PT80443B

PT80443B - Gnrh antagonists vii

Info

Publication number: PT80443B
Application number: PT80443A
Authority: PT
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1984-05-21
Filing date: 1985-05-10
Publication date: 1986-12-15
Also published as: HUT37634A; JPS60260594A; JPH0725795B2; IL74827A; DK166214C; PH22655A; MX160995A; EP0162575A2; GR851205B; HU198089B; DK224985D0; EP0162575B1; EP0162575A3; NZ212124A; DE3583964D1; AU580598B2; PT80443A; DK224985A; AU4244785A; CA1302650C

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

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□ presente invento descreve a preparação de péptidos que inibem a libertação de gonadotropinas pela glândula pituitária em mamíferos, incluindo o homem, e processos para evitar a ovulação e/ou inibir a libertação de esteroides.

Mais em particular, o presente invento refere-se à preparação de páptidos que inibem a função gonadal e a libertação de hojr monas ester o idade, progesterona e testosterona.

A glândula pituitária está ligada por um infundíbulo à região da base do cérebro conhecida por hipotálamo. Em par ticular a hormona estimulante folicular (FSH) e a hormona luteinizante (LH), por vezes referidas como hormonas gonadotropinas ou gonadotrõpicas, são libertadas pela glândula pituitá ria· Estas hormonas combinadas regulam o funcionamento das gánadae para produzirem testosterona nos testículos e progesterona e estrogeno nos ovários, e também regulam a produção e maturação de gâmetae.

A libertação de uma hormona pelo lóbulo anterior da glândula pituitária exige uma libertação prévia de uma outra clasee de hormonas produzidas peio hipotálamo. Uma dae hormo nas hipotalàmicas actua como um factor que desencadeia a libertação das hormonas gonadotrõpicas, particularmente a LH, e esta hormona é aqui referida como GnRH ainda que também tenha eido referida como LH-RH e como LRF. A GnRH foi isolada e ca racterizada como um decapéptido com a seguinte estrutura:

p-Glu-His-T rp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

Os páptidos são compostos que contôm dois ou mais aminoácidos nos quais o grupo carboxilo de um ácido está liga do ao grupo amino do outro ácido. A fórmula da GnRH, acima representada, está de acordo com a representação convencional de páptidos onde o terminal amino aparece à esquerda e o grupo carboxilo terminal à direita. A posição do rselduo do amino ácido é identificada pela contagem de resíduos de aminoácidoe da esquerda para a direita. No caso da GnRH, a parte hidroxi.

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lo do grupo carboxilo da glicina foi substituída por um grupo amino (NH^)· As abreviaturas dos resíduos dos aminoácidos in dividuai8 acima indicadas são as convencionais e baseiam-se nos nomes comuns, em inglês, dos amino ácidos, p. ex· p-Glu á o ácido piroglutàmico, His á histidina, Trp 6 triptofano, Ser á resina, Tyr á tirosina, Gly á glicina, Leu á leucina, Orn é ornitina, Arg á arginina, Pro é prolina, Sar á sarcosina, Phe á fenilalanina e Ala á aianina. Estes amino ácidos juntamente com a valina, isoleucina, treonina, lisina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, cisteina, metionina, fenilalanina e prolina são em gerai considerados como os aminoácidos comuns, ocorrendo naturalmente ou derivados da proteina· Excepto para a glicina, os aminoácidos dos páptidos do invento estão na configuração L a não ser que se indique o contrário.

Há razães para desejar evitar a ovulação em mamíferos fêmeas e a administração da análogos ds GnRH que sejam an tagonietas da função normal da GnRH, tem sido usada para evitar ou atrasar a ovulação. Por esta razão estão a ser investigados os análogos de GnRH que sejam antagonistas da GnRH ps. lo seu uso potencial como contraceptivo ou para regular os p_e riodos de concepção. Os antagonistas da GnRH podem também ser usados no tratamento da puberdade precoce e da endometrig se. Estes antagonistas foram também considerados úteis para regular a secreção de gonadotropinas em mamíferos machos β pjj dem também ser usados para parar a espermatogáneee, p. ex., como contraceptivos masculinos e para o tratamento da hipertrofia proetâtica. Pretende-se preparar páptidos melhorados que sejam fortemente antagonistas da GnRH endógena e que evitem a secreção da LH e a libertação de esteróides pelas gónadas dos mamíferos.

Pelo presente invento preparam-se páptidos que inibem a libertação de gonadotropinas em mamíferos, incluindo o

homem, e fornecem-se processos para inibir a libertação de es,

teroidee pelas gónadas de mamíferos machos e fêmeas. Os análogos de GnRH obtidos são fortemente antagonistas da GnRH e

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têm efeito inibidor nos processos de reprodução dos mamíferos. Estes análogos podem ser usados para inibir a produção ds gonadotropinas e de hormonas sexuais em circunstâncias diversas incluindo a puberdade precoce, neoplasia dependente de hormonas, diemenorreia e endometrioss·

Em geral, de acordo com o presente invento, sintetizaram-se péptidos que inibem fortemente a secreção de gonadotropinae pela glândula pituitária dos mamíferos, incluindo o homem, e/ou inibem a libertação de esteroides pelas gónadas. Estes péptidos são análogos da GnRH onde há uma posição-1 de substituição, de preferência dehidro-Pro ou -(l- ou 2-naftil)-D-alanina (depois β -D-INAL ou /3-D-2NAL), numa posição 2 de subetituição na forma de um D-Phe modificado, uma posição-3 de substituição de preferência na forma de D-Trp substi. tuído, D-3PAL ou /3 -D-NAL, uma substituição opcional de um ácido diaminico não tendo mais do que 5 átomos de carbono na poeição-4, uma substituição opcional na posição-5 na forma quer de (a) um L-Tyr ou L-Phe halogenado ou metilado, quer de

(b) Arg, uma substituição na posição-6 e uma substituição opcional na posição-7 tal como Nle, NML, Phe, Nva, Met, Tyr, Trp, Cye, PAL e 4F-D-Phe-D-Phe modificado na posição-2 aumenta a actividade antagonista como resultado dae modificaçãee específicas presentes no anel benzénico. Fazem-ee substituições simples do hidrogénio do anel na posição-4 ou para-, e eacolhem-ss essas substituições entre cloro, fluoro, bromo e nitro, preferindo-se cloro, fluoro e nitro. As substituições dicloro são nas posições 2,4 ou 3,4 do anel. 0 átomo de carbono alfa pode também ser metilado, p.ex· (C “< Ms/4Cl)Phe. Se na poeiçlo-3 estiver presente β -D-NAL ou D-Trp não substituídos, Ry é de preferência Tyr, Pal, Phe ou 4F-D-Pheí se na posição-3 estiver D-3PAL, R^ é Arg. 0 substituinte na posição-1 pode ser modificado de modo que o seu grupo alfa amino contenha um grupo acilo, como o formilo (For), acatilo, acrililo, vinilacetilo (Uac) ou benzoilo (Bz) sendo preferidos o acetilo (Ac) e o Acrililo (Aer). PAL e D-PAL representam oe isómeros L- β D- da piridil-alanina onde o carbono- Λ de Ala

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-5está ligado, da preferência, è posição-3 do anel de piridina. Quando o -D-NAL está presente na posição-1 e R^ não é Arg,

um residuo de D-aminoâcido hidrofílioo, como 4-NH₂«D-Phe, 4-guanido-D-Pha, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Arg, D-Har (Homoargini na) ou D-PAL, estará de preferência presente na posição-6. Quando o dehidro-Pro estiver presente na posição-1 6 preferível que esteja na posição-6 um isómero-D ds um amino-ácido ljL pofliico, como D-Trp, D-Phe, For-D-Trp, NO^-D-Trp, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Tyr, D-Val, D-Ala, D-Ser(OtBu), -D-NAL ou (imBzl) D-His mas tambám se pode usar o D-PAL. Uma substitui ção na posição-10 de D-Ala em vez de Gly 6 considerada opcional, assim como outras substituições a seguir indicadas.

Estes páptidos por serem altamente potentes para ini bir a libertação de LH, são frequentemente referidos como GnRH antagonistas. Quando administrados a níveis muito baixos de proesto, os páptidos inibem a ovulação de mamíferos fêmeas e são muito eficientes por provocarem a reabsorção de ovos fertilizados se forem administrados logo a seguir a concepção. Estes páptidos são tambám eficientes no tratamento contraceptivo de mamíferos machos.

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Mais especificamente os páptidos preparados pelo pre sente invento são representados pela seguinte Fórmula I: X-R^-(W)D-Phe-Rj-R^-Rç-Rg-R^-Arg-Pro-R|g onda X á hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono; R^ á dehidro-Pro, D-pGlu, D-Phe, 4C1-D-Phe, D-Trp, Pro ou -D-NAL;

W â Cl, F, N0₂, C*Me/4Cl, Cl₂ ou Br; R^ á D-3PAL, f³ -D-NAL ou (Y)D-Trp, sendo Y h, N02, NH2, OCH^, F, Cl, Br, CH^, NⁱⁿFor ou N^lftAc; R^ á Ser, Orn, AAL ou aBu; R^ é Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phs, (3I)Tyr, (3CH5)Phe, (2CH₃)Phe, (3Cl)Phe ou (2Cl)Phe;

R^ á um isómero-D de um aminoácido Lipefilico ou á 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D-Arg; R_?é Nle, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL ou 4F-D-Phej e R|q á Gly-NH₂» D-Ala-NH₂ ou NH-Y’ sendo Y* um alquilo inferior, cicloalquilo, fluoro-(alquilo inferior) ou NHCONH-Q onde Q á H ou alquilo inferior, desde que, contudo, quando Rj for D-3PAL, R₅ seja Arg e que quando Rj for quer Λ -D-NAL quer

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-6-

D-Trp» entSo R? será Tyr, PAL, Phe ou 4F-D-Phe. Quando R^ for β -O-NAL e Rj nSo for Arg, entSo Rg será de preferência 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D-Arg.

Por -D-NAL entenda-se o isómero-D de alanina subs tituido por naftilo no átomo de carbono f , p.ex., 3-D-NAL.

De preferência emprega-se -D-2NAL, eetando a ligaçSo ao naftaleno na pasiçSo-2 da estrutura em anel; pode contudo usar-se tambám £ -D-INAL. PAL representa alanina substituída por piridilo no átomo de carbono- i de preferência a l_i

gaçSo éfá posiçSo-3 do anel de piridina· Em D-Trp na posiçSosimples

-3 fazem-se substituições pelo hidrogânio quer na posiçSo-5 quer na -6, que podem ser escolhidas entre cloro, fluoro, bro mo, metilo, amino, metoxilo e nitro, sendo os preferidos cloro, fluoro e nitro· Em alternativa o azoto do indol pode ser

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acilado, p.ex., com formilo (N For- ou lFor-) ou com acetilo.

Os resíduos substituídos preferidos sSo NⁱⁿFor-D-Trp e 6NQ₂~ -D-Trp. Quando se usa D-Trp nSo-substituido, na posiçSo-3, in troduz-se um resíduo especifico na posiçSo-7, p.ex. Phe ou 4F-D-Phe ou de preferência Tyr ou PAL. Por NML entenda-se N<X CHj-L-Leu. Por AAL entenda-se -amino-Ala e por aBu entenda-ee ácido Cxí , jf-diamino-butírico, podendo qualquer deles ou o Orn estar presente na posiçSo-4. Quando Ser nSo estiver presente na posiç3o-4, dehidro-Pro estará de preferência na posiç3o-l. Por 4-gua-D-Phe entenda-se um resíduo de Ο-Phe com guanidina substituída na posiçSo-para.

Qs péptidos preparados pelo presente invento podem eer sintetizados usando uma resina clorometilada, uma resina metilbsnzidrilamina (MBHA) ("methylbenzhydrylamine") uma resj. na de benzidrilamina (BHA) ou qualquer outra resina adequada J^â conhecida na arte. A síntese em fase sólida â conduzida em passos de adiçSo de aminoácidos à cadeia do modo estabelecido em detalhe na patente americana Nfl. 4 211 693. Como á sabido na arte juntam-se grupos protectores da cadeia lateral, & Ser, Tyr e Arg quando estiverem presentes, bem como a certos substituintes, e podem opcionalmente juntar-se a Trp, antes destes aminoácidos serem ligados à cadeia em construção

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sobre a resina· Este método fornece a peptido-resina intermédia completamente protegida.

Oa intermédios do invento podem aer representados

por:

X¹-R1-(W)D-Pha-R3(X²)-R4(X⁵)-R5(X⁴ ou X⁵)-R6(X⁵)-R₇(X⁶)-Arg(x5)-Pro-X⁷,

onda: X¹ ô um grupo protector de <X -amino de tipo já conhecido e utilizado na arte na eíntese por etapas de polipeptidos a quando, na desejada composiçSo de péptidos, X for um grupo particular acilo esse grupo pode ser usado como grupo protector. Entre as ciasses ds grupos protectores ds -ami. no, incluidas era x\ estSo (l) os grupos protectores do tipo acilo, como o formilo (For), trifluoroacetilo, ftalilo, p-toluenosulfonilo (Tos), benzoilo (Bz), bsnzenosulfonilo, o-nitrofenilsulfenilo (Nps), tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacsti lo, acrililo (Acr), cloroacstilo, acetilo (Ac) e ϊ -clorobu tirilo? (2) grupos protectores tipo urstana, aromáticos, p. ex·, benziloxicarbonilo (Z) e bsnziloxicarbonilo substituído como 0 p-cloro-benziloxicarbonilo (C1Z), p-nitrobenziloxica_r boniio, p-bromobenziloxicarboniio e p-metoxibenziloxicarboni lo? (3) grupos protectores ds uretana, alifáticos, como terc-butiloxicarbonil (Boc), diisopropilmetoxicarbonilo, iso propiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo? (4)

grupos protectores tipo-uretana, cicloalquilicos, como o cic lopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo a ciclohexiloxicarbonilo? (3) grupos protectores tipo -tiourstana, como o feniltiocarbonilo? (6) grupos protectores tipo alquilo, co

mo alilo (Aly), trifenilmatilo (tritilo) e benzilo (Bzl);

(7) grupos trialquilsilano, como trimstilsilano. 0 grupo

-amino protector preferido ô Boc quando X for hidrogénio.

X â hidrogénio ou um grupo protector para o azoto do indol do Trp, como o benzilo? contudo em muitas sínteses nSo há necessidade de proteger Trp.

3

X é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo

hidroxilo alcoólico da Ser, como os do grupo qus consiste em

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-8acetilo, benzoilo, tetrahidropiranilo, terc-butilo» tritilo»

benzilo e 2,6-diclorobenzilo, sendo o benzilo o preferido·

3

En alternativa quando se faz a substituição em Ser» X pode eer un grupo protector de un grupo amino da cadeia lateral cono Toe» Z ou C1Z.

X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector do grupo hidroxilo fenélico de Tyr» se Tyr estiver presente» escolhido entre o grupo que consiste em tetrahidropiranilo» terc-butilo» tritilo» benzilo» Z» 4-bromobenziloxicarbonilo e 2,6-diclorobenzilo. Prefere-se □ 2»6-diclorobenzilo (DCB).

5

X é um grupo protector do grupo guanidino da cadeia lateral ou do grupo amino ou do grupo imidazolo de Arg» Lye, His ou semelhantes» como □ nitro» Tos» tritilo» benziloxicar bonilo» adanantiloxicarbonilo, Z 3 Boc» um grupo protector de Tyr como X » ou um grupo protector de Trp como X » ou X pode ser hidrogénio o que significa que não há protecção nos átomos dos grupos da cadeia lateral. Prefere-se geralmente Toe.

X⁶ é hidrogénio» um grupo protector de Tyr como X^» ou um grupo protector de Cys ds preferência escolhido da cla£ se que consiste em p-metoxi-benzilo (MeOBzl), p-metilbenzilo, acetamidometilo» tritilo e Bzl. 0 grupo protector preferido é p-metoxibenzilo.

F pode ser Gly-Q-CH₂-/""resina de suporte/?; 0-CH₂« -/""resina de suporta/?} D-Ala-0-CH₂-/""resina de suporte/?} Gly-NH-/~resina de suporte/? ou D-Ala-NH-/~resina de suporte/? } e pode ser OH» ester» amida ou hidrazida quer de Gly quer de D-Ala ou directamente ligada a Pro.

0 critério de selecção dos grupos protectores da ca2 6

deia lateral em X-X ê que o grupo protector deve ser estável» nas condições da reacção» ao reagente escolhido para re mover o grupo protector de -amino em cada passo da síntese. 0 grupo protector não deve ser cindido durante a ligação e o grupo protector deve ser removível no fim da síntese da desejada sequência de amino-ácidos sob condições de reacção que não alterem a cadeia peptídica.

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-9Quando o grupo X? for Gly-0-CH₂-Z~resina de suporte_7, D-Ala-O-CH^-Z^rasina de suporte_7 ou 0-CH₂-/"~resina de suporte_J7, a parte éster de um dos muitos grupos funcionais da resina de poliestireno de suporte já está representada. Quando o grupo X? é Gly-NH-/""resina de suporte__7 ou D-Ala-NH-/""resina de supor uma ligação amina liga Gly ou D-Ala à resina

BHA ou à resina RBHA.

Quando X for acetilo, por exemplo, na fórmula final, ê possivel usá-lo como grupo protector X^ do grupo ot -amino de D-NAL ou de qualquer outro amino-ácido usado na posição -1, juntando-o antes da ligação deste último aminoácido à cadeia peptldica. Contudo, a reacção é de preferência conduzida com o pêptido sobre a resina (depois de desbloquear o grupo ol -amino enquanto os grupos da cadeia lateral permanecem protegidos), p.ex., fazenda reagir com ácido acético na presença de diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou de preferência com anidrido acético ou por outra reacção adequada, conhecida da arte.

0 péptido completamente protegido pode ser separado duma resina de suporte clorometilada, por amonólise, como ê bem conhecido na arte, obtendo-se a amida intermédia completa mente protegida. A desprotecção do péptido, bem como a separação do péptido duma resina de benzidrilamina pode efectuar-se a 02C com ácido fiuorídrico (HF). De preferência junta-se anisolo ao péptido antes do tratamento com HF, Depois de remover o HF sob vácuo, o péptido separado, desprotegido, é convenientemente tratado com éter, decantado, tomado em ácido acético diluído e liofilizado.

Assim o invento fornece um processo de preparação de um pêptido ou de um seu sal não tóxico, tendo o referido péptido a seguinte fórmula:

X-R₁-(W)D-Phe-R₅-R₄-R₅-R₆-R₇-Arg-Pro-R_1£3

onde X é hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono; R^ ê dehidro-Pro, D-pGlu, D-Phe, 4C1-D-Phe, D-Trp, Pro, ou /3 -DNAL;

W é Cl, F, N0₂, C'

f<e/4Cl, Cl_o ou

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Brj R, ê D-3PAL, A -D-NAL ou (Y)D-Trp, sendo Y H, N0_o, NH₀,

> I ί n £n £. í.

OCH₃, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿFor ou N*ⁿAcí R₄ é Ser, Orn, AAL ou aBuj R₅ é Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3Cl)Phe ou (2Cl)Phe; R^ 6 um isómero-D de um ami noácido liprofílico ou é 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-Hia, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D-Argj R? é Nle, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL ou 4F-D-Phe; e R^g 6 Gly-NH₂» D-ALA-NH^ ou NH-Y', com Y* sendo alquilo inferior, cicloalqui lo, fluoro (alquilo inferior) ou NHCONH-Q, onde Q é H ou alquilo inferior, desde que quando R^ for D-3PAL, R^ será Arg; e que quando R^ for quer fi -D-NAL quer D-Trp então R_? será Tyr, PAL, Phe ou 4F-D-Phe; compreendendo este processo

(a) a preparação de um composto intermédio com a

fórmula:

X¹-R1-(W)D-Phe-R3(X²)-R4(X³)-R5(X⁴ ou X⁵)-R6(X⁵)-R_?(X⁶)-Arg(X³)-Pro-X?

1 2 onde X é hidrogénio ou um grupo protector de -amino; X

é hidrogénio ou um grupo protector do azoto do indol; X³ é hidrogénio ou um grupo protector do grupo hidroxilo alcoólico de Ser ou de um grupo amino da cadeia lateral; X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector do grupo hidroxilo fenólico de Tyr;

5 6

X e X são cada um quer hidrogénio quer um grupo protector 7

da respectiva cadeia lateral que esteja presente; e X é bs colhido entre o grupo que consiste em Gly-Q-CH₂-(resina de suporte), Q-CH₂-(resina de suporte), D-Ala-0-CH₂-(resina de suporte), Gly-NH-(resina de suporte), D-Ala-NH-(resina de suporte), Gly-NH₂, e ésteres, amidas e hidrazidas;

(b) a cisão de um ou mais grupos X^ a X^ e/ou sepa7

ração de qualquer resina de suporte incluída em X e, se necessário

(c) a conversão do péptido resultante num seu sal não tóxico.

A purificação do péptido realiza-se por cromatografia de permuta de iães sobre coluna CMC, seguida de cromato63 681

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grafia de partilha usando o sistema de eluição: n-butanol;

0,1 N ácido acético (l:l em volume) sobre uma coluna com enchimento de Sephadex G-25, ou usando HPLC como é conhecido da arte e especificamente descrito em 0. Rivier et al. 3. Chroreatooraphv, 288 (1984) 303-328.

Os péptidos do invento são eficientes a níveis inferiores a 100 microgramas por quilograma de peso de corpo, quar» do administrados a cerca do meio dia do dia de proesto, para evitar a ovulação em ratos fêmeas. Para uma supressão prolo.n gada da ovulação, pode ser necessário usar níveis de dosagem entre cerca de 0,1 atá cerca de 2,5 miligramas por quilo de peso de corpo. Estes antagonistas são também eficientes em suspender a espermatogénese quando administrados a mamíferos machos numa base regular e podem assim ser usados como contra ceptivos. Uma vez que estes compostos reduzem os níveis de tsstosterona (uma consequência indesejada no macho normal sexualmente activo), parece razoável administrar doses de teetos terona ao mesmo tempo que o GnRH antagonista. Estes antagonis tas podem também ser usados para regular a produção de gonadj) tropinas e esteroídes sexuais para outros fins atrás indicados.

EXEMPLO 1

Prspararo-se, pelo processo de fase sólida acima refs rido, os péptidos indicados no Quadro i com a fórmula:

Ac-R₁-(4F)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-Leu-Arg-0ro-R^_Q

-1263 681 File 43949

1	^R1 P-D-2NAL	^R3 (óN0₂)D-T rp	^R6 D-Arg	^R10 Gly-NH₂
2	H	H	II	D-Ala-NH₂
3	dehidro Pro	H	í³ -D-2NAL	Gly-NH₂
4	/3-D-2NAL	(6NH₂)D-Trp	D-Arg	I»
5	w	(50CH₃)D-Trp	n	n
6	H	(5Br)0-Trp	II	II
7	H	(5F)0-Trp	w	M
8	M	(5C1)D-Trp	M	M
9	II	(5CHj)D-Trp	w	Gly-NH₂
10	(*-D-2NAL	(NⁱⁿFor)D-Trp	D-Arg	N
11	w	(5F)D-Trp	(4gua)D-Phe	H
12	»1	(5C1)D-Trp	D-His	N
13	dehidro Pro	(6N0₂)D-Trp	D-Leu	NHCH₂CH₃
14	D-Trp	(5F)D-Trp	D-Phe	N
15	D-pGlu	(5F)D-Trp	D-Ile	D-Ala-NH₂
16	D-Phe	(6N0₂)D-Trp	D-Val	nhnhconh₂

A título de exemplo descreve-se a seguir uma síntese representativa em fase sólida do Pâptido Nfi. 1 acima, referido como /"Ac- -D-2NAL¹, (4F)D-Phe², (6N0₂)D-Trp³, D-Arg⁶_7«

-GnRH. Este pâptido tem a seguinte fórmula: Ac- ^-D-2NAL-(4F)D-Phe-(6N0₂)D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂· Os outros pêptidos são sintetizados s purificados ds modo semelhante·

Usa-se uma resina QHA e liga-se Gly de Boc protegido, à resina durante 2 horas sm CH₂C1₂ usando um excesso de 3 x de derivado Boc e DCC como reagente activador· 0 resíduo de glicina liga-se ao residuo BHA por uma ligação amida.

A seguir à ligação de cada resíduo de aminoácido, faz-ee a lavagem, desbloqueamento e ligação do residuo ds amj. noácido seguinte de acordo com o seguinte esquema, usando uma máquina automática e começando com cerca de 5 gramas de resina:

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5

-13PASSO

REAGENTES E OPERAÇÕES

TEMPO MIST. (min)

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10

11

12

13

CH₂Cl₂-lavagem-80 cc (2x)

Metanol-(MeQH)-lav.-30 cc (2x)

CH₂Cl₂-lav.-80 cc (3x)

50# TFA+5# 1,2-etanoditiol em CH₂C1₂»7O cc (2x)

Álcool isopropilico+1# etanoditiol-lav.-80 cc (2x)

TEA 12,5# em CH₂C1₂-7O cc (2x)

Me0H-lav.-40 cc (2x)

CH₂Cl₂-lav.-80 oc (3x)

Boc-aminoácido (10 mmolas) em 30 cc de DMF ou CH₂C1₂, dependendo da solubilidade do particular aminoácido protegido (lx) + +DCC (lQ mmoles) em CH₂C1₂

MeOH-lav.-4Q cc (2x)

TEA 12,5# em CH₂C1₂-7Q cc (lx)

MeOH lav.-30 cc (2x)

CH₂C1₂ lav.-80 cc (2x)

3

10

3

5

2

3

30-300

3

Depois do passo 13 tira-se uma alíquota para o ensaio da ninidrinat se for negativo volta-se para o passo 1 para ligaçSo do aminoácido seguinte; se for positivo ou ligeiramente positivo volta-se para trás e repetem-ee os passos

9 a 13.

0 esquema acima referido á usado para ligar cada um dos aminoácidos do pêptido do invento depois de se ter ligado o primeiro aminoácido. A protecção N°<Boc 6 usada para cada um dos aminoácidos restantes ao longo da síntese. N*<Boc-^ -D-2NAL é preparado por mátodo conhecido na arte, p.ex·, como se descreve em pormenor na patente americana Nfl. 4 234 571 de 18 de Novembro de 1980. A cadeia lateral de Arg á protegi da com Τοβ. Obzl ô usado como grupo protector da cadeia late ral do grupo hidroxilo de Ser. (6N0₂)D-Trp á deixado não-pro tegido. N<Boc- (<5-D-2NAL á introduzido como aminoácido final. Boc-Arg(Tos) e Boc-(6NQ₂)D-Trp que tôm baixa eolubilida

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Filp 43949

14

de em CH₂C1₂ são ligados usando-se misturas DMF:CH₂C1₂·

Depois de desbloquear o grupo (\ -amino no terminal-N, obtém-se a acetilação usando um grande excesso de anidrido acético em diclorometano· A separação do péptido da resina e a dssprotscção completa das cadeias laterais tém lugar a 02C muito facilmente com HF. Ounta-se anisolo como depurador ("scavenger") antes do tratamento pelo HF. Depois de remover peio vácuo o HF, extrai-se a resina com ácido acético a 50% β liofilizam-se as lavagens para se obter o péptido, em bruto, em pé.

A purificação do péptido ê então realizada por croma tografia de permuta de iães sobre CMC (Whatman CM 32, usando um gradiente de 0,05 até 0,3 M NH^OAc em 50/50 de metanol/ /água) seguida de cromatografia de partilha numa coluna de filtração gel usando o sistema de eluição n-Butanol/0,1 N Aci do acético (1:1 em volume).

0 péptido é avaliado quanto à sua homogeneidade usajrj do cromatografia em camada fina e vários sistemas de solventes diferentes e também por cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa usando uma solução aquosa de fosfato de trietilamónio mais acetonitrilo. A análise de aminoácidos do péptido resultante, purificado é consistente com a fórmula de estrutura preparada, mostrando valores substancialmentp in teiros para cada amino-ácido na cadeia. 0 poder rotatório^ ê^1Cmedido num polarímetro fotoelôctrico: _a _3j₎g_a j_

(c=l, 50% ácido acético).

Os péptidos foram ensaiados in vivo e podem também ser analisados in vitro. No ensaio in vitro usam-se células da pituitária de rato separadas e mantidas em cultura durante 4 diae antes do ensaio. Os níveis de LH obtidos em resposta à aplicação de péptidos são avaliados por ensaio radioimuns específico para a LH do rato. As placas de controle das célu las apenas recebem uma medida que é 3 nanomolar em GnRH? as placas experimentais recebem uma medida 3 nanomolar em GnRH mais uma medida com o actual antagonista padrão para fins com

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ί·'

I'·

ί|·^:

paratiwoe, p.ex. /"Ac-dehidro Pro"*·, (4-F)D-Phe², D-Trp^^,é,_7-GnRH ou o péptido do ensaio, em concentrações de 0,01 até 10 nanomolar. A quantidade de LH segregada nas amostras apenas tratadas com GnRH é comparada com a segregada em amostras tratadas com o pôptido mais o GnRH. A capacidade do pág tido do ensaio reduzir a quantidade de LH libertada pelo GnRH 3 nanomolar 6 comparada com a do péptido padrão. A análise in vivo determina a eficiência em evitar a ovulação em ratoe fêmeas. Neste ensaio, um número determinado de fêmeas adultas de ratos Sprague-Dawley, p.ex. seis, tendo cada uma um peso de 225 a 230 g, é injectada com uma dosagem específica de microgramas ds péptido em óleo de milho, cerca das doze ho ras do dia de proesto. 0 proesto é a tarde da ovulação. Uea-se um grupo separado, de ratos fêmeas, como controlo ao qual não se administra o péptido. Cada um dos ratos fêmeas de cojn trola ovula na noite do proesto; regista-se o número de ratos, entre os tratados, que ovulam. Considerou-se que cada um dos péptidos era significativamente eficiente a evitar a ovulação de ratos fêmeas em dosagens muito baixas e considerou-se que cada péptido era completamente eficiente a uma dose de cerca de 5 microgramas. Realizaram-se ensaios adicionais a dosagens mais baixas estando os resultados indicados no Quadro A a seguir:

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-16

QUADRO A

Péptido NS.	in vivo
Dose (fg)	NB. ovulam
1.	1	0/5
	0,5	4/14
2.	1	1/10
3.	2,5	2/10
	2	0/6
4.	1	5/14
5.	1	7/10
6.	2	0/10
	1	6/18
7.	5	2/10
	1	3/9
8.	1	7/14
	0,5	2/7
9.	2,5	0/10
	1	10/16
1Q.	1	o/io
	0,5	9/17

Todos os péptidos listados no Quadro I aão considera dos eficientes para bloquear a secreção LH induzida pelo GnRH, in vitro a concentrações razoáveis· Muitos destes péptidos são muito mais potentes in vivo do que o padrão presente. To dos os péptidos são considerados eficientes para evitar a ovju lação de mamíferos fêmeas em muito pequenas dosee, e alguns escolhidos são considerados serem pelo menos duas vezes mais potentes do que quaisquer GnRH antagonistas anteriorraente conhecidos s ensaiados.

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-17-

EXEMPLO II

Preparam-se, pelo processo de fase sólida acima refe rido, os páptidos indicados no Quadro II com a fórmula:

Ac- -D-2NAL-(W)D-Phe-Rj-R₄-Rj-D-Arg-R₂-Arg-Pro-D-Ala-nh₂

QUADRO II

	W	Rj	^R4	^R5	^R7
17	48r	(6N0₂)D-Trp	Ser	Tyr	Nle
18	N	«	tt	(2F)Phe	Leu
19	4C1	(lFor)D-Trp	II	Tyr	Nva
20	W	II	II	H	Leu
21	H	H	n	II	Nle
22	«	n	II	(2CHj)Phe	Leu
23	M	n	»	Tyr	NML
24	n	M	II	II	" (Ala⁹)
25	N	n	«	(2Cl)Phe	NML
26	4N0₂	(5CHj)D-Trp	»1	(3CHj)Phe	H
27	«	(5F)D-Trp	Orn	Tyr	Nle
28	2,4C1₂	(5C1)D-Trp	Ser	(3F)Phe	" (acetato)
29	>1	(6N0₉)D-Trp	AAL	M	Nva
30	C^A Me/4C1 (5F)D-Trp	aBu	(jI)Tyr	NML
31	3,4C1₂	(5F)D-Trp	Orn	(3Cl)Phe	Leu
	Os	ensaios in vitro	e/ou in	vivo dos páptidos eape-
cificados no	Quadro II mostram que os	ι páptidos	listados no

Quadro II são considerados eficientes para bloquear a secreção LH induzida por GnRH, in vitro a uma concentração razoável· Muitos destes páptidos são mais potentes in vivo do que o padrão presente. Todos os páptidos são considerados eficientes para evitar a ovulação em mamíferos fêmeas, em doses muito baixas·

-1863 681 Fila 43949

EXEMPLO III

Prepararam-se, pelo processo da fase sólida acima des, crito, os péptidos indicados no Quadro III, com a seguinte fójr mula:

X- β -D-2NAL-(4Cl)D-Phe-(6NQ₂)-D-Trp-Ser-R₅-R₆-NML-ftrg-Pro-R₁₀.

QUADRO III

	X	^R5	%	^R10
32	Ac	Tyr	D-Arg	Gly-NH₂
33	Acr	Arg	D-Tyr	D-Ala-NH₂
34	For	H	II	nhch₂ch₃
35	Bz	(3F)Phs	D-Arg	nhch₃
36	Ac	(2F)Phe	D-Lys	nhcf₃
37	Vac	(2Cl)Phs	D-Har	nhch₂ch₂ch₃
38	Acr	(3Cl)Phe	(4gua)D-Phe	nhcf₂cf₃
39	Ac	(3F)Phe	D-Orn	D-Ala-NH₂
40	Acr	(H)Tyr	D-His	H
41	Ac	Tyr	D-Arg	” (Pro&,Arg9)
42	tt	(3Cl)Phs	M	Gly-NH₂
43	Vac	n	(4NH₂)D-Phe	nhnhconh₂
44	Bz	fi	II	NHNHCQNHCHj
	Os ensaios in	vitro e/ou in vivo dos oéotidos esoe-
cificados	no Quadro III	mostram que os	péptidos listados no
Quadro	ι III	são considerados eficientes	para bloquear a secre
ção de	ι LH	induzida por	GnRH, in vitro,	a concentrações razoá

veis. Muitos destes péptidos sSo mais potentes in vivo do

que o padrão presente· Todos os péptidos são considerados eficientes para evitar a ovulação de mamíferos fémeas, em do, ses multo pequenas·

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-19-

EXEMPLO IV

Prepararam-se, pelo processo da fase sólida acima referido, os péptidos indicados no Quadro XV, tendo a seguinte fórmula:

Ac-R^-4C1-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R₆-R₂-Arg-Pro-R₁g-NH₂

QUADRO IV

	^R1	^R6	R?	^R10
45	(³ -D-2NAL	D-Arg	Nle	D-Ala
46	H	H	Met	II
47	II	H	Tyr	n
48	H	II	Nle	Gly
49	n	n	Met	N
50	If	II	Tyr	II
51	tt	N	Phe	D-Ala
52	II	H	4F-D-Phe	II
53	ff	II	Cys	H
54	dehidro Pro	D-Trp	Nle	If
55	J3-D-2NAL	D-Arg	Trp	II
56	ff	D-Har	Cys	H
57	«I	D-Lye	Nva	ff
58	n	D-Arg	3PAL	H
59	dehidro Pro	D-Leu	Tyr	NHCH₂CH₃
	0 péptido NS. 45	acima referido como /~Ac- /	$ -D-2NAL¹,
4C1-D-	Pha^, D-Trp^, D-Arg^	, Nle ,	D-Ala¹⁰/?-GnRH tem	a seguin

te fórmula:

Ac- -D-2NAL-4C1-D-Phs-D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Nle-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

óptico

0 poder rotatório/de vários péptidos sintáticos foi

medido num polarimetro fotoelóctrico em 50% ácido acético

(c=l) β aqui registado no Quadro B.

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-20-

Todos os pâptidos listados no Quadro IV sã₀ considera dos eficientes para bloquear a secreção LH induzida por GnRH, in vitro a concentrações razoáveis. Muitos dsstss pâptidos são muito mais potentes in vivo do qus o padrão presente.

Todos os pâptidos são considerados eficientes para evitar a ovulação de mamíferos fômeas em dosagens muito peque nas e alguns escolhidos são pelo menos tão potentes como quaig, quer GnRH antagonistas já conhecidos e analisados.

EXEMPLO V

Prepararam-se, pelo processo de fase sólida acima re ferido, os pâptidos indicados no Quadro V tendo a fórmula: Ac-R₁-(W)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

QUADRO V

	"l	w	^R3	^Rê	R?
60	(i -D-2NAL	4Br	(6N0₂)D-Trp	D-Arg	Nle
61	M	4F	N	D-His	Tyr
62	M	II	D-Trp	4gua-D-Phe	N
63	dehidro Pro	II	II	D-Trp	Phe
64	N	4N0₂	(¾-D-lNAL	D-Val	Met
65	0-D-2NAL	4C1	NⁱⁿFor-D-Trp	D-Arg	Nle
66	N	H	H	H	Nva
67	dehidro Pro	4Br	P-D-2NAL	D-Tyr	4F-D-Phe
68	M	II	M	D-Nle	Trp
69	N	Ms/4C1	II	D-Phe	Nla
70	H	II	D-PAL	-D-2NAL	Phe
71		4C1	II	N	Leu
72	P-D-2NAL	4N0₂	N	D-Orn	4F-D-Phe
	H	n	H	4NH₂-D-Phe	Met
74	N	3,4C1₂	D-Trp	II	Tyr
75	N	4C1	D-PAL	D-PAL	Leu

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-21As análises in vitro e/ou in vivo dos péptidos especificados no Quadro V mostram que os péptidos listados no Qua

dro V são considerados eficientes para bloquear a secreção de in vitro

LH induzida por GnRH77em concentrações razoáveis. Muitos des, tes péptidos sSo mais potentes in vivo que o padrão presente. Todos os péptidos são considerados eficientes para evitar a ovulação de mamíferos fémeas, em doses muito pequenas.

EXEMPLO VI

Prepararam-se, pelo processo de fase sólida acima re ferido, os péptidos indicados no Quadro Vl tendo a fórmula:

X-R₁-4F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-Rg-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

QUADRO VI

	X	Rj	^R6	^R7
76	Acr	dehidro-Pro	D-Trp	Tyr
77	N	lt	D-Ile	PAL
78	N	M	D-Val	Nle(3F-Phe⁵)
79	N	Pro	D-Ser(OtBu)	Phe
80	H	dehidro-Pro	(imBzl)D-His	Cys(Orn^)
81	Bz	D-Phe	D-Trp	Met
82	H	D-pGlu	D-Trp	Nle(3I-Tyr⁵)
83	For	p -D-INAL	D-Arg	Phe(acetato)
84	M	dehidro-Pro	D-Har	Tyr(aBu^)
85	Vac	P -D-2NAL	D-Lys	Nva(acetato)
86	M	D-Phe	D-Nls	Cys
87	H	dehidro-Pro	D-Ala	Trp
	As	análises in vitro	e/ou in vivo dos	péptidos espe

cificadoe no Quadro VI mostram qus os péptidos listados no Quadro VI são considerados eficientes para bloquear a secreção de LH induzida pelo GnRH in vitro e a uma concentração ra

zoável. Muitos destes péptidos são considerados mais potentes in vivo do qus o padrão presente. Todos os péptidos são

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File 43949

-22consideradoe eficientes para evitar a ovulação de mamíferos fémeas, em doses muito baixas·

EXEMPLO VII

Prepararam-ee, pelo processo da fase sólida acima rg ferido, os péptidos indicados no Quadro VII, tendç4i fórmula:

Ac-R^-(W)D-Phs-RyR^-Tyr-Rg-Leu-Arg-Pro-D-Ala-Nl·^

QUADRO VII

^R1	W	^R?	%	^R6
88	dehidro Pro	4C1	(6N0₂)D-Trp	Orn	(3-D-2 NAL
89	N	4F	M	H	D-Val
90	«	II	(6F)D-Trp	AAL	4gua-D-Phe
91	h	n	n	H	D-Orn
92	n	4N0₂	(50CH₃)D-Trp	N	D-Lys
93	n	1»	n	M	D-PAL
94	β -D-2NAL	II	lAc-D-T rp	Ser	D-Har
95	Μ	II	lFor-D-Trp	H	D-Trp
96	dehidro Pro	II	(6Br)D-Trp	aBu	D-Nle
97	n	C** Me/4C1	n	M	D-Leu
98	H	H	(6CH₃)D-Trp	w	(Õ-D-2NAL
99	N	48r	(6NH₂)D-Trp	Orn	4NH₂-D-Phe
100	n	3,4C1₂	(5NH₂)D-Trp	lt	D-Lys
	As análises in vitro	e/ou in vivo dos	péptidos eepe-

cificados no Quadro V mostram que os péptidos listados no Quadro V são considerados eficientes para bloquear a secreção de LH induzida por GnRH, in vitro a uma concentração razoável. Muitos destes péptidos são mais potentes in vivo do que o padrão presente· Todos os péptidos são considerados eficientes para evitar a ovulação de mamíferos fémeas, em doses muito baixas.

0 ensaio in vivo é conduzido em diversas doses para

vários péptidos e os resultados estão indicados no Quadro B.

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Péptido NS. 17.		Dose ( yxg) 1	in vivo ovulam l/lO
19.		1	2/7
20.		1	6/7
21.		2,5	4/11
22.		1	7/9
23.		2,5	1/5
24.		1	5/6
25.		1	1/5
45.	-28,OS	1 0,5	3/16 9/10
46.	-22,4S	2,5 1	2/15 3/9
47.	-18,8B	1 0,5	0/10 4/7
51.	-22,5S	2,5 1 0,5	0/8 6/15 2/3
52.	-23,8S	2,5 1	0/10 4/7
53.	-22,OS	5	6/8
55.	-17,2S	2,5	0/8
58.		1 0,5	0/10 2/10
88.		2,5 1	0/10 6/9

63 681

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-24EXEMPLQ VIII

Prepararam-se, pelo processo da fase sólida descrito acima, os péptidos indicados no Quadro VIII tendo a fórmula:

Ac-R₁-R₂-D-3PAL-Ser-Arg-R₆-R^-Arg-Pro-R^₀

QUADRO VIII

^Rx	^R2	^R6	Ry	^R10
(3-D-2NAL	4C1-D-Phe	D-Trp	Leu	D-Ala-NH₂
N	H	D-3PAL	II	n
M	II	P-D-2NAL	II	H
n	H	D-3PAL	M	" (4guaPhe^)
dehidro Pro	N	(Ó-D-2NAL	3PAL	D-Ala-NH₂
N	H	n	Tyr	n
p-D-2NAL	n	D-3PAL	NML	II
H	N	β—D—2NAL	3PAL	N
II	II	(imBzl)D-His	Leu	n
N	n	6NQ₂-D-Trp	H	H
1»	II	O-Tyr	«	H
n	H	(For)D-Trp	M	H
II	4N0₂-0-Phe	D-Trp	NML	II
H	4Br-D-Phe	D-Tyr	Nle	nhch₂ch₃
Pro	N	(imBzl)D-His	Met	H
dehidro Pro	II	D-Trp	Nva	NHNHC0NH₂
N	Me4Cl-D-Phe	II	n	NHCH₂CH₃
n	4F-D-Phe	II	4F-Phe	D-Ala-NH₂
n	II	lf	NML	nhnhconh₂
w	M	D-Trp	Nle	nhch₂ch₃
M	II	P-D-2NAL	Trp	Gly-NH₂
Pro	lf	lf	Nva	II
P-D-2NAL	3,4C1-D-Phe	P-D-1NAL	Tyr	D-Ala-NH₂
n	II	D-Trp	Met	D-Ala-NH₂
4C1-D-Phe	II	D-Tyr	3PAL	" (acetato)

63 681

File 43949

-25fc:

I

!

ífc

ιI

I

Os péptidos descritos no Quadro VIII são analisados in vivo para determinar a sua eficiência em evitar a ovulação de ratos fêmeas· Foram todos considerados eficientes para evitar a ovulação de ratos fêmeas, em doses muito baixas e são completamente eficientes a uma dose de cerca de 10 microgramas. A análise especifica de um certo número destes pépti dos, conduzida com dosagens mais pequenas, deu os resultados indicados no Quadro C a seguir:

QUADRO C

Péptido Z^_7d² in vivo

Na. Dose (Ag) Ovulam

101.	-30,32+1	1 0,5	0/6 2/10
102.		1	1/16
		0,5	5/10
103.		1	0/5
		0,5	6/10
		0,25	7/10
108.		1	9/10
109.		0,5	0/6
110.		0,5	0/5

Os péptidos do invento são muitas vezes administrados sob a forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, como os sais ácidos de adição ou os complexos metálicos, p.ex. com zinco, bário, cálcio, magnésio, alumínio ou ss mslhantes (que são considerados como saís de adição para os fins deste pedido de patente), ou uma combinação dos dois·

São exemplos destes sais ácidos de adição o cloridrato, bromi drato, sulfato, fosfato, nitrato, oxalato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato,

63 681

File 43949

-26ff

Η

alginato, malato, ascorbato, tartarato e semelhantes. Por exemplo, uma solução aquosa do péptido pode ser repetidamente tratada com ácido acático 1 N e depois liofilizada obtendo-se o seu sal acético ácido. Se o ingrediente activo for administrado sob a forma de pastilha, esta pode conter uro diluente farmaceuticamente aceitável que inclui um ligante como o tragacanto, amido de milho ou gelatina; um agente deeintegrador como o ácido algínico; a um lubrificante como o estea rato de magnésio. Se se desejar a administração sob forma lí quida, podem usar-se edulcorantes e/ou saborizantes como parte do diluente farmaceuticamente aceitável e pode fazer-se a administração endovenosa em soro isotónico salino, soluções tampão de fosfato ou semelhantes.

Usualmente ae composições farmacêuticas conterão o péptido em conjunção com um suporte convencional farmacêutica mente aceitável. Usualmente a dosagem variará entre cerca de 1 atê cerca ds 100 microgramas do péptido por quilograma de peso do corpo quando administrado via endovenosa; as dosagens orais serão mais elevadas. 0 tratamento com estee péptidos é geralmente conduzido do mesmo modo que o tratamento clinico usando outros antagonistas de GnRH.

Estes péptidos podem ser administrados a mamíferos por via endovenosa, subcutânea, intramuscular, orai, percutânea, p.ex. intranasal ou intravaginal, para se obter inibição e/ou controlo da fertilidade a também em aplicações que impli quem a supressão reversívsl da actividade gonadal, como para controlar a puberdade precoce ou durante a terapia por radiação ou por via química. As doses efectivas variam com a forma de administração e a espécie particular de mamífero a tratar. Um exemplo de uma forma de dosagem típica 6 uma solução aquosa bacteriostática contendo o péptido cuja solução á adrai nistrada para fornecer uma doee entre cerca de 0,1 e 2,5 mg/ /kg de peso de corpo. A administração oral do péptido pode realizar-se quer sob forma sólida quer sob forma liquida.

I

63 681

File 43949

—27—

I

ι

ΐ'

Ainda que o invento tenha sido descrito no que se re fere aos seus modos de realização preferidos, deve entender-se que se podem fazer alterações, óbvias para quem conheça esta arte, sem afastamento do âmbito do invento que ê estabelecido nas reivindicações apensas. Por exemplo, podem ser utilizadas outras substituições conhecidas da arte que não dj.

minuem significativamente a eficiência dos páptidos. As subs 2

tituições no anel fenilo do residuo D-Phe podem também estar na posição-3 e nas posições 2,4, que são consideradas equivalentes; analogamente, D-2PAL e D-4PAL são consideradas equi9

valentes de D-3PAL. No terminal-C, Pro pode estar ligada a uma dae seguintes partes em geral consideradas como suas equi valentes: Gly-OCHj, Gly-QCI^CHj, Sar-NH₂ ou NH-Y’, sendo Y* alquilo inferior, em particular etilo, cicloalquilo, fluoro (alquilo inferior) ou NHCONHQ, onde Q ê H ou alquilo inferior. Sar representa sarcosina.

As características mais particulares do invento estão indicadas nas reivindicações seguintes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de um pâptido ou de um seu sal não tóxico, com a fórmula: X-R^-(W)D-Phe-R₃-R₄-R₃-Rg-R^-Arg-Pro-R^g onde X é hidrogénio ou um grupo acilo tendo 7 ou menos átomos de carbono; R^ é dehidro-Pro, D-pGlu, O-Phe, 4C1-D-Phe, D-Trp, Pro ou -D-NAL; W é Cl, F, N0₂, C°(Me/4Cl, Cl₂ ou Br; R₃ á D-3PAL, β -D-NAL ou (Y)D-Trp sen do Y,H, N0₂, NH₂, 0CH₃, F, Cl, Br, CH^, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; R₄é Ser, Orn, AAL ou aBu; R₅ é Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3l)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3Cl)Phe ou (2Cl)Phe; R_ó á um isómero-D de um aminoácido lipofllico ou é 4-NH₂»D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D-Arg; R? é Nle, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp, Cys, PAL ou 4F-D-Phe; e R|g ô Gly-NH₂, D-Ala-NH₂ ou NH-Y* sendo Y· um alquilo inferior, cicloalquilo, fluoro (alquilo inferior) ou NHCONH-Q, onde

63 681

File 43949

-28Q é H ou alquilo inferior, desde que quando Rg for D-3PAL,

Rg será Arg β quando Rg for -D-NAL ou D-Trp então R? será Tyr, PAL, Phe ou 4F-D-Phe} o qual processo compreende: a) a preparação de um composto intermédio com a férmula X^-R^-(W)D-Phe-R₃(X²)-R4(X³)-R5(X⁴ ou X⁵)-R6(X⁵)-R7(X⁶)-Arg(X⁵)-Pro-X?, onde X^ ô hidrogénio ou um grupo protector de X é hidrogénio ou um grupo protector do azoto do ,3

-amino}

indol; X³ é hidrogénio ou um grupo protector do grupo hidroxilo alcoólico de Ser ou dum grupo amino da cadeia lateral}

X^ é hidrogénio ou um grupo protector do grupo hidroxilo fenó 5 6

lico de Tyr} X β X são, cada um, hidrogénio ou um grupo protector da respectiva cadeia lateral que estéjçfiresente} e

γ

X é escolhido no grupo que consiste em Gly-0-CH₂-(resina ds suporte), 0-CH₂-(resina de suporte), D-Ala-0-CH₂-(resina de suporte), Gly-NH-(re8ina de suporte), D-Ala-NH-(reeina de suporte), Gly-NH_O e eetéres, amidas e hidrazidas} (b) cindinχ 16

do um ou mais dos grupos X^a até X e/ou separando de qualquer 7

resina de suporte incluída em X e, se necessáriq$S)convertendo o péptido resultante num seu sal não tóxico.
2 - Processo ds acordo com a reivindicação 1 onda W é 4C1 ou 4F.
3 - Processo de acordo com as raivindicaçBas 1 e 2 onde R^ é -D-2NAL β R^ ô 4-NH₂«D-Pha, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D-Arg.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3 onda R₆ Ô D-Arg.
5 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 onde R? é Tyr ou 3PAL.
6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a 5 onde Rg é (Y)D-Trp e Y é 6N0₂ ou N^AnFor.
7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 ou 2 onde R^ ô (3 -D-2NAL, Rg é D-PAL s Rg é Arg.

63 681

File 43949

ções 1 a

Gly-NH₂.

Ressalvo

"óptico"

i