JPS63258598A - ペプチドの単離方法、ペプチド及びワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、１又は２以上のエピトープを有する、マンソ
ン住血吸虫（Ｓ　、ｍａｎｓｏｎｉ）の２８ＫＤ蛋白質
から単離されるペプチド及びその単離方法、並びにこの
様にして単離されたペプチド抗原フラクションを認識す
るためのモノクローナル抗体及び該ペプチドを単独で又
は他の適切な物質とともに含有してなり、中和抗体合成
を惹起する治療組成物に関する。

バルール等（Ｂａｌｌｏｕｌ　ｅｔ　ａｌ、　）は、モ
レキュラー　アンド　バイオケミカル　パラシトロジー
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｐ　ａｒａｓｉｔｏｌｉｇｙ。

１７　（１９８５）ｐ、１０５〜１１４〕において、マ
ンソン住血吸虫の全ＲＮＡの試験管内翻訳生成物を構成
する、分子量２８ＫＤ、等重点６．３〜６．８のポリペ
プチドで構成される抗体の試験管内での合成を記述して
いる。

上記の著者は、２８ＫＤのポリペプチドを単離し、抗原
特性を発揮する原因となる一個又は複数個のペプチド性
エピトープを同定することを目的として、研究を行なっ
ている。

ＳＤＳを含有するバファー中でプロテアーゼにより蛋白
質を部分消化することにより、ＳＤＳゲルから単離され
る、蛋白質を構成するペプチドを分析することは、公知
である。この方法により、安定な部分消化生成物が得ら
れ、この生成物は、１５％ＳＤＳアクリルアミドゲル上
で夫々分離することが可能な程度に十分大きい分子量を
有する多数のペプチドからなっている。〔クリーブラン
ド等、ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミスト
リー、２５２、ｐ１１０２〜１１０６、（１９７７））
。

本発明者は、マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から、
２８ＫＤ蛋白質により示される抗住血吸虫抗原活性を発
揮する１個又は２個以上のペプチドを単離することを試
みて、公知文献に記載された蛋白質加水分解によるペプ
チドフラグメント単離技術をこの目的に使用した。

本発明は、（ｉ）ＳＤＳを含有するｐＨ６，８のトリス
−ＨＣｌバファー中８プロテアーゼをマンソン住血吸虫
の２８ＫＤ蛋白質に作用させ、（ｉｉ）２−メルカプト
エタノールとＳＤＳとの混合物を添加することにより蛋
白質の加水分解を停止させ、（ｉｉｉ　）ついで短時間
１００℃で沸騰させた後、（ｉＶ　）ポリクローナル血
清抗体又はモノクローナル抗体により抗原活性をチェ、
ツクしたペプチドを集めることを特徴とする、蛋白質加
水分解による少なくとも１個のエピトープを有するペプ
チドの単離方法を提供する。

本発明の好ましい実施態様の一例においては、Ｖ８プロ
テアーゼによる２８ＫＤ蛋白質の酵素分解は、３０℃で
３０分間行なわれる。

本発明の他の好ましい実施態様では、蛋白質加水分解反
応を停止される為に使用される混合物は、１０％ＳＤＳ
３μｌ当り２−メルカプトエタノール１μｌの割合から
なっている。

本発明の更に他の好ましい実施態様では、２８ＫＤ蛋白
質を溶解させるトリス−ＨＣｌバーは、１００〜１２５
ｍＭのバファーで５ＤＳ０．０８〜０．１２％を含む。

本発明の更に他の好ましい実施態様では、ラット、ウサ
ギ等の抗２，８ＫＤポリクローナル血清を使って行なわ
れるウェスターン　ブロッティングによりなされる、蛋
白質加水分解による単離ペプチドの抗原活性のチェック
は、ラット、ウサギ、マウス等の免疫グロブリンに対す
るペルオキシダーゼによりラベルされた抗体により、６
ＫＤのペプチドエピトープを明らかにしている。

本発明の更に他の好ましい実施態様では、抗２８ＫＤモ
ノクローナル抗体を使用して行なわれるウェスターン　
ブロッティングによりなされる、蛋白質加水分解による
単離ペプチドの抗原活性のチェックは、８ＫＤのペプチ
ドエピトープを明らかにしている。

本発明は、更に、（１）制御された蛋白質の加水分解に
よりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離され、
（ｉｉ）６ＫＤの分子量を有し、（ｉｉｉ　）ウサギ、
ラット等の抗２８ＫＤポリクローナル血清により認識さ
れることを特徴とする、ペプチドフラグメントを提供す
る。

本発明は、更に、（ｉ）制御された蛋白質の加水分解に
よりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離され、
（ｉｉ）８ＫＤの分子量を有し、（ｉｉｉ）ＩｇＧ２ａ
アイソタイプ（Ｗ　　２　　ＡＤ１２）の抗２８ＫＤモ
ノクローナル抗体により認識されることを特徴とする、
ペプチドフラグメントを提供する。

本発明は、更に、２８ＫＤ抗原を認識するＩｇＭアイソ
タイプモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ　
Ｍ　　５　　ＢＤ　　９を提供する。

本発明は、更に、マンソン住血吸虫の２８ＫＤポリペプ
チドの制御された加水分解により単離される８ＫＤペプ
チドフラグメントに対応するストリップを認識するＩｇ
Ｇ２ａアイソタイプのモノクローナル抗体を生成するハ
イブリドーマＷ２ＡＤ　　１２　（１９８６年５月９日
イ寸でＮｏ、　Ｉ　−５５３としてＣＮＣＭに寄託）を
提供する。

本発明によれば、ハイブリドーマ　Ｍ５ＢＤ　９及びＷ
　　２　　ＡＤ　　１２は、下記の様にして得られる： マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質群に対するモノクロ
ーナル抗体は、ラットＬＯＵ　　ＩＲ９８３Ｆの丹髄種
細胞株〔バザン等、１９８０ＡｎｎＩ　ｍｆｆ１ｕｎｏ
ｌ、（パスツール研究所）１３１Ｄ：３５９〕と完全フ
ロインドアジュバントの存在下に１５０の間隔でマンソ
ン住血吸虫の蛋白質の２８ＫＤ群を２５μｇずつ２回合
針５０μｇを皮下注射して免疫化したＬＯＵラットの牌
臓培養細胞とを使用して、ラットの同種細胞のかけ合せ
ハイブリダイゼーションにより得た。

融合後、プレート上でのラジオイムノロジカルテストに
より、抗２８ＫＤ抗体生成細胞を選択した。成虫のホモ
ジエネートをポリビニルプレートに固定し、次いでハイ
ブリット培養物の上澄液中に存在する抗体と接触させた
。抗原−抗体リンケージは、ヨード　１２５によりラベ
ルされた、ラットのＩｇＧｓに対する第二の抗体の添加
により、明確にされた。このテストでの陽性細胞は、限
界希釈培養法により、クローン化された。

本発明は、更に、制御された蛋白質加水分解により単離
されたマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質のペプチドフ
ラグメントの少なくとも１つと適切な賦形剤とを含むこ
とを特徴とする、マンソン住血吸虫に対するワクチン組
成物を提供する。

本発明によるワクチン組成物の好ましい実施例において
は、適当な賦形剤とともに、６ＫＤ及び／又は８ＫＤの
ペプチドフラグメントの少なくとも１種が含まれている
。

本発明によるワクチン組成物の他の好ましい実施態様に
おいては、制御された蛋白質加水分解により単離された
マンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質のペプチドフラグメ
ントの少なくとも１種が３８ＫＤ抗体のエピトープと組
合わされて（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　ｗｉｔｈ）　、
適当な賦形剤とともに含有されている。

分子量３８ＫＤの抗原のエピトープは、本出願人による
フランス国特許願第８６０６２８１号（１９８６年４月
３０日）の対象となっているオリゴ糖である。

上記以外の本発明の構成は、以下の記載から明らかとな
ろう。

本発明の理解を容易ならしめるために、本発明方法を行
なう実施例及び本発明によるペプチドの抗原活性の特性
を示す実施例を示す。

以下の実施例は、単に本発明の実例を示すためのもので
あって、本発明を何ら限定するものではない。

実施例１ の調製 ゴールデンハムスターの門脈に潅流することにより集め
られた成虫マンソン住血吸虫（プエルトリコ系統）を、
ボッターーエルベーセム　ホモジナイザー内のＰＢＳバ
ファー中でホモジナイズし、ホモジナイズ生成物を５０
０Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離した。

抗原的２ｍｇを、レムリによるバッチ方式のバファーシ
ステム〔ネイチャー（１９７０）　、２２７、ｐ、６８
０〜６８５にレムリにより記述されている〕を使用して
、プレート上の１３％ポリアクリルアミドゲル上で分画
した。

電気泳動後、ゲルをクーマシー　ブリリアントブルーに
より染色した。染色ストリップを外科用メスで切断し、
支持ゲルの注型により得られた溶出ゲルに移行させた。

溶出は、４０〜６０Ｖで６〜１２時間行なった。

溶出速度は、分離したゲルのパーセンテージ及び溶出し
た蛋白質の分子サイズの関数である。サンプルの泳動は
、２ＭＮａ（１−グリセロール層の界面で止められた。

全てのペプチドがグリセロール層中へ溶出せしめられた
時点で、電気泳動を停止し、各サンプルをパスツールピ
ペットにより取り出した。次いで、各サンプルは、凍結
乾燥により濃縮されるに先立って、ＳＤＳと塩類とを除
去するために、水により透析された。分画された蛋白質
は、次いで、プレート中１３％ポリアクリルアミドゲル
上で再分析された。

上述の分画方法により得られた分子：１２８ＫＤの蛋白
質は、抗体反応を惹起させること、及びその抗血清は、
成虫のＲＮＡ及びマンソン住血吸虫のシストソームラ（
Ｓ　ｃｈｉｓｔｏｓｏｍｕｌａｓ　）のＲＮＡの双方の
試験管内翻訳生成物中の対応する２８ＫＤ抗原を免疫溶
出させる（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）こ
とを特徴とする。この蛋白質は、下記の第２段階による
処理に使用される。

２８ＫＤ蛋白質１０μｇを５Ｄ８０．１％を含有する１
２５ｍＭ）リス−ＨＣ９バフｙ−（ｐＨ６，８）３０μ
ｌに溶解した。

プロテアーゼｖ８を１μｇ加え、２８ＫＤの抗原の酵素
分解を水浴上３７℃で３０分間行なった。

２−メルカプトエタノール１μｌ及び１０％ＳＤＳ３μ
ｌを添加して、反応を停止させた。全体を水浴上１００
℃に昇温させて６分間保持した。

抗原特性を決定したペプチドからなるサンプルを集めた
。

実施例２ 実施例１で得たペプチドの抗原的応答の分析実施例１で
得たペプチド１０μｇを２０％ポリアクリルアミドゲル
上に析出させた。

この様にして分画されたペプチドをタウビン等（１９８
４、ジャーナル　オブ　イミュノロジカル　メソッド　
７２、ｐ、４７１）の方法に従って、ニトロセルロース
　シート上に移した。

ニトロセルロース　シートは、先ｆ、０．１５Ｍ　　Ｎ
ａＣＱ及び抗体５０μｌを含むリン酸−ナトリウム及び
リン酸二ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７，２）により緩衝
された３％ＢＳＡ溶液により飽和せしめられた。使用し
た抗体は、ラット又はウサギのポリクローナル血清の抗
体であるか、或いはモノクローナル腹水抗体であるか、
或いはハイブリドーマ、特にハイブリドーマ　Ｗ２ＡＤ
　　１２、Ｍ　　５　　ＢＤ　　９から得られた抗体で
あった。

抗原と抗体とを室温で一夜接触させておき、ウェスター
ン　プロットを得た後、リン酸塩バファー中３０分間に
３度洗浄した。

次いで、ウサギ免疫グロブリン（ポリクローナル抗体の
場合）又はラット免疫グロブリン（モノクローナル抗体
の場合）に対して働くペルオキシダーゼ（パスツール製
）でラベルされた抗体を加え、“プロット”とともに２
時間インキュベートした。更に３回洗浄を行ない、冷メ
タノール２０％、４−クロロ−１−ナフトール３０ｍｇ
、リン酸バファ−１００−当りＨ２Ｏ２０，１％、０．
１５Ｎ　　ＮａＣＱを含む溶液を添加することにより、
免疫コンプレックスの存在を明らかにした。

添附した第１図にウェスターン　ブロッティングを示す
。

第１図において、ブロック１の下部には、本発明による
蛋白質分解により単離されたペプチドが示され、その上
部には、２８ＫＤ蛋白質が示されている。ブロック２は
、健康なウサギの血清により得られた“プロット“を示
す。ブロック３は、ハイブリドーマ　Ｗ　　２　　ＡＤ
　　１２に由来するモノクローナル抗体で得られた“プ
ロット”を示す。ブロック４は、ポリクローナル　ウサ
ギ抗２８ＫＤ血清で得られた“プロット”を示す。

このウェスターン　ブロッティングは、感染後のマンソ
ン住血吸虫幼虫に対して細胞毒性を有するモノクローナ
ル抗体Ｗ　　２　　ＡＤ　　１２は、２８ＫＤの蛋白質
に由来する８ＫＤフラグメントを認識したことを示して
いる。

アナフイラキシ−的に抗体を認識することは、マンソン
住血吸虫に対する保護的応答を惹起する点において、こ
のペプチドの重要性を示唆している。

ウサギ血清により認識される６ＫＤフラグメントに備え
られたエピトープは、ラットのモノクローナル抗体によ
っては認識されず、このことは、２８ＫＤ抗原の特定の
−又は他のエピトープの認識は、個々の種に関して特異
的であることを示している。

実施例３ Ａ　　２８ＫＤ抗原の分解生成物中に制限寸法のペプチ
ドエピトープを探すことにより、特にハイブリドーマＷ
　　２　　ＡＤ　　２１から得られたアイソタイプＩ　
ｇＧ２ａのモノクローナル抗体により、８ＫＤフラグメ
ントを認識することが可能となった。

好酸球増加症に関連して、試験管中でのこのモノクロー
ナル抗体の細胞毒性的活性（下記第１表に示ス）は、８
ＫＤのこのペプチドが有する１個又はそれ以上のエピト
ープの重要性を示している。

第　　　１　　　表 好酸球依存細胞毒性 細胞毒性（ｂ） 抗体原（ａ）　　　±ｓ、Ｄ〔％〕 ２８ＫＤ蛋白質により免疫され　　６９．９カ２２．９
たラットの血清 健康なラットの血清　　　　　　　　　５．０±４．２
細胞毒性テストは、カプロン等（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、旦、１２７〜１３３．１９７８）
の方法により行なった。

又、第１表中（ａ）及び（ｂ）は、以下のことを示す： （ａ）５６℃で１時間加熱した種々の血清（最終希釈度
１／１６）の存在下に、住血吸虫の幼虫を１８時間予備
感作した。

（ｂ）細胞毒性のパーセンテージ（平均上平均からの標
準偏差値）は、健康なラットからの腹膜腔細胞の存在下
（実効細胞／ターゲット比＝６０００／１）に感作され
た住血吸虫の幼虫の培養４８時間後に測定した。

抗２８ＫＤウサギ血清は、このペプチドが有する１個又
は２個以上のエピトープを認識しなかったが、６ＫＤの
他のペプチドは認識した。

Ｗ　　２　　ＡＤ　　１２のモノクローナル抗体は、２
８ＫＤの抗原群の２個のペプチドを認識した。

Ｂ　　ＩｇＭのモノクローナル抗体、即ちハイブリドー
マＭ　　５　　ＢＤ　　９から得られたアイソタイプは
、２８ＫＤグループの２つの蛋白質の一方のみを認識し
た。

第２図は、モノクローナル抗体Ｍ　　５　　ＢＤ９及び
Ｗ　　２　　ＡＤ　　１２並びに前述のポリクローナル
　ウサギ血清を使用して本発明方法により得た２８ＫＤ
の抗原群のウェスターンプロティングの結果を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例２で得られたウェスターン　
プロティングの結果を示す図面、第２図は、本発明の実
施例３で得られたウェスターンプロティングの結果を示
す図面である。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）蛋白質分解により少なくとも１つのエピトープを
   有するペプチドの単離を行なう方法において、マンソン
   住血吸虫の２ＫＤ蛋白質に、ＳＤＳを有するｐＨ６．８
   のトリス−ＨＣｌバファー中でプロテアーゼＶ８を作用
   させ、２−メルカプトエタノールとＳＤＳとの混合物を
   添加して蛋白質の分解反応を停止させ、次いで１００℃
   で短時間沸騰させ、ポリクロナール血清抗体又はモノク
   ロナール抗体によりその抗原活性がチェックされたペプ
   チドを集めることを特徴とするペプチドの単離方法。 （２）Ｖ８プロテアーゼによる２８ＫＤ蛋白質の酵素消
   化を３０℃で３０分間行なう特許請求の範囲第１項に記
   載のペプチドの単離方法。 （３）酵素分解反応を停止させるために使用される混合
   物が、１０％ＳＤＳ３μｌ当り２−メルカプトエタノー
   ル１μｌの割合からなる特許請求の範囲第１項に記載の
   ペプチドの単離方法。 （４）２８ＫＤ蛋白質を溶解するトリス−ＨＣｌバファ
   ーが、濃度１００〜１２５ｍＭで且つ ０．０８〜０．１２％のＳＤＳを含むバファーである特
   許請求の範囲第１項に記載のペプチドの単離方法。 （５）ラット、ウサギ等の抗２８ＫＤポリクローナル血
   清を使用してウェスターン　ブロッティングにより行な
   う単離ペプチドの抗原活性のチェックが、ラット、ウサ
   ギ、マウス等の免疫グロブリンに対するペルオキシダー
   ゼでラベルされた抗体により、６ＫＤのペプチドエピト
   ープであることを示す特許請求の範囲第１項に記載のペ
   プチドの単離方法。 （６）抗２８ＫＤモノクローナル抗体を使用してウェス
   ターン　ブロッティングにより行なう単離ペプチドの抗
   原活性の確認が、８ＫＤのペプチドエピトープであるこ
   とを示す特許請求の範囲第１抗に記載のペプチドの単離
   方法。 （７）特許請求の範囲第１項に記載の制御された蛋白質
   分解によりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離
   され、分子量６ＫＤであって、ラビット、ラット又はこ
   れらの類似動物の抗２８ＫＤポリクローナル血清により
   認識されるペプチドフラグメント。 （８）特許請求の範囲第１項に記載の制御された蛋白質
   分解によりマンソン住血吸虫の２８ＫＤ蛋白質から単離
   され、分子量８ＫＤであって、ＩｇＧ２ａアイソタイプ
   （Ｗ　２　ＡＤ　１２）の抗２８ＫＤモノクローナル抗
   体により認識されるペプチドフラグメント。 （９）マンソン住血吸虫の２８ＫＤポリペプチドの制御
   された蛋白質分解により単離された特許請求の範囲第８
   項による８ＫＤのペプチドフラグメントに対応するスト
   リップを認識するアイソタイプＩｇＧ２ａのモノクロー
   ナル抗体を生成し、１９８６年５月９日付で第 I −５
   ５３号としてＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＷ２
   　ＡＤ　１２。 （１０）制御された蛋白質分解によりマンソン住血吸虫
   から単離された２８ＫＤポリペプチドのペプチドフラグ
   メントの少なくとも１種及び適切な賦形剤を含む、マン
   ソン住血吸虫に対するワクチン組成物。 （１１）６ＫＤ及び／又は８ＫＤのペプチドフラグメン
   トの少なくとも１種を適切な賦形剤とともに含有する特
   許請求の範囲第１０項に記載のワクチン組成物。 （１２）制御された蛋白質分解によりマンソン住血吸虫
   から得られた２８ＫＤポリペプチドのペプチドフラグメ
   ントの少なくとも１種と３８ＫＤ抗原のエピトープとを
   適切な賦形剤とともに含む、特許請求の範囲第１０項に
   記載のワクチン組成物。