aos antigenes de Proteus j Antigenes obtidos j

I a partir das estirpes ¹

I I

P. mirabilis J P. vulgaris»

CIP A 234 ' CIP 54.160 ¹ ---------------------------1-------------------------ί

Anticorpo *L1^B5 I +++ j +++ í

---------------------------------------₁

P. morganii *

CIP A 231 i t --------------------------------------------1

I +++

QUADRO VI

Hibridomas anti-Enterobacter

Reactividade em Elisa em relação aos antigenes de Ehterobaoter

1 1 i Antigenes obtidos , 1 · i a partir das estirpes ·	E.aerogenes { E.aerogenes!	E. cloacae CIP 60.85 1
CIP 60.23 ' |	CIP 60.86 i
I I i Anticorpo H7A, . i LL1	1 +++ j L	l +++ | l	í +++ | _______________________________________________1

I. ANTICORPOS MONOCLONAIS ΑΝΤΙ E.COLI

Protecção contra a infecção experimental.

1) Material e método

Administrou-se a grupos de 10 ratos fêmeas de 5-6 semanas de idade OFI (IFFA-CREDO) uma injecção intraperitoneal de 1 ml de uma solução de cloreto de sódio a 0,9 % contendo 5 % de sílica (Kielselguhr Merck, referência 8119), 90 minutos antes de serem infectados.

Incubam-se duas estirpes de Esche richia coli, 0111:B4 (C.I.P. 52167) e 02s KBH4 (C.I.P. 54-52) durante 18 horas a 37° C num meio de Triptocaseína-soja (insti tuto Mérieux). Dilui-se então a mistura por adição de uma solu ção de cloreto de sódio a 0,9$ até à concentração desejada e injectam-se 0,5 ml desta suspensão na cavidade peritoneal. Determina-se o número de bactérias.

2) Resultados

Dois anticorpos DgB^ e DgB^ administrados 3 horas antes da infecção por uma E. coli 0111pro tegem significativamente os ratos (quadro VII).

Fez-se uma estimativa da dose efi caz administrando os anticorpos DgB^ em doses variando de 10 mcg a 1 mg por rato.

Constatou-se ainda uma protecção com uma dose de 50 mcg por rato (quadro VIII).

A injecção do anticorpo DgB^ uma hora depois da infecção provocou também uma protecção significa tiva ainda que menos eficaz do que o tratamento preventivo (quadro ΙΣ).

No caso de uma infecção heterogénea com E. coli 02 observou-se também um aumento bastante níti do do período de sobrevivência para os animais que receberam o anticorpo DgB^ três horas antes da infecção.

Infecção experimental com E. coli 0111:B4

Efeito do tratamento preventivo por anticorpos monoclo nais

QUADRO VII i

I I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

L

Pré-tratamento Anticorpo dose (mg)

Controlo

PBS (b)

N319

DóB4 lE.Coli 0111:B4 por rato I l

l

Infecção bactéria por rato l

I 3,2 x 10 i

] 3,2 x 10 i

' 3,2 x 10 l

i

I

I I 4 I j,

I I I I I I I | I I

Mortalidade ao 15² dia mortos total

10/Ϊ0 ιοΛο

1/10 i

í Signifi· * cado i

i

I

I

I

I

I

I ¹ 0,0001

I

I i

I

I í i

I i l i I I I i

I

I (a) método de Pischer (b) anticorpo monoclonal Antineomicina B utilizado como contro lo negativo.

Administraram-se a grupos de 10 ratos uma injecção intravenosa de anticorpos precipitados com sulfato de amónio 3 horas antes da infecção por E. coli 0111jB4 segundo o modelo de sensibilização pela sílica. Utiliza-se uma solução apirogénica PBS como testemunha. Anota-se a mortalidade dos animais todos os dias durante 14 dias. Utiliza-se o método de Fischer na determinação do significado.

Infecção experimental com E. coli 0111:B4

Efeito dose do tratamento preventivo por anticorpos mono clonais

QUADRO VIII

Mortalidade ao 152 dia

Pré-tratamento íE.Coli 0111:B4 ¹

Anticorpo dose (mg)*

Infecção ¹

1 Controlo 1 1	por rato ( 1	bactéria por rato *	mortos total	1 cado j
j Teste 1 1 PBS	1 1 j 1	7 * 3,3 x 10' j	ΙΟΛΟ	1 1 i ' i
1 1	1,7 x 107 f 3,3 x 107 1	10/10	1 1 1 » 1
' N319 (b)	1 1	ΙΟΛΟ
1	i	1,7 x 107 |	ΙΟΛΟ	1 f 1 1 f 0,0001 1 1 0,0001 1
’ D6B4	1 1 1	3,3 x 107 |	1Λ0
1	1	1,7 x 107 ,	0/10
1 1	0,2 1	3,3 x ΙΟ7 I	0/10	1 0,0001 [
1	1	1,7 x 107 |	2/10	1 0,0007 |
1 1	1 0,1 ,	3,3 x 107 1	1/10	1 0,0001 !
l	1	1,7 x ΙΟ7 1	1/10	( 0,0001 j
1 1	0,05 1	3,3 x 107 [	5Λ0	1 0,032 1
1 1	1 1	1,7 x 107 f	2Λ0	| 0,0007 [
* Teste 2 1 PBS	1 1 I	1 1,8 χ 107 1 |	ΙΟΛΟ	1 1 1 1 1 1
| D6B4	0,1 1	1,8 χ 107 |	3Λ0	1 0,0003 1
1 1	0,05 1	1,8 χ 107	5Λ0	0,032 1
1 1	0,02 1	1,8 χ 107 j 1,8 χ 107 |	6/10	1 NS (c) 1
1	0,01 1	10/10	1 1

I

I (a) método de Fiecher (b) anticorpo monoclonal Antineomicina B utilizado como controlo negativo (e) NS » não significativo

Administrou-se a grupos de 10 ratos uma injecção intravenosa de diferentes doses de anticorpos precipitados com sulfato de amónio 3 horas antes da infecção por E. coli 0111:B4. 0 protocolo de procedimento e idêntico ao que figura no quadro VII.

Infecção experimental com E. coli 0111:B4

Efeito de um tratamento curativo por anticorpos mono clonais

QUADRO IX tJ.

* Pré-tratamento ÍE.Coli 0111sB41 Mortalidade i l Anticorpo doee (mg)J infecção j ao 15^a dia (Significa- * ¹ Controlo por rato | bactéria por | mortos l do , ' I rato i total ιl ,i

’ PBS	1 I	3,5	X	7 1 10' 1	10/10	1 i	I
1 1	1 1	1,8	X	107 |	10Λ0	1	I (
1 N319 (b)	1 1	3,5	X	107	ιοΛο	1 ί	1
1 i	1	1,8	X	107 J	ιοΛο	1	|
1 1 D6B4	i ;	3,5	X	107 ’	6/10	‘ NS (c)	f
l	1	1,8	X	107 !	3Λο	ί 0,003	1 |
1	0,2 '	3,5	X	107 ’	6/10	1 NS	1
1 1	! 1	1,8	X	107 ,	3/10	ι 0,003	i s

(a) método de Fisher (b) anticorpo monoclonal Antineomicina B utilizado como controlo negativo (c) NS « não significativo

Administrou-se a grupos de 10 ratos uma injecção intravenosa cie anticorpos precipitados com sulfato de amónio (às doses indicadas) 1 hora após a infecção por E. coli 0111sB4. 0 protocolo é idêntico ao que figura no quadro VII.

Infecção experimental com E. coli 02sKl

Efeito do tratamento preventivo por anticorpos monoclonais

QUADRO Σ • Pre-tratamento ι E. coli 02sKl I Anticorpo dose (mg) ¹ infecção ¹ Controlo por rato , bactéria por ! ¹ rato ¹Duração de J sobrevivên icia média ¹ em dias l

i

I ^! 4,9 i

* 8,4

I

I

1 1		1 j
’ PBS 1		1 2,5 I	x 107
! D6B3 1	0,6	j 2,5 i	x 107
1 1........		1 f

Administrou-se a grupos de 8 ratos (SWISS) uma injecção intravenosa de anticorpos precipitados com sulfato de amónio 3 horas antes da infecção por E. coli O2:K1 segundo o modelo de sensibilização pela sílica. Utilizou-se uma solução apirogénica PBS como testemunha. Anotou-se a mortalidade dos animais todos os dias durante 13 dias. Compara-se a dura ção média de sobrevivência com a das testemunhas (método de Mann e Withney).

II ANTICORPOS MONOCDONAIS ΑΝΤΙ KP

Protecção contra a infecção experimental

Utilizam-se grupos de 10 ratos fê- 27 -

meas cLe 5-6 semanas de idade OFI (IFFA-CREDO) . Põe-se a incubar uma estirpe de K. pneumoniae 01:K2 durante 18 horas a 37° C num meio de agar, Dilui-se então a mistura por adição de uma solução de cloreto de sódio a 0,9$ até à concentração desejada e injectam-se 0,5 ml desta suspensão na cavidade peritoneal.

Tratamento por anticorpos monoclonais

Purificam-se os anticorpos monoclonais por meio de duas precipitações com sulfato de amónio a 45$ de saturação seguidas de uma diálise com uma solução apirogénica PBS. Determina-se a concentração em anticorpos monoclonais pela técnica de imunodifusão radial descrita por Mancini.

Infecção experimental por K. pneumoniae 01sK2

Efeito do tratamento preventivo por anticorpos monoclo nais

QUADRO XI í Pré-tratamento · K.pneumoniae 01;K2 jMortalidade^ l Anticorpo dose (mg)| infecção lao 142 dial controlo por rato 1 bactéria por rato · mortos J

I ^{1 1} total t

Signi _t fioa- _t do !

I _______________________f l

l

NS I

0,003 ;

I t

PBS	-----1— 1 1	1,6 x 103	1 1 ' * 10/10 i
N319 (b)	0,6 1	1,6 x 103	1 10Λ0
12B6	0,6 1 1	1,6 x 103	' 3/10 1
	1 1		1 í

(a) método de Fischer (b) anticorpo monoclonal Antineomicina B utilizado como controlo negativo.

Administrou-se a grupos de 10 ratos uma injeoção intravenosa de anticorpos precipitados com sul fato de amónio três horas antes da infecção por K. pneumonia© 01sK2. Utiliza-se uma solução apirogénica PBS como testemunha. Anota-se a mortalidade dos animais todos os dias durante 14 dias. Utiliza-se o método de Fischer na determinação do significado ·

Claims (1)

1. Processo para a preparação de anticorpos monoclonais de mamíferos, com acção contra a parte lí pido A-núcleo da endotoxina das bactérias gram negativas de di ferentes géneros, caracterizado por o anticorpo utilizado para a imunização das células imunocompetentes ser um lipopolisacárido completo de bactérias gram negativa cuja componente lípido A-núcleo se encontra exteriorizada.

   - 2ê -

   Processo de acordo com a reivindi cação 1, caracterizado por o lipopolisacárido completo provir de bactérias dos géneros Escherichia, Klebisella, Pseudomonas, Enterobacter, Bacteroides, Serratia ou Proteus.

   -

   Processo de acordo com a reivindi cação 2, caracterizado por o lipopolisacárido completo provir da Klebisella pneumoniae.

   -4â -

   Processo de acordo com a reivindi. cação 2, caracterizado por o lipopolisacárido completo provir da Escherichia coli.

   Processo de acordo com as reivindi, cações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado por o lipopolisacárido se apresentar com uma estrutura de lipopolisacárido com proteínas associadas ao lípido A.

   - 6ê -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se prepararem anti- 30 corpos monoclonais murinos.

   - 7â -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se prepararem anti corpos monoclonais humanos.

   - 8s -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se prepararem hibri domas produtores de anticorpos monoclonais pertencentes ao grupo Dg B^, 6D^ e 12Bg ΒγΒβ, E^jSpj, ΗγΑ₂ e EE₂₂Bg·

   - 9^â -

   Processo para a preparação dos com postos destinados à purificação de produtos contendo a parte an tigénica não específica das bactérias gram negativas, caracteri zado por se utilizar como princípio activo pelo menos um dos an ticorpos monoclonais definidos na reivindicação 1, sob uma forma apropriada a essa utilização.

   - 10 â -

   Processo para a preparação de composições destinadas à purificação de produtos contendo a parte antigénica não específica das bactérias gram negativas, caracterizado por se utilizar como princípio activo pelo menos um dos anticorpos monoclonais definidos em qualquer das reivindica ções 2 a 7, sob uma forma apropriada a essa utilização.