PT85248B

PT85248B - Processo para um isolamento de um peptido apresentando propriedades antigenicas isolado a partir da proteina 28 kd de "s. mansoni", anticorpos monoclonais reconhecendo pelo menos um epitope do referido peptido e sua aplicacao na inducao da sintese de anticorpos neutralizantes

Info

Publication number: PT85248B
Application number: PT85248A
Authority: PT
Inventors: Andre Capron; Raymond Pierce; Jean-Marie Grzych; Jean Marc Balloul
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-07-03
Publication date: 1990-04-30
Also published as: EP0251933B1; FR2601037B1; JPH08140694A; JPS63258598A; DE3785614D1; FR2601037A1; ATE88639T1; PT85248A; DK340887D0; ES2056834T3; DK340887A; EP0251933A1; DE3785614T2

Description

A presente invenção diz respeito a um processo para o isolamento de um péptido a partir da proteína 28 KD de S. mansoni, comportando um ou vários epitopes, assim como a anticorpos monoclonais aptos a reconhecer fracções antigénicas peptídicas assim isoladas e à preparação de composições terapêuticas apropriadas para induzir a síntese de anticorpos neutralizantes, comportando as referidas composições o referido péptido isolado ou em associação com outras substân cias apropriadas.

BALLOUL e colab. /* MOLECULAR AND BIOCHEMICAL BARASI TOLOGY, 17 (1985) p. 105 - 114^7 descreveram a síntese in vitro de um antigénio constituído por um polipeptido que apresenta um peso molecular de 28 KD e um ponto isoeléctrico compreendido entre 6,3 e 6,8, que constitui um produto da tradução in vitro de ARN total de Schistosoma mansoni.

Os autores continuaram as suas pesquisas com o obje£ tivo de isolar e identificar, a partir deste polipeptido de 28 KD, o epitope ou os epitopes peptídicos responsáveis pelas propriedades antigénicas.

É conhecida a análise de pêptidos constituintes das proteínas isoladas em geles de SDS, mediante digestão parei2 al das referidas proteínas por uma protease em um tampão contendo SDS obtendo-se produtos de digestão parcial estáveis, compostos por numerosos péptidos cujos pesos moleculares são suficientemente elevados para que seja possível separá-los em geles de SDS acrilamida a 15% £CLEVELAND e colab. , THE JOURNAL OF BIOLOGICAÍ CHEMISTRY, 252 , p. 1102 - 1106, (1977)J.

Os inventores pesquisaram para isolar, a partir da proteína 28 KD de ”S. mansoni, o ou os péptidos comportando a actividade antigénica anti-Schistosoma que apresenta a proteína 28 KD, utilizando para este fim técnicas de isolamento de fragmentos peptídicos mediante proteólise já anteriormente descritas.

A presente invenção tem por objectivo um processo para o isolamento de um péptido comportando pelo menos um epitope, mediante proteólise, caracterizado pelo facto de se submeter a proteína 28 KD de S. mansoni à acção da pro tease V8 em tampão Tris-HCl pH 8,6, contendo SDS, de se interromper a reacçao de proteólise mediante adição de uma mistura de 2 - mercaptoetanol e de SDS, de se aquecer depois à ebulição a 100°G durante um cui?to intervalo de tempo para se isolar um péptido em que se verifica a actividade antigénica com a ajuda de anticorpos de um soro policlonal ou de anticorpos monoclonais.

De acordo com um modo de realização preferido do processo de acordo com a presente invenção, a digestão enzimática da proteína 28 KD pela protease V8 realiza-se durante 30 minutos à temperatura de 30°G.

De acordo com um outro modo de realização preferido

- 3 do processo de acordo com a presente invenção, a mistura utilizada para interromper a reacção de proteólise compreende 2 - mercaptoetanol à razão de 1 jul por 3 ju.1 de SDS a 10%.

De acordo ainda com outro modo de realização preferido do processo da presente invenção, o tampão Tris-HCl em que se dissolve a proteína 28 KD é um tampão 100 mM a 125mM contendo entre 0,08 e 0,12% de SDS.

De acordo com um outro modo de realização preferido do processo da presente invenção, a verificação da actividade antigénica do péptido isolado por proteólise, realizada mediante Western blotting com a ajuda de um soro policlonal de rato, de coelho ou similar, anti - 28 KD, revela, com o auxílio de anticorpos marcados pela peroxidase, dirigidos contra imunoglobilinas de rato, de coelho, de murganho ou similar, um epitope peptídico de 6 KD.

De acordo ainda com um outro modo de realização preferido do processo da presente invenção, a verificação da actividade antigénica do péptido isolado mediante proteólise realizada mediante Western blotting com a ajuda de um anti. corpo monoclonal anti - 28 KD revela um epitope peptídico de 8 KD.

A presente invenção tem por objectivo um fragmento peptídico, caracterizado pelo facto de ser isolado a partir da proteína 28 KD de S. mansoni , mediante proteólise orientada, apresentando um peso molecular de 6 KD, e de ser reconhecido pelo soro policlonal de coelho, de rato ou análogo anti - 28 KD.

A presente invenção tem igualmente por objectivo um fragmento peptídico, caracterizado pelo facto de ser isolado da proteína 28 KD deS. mansoni mediante proteólise orientada, apresentando um peso molecular de 8 KD, e de ser reconhecido por um anticorpo monoclonal anti - 28 KD, de isotipo IgG2a (W 2 AD 12).

A presente invenção tem além disso por objectivo um hibridoma denominado M 5 BD 9, que fornece anticorpos monoclonais de isotipo IgM que reconhecem o antigénio de 28 KDa.

A presente invenção tem igualmente por objectivo um hibridoma denominado W 2 AD 12, depositado na CNCM em 9 de Maio de 1986 sob ο N2 I - 553, que fornece anticorpos monoclonais de isotipo IgCr2a que reconhecem uma banda correspon dente a um fragmento peptídico de 8 KD, isolado mediante proteólise orientada do polipéptido 28 KD de S. mansoni.

De acordo com a presente invenção obtêm-se os hibrà domas M 5 BD 9 e W 2 AD 12 pelo seguinte processo:

Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o grupo de proteínas de 28 KD de Schistosoma mansoni sao obtidos mediante hibridação celular homóloga rato x rato utilizando a estirpe mielomatosa de rato 10U IR983F /Bazin e colab. 1980 Ann. Immunol. (Istitut Pasteur) 131 D *. 359e cul turas esplénicas de rato LOU imunizados com 50 JAg do grupo de proteínas de 28 KDa de S. mansoni , na presença de adju vante completo de Freund, em duas injecçÕes sub-cutâneas de 25 pg, com quinze dias de intervalo.

Após fusão, as células produtoras de anticorpos anti-28 KDa foram seleccionadas mediante ensaios radioimunológicos sobre placas. Fixa-se um homogeneizado de verme adulto sobre placas de polivinilo e coloca-se depois em contacto com os anticorpos presentes nos sabrenadantes das

- 5 culturas de híbridos. A ligação antigénio-anticorpo é em seguida revelada mediante adição de um segundo anticorpo marcado com o iodo I, dirigido contra as IgG de rato. As células positivas neste ensaio são clonadas pelo método da dilução limite.

A presente invenção tem, além disso, por obje£ tivo uma composição vacinante contra ”S. mansoni” caracterizada pelo facto de conter pelo menos um fragmento peptídico isolado de 2õ KD de S. mansoni” mediante proteólise orientada associado a um veículo apropriado aoeitável sob o ponto de vista farmacêutico.

De acordo com um modo de realização vantajoso da composição vacinante de acordo com a presente invenção, esta contém pelo menos um fragmento peptídico de 6 KD e/ou de 8 KD, associado a um veículo apropriado.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso da composição vacinante segundo a presente invenção, esta contém pelo menos um fragmento peptídico isolado a partir da proteína 28 KD de S. mansoni” mediante proteólise orientada, associado ao epitope do antigénio 38 KD, assim como a um veículo apropriado aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico.

epitope do antigénio de PM 38 KD é um oligossacarido que constitui 0 objecto do pedido de patente de invenção francesa N9 86 06281 de 30 de Abril de 1986 em nome das requerentes.

Além das composições anteriores, a presente invenção compreende ainda outras disposições, que sobressairão ao longo da descrição que se segue.

- 6 A presente invenção será mais claramente compreendida com a ajuda de um exemplo de realização do processo de acordo com a presente invenção e de exemplos de caracterização da actividade antigénica do pêptido isolado segundo a presente invenção.

Deve, no entanto, ficar bem esclarecido que este exemplo de realização é dado unicamente a título ilustrativo da presente invenção, da qual nao constitui qualquer limitação.

) EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DO PÊPTIDO I30LAD0 A PARTIR DA PROTEÍNA 28 KD DE »S. MAN3ONI¹¹.

ETAPA I : Preparação do antigénio de 28 KD de S, Mansonif.

Vermes adultos de 3. mansoni (estirpe portoricaine-porto-riquenha) obtidos mediante perfusão da veia forte em hamsters dourados, são homogeneizados em tampão PBS em um homogeneizador POTTER-ELVEHSEM e o homogeneizado é centrifugado a 5000 rotaçoes/minuto durante 20 minutos.

Fraccionou-se cerca de 2 mg de antigénios sobre geles de poliacrilamida a 13% em placas, utilizando o sistema tampão descontínuo de Laemmli £ descrito por LAEMMLI, NATURE (1970), 227, p. 680 - 685 J.

Após electroforese, os geles são corados com azul brilhante de COOMASSIE. As bandas coradas são cortadas com escalpelo e transferidas em um gel de eluição constituído por desperdícios de gel de suporte.

--7Etapa II

A eluição efectua-se a 40-60V durante 6 a 12 horas. A velocidade de eluição é função da percentagem do gel que se separa e da dimensão molecular das proteínas que se elui. A migração das amostras foi interrompida na interface das camadas de NaCl 2M-glicerol,

Quando todos os péptidos forem eluídos na cama da de glicerol, interrompe-se a electroforese e re tiram-se as amostras com a ajuda de uma pipeta PASTEUR. As amostras são então dialisadas contra a água para eliminar o SDS e os sais, antes de se con centrarem mediante liofilização. As proteínas fraccionadas são então reanalisadas sobre gel de poliacrilamida a 13%, em placa.

A proteína de PM 28 KD obtida pela técnica de fraccionamento que se aoabou de descrever, e que é caracterizada pelo facto de induzir uma resposta, de anticorpos e de o seu antisoro imunoprecipitar os antigénios 28 KD correspondentes entre os produtos de tradução in vitro assim como o ARN de vermes adultos e de ARN de Schistosomulos de S. mansoni, é retida para ser tratada de acordo com a etapa II a seguir.

: Isolamento mediante proteólise de um pêptido da proteína 28 KD de S. mansoni.

Dissolve-se 10 jig de proteína 28 KD em 30 jul de tampão 125 mM Tris-Hcl (pH 6,8) contendo 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS).

Adiciona-se 1 jag cLe protease V8 e realiza-se a

- 8 digestão enzimática do antigénio de 28 KD a 37° C durante 30 minutos, em banho-maria.

Interrompe-se a reacçao mediante adição de 1 jil de 2 - mercaptoetanol é de 3ju.1 de SDS a 10%. Leva-se o conjunto a 100°C em banho-maria durante 6 minutos.

Obtém-se deste modo amostras constituídas por um péptido de que se determina as propriedades antigénicas.

) EXEMPLO 2 - ANÁLISE DA RESPOSTA ANTIGENICA DO PÉPTIDO DO

EXEMPLO 1.

Deposita-se 10 jug do péptido obtido no exemplo 1 sobre um gel de poliacrilamida a 20%. 0 péptido assim fra£ cionado é transferido para uma folha de nitrocelulose de acor do com o método descrito por TOWBIN e colab. /1984, J. Immunol. Methods” 72, p. 471_/.

A folha de nitrocelulose é imediatamente saturada com uma solução de BSA a 3% tamponada com fos) fato mono- e dissódico 10 mM pH 7,2 contendo 0,15 M de cloreto de sódio - 50 Jil de anticorpos, os quais são quer anticorpos de um soro policlonal de rato ou de coelho, quer anticorpos de ascite monoclonal, quer anticorpos obtidos a partir de um hibridoma, especificamente de hibridoma W 2 AD 12, M 5 BD 9.

Antigénio e anticorpo são deixados em contacto durante uma noite à temperatura ambiente, para se obter um Western blot que se lava três vezes durante trinta minutos em tampão de fosfato.

- 9 Adiciona-se em seguida anticorpos marcados pela peroxidase (fornecidos por PASTEUR PRODUCTION) dirigidos quer contra imunoglobulinas de coelho (no caso de anticorpos policlonais), quer contra imunoglobulinas de rato (no caso de anticorpos monoclonais), e incubam-se depois com o blot (mancha) durante 2 horas. Realizam-se três novas lavagens e a presença de imuno-complexos é revelada mediante adição de uma solução contendo 20% de metanol frio, 30 mg de 4-cloro-l-naftol, 0,1% de HgOg para 100 ml de tampão de fosfato, 0,15 M de cloreto de sódio.

Western blotting está representado na figura 1 anexa na qual:

- o bloco 1 representa, na parte inferior, o péptido isolado mediante proteólise, pelo processo de acordo com a presente invenção, e sua parte superior a proteína 28 KD;

- o bloco 2 representa o blot (mancha) obtido com um soro de coelho sao;

- o bloco 3 representa o blot (mancha) obtido com anticorpos monoclonais provenientes do hibridoma ff 2 AD 12;

- o bloco 4 representa o blot (mancha) obtido com soro policlonal de coelho anti - 28 KD.

Este Western blotting demonstra que o anticor po monoclonal W 2 AD 12 portador de uma actividade citotóxica relativamente à larva pós-infestante de Schistosoma mansoni reconhece um fragmento de 8 KDa derivado da proteína de 28 KDa.

reconhecimento por um anticorpo de classe anafi

- 10 láctica sugere a importância deste péptido na indução de uma resposta protectora relativamente a S. mansoni”.

epitope transportado por um fragmento de 6 KDa, reconhecido pelo soro de coelho não é reconhecido pelo anticorpo monoclonal de rato o que sugere que o reconhecimento deste ou daquele epitope do antigénio de 28 KDa é específico de espécie,

EXEMPLO 3 - CONTROLO DO RECONHECIMENTO DO PÉPTIDO

ANTIGÉNICO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO POR ANTICORPOS MONOCLONAIS.

A, A pesquisa de um epitope peptídico de tamanho restrito entre os produtos de proteólise do antigénio de 28 KD, permitiu revelar um fragmento de 8 KD reconhecido específicamente pelo anticorpo monoclonal de isotipo IgG2a, obtido a partir do hibridoma W 2 AD 12.

A actividade citotóxica (ilustrada no quadro I adiante) deste anticorpo monoclonal em ensaios in vitro impli cando eosinófilos, sugere a importância do ou dos epitopes transportados por este péptido de 8 KD.

QUADRO I

Citotoxicidade dependente de eosinófilos

Estudo do anticorpo monoclonal W 2 AD 12

Estirpe do anticorpo ^a	Ή Percentagem de citotoxidade S.D.
- Soro de rato portador de tumor sob-cutâneo de híbrido W 2 AD 12	66,9 Í 26,0
- Soro de rato portador de tumor sob-cutâneo de células IR 983 F	7,3 t 1,06
- Soro de rato imunizado pela proteína 28 KDa	69,9 22,9
- Soro de rato infectado depois de 4 semanas por S. mansoni’·	74,3 ± 23,5
- Soro de rato sao	5,0 ± 4,2

Os ensaios de citotoxicidade são realizados de acordo com as condições descritas por Capron e colab. /~Eur. J. Immunol, 8 , 127 - 133, 1978 J.

a) Os Schistosomulos são pré-sensibilizados durante 18 horas, na presença de 100 ju.1 dos diferentes soros (diluição final 1/16) aquecidos durante 1 hora a 56°C.

b) A percentagem de citotoxicidade (média í desvio-nadrão da média) é calculada após 48 horas de incubação dos Schistosomulos sensibilizados na presença de células peritoneais de rato são (relação células efectoras/alvo = 6000/litro).

soro de coelho anti-28 KD não reconhece o ou. os epitopes presentes neste pêptido, mas reconhece um outro péptido de 6 KD.

anticorpo monoclonal de W 2 AD 12 reconhece os dois péptidos do grupo de antigénios de 28 KD.

B. 0 anticorpo monoclonal de isotipo IgM, obtido a partir do hibridoma M 5 BD 9 só reconhece uma das duas proteínas do do grupo com 28 KDa.

A figura 2 anexa mostra os resultados de Western blotting do grupo de antigénios de 28 KDa de acordo com a presente invenção com anticorpos monoclonais de M 5 BD 9 , de W 2 AD 12 e com soro policlonal de coelho, tais como os relatados antes.

Claims

1. - Processo para o isolamento de um pêptido comportando pelo menos um epitope, mediante proteólise, caracterizado pelo facto de se submeter a proteína 28KD de S. mansoni à acção da protease V8 no seio de um tampão Tris-Hcl de pH8,6 , contendo SDS , de se interromper a reacção de proteólise mediante adição de uma mistura de 2-mercaptoetanol e SDS , e de se aquecer depois à ebulição a 100°C durante um curto intervalo de tempo, para se isolar um pêptido em que se verifica a actividade antigénica com a ajuda de anticorpos de um soro policlonal ou de anticorpos monoclonais.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a digestão enzimática da proteína 28KD por meio da protease V8 durante 30 minutos a 30°C.

3. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto de a mistura utilizada para interromper a reacção de proteólise compreender 2-mercaptoetanol à razão de lyd. por 3yJ. de SDS a 10%.

4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o tampão Tris-HCl no qual se dissolve a proteína 28KD ser um tampão 100 mM e 125 iriM e conter entre 0,08 e 0,12% de SDS.

5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de a verificação da actividade antigénica do pêptido isolado por proteólise, se realizar mediante Western blotting com a ajuda de um soro policlonal de rato, de coelho ou análogo, anti-28KD , revelado,com a ajuda de anticorpos marcados pela peroxidase, dirigidos contra imunoglobulinas de rato, de coelho, de murganho ou análogos, um epitope peptídico de 6KD.

6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de a verificação da actividade antigénica do péptido isolado mediante proteólise, realizada mediante Western blotting com a ajuda de um anticorpo monoclonal anti-28KD, revelar um epitope peptídico de 8KD.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se isolar um fragmento peptídico a partir da proteína 28KD de S. mansoni mediante proteólise dirigida, apresentando o referido fragmento um peso molecular de 6KD e de se reconhecer com soro policlonal de coelho,de rato ou análogo, anti-28KD.

8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se isolar um fragmento pept*dico a partir da proteína 28KD de S. mansoni, mediante proteólise dirigida, apresentando o referido fragmento um peso molecular de 8KD e de se reconhecer com um anticorpo monoclonal anti-28KD, de isotipo IgG2a (W2 AD 12).

9. - Hibridoma denominado W2 AD 12, depositado na CNCM em 9 de Maio de 1986 sob ο ηθ 1-553, caracterizado pelo facto de fornecer anticorpos monoclonais de isotipo IgG2a que reconhecem uma banda correspondente a um fragmento peptídico de 8KD, obtido de acordo com a reivindicação 8 , isolado mediante proteólise dirigida do polipéptido 28KD de S. mansoni.

10.- Processo para a preparaçao de uma composição vacinante contra S. mansoni, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de pelo menos um fragmento peptídico isolado a partir da proteína 28KD de S. mansoni, mediante proteólise dirigida, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

11.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade efectiva de pelo menos um fragmento peptídico de 6KD e/ou 8KD, em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

12.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi- cações 10 e 11, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade efectiva de pelo menos um fragmento peptídico isolado a partir da proteína 28KD de S. mansoni mediante proteólise dirigida, em associação com um epitope do antigénio 38KD, assim como com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.