PT81407B

PT81407B - Process for the preparation of peptides having pharmacological activity

Info

Publication number: PT81407B
Application number: PT81407A
Authority: PT
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1984-11-01
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 1987-05-18
Also published as: EP0184309A2; JPS61129198A; PT81407A; GB8427651D0; US4737487A; ES8704973A1; GR852640B; DK499485D0; EP0184309A3; AU4920885A; ES548388A0; ZA858328B; DK499485A

Description

Descrição do objecto do invento que

BEECHAM GROUP, p.l.c., britânica, industrial, com sede em Great West Road, Brentford, Middlesex TW8 9BD, Grã-Bretanha, pretende obter em Portugal para " PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PEPTIDOS COM ACTIVIDADE FARMACOLÓGICA "

0 presente invento refere-se a um processo para a preparação de péptidos com actividade farmacológica.

0 presente invento refere-se a fragmentos PIV e análogos, ao processo para a sua preparação, a preparações farmacêuticas que contêm os mesmos e à sua utilização na medicina.

Os péptidos intestinais vasoactivos (PIV) foram isolados originariamente a partir do intestino delgado do porco, mas tem, desde aí, sido isolado de outras espécies, tais como aves de criação e tem sido representado como tendo uma larga distribuição em todos os tecidos do corpo.

Possui actividade vasodilatadora sistémica. Induz hipotensão sistémica e aumenta a saída cardíaca na infusão intravenosa. Aumenta o fluxo de sangue arterial hepático, aumen ta os níveis de açúcar no sangue, e tem a possibilidade de provocar o relaxamento da traqueia, e o relaxamento do músculo liso do intestino, assim como a estimulação da saída de bicarbonato das secreções intestinais. Portanto parece ser útil no tratamento da hipertensão e doçura vascular periférica na administração parentérica e como um bronco dilatador na administração parentérica ou por aerosol.

Os péptidos intestinais vasoactivos compreendem um péptido que possui uma sequência de 28 amino ácidos numa ca56.739

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deia única.

A sequência de PIV ( porco ) está representada no Quadro

1.

Términus - N

QUADRO X VIP ( porco )

CH, 1 ² HjNCHCOHis	OH 1 CH, 1 ² -NHCHCO — Ser	-CO-H 1 ² CH, 1 ² -NHCHCO Asp	CH, 1 ³ —NHCHCO— Ala	CH, CH, ³\ / ³CH 1 NHCHCO— Vai	9 CH, 1 ² —NHCHCO— Phe	CH, OH \ / CH 1 — NHCHCO— Thr
		OH I		H,N NH ² \/		H-N NH
				² \//
		fil		c	CH, CH, \ / ³CH 1	c I
CO.H 1	CONH, 1 ²	9	CH, OH ³\ /	1 NH 1	1 NH 1
CH₀ I ^z	CH, 1 ²	CH, 1 ² ·	CH \|	3	CH, I ²	^^H2^}3
1 —NHCHCO -	I —NHCHCO —	1 -NHCHCO-	— NHCHCO —	-NHCHCO-
— NriCHCU —
Asp	Asn	Tyr	Thr	Arg	Leu	Arg
		CH, I ^J
NH, 1 ²	CONH1 ²	S 1		CH, CH, \ /	NH, 1 ²	NH, 1 ²
⁽Ç^H2>4	^^H2^}2	(ÇH₂)₂	CH, 1 ^J	CH I	«f^H2⁵4	^2^ 4
1 -NHCHCO-	-NHCHCO —	-NHCHCO—		.ΜΠΓΗΡΠ	-NHCHCO —	— NHCHCO-

Lys	Gin	Met	Ala	Val	Lys	Lys
OH
	CH, CH, \ /³CH I	CONH1	OH 1	CH, 1 ³ CH- CH, \ /	CH, CH, \ /³ CH 1	CONH, 1 ²
CH, 1 ¹	CH, 1 ^z	CH, 1 ²	CH, 1 ²	CH I	CH, 1 ²	CH, 1
— NHCHCO -	-NHCHCO —	1 -NHCHCO —	1	1
NHCHCO	-NHCHCU
Tyr	Leu	Asn	Ser	Ile	Leu	Asn-NH₂

Términus - C

2

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As abreviaturas utilizadas

Residuos de ácidos amino

alamina

arginina

asparagina

acido aspârtico

glutamina

histidina

isoleucina

leucina

lisina

metionina

norleucina

fenilalanina

serina

treonina

tirosina

valina

sSo como se segue:

Abreviat uras

Ala

Arg

Asn

Asp

Gin

His

lie

Leu

Lys

Met

Nie

Phe

Ser

Thr

Tyr

Vai

Os componentes amino ácidos são na forma L

0 PIV ( aves de criação ) está estreitamente relacionado diferindo nas posições 11, 13, 26 e 28; o péptido possui:

um resíduo de serina na posição 11,

um resôduo de fenilalanina na posição 13,

um resíduo de valina na posição 26,

um resíduo de treonina na posição 28.

Tem-se produzido um número de fragmentos de terminal-C na maior parte das vezes no programa sintético necessário para provar a estrutura de PIV. Têm-se obtido poucas estruturas a partir do términus -N, e tem sido efectuado muito pouco trabalho em fragmentos a partir do centro da molécula.

No entanto, tem-se concluido ( Robberecht, Gut Hormones ( 1978 ) publicado por Bloom, p. 97 a 103 ) que o términus-C

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de PIV sustenta o local de reconhecimento receptor, e que o términus-N sustenta o local de activação, em conjunto com uma capacidade mínima de ligação.

Contrariamente às opiniões comumente sustentadas, no que se refere à actividade de PIV, verificou-se que existe actividade farmacológica mesmo na ausência das unidades de amino ácido nos términus-C e -N da molécula.

0 presente invento proporciona um péptido que compreende em sequência, unidades escolhidas dos resíduos de amino ácidos 11 a 23 de PIV e consistindo, pelo menos, nos resíduos de amino ácidos 15 a 20, ou um seu análogo em que um ou mais dos resíduos de amino ácidos é substituido por um outro amino ácido equivalente.

0 presente invento proporciona também um péptido que cor siste, em sequência, nas unidades de PIV escolhidas dos resíduos de amino ácidos 11 a 23, e que compreende, pelo menos, os resíduos de amino ácidos 15 a 20, ou um seu análogo que possui actividade farmacológica.

De preferência, num péptido de acordo com o presente invento as unidades de amino ácidos são escolhidas dos resíduos 13 a 23 ou 11 a 21, mais especialmente dos resíduos 13 a 21, de PIV. Num seu análogo, uma ou mais do que uma unidade de amino ácido pode ser substituída por uma unidade de amino ácido equivalente.

Os amino ácidos podem ser considerados como elementos de diferentes classes; estes agrupamentos são bem conhecidos. A substituição de um amino ácido do péptido por um amino ácido equivalente pode ser por outro amino ácido das mesma clas-j se, e onde um amino ácido pode ser agrupado em duas ou mais classes, a substituição pode ser feita a partir de uma ou mais destas classes.

Todos os amino ácidos num análogo do presente invento podem, por exemplo, ser amino ácidos que ocorrem naturalmente isto é, amino ácidos L, ou amino ácidos na forma D- ou DL.

Parece razoável supor que a actividade de um péptido gera alguma relação com a sua estrutura secundária ( que po- 4 56.739

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deria ser inerente, ou adoptada no local de recepção). Deste modo, a actividade expressa poderia estar relacionada com um potencial para a formação de uma disposição altamente ordenada de alguns dos amino ácidos.

Onde existe substituição de um ou mais amino ácidos, a substituição pode, por exemplo, ser tal que se mantenha a estrutura essencial do fragmento.

Sem pretender estar limitado às hipóteses seguintes, presentemente crê-se ser possivel que, para péptidos de acorde com o presente invento, uma estrutura helicoidal pode ser um factor contributório na actividade farmacológica. 0 amino ácido ou ácidos de substituição num seu análogo pode, portanto, se se desejar, ser escolhido de maneira a possuir, pelo menos um caracter de formação helicoidal tão bom como o(s) amino(s) substituido(s). No entanto, a falta de uma estrutura helicoidal pode não prejudicar a actividade de um péptido ou análogo do presente invento; por exemplo, pode preferir-se, por razões farmacológicas ou outras, incorporar amino âcido(s) D como o(£) amino ácido(s) de substituição e, evidentemente compreender-se-á que, a menos que todos os amino ácidos no análogo resultante sejam na forma D, a estrutura não será de natureza helicoidal.

Assim, por exemplo:

- a treonina na posição 11 de PIV ( porco) pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido hidroxi, poi¹exemplo, serina (Ser); e a serina na posição 11 de PIV

( aves de criação ) pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido hidroxi, por exemplo, treonina ( Thr );

- a arginina na posição 12 e/ou na posição 14 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido básico, por exemplo lisina ( Lys ) ou ornitina ( orn );

- a leucina na posição 13 de PIV ( porco ) e/ou na posição 23, e a fenilalanina na posição 13 de PIV ( aves de criação) podem, se se desejar, ser substituídas por outro

- 5 -

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amino ácido hidrofôbico, no caso de leucina, por, por exemplo valina ( val ) e, no caso de fenilalanina por, por exemplo tirosina;

- a lisina, em qualquer uma ou mais das posições 15, 20 e 21 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido básico, por exemplo ornitina (orn) ou arginina ( Arg);

- a glutamina na posição 16 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido carboxamido, por exemplo, asparagina ( Asn);

- a metionina na posição 17 pode, se se desejar, ser substitui da por outro amino ácido neutro, por exemplo a norleucina isostérica (Nle) ou leucina (Leu);

- a alanina na posição 18 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido hidrofôbico, por exemplo, glicina (Gly) ou norvalina (Nva);

- a valína na posição 19 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido hidrofôbico, por exemplo, leucina (Leu);

- a triosina na posição 22 pode, se se desejar, ser substituída por outro amino ácido hidrofôbio, especialmente um amino écido aromático, por exemplo fenilalanina ( Phe ).

Em especial deveriam mencionar-se análogos em que um ou mais dos resíduos de amino ácidos 15 a 20 ê substituido por um outro amino ácido equivalente e quaisquer resíduos adicionais de amino ácidos correspondem aos de PIV.

Em especial o presente invento proporciona uma amina de hexapéptido com as sequências de amino ácido do residuo 15 a 20 de PIV, ou um seu análogo em que um ou mais dos amino ácidos é substituido como acima se indicou.

Muito especialmente, o presente invento proporciona o hexapéptido

Lys Gin Y Ala Val Lys

em que Y representa Met ou Nle, e também o hexapéptido Lys Gin Y Ala Leu Lys

em que Y representa Met ou Nle.

- 6 —

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eo$oo]

P0RTUG.4I

Si

Deveriam mencionar-se, em especial, os fragmentos e análogos de PIV (porco), mas a estrutura básica pode corresponder a PIV de qualquer fonte.

Devem mencionar-se especialmente os seguintes fragmentos

e análogos·.

			Arg	ΔΑ7; L ¹	► t
		Leu	Arg	[Aj;	)
Arg	Leu	Arg	t^kr·	►
Thr .	Arg	Leu	Arg	[Ã]\
				[Δ]	Lys;
				7^a;	Lys Tyr;
				7^a;	Lys Tyr Leu;
			Arg	7a;	Lys;
			Arg	/a;	Lys Tyr;
			Arg	7a;	Lys Tyr Leu;
		Leu	Arg	7^a;	Lys;
		Leu	Arg	7A7	Lys Tyr;
		Leu	Arg	7a;	Lys Tyr Leu;
	Arg	Leu	Arg	7a;	Lys;
	Arg	Leu	Arg	7a;	Lys Tyr;
	Arg	Leu	Arg	7a;	Lys Tyr Leu;
Thr	Arg	Leu	Arg	7 a;	Lys;
Thr	Arg	Leu	Arg	7a;	Lys Tyr;
Thr	Arg	Leu	Arg	7a;	Lys Tyr Leu;

em que

A indica Lys Gin Y Ala Vai Lys na qual Y representa Met ou Nle.

Os amino ácidos podem, por exemplo, ser na forma L; embora um ou mais amino ácidos D possam, se se desejar, estar presentes na estrutura.

0 términus carboxi dos péptidos ou análogos do present» invento podem ser na forma do ácido ( -OH ); um éster, por exemplo, um éster alquilo, especialmente um éster alquilo ( ), por exemplo o éster de metilo, (-OCH^), a hidra- 7 -

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zida ( -NH - NHg ), ou uma amida, habitualmente a amida não substituída (-NH₂). De preferência o términus carboxi é na forma da amida não substituída.

0 términus amino dos péptidos ou análogos do presente invento podem ser na forma da amina não substituída (-nh₂) ου amina protegida ( -NHR ) em que R representa, por exemplo, acetilo, Ferc-butiloxicarbonilo ou benziloxicarbonilo, ou na forma de um sal de adição de ácido, de preferência um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável e fisiologicamente tolerável da amina.

Os sais de adição de ácido podem, por exemplo, ser sais com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido ortofosfórico ou ãcido sulfúrico, ou ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárieo, ácido málico, ácido succinico, ácido salicilico ou ácido acetisalicílico.

Assim, mais particularmente, o presente invento proporciona um polipéptido da fórmula geral.

X- (Y')n-Y₁₅ Y₁₆ Y„ Y₁₈ Y₁₉ Y₂₀ -(Y")m-Z

em que

X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo amino protector, de preferência um átomo de hidrogénio;

(Y’)h representa uma ligação directa ou

^Y11 ^Y12 ^Y13 ^Y14 · ^Y12 ^Y13 ^Y14 ^Y13 ^Y14 °^{U Y}14

em que

^Y11 representa Thr, Ser ou o residuo de outro amino ácidc hidroci;

^Y12 representa Arg ou o resíduo de outro amino ácido básico;

^Y13 representa Leu, Phe ou o residuo de outro amino ácido hidrofôbico;

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residuo	de	outro	amino	ácido	básico;
resíduo	de	outro	amino	ácido	básico;
residuo	de	outro	amino	ácido	carboxa-
resíduo	de	outro	amino	ácido	neutro,
resíduo	de	outro	amino	ácido	hidrofó-
resíduo	de	outro	amino	ácido	hidrofó-
resíduo	de	outro	amino	ácido	bâsico,

por exemplo Ora, representa Gin ou mido,

representa Met ou por exemplo Nle, representa Ala ou bico,

representa vai ou bico,

representa Lys ou por exemplo, Ora,

( Y” )m representa uma ligação directa ou ^Y21’ ^Y21 ^Y22 ^{OU Y}21 ^Y22 ^Y23

em que

21

22

23

representa Lys ou o resíduo de outro amino ãcido básico, representa Tyr ou o resíduo de outro amino ácido hidrofóbico,

representa Leu ou o resíduo de outro amino ácido hidrofico; e

representa um grupo hidroxilo, ou um grupo da fórmula OR de tal modo que COZ representa um éster, ou um grupo hidrazino de tal modo que COZ represente uma hidrazida, ou NHg de tal modo que COZ represente uma amida, de preferên cia NH₂; e seussais, de preferência seus sais fisiologicamente toleráveis, especialmente seus sais de adição de ácido fisiològicamente toleráveis.

Os compostos de fórmula I são, de preferência,’ na forna farrnaceuticamente aceitavel. Por forma farrnaceuticamente aceitavel pretende significar-se, entre outros, um nível farnacêuticamente aceitável de pureza excluindo os aditivos farnacêuticos normais tais comodiluentes e veículos, e que não incluem material considerado tóxico a níveis de dosagem normaisL

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Um nível farmaceuticamente aceitável de pureza será, em geral, pelo menos 50% excluindo os aditivos farmacêuticos normais.de preferência 75%, mais preferentemente 90% e ainda mais preferentemente 95%.

Um péptido ou análogo do invento pode ser preparado peloíi processos conhecidos no ramo para a sintese de compostos de estrutura análoga e faz-se referência a este respeito, apenas a titulo de ilustração, à seguinte literatura:

(a) Y.S.Klausner e M. Bodanszky, Bioorg.Chem.

( 1973 ), 2, p 354-362.

( b) M. Bodanszky, C. Yang Lin a S.I.Said, Bioorg. ghem. ( 1974 ), 3, p 320-323.

(c) S.R. Pettit, * Synthetic Peptides " , (Elsevier Scientific Publishing Co. 1976 ).

(d) Stewart e Young, “ Solid Phase Peptides Synthesis"

( W.H. Freeman and Co. 1969 ).

(e) E. Atherton, C.J. Logan e R.C. Sheppard, J.C,S.

Perkin I , ( 1981 ) p 538-546.

(f) E. Brown, R.C. Sheppard e B.J. Williams, J.C .S.

Perkin I, ( 1983 ) p 1161 - 1167.

0 presente invento proporciona também um péptido ou análogo do presente invento que tem sido preparado sinteticamente .

Um péptido ou análogo do presente invento pode, por exem pio, ser formado através do acoplamento sequêncial de amino ácidos apropriados ou através da preparação inicial e acoplamento subsequente de subunidades de péptido, elas próprias preparadas por fases, em ambos os casos tanto podem utilizar-se cs processos químicos de solução clássica de síntese de péptido como os processos de fase sólida.

As reacçóes de acoplamento podem ser efectuadas através de, poe exemplo, da activação do grupo carboxilo de reacção

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do amino ácido de entrada, e faendo reagir este com o grupo amino da unidade de substrato. Na literatura acima referida podem encontrar-se pormenores de grupos apropriados, opcional- mente de activação e protecção ( máscaras ) e de condições de reacção apropriadas ( para as reações de acoplamento e para a introdução e remoção de grupos protectores ), dando, de preferência, o mínimo de recemisação.

Consequentemente o presente invento proporciona ainda um processo para a preparação de um péptido ou análogo do presente invento, que compreende o acoplamento de um amino ácido ou sequência de amino ácido apropriada em que o grupo carboxi- lo é activado com um amino ácido ou sequência de amino ácido apropriada e repetindo, se necessário, o processo de acoplamento até que se obtenha um péptido que compreenda, em sequência, unidades escolhidas dos resíduos de amino ácido 11 a 23 de PIV que consistem, pelo menos, nos resíduos de amino ácido 15 a 20, ou um seu análogo em que um ou mais dos resíduos de amino ácido é substituido por um outro amino ácido equivalente, em que, se se desejar ou for necessário, se protegem grupos funcionais não reactivos durante o processo de acoplamento e, se se desejar, se desprotegem subsquentemente.

Assim, pode preparar-se um polipéptido de fórmula geral I faendo reagir um reagente da fórmula geral

H - y¹ - OH

( II )

em que

Y^· representa uma unidade de amino ácido ou uma sequência de radical parcial idêntica à unidade de amino ácido de terminal N correspondente ou uma sequência de radical parcial na fórmula I,

Com um reagente da fórmula geral

Η - Y² - OH (III

(III)

2

Y representa uma unidade de amino ácido ou uma sequência de radical parcial idêntica à do equi- 11

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librio do péptido do produto acima definido, sendo os reagentes (ll) e (líl) opcionalmente protegidos e/ou activados onde e quando apropriado, segundo se se desejar ou se for necessário por uma ou mais das fases seguintes:

- desprotecçâo dos produtos;

- conversão de um términus carboxi noutro términus carboxi,

- conversão de um péptido livre num seu sal.

Por exemplo, um éster de péptido apropriado da fórmula

geral

X _ x¹ _ x² _ OR (IV)

em que X, Y e Y possuem os significados dados acima, e R representa, por exemplo, um grupo alquilo e, de preferência, um grupo alquilo que possui de 1 a 4 átomos de carbono, podem ser convertidos numa amina através da reacção com amónia.

Os compostos de fórmulas gerais II, III e IV podem, eles próprios, ser preparados por técnicas padrão análogas às acima descritas.

Apreciar-se-á que formas protegidas de um péptido ou aná logo do presente invento são novos intermediários úteis e for mam um aspecto do invento.

Um péptido ou análogo do presente invento pode também ser preparado num suporte de fase, sólida, por exemplo, uma poliamida ou uma resina de poliestireno, utilizando amino ácidos protegidos no terminus N, por exemplo com o grupo fluorenilmetiloxicarbonilo ou com o grupo T-butiloxicarbonilo e com protecção apropriada de quaisquer grupes funcioanis de cadeia lateral.

Um tal esquema de reacção para a síntese de péptido de fase sólida é, por exemplo, ilustrada a seguir.

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Esquema de Fase Sólida
	Resina
A .A. = Amino ácido t-BOC = T—Butiloxi— carbonilo Fmoc = Fluorenil- >	*	Fmoc-A ,A . (1) ou t-BOC-A.A. (1)
metiloxi- Fmi carbonilo,	□c	(or t-BOC) A.A .(l)Resina
isto é, H-A í\| \| \|\| I Ί	f' .A. *·	Desprotecção (l) - Resina Acoplamento com Fmoc-A. A, (2) act ivado
^Fm( ÍT^CHg-O-C-	3C -	A.A. (2) - A.A. (l)-Resin«i Desprotecção

ό H-A.A. (2) -A.A.(l) - Resina

Repetição de fases de acoplamento e desprotecção

'^z até que se obtenha o pêptí do necessário.

Ψ

Péptido-Resina Protegida

Péptido

Clivagem e desprotecção de resina

desprotegido

Esta técnica envolve a adição do primeiro amino ácido protegido a um suporte de resina. Após remoção do grupo protector ( desprotecção ) o amino ácido-resina é acoplado ao amino ácido protegido seguinte na sua forma activado. Os processos de desprotecção/acoplamento são repetidos até se obter o péptido necessário.

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O péptido é, em seguida, separado da resina antes da remoção final dos grupos protectores. Em alternativa, quando se desejar ou for necessário, os grupos protectores podem ser removidos antes da clivagem do péptido da resina.

Vantajosamente o grupo Fmoc ê a forma de protecção utilizada para a função - amino dos amino ácidos envolvidos ( mas não para protecção de cadeia lateral ).

No entanto, o último amino ácido em cada síntese é geralmente protegido como o seu derivado T-BOC ou FMOC. Isto permite que o péptido permaneça completamente protegido na clivagem da resina.

A utilização de resinas alternativas pode também necessitar da remoção de grupos protectores antes da clivagem da resina. Neste caso o grupo protector Fmoc seria utilizado, de modo semelhante na protecção alfa-N em toda a sintese.

Os péptidos e análogos do presente invento possuem acti vidades relaxante do músculo liso tal como acções gastro-intestinal, broncodilatora e vasodilatora e, além disso, activi dades anti-úlcera. Podem ser úteis para evitar a dor e a cons tipaçâo encontradas frequentemente nalguns pacientes com síndroma de intestino irritável (SIl) e pode ser uma nova aproximação útil para a terapia da úlcera duodenal.

0 presente invento proporciona ainda um péptido ou análogo do presente invento, para utilização num processo de tratamento do'corpo humano ou animal. Onde o fragmento ou análogo é na forma de um seu sal, deverá evidentemente, compreender-se que é um sal fisiologicamente tolerável que ê farmaceuticamente aceitável.

0 péptido ou análogo do invento pode ser administrado per se ou, de preferência, como uma composição farmacêutica que compreende também um veículo farmaceuticamente apropriado.

Consequentemente, o presente invento proporciona uma composição farmacêutica que compreende um péptido ou análogo de acordo com o presente invento, em mostura ou em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

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A preparaçSo pode, se se desejar, ser na forma de uma embalagem acompanhada de instruções de utilização escritas ou impressas.

De acordo com uma prática farmacêutica convencional, o veículo pode compreender um diluente, recheio, desintegrante, agente molhante, lubrificante, corante aromatizante ou outro aditivo eonvencional.

De preferência, numa composição farmacêutica de acordo com o presente invento é na forma de unidade de dosagem.

A gama de dosagem apropriada para compostos do presente invento pode variar de composto para composto e pode depender da condição a ser tratada. Dependerá também, inter alia, da relação de potência para absorbabilidade e da forma de administração escolhida.

Formulações apropriadas são, por exemplo, infusões intravenosas, aerossóis e cápsulas entéricas revestidas.

0 presente invento proporciona ainda um processo de tratamento de um animal humano ou não humano, que compreende a administração de uma quantidade eficaz, não tóxica, de um péptido ou análogo de acordo com o presente invento para um animal humano ou não humano e um péptido ou análogo de acordo com o presente invento para utilização como um produto farmacêutico, em particular, para o tratamento de perturbações e doenças descritas a seguir:

Um péptido ou análogo, de acordo com o presente invento pode ser utilizado para tratar as seguintes perturbações e doenças; anomalias da mobilidade dos intestinos, por exemplo hipermobilidade como no SII ou espasmo esofágico; alceração péptica; espasmo bronqueai; condições vasculares tais como hipertensão e isquemia e perturbações mentais.

Apropriadamente, o ingrediente activo pode ser adminis· trado como uma composição farmacêutica anteriormente descrita, e isto representa um aspecto particular do presente invento.

Uma dose apropriada é, por exemplo, na gama de 1 ug a

2,5 mg/Kg i.v. no rato.

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Uma dose diária possivel para seres humanos é, por exemplo, 0,01 a 50 mg por infusão intravenosa, 0,01 a 250 mg por aerosol ou 0,1 a 500 mg por cápsula entérica revestida.

Não são indicados efeitos toxicológicos prejudiciais nas gamas de dosagem anterioemente mencionadas.

No que se segue, os vários grupos protectores derivados reagentes e solventes são referidos como abreviaturas por conveniência.

Derivados, Grupos Protectores, Reagentes, Solventes	Designação Abreviada
Terciário - butilo	+· Bu
Terciário - butiloxicarbonilo	t-BOC
Éster de N-hidroxisuccinimida	0SU
Éster de Methilo	OMe
Acido Trifluoroacético	TFA
Diciclohexilcarbodimida	DCC
Benxiloxicarbonilo	CB2
Dimetilformamida	DMF
Tetrahidrofurano	THF
Éster de p-Nitrofenilo	ONP
Sal cloridrato	.HC1
Acetato de étilo	EtOAc
Metanol	Me 0H
Acetato de amónio	nh₄oac
1-Hidroxibenzotriazola	HOBT
Clorofórmio	chci₃
Piridina	Pyr
n-Butanol	BuOH
hidróxido de amónio	nh₄oh
Carbonato de Hidrogénio de sódio	NaHC0₃
Cloreto de sódio	NaCl
Éter	Et₂O
Sulfato de Sódio	Na₂S0₄
Hidróxido de potássio	Κ0Η
Acido acético	AcOH

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T.L.C. ( Merck) placas de silica gel ) com sistemas de solven te E₄ MeOH—CHClg ( 1: 9)

H n-BuOH : AcOH : Pyr : H₂0 ( 15: 3 : 10 : 12 )

A₃ n-BuOH : AcOH : HgO (4:1: 1 )

Exemplo I

H-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-NH₂

A amida hexapéptida (v) foi preparada como se ilustrou no Esquema I e os pormenores experimentais são dados a seguir

X

t-t

N Φ N Φ m £ ro 2 o o. o

N (D « dl « WN WN Cl m s ks mg mK mg o o 00 OZ Og o is

CM

CC

ro

cc

2

co

í

H

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t-Boc-Val-Lys-(CBZ)-OMe (VI)

Uma mistura de t-Boc-Val-Osu ( 3,14, 10 moles) e H-Lys (CBZ)-0CH₃. HCL ( 3,31g , 10 moles ) em THF ( 300 ml ) foi tratada à temperatura ambiente com trietilamina ( 1,38 ml ) e deixada agitar durante 17 horas. A solução resultante foi evaporada em vácuo e o resíduo foi dissolvido em B+OAc (500ml).

A solução orgânica foi lavada sucessivamente com água (2x200 ml), 5% de ácido cítrico ( 2x200 ml ), âgua ( 2x 200 ml) e seca sobre Na₂ SO^. A solução seca foi filtrada evaporada in vacuo para produzir o produto (VI) (4,98; 99% ) como uma espuma. T.P.C. Rf E^= 0,64.

Trifluoroacetato de H-Val-Lys-(CBZ)-OMe (VII)

0 dipéptido protegido (VI) (4,9 g, 10 moles ) foi dissolvido em TFA ( 20 ml ) e agitado durante 10 minutos â temperatura ambiente. A solução foi evaporada in vacuo, azeotropizada com tolueno ( 2 χ 20 ml ) e triturada com EtgO (2x50 ml). Os líquidos originais foram decantados para deixar o depéptido parcialmente como o sal trif luoroacetato VII (2,41 g; 51% ) RfE₄ = 0,22.

t - Boc - Ala -Val-Lys (CBZ)-OMe (VIII)

Adicionou-se o produto (VII) ( 2,4g, 6,1 moles ) a tBoc-Ala-ONP ( l,9g, 6,1 moles ) em THF ( 50 ml ) contendo trietilamina ( 0,85 ml ). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 dias, evaporada em vácuo e dividida entre BtOAc ( 250 ml ) e água (100 ml ). A camada orgânica foi lavada sucessivamente com 0,45 M NH^OH ( 4x50 ml ), 2% de ácido cítrico ( 4χ 50 ml ) e âgua ( 4x50ml ). A camada orgânica foi seca sobre Na^so^, filtrada e evaporada in vacuo. 0 resíduo foi recristalizado a partir de ETOAc-hexano para dar o produto (VIII) ( 1,62 g; 47% ) como um incolores microcristais p.f. 1042ClfC] - 482C ( 0=1, MeOH ) .

t-Boc-Ala—Val-Lys (CBZ)-NH₂ (IX)

- 18

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Adicionou-se o produto (VII) (2,0g. 35 moles ) a uma solução de amónia (ca.50ml) em metanol ( 50 ml ). A mistura foi mantida num recipiente de pressão vedado durante 24 horas e em seguida evaporada até à secura. 0 resíduo foi tomado em EtOAc, evaporado até à secura e triturado com EtgO para dar o produto (ix) (l,75g; 90% ) como microcristais incolores p.f. 195-196SC - 43,83 (c»l,MeOH ).

Trifluoroacetato de H-Ala-Val-Lys (CBZ)-CH₂ (x)

A amida tripéptida protegida (IX) (l,0g, 1,8 moles )fo:. dissolvida em TFA frio ( 10 ml ). Após 10 minutos a mistura foi evaporada in vacuo e o resíduo foi triturado com éter (2x50 ml ). Os líquidos originais foram decantados e o resíduo foi seco sob vácuo para dar o produto (X) como uma espuma (0,85 g; 83% ).

t-Boc-Gln-Nle-OMe (XI)

Adicionaram-se t-Boc-Gln-ONP ( 12,3g, 32 moles ) e HOBT ( 5,0g, 37 moles ) a uma solução de H-Nle-OMe-HCl (5,99 g, 33 moles ) e trietilamina ( 4,9 ml ) em DMF ( 55 ml ).

A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, adicionou-se EtOAc (100 ml ) e a fase orgânica foi lavada com 2% de ácido cítrico 0,45M NH^OH até estar livre de nitrofenol, 5% de NaHCOg, 2% de ácido cítrico, água até à neutralidade, e uma solução saturada de Nacl. A solução foi seca sobre Na₂S0₄, filtrada e concentrada in vacuo. Adicionou-se êter de petróleo ( Gpt 40-602C ), filtrou-se o precipitado, lavou-se com o mesmosolvente e secou-se in vacuo sobre sílica gel para dar o produto (xi) ( 10,2g, 85% ) mpt 1O8-1O9SC,

14,893C (C=1,DMF ), T.L.C. RfA^ 0,72.

Trifluorocetato de H-Gln-Nle-Ome ( XII)

0 éster dipéptido protegido (XI) (4,8g, 13 moles ) foi dissolvido em TFA frio ( 40 ml ). Após 10 minutos, o TFA foi removido in vacuo e adicionou-se éter seco ( 200 ml ). 0 éter foi decantado e o residuo foi lavado com mais êter (100 ml ). 0 material oleoso foi seco sobre KOH para dar o produto (XII) como uma espuma branca que foi utilizada imediatamente T.l.c. RfA₃= 0,42.

BOC-Lys (CBZ)-Gln-Nle-OMe (XIII)

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10

Dissolveram-se sal de H-Gln-Nle-OMe TFA ( Xll) (13 moles) trietilamina ( 1,76 ml, 13 moles ), HOBT (2,l6g, 16 moles ) e BOC-Lys-(CBZ)-ONP (7,6g,15 moles ) em DMF (30 ml ). A mistura de reacçao foi mantida básica com pequenas quantidades de trietilamina. A mistura foi agitada durante a noite à tempera tura ambiente, concentrada in vacuo e tratada com dimetiletils nodiamina assimétrica ( 2 equiv. ). Após 2 horas,adicionou-se StOAc e o produto foi isolado como se descreveu para o compos to (XI).

0 sólido foi lavado com éter de pretóleo ( Gpt 40-602C ) eseco in vacuo sobre silica gel para dar o produto (XIII) (5,5g; 65%) - 16,492 (C=1,DMF) T.l.c. RfA₃ 0,8.

BOC - Lys (CBZ) - Gin - Mie - NHNHg (XIV)

15

20

0 éster de metilo tripéptido (xm) (lg, 1,6 moles) foi suspenso em DMF ( 5ml ) adicionou-se hidrazina ( 0,8 g,O,78ml 16 moles ) e a mistura foi agitada durante a noite.

0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi solidificado utilizando MeOH/EtOAc para dar o produto (XIV) (0,9g, 90% ) T.P.c. RfA₃= 0,70. Utilizou-se o mesmo imediatamente na fase seguinte.

t-BOC-Lys-(CBZ)-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-(CBZ)-NHg (XV)

25

30

Dissolveu-se o produto (XIV) (O,58g, 0,9 mole ) em DMF anidro ( 18 ml ) e arrefeceu-se para -3O2C. Adicionou-se 4,56 M HCP em dioxano ( 0,90 ml ) seguido de nitrito de t-butilo (0,12 ml ). A reacção foi deixada durante 30 a 40 minutos a -302C e em seguida arrefecida para -602c . Adicionou-se trietilamina (0,60 ml ) seguida da amina desprotegida (x) (0,68 moles ) e uma outra adição de trietilamina ( 0,1 ml ). A mistura (m) foi deixada repousar, atingindo a temperatura ambiente, durante 2 dias. Uma outra quantidade do produto (XIV) (0,29 g , 0,45 moles ) em DHF ( 10 ml ) foi tratada a - 302c com 4,5 M MCI em dioxano ( 0,45 ml ), T-butilnitrito (0,06 ml) e trietilamina (o,3 ml ) como acima se cescreveu e adicio nada à mistura de reacção (M) a -302c.

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Deixou-se tudo a repousar, atingindo a temperatura ambiente, durante mais 4 dias.

A mistura foi evaporada in vacuo e o resíduo foi triturado com EtOAct MeOH (líl) ( 50 ml ) para dar o produto'(XV) (O,62g;85% ) como um sólido acinzentado.

H-Lys-Gln - Nle -Ala - Vai Lys - Nh₂ (V)

0 hexapéptido protegido (XV) (0,2g, 0,2 mole ) foi dissolvido em TFA (5 ml) e tratado com gás HBr durante 1 hora.

A mistura foi evaporada in vacuo e triturada com StgO (2x50 ml ) para dar o produto (v) como um sal bromidrato (0,13g RfH= 0,14 . Esta e uma quantidade subsequente do produto foram purificadas por adsorçâo numa coluna de permenta de ião (CM 25 Sephadex, Pharmacia ) que foi lavada com 10-100 moles de NH^OAc a pH7. 0 produto foi eluído com 100 moles de NH^OAc a pH 8,5. A liofilização e o subsequente HPLC preparativo juBondapak ODS; CH^CN: 50 moles NH₄0Ac (aq) (15:85) deu o produto V como um sal acetato (0,15g) p.f. 253-2552C T.L.c. RfH=0,14, MH+ (FAB )=685.

Exemplo 2

Acetato de H-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-NHg (XVI)

A amida octapéptida (xvi) foi preparada como se ilustram no esquema II e os pormenores experimentais são dados a seguir.

t-Boc - Lys - (CBZ) - Lys - (CBZ) - OCH₃ (XVII)

Uma mistura de t-Boc-Lys - (CBZ)-OH (l,14g,3 moles ), Lys - (CBZ)-0CH₃. HCL ( 0,99g, 3 moles ), DCC ( 0,62 g, 3 moles). HOBT ( 0,41g, 3 moles ) e trietilamina ( 0,42 ml ) em DMF de amina livre seco ( 20 ml ) foi agitada durante 17 hora A transformação tal como se descreve para VI deu o produto XVII ( 1,2 g; 61 % ) como um microcristais incolores, p.£g 109-1102 ( éter de petróleo de acetona-leve 40-602C ) =

-11,92 ( C= 1 MeOH ) RfE^ = 0,71.

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Trifluoroacetato de H-Lys-(CBZ)-Lys-(CBZ)-OCH₃ (XVIII)

0 dipéptido protegido (XVII) (l,8g,2,7 moles ) foi parcialmente desprotegido como fora VII para dar o produto XVIII como uma espuma ( 1,8 g; 99% ) RfE₄= 0,22.

t-Boc-Val-Lys- (CBZ)-Lys-(CBZ)-0CH₃ (XIX)

Uma mistura de t-Boc-Val-Osu (O,86g 2,7 moles ), do produto XVIII (l,8g, 2,7 moles ) e trietilamina (0,4 ml) em THF ( 50 ml ) foi agitado, sob Ng, durante 2 dias: A transformação, sonforme se descreveu para VI deu o produto XIX (l,25 g; 60% ) como microcristais incolores, p.f. 145-1472 (ex EtoAc ) RfE₄ = 0,40 d⁶⁼ ~ ²⁴' ⁵⁹² ( ^{C= 1 Me0H}

Trif luoroacetato de H-Val-Lys-(CBZ)-Lys - (CBZ) - OCH₃ (XX)

0 tripéptido protegido XIX ( 2,16 g, 2,9 moles ) foi parcialmente desprotegido como para VII para dar o produto XX como um sólido escamoso ( 2,02 g · 92 % ).

Boc - Ala-Val-LyS-(CBZ)—Lys—(CBZ)—0CH₃ (XXl)

Uma mistura do produto XX ( 2,0g), Boc-Ala-ONP (l,0g,

3,2 moles), HOBT (0,80g) e trietilamina (0,50 ml) foi agitada à temperatura ambiente em DMF ( 5 ml ) durante 24 horas.

A mistura foi evaporada até l/4 do volume, e tomada em CHCL₃(100 ml). A solução orgânica foi lavada sucessivamente com 0,45 M NH₄ 0H (4 χ 50 ml ), 2% de ácido cítrico ( 4 χ 50 ml) e água ( 4 χ 50 ml ) . A camada orgânica foi seca sobre Na₂S0₄, filtrada e evaporada in vacuo até l/4 de volume. A solução foi cromatografada em Kieselgel 60 PFg^₄ ^num "^chrôniatotron" e o produto foi eluido com uma concentração aumentada de MeOH ( 0-5%) em CHCL,, para dar o produto XXI ( l,98g;

*3 Γ 26

84% ) como microcristais incolores, p.f. 175-177² [Kj_D = -36,89 ( Ol MeOH ) . MH+ = 827 (FAB).

Boc - Ala - Val - Lys - (CBZ) - Lys - (CBZ) - NHg (XXIl)

0 produto XXI ( l,78g, 2,2 moles ) foi adicionado a uma solução de amónia ( Ca. 50 ml ) em metanol ( 50 ml ).

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A mistura foi mantida num recipiente vedado durante 48 horas. 0 precipitado resultante foi filtrado, lavado com EtgO seco para dar o produto XXII ( l,78g; 98% ) como microcristais incolores , p.f. 243-2442.

Trifluoroacetato de H-Ala-Val-Lys-(CBZ)-Lys-(CBZ)-NH₂ (XXIII)

0 tetrapêptido protegido XXII ( 1,75 g, 2,2 moles ) foi suspenso em ácido acético ( 3ml), arrefecido para 102 e trata do com TFA ( 9ml ). A solução foi agitada durante 20-25 minutos. A transformação tal como se descreveu para VII deu o pro duto XXIII ( l,71g ) RfE_T= 0,7.

Η-Lys- (CBZ) - Gin - Nle - OMe ( XXIV )

0 éster de tripéptido protegido (XIII) (2,0g, 3 moles) foi dissolvido em TFA frio ( 12,6 ml ) e ácido acético glacial ( 5,4 ml ). Após 25 minutos, os solventes foram removidos in vacuo a adicionou-se éter seco ( 100 ml ). 0 éter doi decantado e o resíduo foi lavado com mais éter (100 ml). 0 material oleoso foi seco in vacuo sobre KOH para dar o sal trifluoroacetato do produto (XXIV) como uma espuma branca. A espuma foi dissolvida em água ( 40 ml ) e adicionou-se uma solução fria de carbonato de sódio (0,15 ml ) em água (10 ml).

A base livre foi extraida em acetato de etilo (100 ml, em seguida 4 χ 30 ml ) e esta fase orgânica foi lavada com água ( 2 x 20 ml ), com NaCP saturado ( 20 ml ), seca sobre Na₂S0₄, filtrada e evaporada in vacuo para dar o produto XXIV ( l,5g; 89% ) . T.L.C. Rf = 0,3 em 30% de MeOH/CHCL₃.

BOC-Arg (H+)-Lys-(CBZ)-Gin - Nle - OMe (XXV)

A amina livre(XXIV) ( l,5g, 2,8 moles ) foi dissolvida em DMF ( 9ml ).

A solução foi arrefecida, em seguida adicionaram-se BOC-Arg (H+) 0H (l,23g, 4,5 moles ), DCC (0,82g, 4 moles ) e HOBT ( O,57g, 4 moles ). Após 2 horas adicionaram-se porções adicionais de BOC-Arg (H+) 0H (0,45g, 1,6 moles ),DCC (0,3g,

1,5 moles ) e HOBT ( 0,2g, 1,6 moles) e a reacção foi deixada prosseguir durante 3 dias.

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A diciclohexilureia foi removida por filtração e lavada com DMF ( 3 χ 5 ml ). 0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi aplicado em metanol numa coluna Sephadex LH-20 (2,5 χ 100 cm ) pré-equilibrada com o mesmo solvente. Recolheram-se fracções de 5 ml a um ritmo de fluxo de lml/3 minutos. As fra cções que continham o produto desejado foram repartidas, evaporadas e recromatografadas sob as mesmas condiç^ões .

0 produto foi purificado mais uma vez em Kieselgel 60 Pf_ot.. utilizando um *’ Chromatroton " ( 20% de Me0H/CHCL„ como elmente) para dar o produto XXV ( 1,3 g; 56% nX]_D = -24,92 (C=l, MeOH ).

BOC - Arg-(H+)-Lys-(CBZ) -Gin -Nle —NHNHg (XXVI)

0 éster de metilo tetrapêptido (xxv) (l,3g, 1,6 moles) foi suspenso em metanol (6 ml) adicionou-se hidrato de hidrazina ( 0,8g, Q78 ml, 1,6 moles ), e continuou-se a agitação durante 6 horas. 0 produto foi filtrado, lavado com metanol frio ( 3 χ 10 ml ), âgua ( 8 χ 5 ml ), e seco in vacuo para dar o produto (XXVI) (l,2g; 92% ). 0 produto foi utilizado imediatamente.

Cloreto de BOC-Arg (H+) -Lys-(CBZ)-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-(CBZ)Lys-(CBZ)-NH₂ ( XXVII )

0 tetrapêptido protegido (XXVI) ( O,37g, 0,45 mole ) foi dissolvido em DMF anidro ( 5 ml ) e arrefecido para -302. Adicionou-se 4,56 M HCL em dioxano (0,45 ml) seguido de Tbutilnitrito ( 0,06 ml ). A reacção foi deixada durante 30-40 minutos a -309 e, em seguida, arrefecida para -609. Adicionou-se trietilamina (0,30 ml ) seguida pela amida desprotegida XXIII ( 0,28g, 0,3 mole ) e mais uma adição de trietilamina (0,05 ml ). A mistura M₂ foi deixada repousar, atingindo temperaturas ambientes, durante 2 dias. Tratou-se mais uma quantidade do produto XXVI ( 0,21g, 0,26 mole ) em DMF (5 ml) a - 302 com 4,5βΜ HCL em dioxano ( 0,25 ml ), nitrito de Tbutilo (0,04 ml ) e trietilamina ( 0,17 ml ) como se descreveu acima e adicionou-se à mistura de reacção M₂ a - 302 c.

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Deixou-se repousar tudo, atingindo a temperatura ambiente, durante 4 dias.

A mistura foi tratada com metanol e contrifugou-se.

0 sólido resultante e os líquidos originais mostraram ambos que continham o produto desejado (XXVIII) (l,25g) MH+=1471 (FAB).

Acetato de H-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Iíys-Lys- NH₂ (XVI)

0 octapéptido protegido (XXVII) ( l,25g, 0,85 mole) foi dissolvido em TFA a 10S e tratado com gás de brometo de hidrogénio durante 2 horas.

Toda a mistura foi evaporada in vacuo, triturada com éter ( 4 χ 15 ml ) e filtrada para dar o péptido livre como o seu sal bromidrato ( l,0g). 0 péptido foi purificado com a concomitante conversão para um sal acetato, XVI (o,22g) (mh+ (fab) = 969 ) do mesmo modo que se descreveu para (v) .

25 -

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Esquema II

H	H	H
H	K				H	H	H
H	H	X			t—1	H	>	H
>	>	H	X	X	X	X	X	>
	X	X	X	X	X	X	X	X

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1 Péptidos sintetizados de Fase Solida

a)

10

15

Os exemplos seguintes foram sintetizados por processos de fase sólida utilizando o derivado 4-hidroximetilbenzoilnorleucilo resina de gel de polidimetilacrilamida Pepsina B (l,Qm equiv/g ou O,3m equiv/g ) como fornecido por Cambridge

Research Biochemicals Ltd.

O DMF foi destilado fraccionadamente in vacuo a partir de ninidrina antes de utilizar e armazenado em peneiras molecu lares pré-activadas (4A). A piperidina foi destilada de novo a partir de um agente secante apropriado. Secou-se diclorometano (A.R) em peneiras moleculares pré-activadas (4A).

Os amino ácidos foram escolhidos como os seus derivados Fmoc com protecção de cadeia lateral BOC-ou-t-Bu-quando necessário.

20

I

25

30

35

0 anidrido simétrico do primeiro amino ácido (2,5 equiy ( preparado conforme descrito por E. Brown e outros em J.C.S. Perkin I, 1983,80) foi adicionado à resina (l equiv) em DMF (10-15 ml ) na presença de uma quantidade catalítica de dimetil aminopiridina. A mistura foi agitada com N₂ e a reacção foi deixada prosseguir durante 1 hora. A resina foi drenada e repetiu-se o processo de adição. A resina drenada foi, em seguida, lavada com DMF ( 10-15 ml χ 1 minuto χ 10 ).

Conseguiu-se a remoção dos grupos protectores Fmoc por agitação do péptido-resina com piperidina ( lOml; 20% em DMF) durante 3 minutos e, em seguida 7 minutos.

A adição subsequente de cada amino ácido foi efectuada utilizando os anidridos de amino ácidos simétricos Fmoc (2,5 equiv) ou o éster hidroxibenzotriazola pré-formado (3,0 equiv) ( do amino ácido-Fmoc, DCC e HOBT ).

Os amino ácidos que contem cadeias laterais amídicas (por exemplo Gin ou Asn ) foram acopladas como os seus ésteres activados p-nitrofenilo (3,0 equiv) na presença de hidroxiben zotriazola ( 6,0 equiv ).

A Fmoc-Arginina foi acoplada à resina péptida através

_ 97 _

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do seu éster hidroxibenzotriazola. Este foi preparado através da suspensão Fmoc-Arginina (10 equiv) em DMF (10 ml ) e adicionado HOBT (30 equiv).

A solução limpida foi adicionada à resina e agitada durante 1 minuto. Em seguida adicionou-se DCC ( 10 equiv ) e a rea cção foi deixada prosseguir até estar completa.

0 amino ácido final na sequência escolhida foi adicionado como o seu derivado N Boc tanto como o anidrido simétrico ou como o éster de hidroxibenzotriazola pré-formado.

A Boc-Arginina foi acoplada como o seu cloridrato e activado através da adição de DCC ( 5 equiv ) ao sal cloridrato protegido (10 equiv ) em DMF ( 10-15 ml ) 5 minutos antes da adição de toda a mistura de reacção ao péptido-resina (1 equiv).

Nalguns casos, os anidridos de amino ácido-Fmoc (eg Phe, Ala, Gly) precipitaram em conjunto com DCV durante a sua formação. Nestes casos, os anidridos foram preparados na presença de 10% de DMF em diclorometano.

0 diclorometano foi removido in vacuo antes da adição de toda a mistura à resina de péptido.

0s acoplamentos foram, em geral, efectuados durante 1-2 horas e repetidos, se necessário. Verificou-se que a acilação estava completa através de um ensaio de ninidrina Kaisser con forme descrito por E. Kaiser e outros em Anal. Biochem.(1970) p. 34.

A clivagem de péptido a partir de resina foi completada através da amonolise para proporcionar a amida de péptido protegida. Para este fim, quando se completou o acoplamento finaL o péptido-resina foi lavado com DMF (10-15 ml χ 1 minuto χ 10) diclorometano anidro ( 10-15 ml χ 1 minuto χ 10) e éter seco (10 ml χ l minuto χ 10 ). A resina separada foi seca sobre sílica gel durante 1 hora num dissecador de vácuo: A resina foi reaumentada como se descreveu previamente, drenada e tratada com uma solução saturada de amónia em metanol a -102,

0 recepiente foi vedado e deixou-se que atingisse temperaturas ambiente durante 2 dias.

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O aparelho foi arrefecido, aberto e o conteúdo foi deixado aquecer à temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada sob secção e o resíduo resultante foi lavado com metanol (5 χ 5ml) e DMF ( 5x(ml). As lavagens combinadas e filtradas foram evaporadas in vacuo. 0 residuo resultante foi triturado com éter seco e filtrado para dar o péptido protegido.

0 processo de desprotecção acidoletica final removeu todos os grupos protectores ( por exemplo B0C,T-Bu ) da amida péptida. Assim, o péptido protegido foi dissolvido em ácido trif luoroacét ico ( 4 ml/lOOmg de péptido) e agitado à. temperatura ambiente durante 3 horas. Nalguns casos, o gas brometo de hidrogénio foi borbulhado através da mistura durante este tempo. A.mistura foi evaporada in vacuo e o sólido resultan te foi triturado com éter seco ( 7 χ 5 ml ) para dár o péptido desejado tanto como o seu trifluoroacétato ou como o seu sal bromidrato.

Os pêptidos foram purificados por um processo ou por uma combinação de processos descritos a seguir.

a) Conversão para sal de acetato.

0 sal de péptido foi dissolvido numa quantidade minima de âgua e feito passar sob uma forte resina de permuta de anião que estava na sua forma de acetato ( por exemplo Sephadex qAE-A-25 ). 0 eluente foi fraccionado e as fracções que

continham os materiais desejados foram liofilizadas.

b) Cromatografia de adsorção selectiva

0 sal de péptido foi dissolvido numa quantidade minima de água e adsorvida numa resina fraca de permuta de catião ( por exemplo Sephadex CM-25). 0 acetato de péptido foi recuperado durante a eluição com concentração aumentada de NH^OAc ( 0,05 M-0,5 M ) a pH7, um gradiente de aumento de pH ( pH7-pH9) ou uma combinação de ambos.

c) Cromatografia Liquida de Elevado Desempenho. HPLC

0 péptido foi purificado por meio de HPLC de preparação de colunas de silica C^g em fase inversa ( por exemplo ), ubonda pak Hypersil ODS).

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Os péptidos foram caracterizados por clivagem acidolíticc de 24 horas e análise derivada de amino ácidos PITC ( sistema waters Picotag) e espectometria de massa de bombardeamento rápido de átomo (FAB) (jeol Dx3O3).

Exemplo 3

Acetato de H-Lev-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-NH₂

xxvm

0 produto XXVIII foi praparado utilizando a resina Popsina B 0,3 mequiv./g.

|MHj+ = 1081 (FAB).

Análise de amino ácido. Gin (1,0) Arg (l,0) Ala (1,0)

Vai (0,88) Nle (1,0) Leu (l,0) Lys (2,88).

Exemplo 4

Acetato de H-Lys-Gln-Nle-Ala-Leu-Lys-Lys-NH₂(xxix)

0 produto XXIX foi preparado utilizando a resina Pepsina B 1,0 mequiv./g (fab) = 699. Análise de amino ácido;

Glu (0,9), Ala (0,8), Leu (0,8), Nle (0,8), Lys (1,8).

Bxemplo 5

Acetato de H-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-0rn-NH₂ (XXX)

0 produto XXX foi preparado utilizando a resina Pepsina B 1,0 mequiv/g [μη| ⁺ (FAB) = 671. Análise de amino ácido;Glu (1,01), Ala (0,9), Vai (0,8), Nle (l,l), Lys (1,0), Orn (l,l) , Exemplo 6

Acetato de H-0rn-Gln-Nle-Ala-Val-0rn-NH₂ (XXXI)

0 produto XXXI foi preparado utilizando a resina Pepsina B de 1,0 mequiv./g⁺ (FAB) = 657.

Exemplo 7

Acetato de H-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Lys-NH₂ (XXXII)

0 produto XXXII foi preparado utilizando a resina Pepsina B 1,0 mequiv./g jWJ ⁺ (fab) = 685.

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Exemplo 8

Acetato de H-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-LeuNHg (XXXIII)

0 produto XXXIII foi preparado utilizando a resina de Pepsina B 0,3 maquiv/g. jjffi] ⁺ (FAB) = 1245.

Exemplo 9

Acetato de H-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH₂

(XXXIV)

0 produto XXXIV foi preparado utilizando a resina de Pepsina B 0,3 mequiv/g (FAB) = lo89.

b) Utilização do sintetizador de Péptido 990B modelo Beckmann

0 exemplo seguinte foi sintetizado utilizando éster de resina de leucina. Este foi preparado por intermédio da reacção de resina clorometilada ( 3,5g, 0,7 mequiv. dg”¹; 1% de estireno/ divimildenzeno de ligação cruzada, tal como fornecido por Merseyside Laboratories ) a 5O2C, durante 17 horas, em DMF (40 ml) com o sal de césio anidro obtido a partir de monohidrato de BOC-L-leucina (0,5g, 2 moles). 0 éster de resina de BOC-L-leucina resultante foi lavado exaustivamente com DMF, DMF aquoso a 50%, H₂0, DMF e finalmente CH₂C1₂ e,em seguida, seco (3,68g; 0,22 mole leucina/g).

A remoção do grupo BOC ( de 3,6 g de resina) foi conseguida por intermédio da reacção com 50% de TFA em CH^CLg (50 ml) durante 5 minutos e, em seguida, 25 minutos. 0 sal de éster de resina de leucina foi lavado com CH₂CL₂ ( 7x50 ml), neutralizado com 10% de di-isopropilamina em CH₂CL₂ durante 5 minutos ( 3 χ 50 ml ) e lavado com CH₂CL2 ( 8 χ 50 ml ).

0 primeiro amino ácido da sequência necessária foi acoplado ao éster de resina de leucina, por intermédio do proces so seguinte:

Fizeram-se reagir êter de Fmoc-L-tirosina-t-butilo- (6 moles) e di-isopropilcarbodiimole (6 moles) com o éster de

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resina de leucina em CHgCLg/ DMF ( 35 ml ) durante 12 horas e, em seguida, o éster de resina Fmoc-Tyr-(Bu^t)-Leu foi lavado com CHgCLg ( 5 χ 50 ml ).

Para remover o grupo protector Fmoc, a resina de péptido foi lavada com DMF ( 5 χ 50 ml ), feita reagir com pipe ridina a 55% em DMF ( 50 ml ) durante 5 minutos, em seguida durante 20 minutos e, em seguida lavada com DMF (5 χ 50 ml ).

Os amino ácidos subsequentes de Fmoc foram acoplados, utilizando o processo acima descrito, excepto para a glutamina Fmoc que foi incorptrada utilizando o processo de pré-activação de HOBT/dcC de Kõnig e Geiger ( Chem. Ber., 103, 788-98 (1970)).

Os acoplamentos, em geral,foram efectuados durante 1-2 horas e, se necessário, foram repetidos. Verificou-se a acilação completa através de um ensaio qualitativo de ninidri na, conforme descrito por E. Kaiser e outros, em Anal. Bioclen, (1970) p. 34.

A desprotecção foi efectuada, por intermédio de reacção com piperidina em DMF a 55%, como acima descrito, seguida por reacção com uma mistura de TFA ( 45 ml), CH₂CL₂ ( 45 ml), anisola ( 10 ml) e metionina ( lg) durante 84 minutos. A resina de péptido foi, seguidamente lavada com CH₂CL₂ (5 χ 50 ml ) e seca.

A clivagem de péptido, a partir da resina, foi comple tada através de amonólise para proporcionar a amida de péptido. Para este fim, a resina de péptido foi agitada com metartí saturado de amónia (120 ml) durante 4 horas, filtrada e lavada com metanol.

A evaporação das lavagens combinadas, seguidas pela liofilização a partir de ácido aquoso, rendeu a amida dé péptido em bruto, a amonólise foi repetida se o spc de massa FAB demonstrou a presença de éster de péptido.

A purificação foi efectuada através de HPLC numa colu na Lichoprep RP8 ( 25 χ 1,6 cm ) com TFA aquosa a 0,1% (A) e 90% de acetonitrilo/ 10% de A (b) como um gradiente de 0% de

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B a 100% de B durante 60 minutos a 12 ml/ minuto.

Exemplo 10

Acetato de H-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leunh₂ (XXXV)

[mh| ⁺ (FAB) = 1007

Análise de amino ácido; Glu (0,92), Ala (0,92),Tyr (0,98), Val (0,99), Met )0,85), Leu (i,08), Lys (3,24). Exemplos 11 e 12

Os exemplos seguintes são preparados de acordo com os processos descritos para os exemplos 3 a 9.

H-Lys-Gln-Ala-Val-Lys-NH₂ (XXXVI)

H-Leu-Árg-Lys—Gln-Nle-Ala-Val-Lys-NH₂ (XXXVII)

Dados farmacológicos

I Mobilidade da Colónia

(a) In vivo

Anestasiaram-se ratos albinos machos de 3OO-5OOg estirpe, Wistar ( Charles River UK ) com uretano. Preparou-se um segmento proximal do Cólon para registo de pressão intraluminal segundo o processo de Maggi e Melli ( Maggi, C.A, e Malli, A. ( 1982 ) J. Pharmacol. Methods 8, 39-46) . A actividade do composto (v) foi avaliada a partir da sua acção na mobilidade espontânea da preparação após administração intravenosa. Verificou-se que o composto era activo a 3 umole/Kg.

(b) In vitro

Introduziram-se segmentos de músculos circular, cortados do cólon procimal de ratos, em solução "Krebs”, em banhos de tecidos isolados segundo os processos de Conture e outros, ( Conture R. et al. ( 1981), Con. J. Physiol. Pharmocol, 59, 957-964; e Conture R. et al ( 1982 ) , Pharmacol, 24, 230-242). A actividade do composto V foi avaliada a partir do efeito em respostas contrácteis espontâneas originadas por este tecido.

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_c

Verificou-se que o ED^₀ é de 10 M. II Actividade anti-ulcerosa

A actividade anti-ulcerosa pode relacionar-se com a capacidade aumentada para dispor do ácido gástrico. A capacidade de disposição do ácido pode ser aumentada através de secções intestinais aumentadas e crê-se que uma maior capacidade de disposição de ácido é util no tratamento da doença da fllcera péptida.

Processo para avaliar a capacidade de disposição de ácido

do duodeno procimal do rato.

Ratos machos ‘'Wilstar", com peso corpóreo de l80-250g, atados durante a noite foram anestesiados com uretano ( 150mg /lOOg de peso corpóreo i.m.). A traqueia é canulada, e uma cânula gástrica 0,5 cm i.d. com 3 cm de comprimento, é inserida no sentido longitudinal do estômago não glandular, através de uma incisão abdominal de linha média. A cânula intragástrica é exteriorizada através de uma prega enrolada na parede do corpo. Um cateter de triplo lumen 0,3 cm o.d., é passado via cânula gástrica, através do piloro. 0 duodeno é liga do 1 cm abaixo do piloro, e o piloro ligado em torno da cânula, criando assim uma bolsa de 1 cm do duodeno proEimal excluindo as secreções pancráticas e biliares. As duas ligaduras que envolvem a bolsa duodenal são colocadas de modo a evitar a oclusão da alimentação de sangue ao segmento do duodeno. Permite-se que as secreções gástricas sejam livremente drenadas da cânula gástrica.

Administram?-se os compostos dissolvidos em 0,9% de cloreto de sódio (salino) como uma infusão de 1,2 ml/hora através do catéter inserido numa veia jugular.

0 catéter de triplo lumen está ligado como se segue:

0 lumen entrega um meio de aspersão a 0,1 ml/minuto através de uma bomba peristaltica.

0 lumen 2 recolhe a aspersão e entrega-o a uma célula de fluxo que contem um pH microeléctrodo. 0 pH de fluxo de saida é registado em toda a experiência. 0 Lumen 3 está ligadc

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a um transdutor de pressão para monotorizar a pressão da bolsa intraluminal. A temperatura do corpo é mantida a 342C em todas as experiências.

Após a preparação, o segmento duodenal é aspergido com solução salinar ajustado para pH 6,5, com ácido cloridrico, durante 30 minutos.

0 meio de aspersão é, em seguida, mandado secessivamente para solução salina ajustado com ácido cloridrico para pH 4,3,

5,3 e 2,5 em ordem crescente de acidez. Cada solução ê aspergida durante 40 minutos. No final de cada período de infusão a pH 2,5, perfusou-se salina a pH 6,5 durante 30 minutos, e repetem-se as séries descendentes de pH. Este processo produz duas séries de valores de pH de entrada e de pH de saída, designados 12 e 22 passos.

Utilizou-se um grupo de 6 aminas, ou mais e comparou-se o efeito dos compostos no pH de saida para controlo de dados determinados .

Para comparações entre os grupos, utilizou-se o ensaio "Studenfs E".

Era significativo a PL 0,05.

0 composto do exemplo 4 provocou um aumento significativo na disposição de ácido no pH de entrada 3 e 2,5 no primeiro passo e pH de entrada 2,5 no segundo passo a uma dose de 150 nmol/Kg/hora e a pH de entrada de 2,5 no primeiro passo a uma dose de 30 nmol/kg/hora.

0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado na Grã-Bretanha em 1 de Novembro de 1984 sob o n2. 8427651.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

lã - processo para a preparação de um péptido que compreende, em sequência, unidades escolhidas de resíduos de amino ácidos 11 a 23 de Péptido Intestinal Vasoactivo (PIV) e que consiste, pelo menos, nos resíduos de amino ácidos 15 a 20, ounurn seu análogo em que um ou mais dos resíduos de amino ácidos é substituido por um outro amino ácido equivalente, ou por um seu sal farmacêuticamente aceitável, que compreende o acoplamento de um amino ácido apropriado ou uma sequência de amino ácido em que o grupo carboxilo é activado, com um amino ácido apropriado ou uma sequência de amino ácido e a repetição, se necessário, do processo de acoplamento até que se obtenha um péptido que compreende, em sequência unidades escolhidas dos resíduos de amino ácidos 11 a 23 do PIV que consiste, pelo menos, nos resíduos de amino ácidos 15 a 20, ou num seu análogo , caracterizado pelo facto de um ou mais dos resíduos de amino ácidos ser substituido por um outro amino ácido equivalente em que, se se desejar ou se fôr necessário se protegem grupos funcionais não reactivos durante o processo de acoplamento e se se desejar, se desprotegem subsequentemente e, facultativamente se forma em seguida um seu sal farmacêuticamente aceitável.

2ã - Processo para a preparação de um péptido, de acor do com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as unidades de amino ácido serem escolhidas de resíduos 13 a 23 ou 11 a 21 de PIV ou de um seu análogo, de acordo com a reivindicação 1.

3ã - Processo para a preparação de um péptido, de acoí do com as reivindicações l ou 2, caracterizado pelo facto de todas as unidades de amino ácido se encontrarem na forma L.

4ã - Processo para a preparação de um análogo de um péptido , de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de um ou mais dos resíduos de amino ácidos 15 a 20 ser substituido por um outro amino ácido equi

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valente e de quaisquer resíduos presentes de amino ácido corresponderem aos existentes em PIV.

- Processo para a preparação de um péptido ou análogo. de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o terminus carboxi do péptido ou análogo se encontrar na forma da amida não substituída.

6B - Processo para a preparação de um péptido ou análogo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de o términus amino do péptido se encontrar na forma da amida não substituída.

7^ - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um polipéptido da fórmula geral

X- (y >n-^Y15^Y16^Y17^Y18^Y19^Y2O-^(Y''

(I)

caracterizado pelo facto de

X representar um átomo de hidrogénio ou um grupo protector de amina, de preferência um átomo de hidrogénio;

(Y')_n representar uma ligação directa ou

^Y11^Y12^Y13^Y14 , ^Y12^Y13^Y14 ’ ^Y13^Y14 °^{U Y}14

em que

^Y11 representa Thr, Ser ou o resíduo de outro amino ácido hidroxi ,

^Y12 representa ^a Arg ou ° resíduo de outro amino ácido básico Y₁₃ representa Leu, Phe ou o resíduo de outro amino ácido hidrofóbico,

Y_l4 representa Arg ou o resíduo Y.^ representa Lys ou o resíduo

por exemplo Orn,

Y_l6 representa Gin ou o resíduo

mi do,

Yyj representa Met ou o resíduo tro, por exemplo Nle,

^Y18 representa Ala ^{ou 0} resíduo fôbico,

de outro amino ácido básico; de outro amino ácido básico, de outro amino ácido carboxa-

de um outro amino ácido neude um outro amino ácido hidro

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Y₁g representa Vai ou o resíduo de outro amino ácido hidrofóbico,

Y₂₀ representa Lys ou o resíduo de outro amino ãcido básico, por exemplo Orn,

(Y’’)_n representar uma ligação directa ou

^Y21 ’ ^Y 21 ^Y22 ^{OU Y}21 ^Y22 ^Y23

em que

^Y21 Lys ou o residuo de outro amino ácido básico,

Y₂₂ representar Tyr ou o resíduo de outro amino ácido hidrofóbico,

^Y23 ^reP^resentar Leu ou o resíduo de outro amino ácido hidrófico; e

Z representar um grupo hidroxilo, ou um grupo da fórmula OR de tal modo que COZ representa um éster ou um grupo hidra zino de tal modo que COZ represente uma hidrazida, ou NH₂de tal modo que COZ represente uma amida, de preferência NH₂; e seus sais, de preferência os seus sais fisiológicamente toleráveis especialmente os seus sais de adição de ácido fisiològicamente toleráveis.

8ã - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do hexapéptido

Lys Gin Y Ala Vai Lys ou

caracterizado