PT85166B - Processo para a preparacao de um meio de diagnostico para a representacao cintilografica de tumores malignos - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a um meio de diagnóstico para a representação cintilográfica de tumores malignos, a um processo para a representação cintilográfica de tumores malignos com este meio de diagnóstico, e a um processo para a preparação do meio de diagnóstico.

Existe desde há muito tempo o desejo de se ter â disposição um meio de diagnóstico que permita reconhecer desde os primeiros instantes o tamanho e a localização de tumores malignos. Realizaram-se imensos ensaios com este objectivo, recorrendo a métodos da medicina nuclear, para se conseguir tornar sensível e puder representar gráficamente o perfil de distribuição de substâncias do corpo humano acipladas a nuclidos que emitem radiação gama. 0 êxito deste método depende do facto de se conseguir dispôr de substâncias que se li» guem aos tumores malignos de forma específica ou não específica.,»

Para a cintilografia de tumores já se dispõe de um número considerável de substâncias associadas a tumores que, todavia, não são específicas do tumo e cuja afinidade ao tumor é frequentemente desconhecida. Entre estas encontram-se substratos inorgânicos como citrato de gálio-67, cio reto de índio-111 e cloreto de biseuto-206. Mas também já foram utilizados na localização cintilográfica de tomores metabolitoo provenientes do metabolismo do tumor com glutamato de azoto-13 e metionina de selénio-75 (ver E. Henze, “Szintigraphische Lokalisationsdiagnostik von Tumoren”, Munch.med. Wschr. 127,182« -184 (1985))· Finalmente foram também já utilizados meios eitos táticos marcados radioactivamente, como bleomicina de cobal·· to-57» ou proteinas associadas a tumores, como antifibrina de iodo-131· A todas estas substâncias é comum o facto de frequen·· temente só alcançarem o tumor em concentrações muito fracas, de modo que não é possível uma determinação nítida da localiza·· ção do tumor, especialmente tal não se torna possível quando s« trata de aglomerados de pequenos tumores.

Contudo, a cintilografia de tumores deu também, nestes últimos anos, um passo em frente essencial atra«>

vás da disponibilidade de anticorpos monoclonais ou dos seus fragmentos imunoactivos marcados radioactivamente e específicos dos tumores (ver A.M. Keenan, J.C. Harbert e S.M. Larson, ”Monc clonal Antibodies in Nuclear Medicina”, The Journal of Nuclear Medicine, vol. 26, 531-537 (1985))· Uma cinética in vivo melho·, rada destes anticorpos já produziu resultados muito encorajado·, res. A técnica da medicina nuclear de que se dispõe actualmente permite uma representação quantitativa e tomográfica. Ainda não há, contudo, uma grande experiência clínica no que se refere â sensibilidade, especificidade ou acções colaterais devido à he·· terogeneidade dos anticorpos usados até ao presente. Resulta daqui que os anticorpos monoclonais só podem alcançar os tumores que transportam sobre a superfície das células o antigene exactamente correspondente. A alta especificidade dos anticorpos monoclonais não permite, por conseguinte, uma comprovação generalizada de quaisquer tumores.

I)

Tornou-se recentemente conhecido através do Pedido de Patente Europeia 142 641 um meio para a diagnose e terapia de tumores, o qual contém um imunomodulador marcado com um agente emissor de radiações radioactivas, um corante ou um meio citostático. Este meio é administrado de preferência conjuntamente com um cocktail” constituído por um aldeído e um álcool. Entre os imunomoduladores preferidos contam-se deri· vados de dipeptíde os de ácido muramílico, peptidoglicanos ou extractos isentos de peptidoglicanos de diversas espécies de bactérias. Em pacientes que tinham tomado o cocktail* referido 30 minutos antes possível fazer-se a da administração do meio de diagnóstico foi localização do tumor.

Descobriu-se agora que se pode prescindii' um cocktail* constituído por um aldeído e da administração de um álcool se, na representação cintilográfica de tumores malignos, fôr utilisado um meio de diagnóstico que contem uma subs tância obtida pelo tratamento enzimático tá ligado um radionuclido por meio de um de mureina â qual esaglutinante complexo₀

Quanto â distância enzimático da mureina, trata-se de uma mistura de componentes como é descrita por exemplo por B. Glauner e U. Schwarz, em Analyses of Murein With HPLC, em The Target of Penicillin, 29-34, Berlim 1983, obtida pelo tratamento

The pág s₀ mufiaEntre estes conta-se um componente de ropeptídeos cíclicos, por exemplo muropeptídeos em como são descritos por W. Weidel e H. Pelzer, Adv. in Enzymol 26, 193“ -232 (1964), e um componente de fragmentos de muireina de peso molecular elevado com um peso molecular de cerca de 10 000o ta substância é obtida pondo em suspensão mureina de células de Escherichia coli (10 mg/ml), preparada por um processo conhecido da literatura, em acetato de amónio 0,05M e incubando com 10 -pz/ml de albumina de ovo de galinha-lisozima durante 18 horas a 37°C. Depois da sedimentação dos constituintes insolúveis a 50 000 x g extrai-se com clorofórmio e a fase aquosa é secao acetato de amónio 4 eliminado a 5θ°0 em vácuo ao longo de horas.

Aos grupos amino livres desta substância liga-se um eomplexante, tal como ácido etilenodiaminotetracáti· co, Úcido dietilenotriaminopentacático ou ácido nitrilotriac4tico, o qual transporta um radionuclido. Utilizam-se de preferência para este efeito tecn4cio-99 ou índio-111,

É particularmente vantajoso que o meio de diagnóstico de acordo com a invenção possa aser preparado pelo tratamento de paredes celulares de quaisquer bactórias. É por conseguinte obtido de preferência a partir de Escherichia coli, visto que este microorganismo pode ser obtido comercialmente na forma de uma massa celular congelada. A substância obtida pelo tratamento enzimático da mureina 4 convenientemente levada a reagir á temperatura ambiente com o eomplexante. Depois da separação do excesso de eomplexante a solução ó liofilizada e misturada com a actividade desejada do radionuclido. Seguidamente realiza-se uma filtração est4ril e o ajustamento à concentração da actividade pretendida com solução de soro fisiológico isotónica.

meio de diagnóstico assim obtido 4, sur< preendentemente, apropriado para tornar visíveis tumores malignos das mais diversas naturezas. Podem ser facilmente reconhecidos tanto tumores das partes moles como tamb4m tumores dos ossos·

A preparação e a utilização do meio de diagnóstico são elucidadas com base nos seguintes exemplos»

Exemplo 1

Acoplamento do ácido dietilenotriaminopentacático (PTPA) mg de muweina obtida de E. coli e tratada enzimaticamente po

.. ......ρ.

um processo genericamente conhecido são dissolvidos em 0,5 ml de tampão de bicarbonato 0,05 M pH 8,2, misturados à temperatura ambiente com 10 mg de anidrido de DTPA bicíclico e deixados em repouso 10 minutos â temperatura ambiente· 0 excesso de DTPa ó separado cromatograficamente (material de suportei sílica-ge:. RP-18j eluente: solução 0,1 M de fosfato pH 4,69 ® metanolf águsi 70130), A solução do preparado assim obtida é dividida em pequenas porçtíes e liofilizada.

Exemplo 2

Reacção com índio-111 liofilizado 4 dissolvido em tampão de citrato de amónio 0, M pH=6,5 e misturado á temperatura ambien·· te com a actividade desejada, por exemplo 100 MBq, de citrato de índio-111. 0 citrato de índio-111 é preparado a partir do cloreto de índio-111 que pode ser adquirido comercialmente, por diluição a 1:1 com citrato de amónio 0,1 Μ pH=6.5· Depois de 10 min. de repouso da esteril atravós de actividade pretendida co.

â temperatura ambiente a solução é filtra um filtro e óajustada ã concentração de com solução isotónica de soro fisiológi»

A pureza radioquímica pode ser comprovada por cromatografia líquida de alta pressão.

Material de suporte:silica—gel RP-18 Eluente: 20 min 0,1 m H^PO^ 4,69+15$ CH^OH

120 min 0 100% 0,lm H^PO^ pH=4,69+15% C^OH preparado depois de filtrado pelo filtro esteril está apto a ser injectado· 0 processo de marcação pode ser realizado tanto pelo preparador como também pelo utilizador.

Exemplo 3

Ensaio com animais <m m

No musculo da pata dianteira direita de uma ratazana (Sprague-Dawley) foi implantado um carcinoma de Walker 256 (tumor das partes moles). Depois de se.· verificar que o tumor se desenvolvia normalmente administrou-se ao animal, por injecção intravenosa, 0,5 ml do preparado (0,3 MBq de índio-111). 0 cintilograma obtido ao fim de 2 h está representado na fig. 1.0 tumor é demarcável nitidamente na pata di·-reita» 0 cociente tumor/músculo 4 de 4.

Exemplo 4

Ensaio com animais

A uma ratazana (Sprague-Dawley) â qual tinha sido implantada na pata traseira direita um oesteossarcoma (tumor osseo) aplicaram-se i.v. 0,5 ml (0,3 MBq de índio-111) do preparado. No cintilograma obtido passadas 2 h (figo 2) localiza-se nitidamente o tumor. A relação medida tumor/mus» culo era igualmente de 4.

Claims (5)

REIVINDICAÇÕES ** X - *· Processo para a preparação de um meio de diagnóstico para a representação cintilográfica de tumores malignos, caracterizado pelo facto de sa ligar um rádionuclido, com auxílio de um complexante, a uma substância obtida pelo tratamento enzimático de mureina.

1 ou 2, caracterizado pelo facto de o produto de decomposição da mureina ser obtido a partir da mureina de Escherichia coli_e

- 2» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se liofilizar a substância obtida por tratamento da mureina depois da ligação ao complexante e de se pôr de novo em solução só para a marcação.

3»

Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2_t caracterizado pelo facto de se utilizar como radionucli*· do tecnecio-99 ou índio-111.

- 4* -

Processo de acordo com a reivindicação

- 5» ~

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se utilizar como complexan te ácido dietilenotriaminopentacético·

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 27 de Junho de 1986, sob o n2, P 36 21 57θ·θ·