PT85316B

PT85316B - Processo para a obtencao de uma glicoproteina inibidora da sintese proteica

Info

Publication number: PT85316B
Application number: PT85316A
Authority: PT
Inventors: Pierre Casellas; Luigi Barbieri; Fiorenzo Stirpe
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1986-07-15
Filing date: 1987-07-13
Publication date: 1990-04-30
Also published as: KR880001698A; FR2601680B1; NZ221066A; ES2038680T3; ATE68351T1; DK369387A; PT85316A; GR3002918T3; EP0256907A1; DE3773800D1; IL83182A0; ZA875175B; FR2601680A1; AU7539787A; IL83182A; US5037960A; AU594482B2; JPS6323900A; EP0256907B1; DK369387D0

Description

invento refere-se à obtenção de um inibidor da sintese das proteínas que é uma nova gl_i_ coproteina extraída das sementes de Trichosanthes Kirilowi í e denominada Trícoquirina.

SANOFI S.A.,

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UMA GLICOPROTEINA INIBIDORA DA

SINTESE PROTEICA

Esta peso molecular de 28.000+3.000, um conteúdo em açucares neutros nova glicoproteina tem um um ponto isoeléctrico 9 e de 1,1 a 1,5%.

processo consiste em se proceder à extracção das referidas sementes com uma solução aquosa tam ponada de pH 6,5-7,5 se eliminar o material insolúvel, se fraccionar o extracto bruto por cromatografia e se recuperar a proteína por filtração sobre gel.

presente invento refere-se â obtenção de um novo inibidor da sintese proteica assim como à sua utilização para a preparação de conjugados.

Foram encontradas nas sementes ou noutras partes de um certo número de plantas proteínas que inibem a sintese proteica nos sistemas eucariontes. Entre essas proteínas, a ricina, a abrina e a modecina inibem a sintese proteica tanto nos sistemas celulares como nos sistemas acelulares sendo por esse motivo altamente tóxicas no animal.

Outras, pelo contrário, eficazes apenas sobre os sistemas acelulares, são pouco ou nada tóxicas no animal talvez porque não podem penetrar nas células .

De um modo geral, estas proteínas inactivam de um modo irreversível a sub-unidade ribosómica 60 S, que se encontra na impossibilidade de reagir com o factor de alongamento 2. Por consequência, elas apresentam um interesse para o estudo da sintese proteica e foi também proposto utiliza-las no combate aos tumores.

Uma proteina deste tipo será em seguida designada pela expresão Ribosome inactivating Protein(RIP), Proteina Inactivadora do Ribosoma.

A RIP que é melhor conhecida ê a Ricina que é obtida pela extracção das sementes de Rícino.

-4Uma outra RIP, a gelonina, foi dejs crita recentemente e foi publicada uma revista sobre as RIP em FEBS Letters, 1986, 195 (1,2) páginas 1-8.

Foi recentemente descrita uma proteína extraída das raízes de Trichosanthes Kírilowií, a tricosantina (Nature, 1986, 321, 477-478) revelando um certo grau de homologia de sequencia com a subunidade A da ricina D.

Verificou-se actualmente que se pode extrair das sementes de Trichosanthes Kirilowii, uma nova RIP excepcionalmente potente, diferente da tricosantina. Esta nova RIP será aqui a seguir designada tricoquirina.

Assim, o presente invento referese à obtenção da nova RIP denominada tricoquirina tendo as caracteristicas que se seguem:

E uma G1icoproteina :

- tendo um peso molecular de 28.000 + 3.000, determinado por electroforese sobre gel de poliacrilamina em preseji ça de SDS (sulfato dodecílico de sodio).

com ponto isoelectrico^ 9,

- Com um conteúdo em açucares neutros: 1,1 a 1,5% em peso dos quais 0,3 a 1,2% de manose.

- com composições em ácidos aminados: em grande número de resíduos por mole de proteína + 20%.

Lis	: 17,3	; His	: 1,1:	Arg	: 6,7;	Axs:	22,8;
Tre	: 18,9	; Ser	.'23,5;	glx	: 21,6;	Pro	8,0;
Gli	: 16,0	; Ala	:21,1;	1/2	Cis: 1,9;
Val	: 12,5	; Met	: 3,05;	Ile	; 15,8;	Leu:	24,3;
T ir	: 12,1	; Fen	:10,1 ;	T rp	: n.d.

no que ê atras referido, Asx representa o conjunto dos resíduos do acido aspârtico e da asparagina e Glx o conjunto dos resíduos do ácido glutâmico e da glutamina.

1/2 de Cis é o residuo de cisteina da proteína nativa sob a forma de ãcido cisteico, determinado quando da análise, e n.d. significa não determinado, sendc os outros ácidos designados de acordo com as recomendações da IUPAC.

e cuja sequência amino-terminal é:

Asp-Val-Ser-Fen-Ser-Leu-Ser-Gli-Gli-Gli-Tre-Ala-Ser-Tir-Glu-Lis

A composição em ácidos aminados fo:. determinada por aquecimento da glicoproteina a 105°C durante 24 horas sob azoto em presença de acido clorídrico 6N, de fenol a 1% e de 2-mercaptoetanol a 1%. Os ácidos aminados foram derivados pelo isotiocianato de fenilo, (PITC) em meio alcalino.

As feniltio-hídantoínas (PTH) assim obtidas foram analisados por CLEP (cromatografia liquida de elevada performance) em fase inversa,. 0 acido cisteico foi determinado após oxidação da proteína com o acido perfórrrtco (d. Biol. Chem. 1963, 238, 235-237).

A sequência amino-terminal foi de_ terminada sobre um micro-sequenciador comercializado por Applied Biosynthesis a partir de 5 mmoles de proteínas solubj_ lizadas numa solução aquosa de acido acético a 10%. As PTH dos aminoácidos são analisados por CLEP em fase inversa.

Todos estes resultados comparados com os publicados na bibliografia para a tricosantina indicam claramente que a tricoquirina e a tricosantina são 2 substancias totalmente diferentes.

processo para a obtenção da tricoquirina de acordo com o invento é caracterizado por se extraírem as sementes moídas de Trichosanthes Kirilowii , com âgua em presença de um tampão com um pH 6,5-7,5 por se determinar o material insolúvel e por se fraccionar o extracto por cromatografia sobre uma resina permutadora de iões fracamente acida, fazendo-se a eluição com uma solução tampão contendo cloreto de sódio 0,3 - 0,6M com com um pH de 7,2 - 7,7, e isola-se a fracção contendo a proteína inibidora, e que e purificada, podendo os produtos com baixo peso molecular ser eliminados por diálise do extracto.

Por exemplo, as sementes de Tricho santhes Kirilowii, de preferencia após descorricação são moidas e extraídas com âgua contendo um electrolito por exemplo cloreto de sodio, e um tampão, por exemplo â base de fosfato, com um pH próximo da neutralidade.

As substâncias insolúveis são em seguida eliminadas por exemplo por centrifugação e as subs tâncias com baixo peso molecular são eliminadas da solução por diãlise por exemplo contra tampão fosfato. 0 extracto dialísado é então submetido a um fracionamento, por exemplo por cromatografia sobre uma resina permutadora de iões fracamente acida tal como a celulose carboximetílica. A eluição quando se utiliza esta resina, pode ser efectuada utilizando um gradiente linear de concentração, por exemplo uma solução aquosa de 0 a 0,3M de cloreto de sodio. Normalmente, são eluidos 4 picos principais e o 4⁹ pico eluido por uma solução com uma concentração em cloreto de sodio de 0,03 a 0,11 M contem a maior parte da tricoquirina.

A purificação da tricoquirina pode ser conseguida por filtração sobre gel, por exemplo sobre uma coluna de Sephadex (marca registada).

A tricoquirina pode ser ligada aos haptómeros por intermédio de um agente de ligação apropriado. Assim, por exemplo, a tricoquirina pode ser ligada a um anticorpo por uma ponte di-sulfureto de acordo com os métodos clássicos.

Para tal, tanto a tricoquirina como o heptómero podem ser submetidos a uma reacção com um reagente que permita a introdução de uma cadeia portadora de um grupo di-sulfureto.

Um outro objectivo do invento é constituído pela obtenção de derivados modificados da tricoquirina contendo um grupo SH livre ou bloqueado e mais particularmente um S-acetilmercaptosuccinoilo de tricoquirina obtido por tratamento da tricoquirina pelo anidrido S-acetilmercaptosuccínico, assim como dos derivados do mercaptosuccinoilo correspondentes preparados pela acção da hidroxilamina sobre o derivado S-acetilo.

método de preparação da tricoquirina assim modificada é o método que é habitualmente utilizado para a preparação de produtos, nomeadamente de proteínas, activados. Assim, a introdução do grupo S-acetilmercaptosuccinoilo sobre um anticorpo ê descrita na Patente dos EUA No.4.340.535; a introdução do grupo S-acetiImercap tosuccinoilo sobre a hidrólise primaria de um ionóforo é de_s crita no requerimento da Patente Europeia No.162.781 e a introdução do grupo S-acetilmercaptosuccinoilo sobre a cadeia A da ricina é descrita no requerimento da Patente Europeia No.169.111.

Estas tricoquirinas modificadas podem ser representadas pela formula

TK° - (CO - CH - S - W) (I)

CH₂C00H na qual TK° representa o radical da tricoquirina, W representa o hidrogénio ou o grupo acetilo e n pode variar entre 0,2 e 3, de preferencia entre 0,4 e 1, de preferencia ainda n=0,7.

A tricoquirina obtida de acordo com o presente invento inibe as sínteses proteicas num lisado de reticulocitos com uma DI^q de 1,5 - 4 ng/ml. Sobre as células intactas, o efeito é de longe inferior, com uma DI^q que pode variar entre 7 e mais de 100 jug/ml, de acordo com a célula examinada.

quadro I mostra o efeito da tricoquirina sobre diversas células nomeadamente a DI_5Q (em jjg/ml e em M.IO^) da inibição da síntese proteica;

esta foi determinada aplicando o método descrito em J. Biol.

Chem. (1984) 259 ρ. 9359-9364.

QUADRO I

Célula	DI₅₀ pg/ml	M.10'⁷
Fibroblastos humanos	3,9	1,3
Células TG	7,5	2,5
Células NB 100 (neurob1astoma)	10,3	3,4
Células JAR (coriocarcinoma)	16,3	5,4
Células HeLa	45,0	15,0
M 4039 (melanoma)	9,9	3,3

-11A toxicidade da tricoquirina no animal foi avaliada em ratinhos fêmeas Swiss com um peso de 27-32 g. A tricoquirina é administrada por via intraperitoneal em doses que variam entre 0,56 e 20 mg/kg de peso corporal (com uma relação 2 entre 2 doses) a grupos de 6 animais por dose. A dose letal 50(0ί^θ) ê calculada pelo método de Sperman-Karber tal como foi descrito por Finney (Statistical Methods in Biological Assay, p 524-530) (Métodos Estatísticos em Ensaio Biológico, p 524-530). A DLgg da tricoquirina é de 8,1 mg/kg + 20%.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento sem contudo o limitarem.

ISOLAMENTO DA TRICOQUIRINA

A) Extracto bruto

Exemplo 1

Sementes de Tríchosanthes Kírílowi:: (1,2 kg) são esmagadas num aparelho Ultraturrax com 8 volumes de solução aquosa de cloreto de sódio 0,14 M contendo tampão fosfato 5mM, pH 7,5. A extracção é prosseguida durante uma noite a 4°C sob agitação magnética.

Após eliminação dos resíduos grosseiros, procede-se a uma centrifugação a 10.000 g a 0°C durante 45 minutos. 0 produto que sobrenada (flutua/) é decantado, a frio para eliminar as gorduras solidifiçadas sendo em seguida as proteinas precipitadas por adição de sulfato de amónio até à saturação.

Após centrifugação tal como foi atras referido, o produto precipitado é colocado de novo em suspensão em 1 litro de solução aquosa 0,14 M de cloreto de sodio contendo tampão fosfato 5 mM, pH 7,5. 0 produto não dissolvido é eliminado por centrifugação nas mesmas condições que foram atrás referidas. 0 produto flutuante é feito passar por uma coluna de Sephadex RG 25 coarse (grosseiro) comercializado por Pharmacia (95 cm χ 10 cm) equilibrada com tampão fosfato 5mM, pH 7,0 à temperatura ambiente e eluida à velocidade de 3 1/hora. E recolhido o primeiro pico proteico; é o extracto bruto.

B) CROMATOGRAFIA DE PERMUTA IONICA

Os extractos brutos combinados de 2 operações (provenientes a partir de 2,4 kg de sementes) são adicionados a cloreto de sodio até uma concentração final de 30 mM e feitos passar por uma coluna (17,5 cm χ 5 cm) de CM-Sepharose RFast Flow comercializada por Pharmacia, equilibrada com tampão fosfato 30 mM, pH 7,0.

Após lavagem da coluna com o mesmo tampão, a proteína ligada é eluida por um gradiente contendo de 30 a 110 mM de cloreto de sodio no mesmo tampão fosfato (volume 20 litros). São recolhidas fracçoes de 400 ml à velocidade de 1,2 litros por hora. Segue-se a eluição medindo a absorvência a 280 nm e a conductibi1 idade do prod£ to eluido. As fracçoes que revelam uma actividade inibidora da síntese proteica são reunidas (3,6 1) e levadas a um pH 5,8 pelo ácido acético. Passa-se a solução sobre uma comuna de S-Sepharose Fast Flow (6,6 cm χ 5 cm) equilibrada com o tampão acetato de soido 10 mM, pH 4,5. Após lavagem da coluna com o mesmo tampão, a proteína inibidora fixada é eluida pelo tampão fosfato 20 mM, pH 7,5 contendo cloreto de sodio 0,5 M.

A fracção correspondente ao pico contendo a proteína inibidora (200 ml) é recolhida e díalisada contra 3 vezes 50 1 de água destilada sendo em seguida liofilizada. Obtem-se assim 380 mg de tricoquirina em bruto

C) FILTRAÇAO SOBRE GEL

A tricoquirina atras obtida ê di_s solvida em 50 ml de solução aquosa de cloreto de sodio 0,14M Elimina-se um produto insolúvel por centrifugação a 20.000 g durante 30 minutos.

produto flutuante ê feito passar sobre uma coluna de Sephadex G 50 coarse (grosseiro) (95 cm x 5 cm) equilibrada com um tampão fosfato 30mM, pH 7 a 4°C.

Obtem-se assim 267 mg de tricoquirina purificada.

Realiza-se a eluição à velocidade de 60 ml/hora. A fracção correspondente ao pico contendo a proteína érecolhida, dialísada e liofilizada tal como foi indicado atras.

Exemplo 2

S-acetilmercaptosuccinoil-tricoquirina

Mercaptosuccinoil-tricoquirina

A 5,8 mg de tricoquirina cerca de 0,215 umole dissolvidos em 6 ml de tampão fosfato 125 mM pH 7 (ou seja 0,973 mg/ml), cerca de 0,036 ^umole/ml) são adicionados 100 ulitros de uma solução de anidrido S. acetilmercaptosuccínico (SAMSA) a 10,5 mg/ml (60, 33 /jmoles/ml) em dimetilformamida.

a

A incubação dura uma hora sendo em seguida o meio reaccional purificado do excesso do reagen te por dialise contra tampão fosfato 125 mM pH 7.

Obtem-se assim 5,7 ml de uma solij ção de S-acetilmercaptosuccinoi1-tricoquirina a 0,948 mg/ ml. Por acção da hidroxilamina e de acordo com o método de Ellman (Methods in Enzymology 25, 457 (1972) obtem-se mercaptosuccinoil-tricoquirina, ou tricoquirina activada, contendo 0,7 grupos de SH livres por mole de tricoquirina (dosagem espectrofotomêtrica).

Examinada por electroforese em gradiente de poliacrilamida, esta proteína modificada apresenta uma única banda de peso molecular proximo de 28.000 + 3.000 idêntica à da proteína nativa.

-16Exemplo 3

CONJUGADO OBTIDO POR REACÇAO ENTRE O ANTICORPO AT15E (Anti-thy 1,2) E A MERCAPTOSUCCINOIL TRICOQUIRINA

A) Preparação do anticorpo AT15E modificado.

anticorpo AT15E é um anticorpo monoclonal dirigido contra o antigénio Thy 1.2 dos linfocitos murinos. Este anticorpo é o que é descrito em Journal of Immunology 122, 2491-8 (1979) e foi obtido a partir de hibridoma descrito em Hybridoma 1 (1); 13-17 (1981).

A 3,7 ml de uma solução de anticorpo AT15E a 3,55 mg/ml (ou seja 0,087 ^umole) num tampão borato 0,1 M pH 8,8 acrescentam-se 25 microlitros de uma solução de N-succinimidi1 3-(piridil-2 dissulfani1)-3 propio nato a 5,5 mg/ml em etanol.

A incubação dura 30 minutos sendo em seguida eliminado o excesso de reagente por diâlise contra tampão fosfato 125 mM pH 7. Apôs solução a 3,4 mg/ ml. Por dosagem espectrofotométrica a 343 nm da piridina tiona-2 libertada por troca com o mercapto-2 etanol verifica-se que se obteve um anticorpo portador de 3,2 agrupamento' di-sulfureto mixtos por mole de anticorpo.

B) PREPARAÇAO DE IMUNOTOXINA (CONJUGADA)

A 1,9 ml da solução de anticorpo activado obtido anteriormente (ou seja 0,043 , acres

centam-se 5 ml da solução de tricoquirina modificada obtida anteriormente (ou seja 0,183 umole) e incuba-se 20 horas

a 25°C em presença de 350 ulitros de uma solução aquosa molar de cloridrato de hidroxilamina. A solução é centrifugada sendo em seguida purificada por filtração por filtração sobre coluna de Sephadex G 200 com medição da densidade optica do efluente a 280 nm. 0 reagrupamento das fracções contendo ao mesmo tempo o anticorpo e a TK conduz a 20 ml de uma solução de imunotoxina a 0,215 mg/ml (ou seja 4,3 mg). Esta solução contem 0,045 mg/ml de tricoquirina modificada ligada ao anticorpo.

A taxa de ligação média nesta prepa ração é de 1,5 TK por mole de anticorpos.

TESTES DE ACTIVIDADE DAS IMUNOTOXINAS

Uma das propriedades da tricoquirina é a de inibir a síntese das proteínas nas células eucariontes. Os testes realizados são pois testes de inibi ção da sintese proteica:

-quer sobre um modelo acelular.

-quer sobre um modelo celular.

A) 0 MODELO ACELULAR: ACTIVIDADE INIBIDORA DA TOXINA.

protocolo in vitro utiliza fra£ ções subcelulares de fígado de rato convenientemente complementadas e capazes de incorporar a 14C-fenilalanina em presença de um ARN mensageiro artificial, o acido poliuridí1 ico.

modo operatório utilizado para preparar as fracções subcelulares e para medir a incorporação de 14C-fenilalanina ê uma adaptação do método descrito em BBA 312, 608-615 (1973), preparando ao mesmo tempo uma fracção microsomal e uma fracção de citosol dos hapatocitos de rato. A amostra contendo a tricoquirina é introduzida sob a forma de uma solução convenientemente diluída num tampão tris-HCl 50 mM pH 7,6 contendo mercapto-2 etanol a 0,2% e albumina de soro bovina 15 jugramas/ml. A partir dos

-19dados de contagem calcula-se, em relação ao meio testemunha sem inibidor, a percentagem de inibição da incorporação de 14C-fenilalanina para cada meio de reacção.

conjunto dos valores obtidos permite determinar a concentração de tricoquirina (ou CI₅₀) que inibe 50% da incorporação da 14C-fenilalanina nas condj^ ções de ensaio. Para a tricoquirina nativa, determinou-se -1 1 desse modo que a 0Ι_ςη é igual a 7.10 M, e que a da tric£ ^3U -11 quirina modificada é igual a 8-10.10 mole/litro.

A modificação não leva a uma perda importante da actividade da tricoquirina.

B) CITOTOXICIDADE ESPECIFICA DA IMUNOTOXINA COM TRICOQUj. RINA SOBRE MODELO CELULAR.

A actividade biológica da tricoquirina consiste em inibir a síntese proteica celular dos sistemas eucariontes. A técnica utilizada prepara um modelo celular no qual se mede o efeito das substancias estudadas sobre a incorporação da 14C-leucina nas células cancero sas em cultura. As células utilizadas pertencem â linhagem celular T2, provenientes de uma leucemia T de ratinho que representa o antigenio de superfície Thy 1.2. As células são incubadas na presença da substancia a estudar com diversas concentrações e em seguida, no fim da incubação, procede-se à medição da taxa de incorporação da 14C-leucina pe-20las células assim tratadas.

Esta medição é efectuada de acordo com uma técnica adaptada do processo descrito em Journal of Biological Chemistry 1974, 249 (II), 3557-3562, utilizando o marcador 14C-Ieucina para a determinação da taxa da síntese proteica. A determinação da radioactividade incorporada é aqui efectuada sobre as células inteiras isoladas por filtração.

A partir destas determinações, pode-se traçar as curvas dos efeitos das doses apresentando em abcissa a concentração molar em tricoquirina das substancias estudadas e em ordenada a incorporação da 14C-leucina expressa em percentagem da incorporação pelas células testemunhas cultivadas na ausência de qualquer substancia que afecte a síntese proteica.

Pode-se assim determinar para cada substancia estudada a concentração que inibe 50% da incorporação de 14C-leucina ou concentração inibidora 50 (CI₅₀). 0 quadro 2 representa os valores de CI_5Q obtidos na mesma experiencia pela imunotoxina com tricoquirina por um lado, a tricoquirina não ligada por outro lado.

QUADRO 2
Produtos	Concentração inibidora 50
IT com tricoqu^ rina	2 x 10“¹⁰M
Tricoquirina	2 x 16“⁶ M

Pode constatar-se que a IT com tricoquirina possui uma actividade citotóxica muito forte que é mais de 10.000 vezes superior à da tricoquirina não ligada.

Esta nova classe de imunotoxinas pode ser utilizada para o tratamento das doenças cancerosas ou não cancerosas, para as quais as células a destruir seriam conhecidas pelo anticorpo utilizado para a preparação da imunotòxina.

As modalidades óptimas de administração assim como a duração do tratamento deverão ser determinadas em cada caso em função do indivíduo e da natureza de doença a tratar.

-22Os produtos biológicamente activos do invento podem ser formulados para administração por qualquer via conveniente. Mais frequentemente, o principio acti vo será administrado por injecção e será formulado num líquidp estéril apirogénico de preferencia água que pode conter sais fisiologicamente aceitáveis tais como tampões ou cloreto de sodio de modo a obter uma solução isotónica.

Para um tratamento anti-tumoral a dose diaria da tricoquirina conjugada com um anticorpo está de preferencia compreendida entre 1 e 100 mg, vantajosamente entre 5 e 50 mg e por exemplo cerca de 10 mg.

As unidades de dosagem contendo a tricoquirina sob a forma de conjugado, por exemplo ampolas para injecção, conterão pois habitualmente de 1 a 100 mg de conjugado de tricoquirina.

I

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-.- Processo para a obtenção de uma proteína inibidora dos ribosomas, denominada tricoquirina, tendo as características que se seguem:

E uma G1icoproteina:

-tendo um peso molecular de 28.000 + 3.000 determinado por electroforese sobre gel de poliacrilamida em presença de dodeci1-sulfato de sodio;

-com ponto isoeléçtrico > 9;

- com um conteúdo em açucares neutros de 1,1 a 1,5% em peso dos quais 0,3 a 1,2% de manose;

-com uma composição em amino-ácidos expressa como o número de resíduos/mole de proteína, com um desvio de mais ou menos 20%;

Lis : : 17,3; His : 1J; Tre : : 18,9; Ser :23,5; Gli : : 16,0; Ala :21 ,1; Vai : : 12,5; Met : 3,05; Tir : 12,1; Fen :10,1 ;

Arg : 6,7; Asx : 22,8

Glx :21 ,6; Pro : 8,0

1/2 Cis : 1,9;

Ile : 15,8 ; Leu:24,3

T rp em que

Asx é o conjunto de resíduos de acido aspârtico e de asparagina Glx é o conjunto de resíduos de acido glutâmico e de glutamina, 1/2 Cis é o resíduo de cisteína da proteína nativa sob a forma de ácido cisteico, determinado quando da análise, e n.d. significa não determinado, sendo os outros amino-ácidos designados de acordo com as recomendações da IUPAC, e cuja sequência amino-terminal é:

Asp-Val-Ser-Fen-Ser-Leu-Ser-Gli-Gli-Gli-Tre-Ala-Ser-Tir-Glu-Lis assim como os seus derivados modificados contendo um grupo

SH livre ou bloqueado, caracterizado por compreender a extrac_ ção de sementes de Trichosanthes Kírikowii por uma solução aquosa tamponada com pH 6,5 - 7,5, a eliminação do material insolúvel e o fraccionamento do extracto bruto por cromatografia sobre uma resina de permuta iõnica, fracamente ácida, fazendo-se a eluição com uma solução tampão contendo cloreto de sodio com um pH de 7,2 -7,7 e a recuperação de fracção proteica inibidora e a purificação da proteína por filtração sobre gel.
2^a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se eliminar o extracto por diâlise dos produtos de baixa massa molecular.
3^a.- Processo para a obtenção de derivados mercapto-succinoil-tricoquirina representados pela fórmula

TK° - (CO - CH - S - W) ch₂cooh o <

-25na qual

RK° representa o radical da tricoquirina, W representa o hidrogénio ou o grupo acetilo e n pode variar entre 0,2 e 3, caracterizado por se fazer reagir sobre a tricoquirina, obtida pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, o anidrido S-acetilmercapto-succinico e por eventualmente se fazer reagir o produto obtido com hidroxilamina.
4^â.- Processo para a obtenção de conjugados entre a tricoquirina e um haptómero, caracterji zado por se acoplar a tricoquirina obtida de acordo com o processo de uma qualquer das reivindicações 1 a 3, com um haptómero.