PT788568E

PT788568E - Metodo destinado a eliminar tintas acetinados e toneres de papel impresso atraves da utilizacao de uma celulase de componente unico

Info

Publication number: PT788568E
Application number: PT95938881T
Authority: PT
Inventors: Neal E Franks; Steven E Bazewicz; Hans Christian Holm
Original assignee: Novo Nordisk Biochem Inc; Novozymes As
Priority date: 1994-10-26
Filing date: 1995-10-23
Publication date: 2001-09-28
Also published as: DE69520589D1; AU692328B2; US5525193A; EP0788568A1; DE69520589T2; EP0788568B1; JP3042718B2; WO1996013633A1; ES2158135T3; AU4009995A; ATE200320T1; JPH10507794A

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

MÉTODO DESTINADO A ELIMINAR TINTAS, ACETINADOS E TÓNERES DE PAPEL IMPRESSO ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE UMA CELULASE DE COMPONENTE

ÚNICO

Descrição

1. CAMPO DO INVENTO O invento refere-se a um método destinado a eliminar tintas, acetinados e tóneres durante o processo de reciclagem de papeis impressos, através da utilização de uma celulase de um só componente.

2. ESTADO DA TÉCNICA A vontade de reciclar quantidades cada vez maiores de vários tipos de papel impresso despertou um interesse mundial. Este facto é especialmente óbvio em certas zonas, como na América do Norte, onde esta questão não foi tratada de forma extensa. Nalguns casos, como acontece com o cartão canelado velho, hoje em dia o nível de reciclagem nos Estados Unidos é superior a 50%.

Alguns níveis de qualidade superior, entre os quais se incluem os diversos tipos de desperdícios de fábrica, não apresentam o mesmo índice de reciclagem e, em consequência, representam um grave problema quando é necessário proceder à sua eliminação. Este facto deve-se à dificuldade de eliminar as tintas poliméricas, os revestimentos e os tóneres como, por exemplo, as tintas para impressoras a laser e de jacto de tinta, os tóneres xerográficos, as tintas polimerizadas UV/EB, as camadas de verniz e os papeis acetinados. Os agentes químicos de eliminação de tintas como, por exemplo, o hidróxido sódico, o 1 silicato sódico e o peróxido de hidrogénio, podem não contribuir da melhor forma para a eliminação da tinta de impressoras a lasef e do tóner xerográfico. Especificamente, é possível produzir uma solubilização da carga de cálcio nos casos em que existem valores de pH mais elevados. A dispersão mecânica dos acetinados, dos tóneres de jacto de tinta e das tintas implica tanto um elevado custo monetário como um elevado custo operacional. Além disso, é possível que ocorram uma série de alterações irreversíveis na química da fibra da pasta de papel, no caso de a sua composição incluir uma proporção significativa de fibra de pasta de papel mecânica.

Na técnica anterior procedeu-se à utilização de enzimas para melhorar o processo de eliminação de tintas em papel xerográfico, em papel impresso a laser, em revistas velhas e em papel de jornal velho. Deverão consultar-se, por exemplo, os documentos PCT WO 91/14819 (pH básico das revistas velhas e do papel de jornal); WO 92/18688 (por exemplo, resíduos de papel: endoglucanase para ajudar ao processo de eliminação de tintas na presença de produtos químicos de eliminação de tintas); as publicações de Jeffiies et al., 1994, Tappi Journal 77:173-179 (papel xerográfico e impresso a laser); de Kim et al., Proceedings of the 1991 Tappi Conference, págs. 1023-1030 (papel de jornal velho: pH ácido); de Prasad et al., 1993, Appita 46:289-292 (papel xerográfico e impresso a laser); e de Prasad et al., 1993, Nordic Pulp e Paper Journal 2:284-286 (papel de jornal velho).

No entanto, todas as referências acima mencionadas apenas utilizavam celulases de componentes múltiplos que continham diferentes tipos de actividades enzimáticas. Não foi tida em consideração qualquer outra alternativa. Mas a utilização de celulases de componentes múltiplos apresenta inúmeras desvantagens. Em primeiro lugar, estas celulases de componentes múltiplos contêm uma grande variedade de actividades enzimáticas, muitas das quais são 2 inúteis para o processo de eliminação de tintas. Estas enzimas inúteis podem provocar reacções de degradação indesejadas, podendo também ser a causa potencial de uma perda de rendimento e de uma redução da resistência da fibra de papel. Em segundo lugar, ocorrerão com grande frequência variações entre os lotes, nos casos em que sejam utilizadas enzimas originais de componentes múltiplos e nos casos em que a uniformização se deva basear em determinadas características conjuntas. Em terceiro lugar, dado que as celulases de componentes múltiplos apenas podem ser isoladas dos microorganismos, toma-se muito mais dispendioso isolar as referidas celulases dado que não é possível aplicar os métodos de ADN recombinante.

Consequentemente, existe necessidade de criar um processo de eliminação de tintas aperfeiçoado para diferentes papéis impressos, destinados a impressão e a escrita, que contenham, por exemplo, tinta laser e tóneres xerográficos e para papel de jornal. Em consequência, um dos objectivos do invento consiste em proporcionar um método destinado a reciclar papeis impressos de alta qualidade e papel de jornal de um modo que seja económico.

3. RESUMO DO INVENTO

Surpreendentemente, os inventores descobriram que, ao contrário do que acontece com as enzimas descritas na técnica anterior que são enzimas de componentes múltiplos, pode ser utilizada uma celulase de componente único para eliminar a tinta, os acetinados e os tóneres de papeis impressos. Consequentemente, ao contrário do estabelecido na técnica anterior, não é necessário utilizar celulases de componentes múltiplos no processo* de eliminação de tintas.

As celulases de componente único apresentam diversas vantagens, quando comparadas com as celulases de componentes múltiplos descritas na técnica 3 anterior. A oportunidade de fabricar misturas exáctas de celulases de componente único de modo a obter o resultado final pretendido constitui uma vantagem que não é possível obter através da utilização das celulases de componentes múltiplos. As celulases de componente único pode ser isoladas mais facilmente que as celulases de componentes múltiplos devido ao facto de poderem ser obtidas através de uma grande variedade de métodos como, por exemplo, através da expressão de uma sequência de ADN recombinante que codifique a celulase ou através do isolamento de um determinado microorganismo. É também mais fácil efectuar experiências com a celulase de componente único devido à sua actividade enzimática, dado que é necessário avaliar um menor número de tipos de actividade enzimática. Além disso, em geral as celulases de componente único são normalmente compatíveis com os agentes activos de superfície que podem ser utilizados no método de acordo com o presente invento. O método de acordo com o invento inclui as etapas descritas em seguida: (a) redução do papel impresso a pasta de papel, até atingir uma consistência superior a cerca de 3%; (b) tratamento do papel impresso com pelo menos uma celulase de componente único, embora não em presença de produtos químicos de eliminação de tintas seleccionados a partir do grupo constituído por hidróxido sódico, silicato sódico e peróxido, numa quantidade suficiente para libertar as tintas, os acetinados e os tóneres da referida pasta de papel; e (c) separação das tintas, dos acetinados e dos tóneres libertados da pasta de papel.

As tintas, os acetinados e os tóneres eliminados através do método do presente invento incluem, embora não se limitem a estes, as tintas para impressoras a laser e a jacto de tinta, a tinta para tipografia como a que é utilizada em geral na impressão de jornais e revistas, a tinta para impressão por transferência, as 4 tintas polimerizadas por raios ultravioletas ou electrónicos, os acetinados e os tóneres como, por exemplo, os tóneres xerográficos.

Numa das formas de concretização de acordo com o invento o papel impresso é ligeiramente reduzido a pasta de papel ou, mais especificamente, é reduzido a pasta de papel durante cerca de cerca de dois a dez minutos. Posteriormente, é adicionada a enzima e continua a proceder-se à redução da pasta ao longo do período do tratamento enzimático. Em alternativa, é possível continuar a reduzir a pasta depois de ser ter levado a cabo o tratamento enzimático. A pasta de papel pode ser diluída depois de terminada a operação de redução.

Numa outra forma de concretização o papel impresso é reduzido a pasta de papel durante, no mínimo, cerca de 20 minutos. Posteriormente, é adicionada a enzima e a pasta de papel é tratada com a referida enzima, não se continuando a proceder à redução da pasta. Além disso, opcionalmente, a pasta de papel pode ser diluída ou antes de se levar a cabo o tratamento enzimático e/ou depois deste.

Numa outra forma adicional de concretização do invento a enzima pode ser adicionada ao papel impresso suspenso em água; sendo o papel impresso simultaneamente reduzido a pasta de papel e sujeito a tratamento com celulase de modo a obter uma pasta de papel tratada, sendo depois separados da pasta de papel as tintas, os acetinados e os tóneres libertados.

Segundo o método de acordo com o invento apenas se pode adicionar à pasta de papel uma enzima, ou seja, uma celulase de componente único. Numa outra forma de concretização, são adicionadas à pasta de papel pelo menos duas celulases de componente único, quer de forma consecutiva quer em simultâneo. Numa outra forma adicional de concretização pode adicionar-se à pasta de papel 5 uma celulase de componentes múltiplos e uma celulase de componente único, quer de forma consecutiva quer em simultâneo.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 ilustra a eliminação de tintas de fotocópias impressas ou de papel impresso a laser, depois de sujeitos a um tratamento com Novozym®342. A figura 2 ilustra a eliminação de tintas de fotocópias impressas ou de papel impresso a laser, depois de sujeitos a um tratamento com Endoglucanase V de Humicola insolens. A figura 3 ilustra a eliminação de tintas de fotocópias impressas ou de papel impresso a laser, depois de sujeitos a um tratamento com Endoglucanase I de Humicola insolens. A figura 4 ilustra os resultados de luminância derivados da eliminação do tóner de baixa consistência com Endoglucanase I de Humicola insolens. A figura 5 ilustra os resultados da luminância e da contagem de impurezas com Endoglucanase I de Humicola insolens.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO O método de acordo com o presente invento inclui as etapas descritas em seguida: (a) redução a pasta de papel; (b) tratamento enzimático; e (c) eliminação das tintas, dos acetinados e dos tóneres da pasta de papel. Opcionalmente, o método de acordo com o presente invento pode incluir a acidificação da pasta de papel e/ou a diluição da referida pasta. Em seguida, é descrita de forma pormenorizada cada uma das referidas etapas. 6 5.1. Redução a pasta de papel É possível utilizar um redutor convencional de elevada consistência, como os que são utilizados na indústria do papel, para pôr em prática o invento. A consistência da pasta deve ser no mínimo de cerca de 3%, embora seja preferível que seja de entre cerca de 3,5% e cerca de 40%, e especialmente de entre cerca de 10% e cerca de 20%.

Numa das formas de concretização, é possível procede a uma ligeira redução do papel impresso durante um período de entre cerca de 2 e 10 minutos. Depois de reduzido o papel contém ainda feixes de fibras que podem ser vistas a olho nu, enquanto o papel completamente reduzido a pasta de papel não apresenta qualquer feixe de fibras visível. Em seguida, é adicionada a enzima e continua-se a proceder à redução da pasta durante todo o tratamento enzimático. Em alternativa, o papel impresso pode ser completamente reduzido a pasta de papel antes de se levar a cabo o tratamento enzimático, especifícamente entre cerca de 20 e cerca de 120 minutos antes. O pH pode oscilar entre cerca de 6.5 e cerca de 10, embora seja preferível que oscile entre cerca de 7.0 e cerca de 8.5. A temperatura pode oscilar entre cerca de 35° C e cerca de 75° C. Numa outra forma adicional de concretização é possível adicionar a enzima directamente aos desperdícios de papel e de pasta de papel, enquanto se pode efectuar o tratamento enzimático em simultâneo durante entre cerca de 20 e cerca de 120 minutos, a uma temperatura de entre cerca de 35° C e cerca de 75° C.

Também é possível adicionar um agente tensioactivo durante a etapa de redução / tratamento enzimático ou após esta etapa, embora antes de se levar a cabo a etapa de flutuação. É preferível que o agente tensioactivo seja não iónico por natureza como pode ser o caso, por exemplo, do nonilo de etilo ou do fenol octílico disponíveis a nível comercial. Existe uma grande variedade de agentes tensioactivos não iónicos que podem funcionar nesta aplicação, tal como é 7

descrito, por exemplo, na publicação de Park et al., 1992, Biotechnology and Bioengineering 39:117-120. 5.2. Diluição

Depois de terminado o processo de redução, é possível diluir a pasta de papel pelo menos 2 vezes, com água ou com água reciclada proveniente do processo. A consistência final pode oscilar entre cerca de 0,5% e cerca de 3,5%. No caso de a redução ser levada a cabo antes de se terminar o tratamento enzimático, a pasta de papel deverá ser diluída após o tratamento de redução e/ou enzimático, de acordo com o descrito em seguida. 5.3. Acidificação

No caso de o pH da pasta de papel ser superior a cerca de 8.5 é necessário que a pasta de papel seja acidificada. A pasta de papel deverá ser acidificada antes de se levar a cabo o tratamento enzimático. Após o processo de acidificação o pH deverá situar-se de preferência entre 6.5 e 8.5. O agente acidificante de acordo com o método do presente invento pode ser um ácido mineral como o ácido sulfurico (adicionado sob a forma de ácido diluído). Além disso, também se pode utilizar um sal de ácido forte ou de base fraca como, por exemplo, o sulfato de alumínio, cujas propriedades o tomam útil para utilização na indústria do papel. E também possível utilizar parcial ou totalmente um ácido orgânico (como o ácido glucónico ou cítrico), com o objectivo de ajustar o equilíbrio entre o cálcio livre e o cálcio sequestrado. Estes ácidos são especialmente úteis nos casos em que os sais de cálcio dos ácidos gordos são utilizados para ajudar à flutuação durante o processo de eliminação de tintas. 8

5.4. Tratamento com celulase de componente único A enzima utilizada no método de acordo com o presente invento é uma celulase de componente único. A "celulase de componente único", tal como se define neste documento, consiste numa enzima que hidrolisa a celulose e que, essencialmente, está isenta de outros componentes que contenham celulase. Alguns exemplos de celulases específicas são descritos na publicação de Dalboge e Hansen, 1994, Mol. Gen. Gen. 243:253-260. Numa forma de concretização específica a celulase de componente único pode ser, por exemplo, uma endo-B-D-1,4-glucanase (glucanohidrolase de 1,4-B-D-glucano, EC 3.2.1.4) que cataliza a dissociação das ligações B-l,4-glucosídicas internas; a celobiohidrolase (celobiohidrolase de 1,4-B-D-glucano, EC 3.2.1.91) que cataliza a extracção de glucose dos extremos não redutores da cadeia; a glucohidrolase de 1,4-B-D-glucano, EC 3.2.1.74, que cataliza a extracção de celobiose dos extremos não redutores da cadeia; ou a celobiase (B-glucosidase, EC 3.2.1.21), que cataliza a dissociação da celobiose da glucose. A celulase de componente único pode ser derivada de microorganismos que se sabe serem capazes de produzir enzimas celulolíticas como, por exemplo, alguns tipos de Humicola, Thermomyces, BaciUus, Tríchoderma, Fusarium, Myceliophthora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium, Aspergillus e Geotricum. O fungo pode ser cultivado através de processos conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, a publicação de Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). A celulase de componente único pode ser recuperada do meio e pode ser separada de outros compostos enzimáticos através de centrifugação ou de filtração, precipitando os componentes proteicos do sobrenadante ou do produto obtido a partir da filtração através de um sal como, por exemplo, sulfato de amónio, sendo depois efectuada a sua depuração através de vários procedimentos cromatográficos como, por exemplo, a cromatografia de intercâmbio iónico, a 9 cromatografia de permeação sobre gel, a cromatografia de afinidade ou outras semelhantes. A celulase de componente único isolada caracteriza-se, por exemplo, graças ao sistema de diluição simples por electroforese em gel de poliacrimida e é avaliada através de processos conhecidos na técnica. Numa das formas de concretização é possível submeter a celulase a investigação, em particular a endo-B-D-1,4-glucanase, de modo a determinar a actividade celulolítica da celulase, especificamente, uma enzima celulolítica como a carboximetilcelulose (CMC) hidrolisada através da endo-B-D-1,4-glucanase, aumentando deste modo a viscosidade da mistura em incubação. A redução da viscosidade resultante pode ser determinada através de um viscosímetro por vibrações (por exemplo, o MIVI 3000 da Soffaser, França). A actividade celulolítica da enzima pode ser quantificada através de um teste ECU. O teste ECU quantifica a quantidade de actividade catalítica presente na amostra, medindo a capacidade da amostra para reduzir a viscosidade de uma solução de carboximetilcelulose (CMC).

Em alternativa, a celulase pode ser submetida a um teste destinado a comprovar a sua actividade sobre a celulose amorfa. Alguns exemplos de celulases que apresentam este tipo de actividade são a endo-B-D-1,4-glucanase e a celobiohidrolase. No entanto, a celobiohidrolase não apresenta qualquer actividade sobre a CMC.

Além disso, é também possível determinar a actividade da celulase perante a celotriose. Especificamente, a actividade da celulase perante a celotriose, em termos de kcat-s'1, é determinada através de um teste acoplado:

Celotriose --> Glucose + Celobiose (cat.: celulase)

Glucose + O2 + H20 —> gluconase + H2O2 (cat.: glucose-oxidase) H202 + ABTSr --> ABTS0x (cat.: peroxidase) 10 que é seguido espectrofotometricamente a 418 nm (absorção máxima de ABTS0x a 418 nm. O ABTSR é sulfonato (6) de 2,2'-Azino-di-[3-etilbenzotiazolina] e pode ser obtido comercialmente junto da empresa Boerhinger Mannheim. O kcat.s'1 é calculado através de uma representação de Lineweaver Burk. Para efectuar os cálculos são utilizadas as seguintes constantes: celulase: 0=66,310 M^.cmf1 e ABTS: 0=0,0323 ΟιηοΓ'-αη'1.

Em alternativa, a celulase de componente único pode ser obtida através de processos de ADN recombinante. As sequências de ácidos nucleicos que codificam a celulase de componente único podem ser de origem genómica ou de ADNc e podem ser obtidas, por exemplo, através da elaboração de uma biblioteca genómica ou de ADNc de um organismo apropriado e seleccionando as sequências de ácidos nucleicos que codifiquem a celulase de componente único total ou parcialmente através de hibridação, utilizando testes de oligonucleótidos sintéticos preparados, por exemplo, com base na sequência aminoácida da celulase de componente único de acordo com as técnicas normalizadas (consultar a publicação de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

As sequências de ácidos nucleicos também podem ser preparadas sinteticamente através dos métodos normalizados estabelecidos como, por exemplo, o método da fosfoamidite descrito nas publicações de S.L, Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters 22, págs. 1859-1869 e de Matthes et al. (1984), The EMBO J. 3: 801-805. De acordo com o método da fosfoamidite, os oligonucleótidos são sintetizados, por exemplo, num sintetizador de ADN automático, sendo depois purificados, ligados e clonados num vector apropriado. 11

Por último, as sequências de ácidos nucleicos podem ser de origem mista sintética e genómica, de origem mista sintética e de ADNc ou de origem mista jenómica e de ADNc, e podem ser preparadas através da união dos fragmentos de origem sintética, genómica ou de ADNc (consoante seja adequado), sendo os fragmentos correspondentes a diferentes partes da cadeia de ADN completa, de acordo com as técnicas normalizadas. É preferível que a célula utilizada na expressão da celulase de componente único nos processos de acordo com o invento seja uma célula que, ao ser cultivada, produza grandes quantidades de celulase de componente único de acordo com o invento. Tal como foi indicado anteriormente, pode tratar-se de uma célula que produza na natureza a celulase de componente único de acordo com o invento, embora seja preferível que se trate de uma célula do invento que tenha sido transformada graças a uma sequência de ácidos nucleicos que codifique a celulase de componente único. De modo conveniente, pode tratar-se de uma célula que tenha sido utilizada previamente como hóspede para produzir proteínas recombinantes, quer uma célula procariótica quer eucariótica, entre as quais se incluem (embora não se limitando a estas) as células de mamíferos, as células de insectos, as células de plantas ou as células fúngicas e deverá ser preferencialmente um microorganismo como uma bactéria ou um fungo. Pretende-se que o termo "fungo" englobe os fungos filamentosos e as leveduras.

Alguns exemplos de bactérias adequadas são as bactérias gram positivas do género do Bacillus como o Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans, Bacillus lautus e do género do Streptomyces como o Streptomyces lividans. Alguns exemplos de bactérias gram negativas adequadas incluem as bactérias do género da Escherichia como a E. coli. Por exemplo, a 12

transformação da célula hóspede bacteriana pode ser levada a cabo através da transformação do protoplasto ou através da utilização de células competentes de um modo que seja conhecido per se. Outra célula bacteriana adequada é uma célula da espécie Pseudomonas. como a Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fragi, Pseudomonas gladioli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas síutzeri, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas glumae o Pseudomonas aeruginosa.

Em alternativa, a célula pode ser um fungo, ou seja, uma célula derivada de uma levedura ou de um fungo filamentoso. A célula derivada da levedura pode ser, por exemplo, uma célula do género das Sacaromices como a S. cerevisiae. O organismo hóspede do fungo filamentoso pode ser, por exemplo, uma estirpe de Aspergillus sp., como o A. Niger, A. nidulans ou A. oryzae. As técnicas utilizadas para transformar uma célula hóspede de Aspergillus e obter a expressão da proteína recombinante podem ser idoneamente as que são descritas no documento EP 238 023. Em alternativa, a célula hóspede fúngica pode ser uma estirpe da espécie Fusarium como o F. oxyspomm, cuja transformação se pode levar a cabo, por exemplo, da forma descrita na publicação de Malardyer et al., 1989, Gene 78: 147-156.

Com o objectivo de obter a expressão, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a celulase de componente único é normalmente precedida por um estimulador. O estimulador pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos que mostre uma actividade de transcrição forte na célula hóspede escolhida e que possa derivar de um gene que codifique uma proteína extracelular ou intracelular como uma amilase, uma glucoamilase, uma protease, uma lipase, uma celulase ou uma enzima glicolítica. Alguns exemplos de promotores adequados, especialmente quando se utiliza um hóspede bacteriano, são o estimulador do operão lac de E. coli; os promotores dagA do gene de agarase de 13

Streptomyces coelicolor; os promotores do Bacillus licheniformis □; os promotores do gene da D-amilase (amyL) do Bacillus licheniformis; os promotores do gene da amilase maltogénica (amyM) do Bacillus Stearothermophilus; os promotores da D-amilase (amyQ) do Bacillus amyloliquefaciens; ou os promotores dos genes xylA e xinB do Bacillus subtilis. No caso de um hóspede de uma levedura pode ser considerado útil utilizar um estimulador como o estimulador eno-1. Para levar a cabo a transcrição num hóspede fúngico pode ser considerado que alguns exemplos de promotores úteis são aqueles que derivam do gene que codifica a amilase A. oiyzae TAKA; a proteinase aspártica Rhizomucor miehei; a D-amilase neutra A. Niger; a D-amilase ácida estável A. niger; a glucoamilase (gluA) A. niger ou A. awamsii; â lipase Rhizomucor miehei; a protease alcalina A. oiyzae; a isomerase triosfática de triose A. oryzae; ou a acetamidase A. nidulans. Os promotores preferidos são a TAKA-amilase e os promotores gluA.

Outras sequências implicadas na expressão da celulase de componente único incluem as sequências de terminação e de poliadenilação, bem como os vínculos de ligação do ribossoma e podem derivar idoneamente da mesma fonte que o estimulador. Além disso, o vector pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que permita que o vector se replique na célula hóspede em questão, por exemplo, uma origem de replicação adequada. O vector pode também incluir um marcador seleccionável como, por exemplo, um gene, cujo produto complemente um defeito na célula hóspede, como é o caso dos genes dal do B.subtilis ou B. licheniformis, ou que confira uma resistência antibiótica como a resistência à ampicilina, à canamicina, ao cloroanfenicol ou à tetraciclina. Entre os exemplos de marcadores de selecção do Aspergillus incluem-se o amdS; o pyrG; o argB; o niaD; e o sC, um marcador que dá origem à resistência à higromicina. Para utilização numa célula 14 hóspede Âspergillus é preferível utilizar os marcadores amdS e pyrG de A. nidulans ou de A. oryzae. Um dos marcadores utilizado com maior frequência e derivado de um mamífero é o gene da reductase dihidrofolática (DHFR). Além disso, a selecçao pode ser levada a cabo através de co-transformação, por exemplo, da forma descrita no documento WO 91/17243.

Os procedimentos utilizados para unir a cadeia de ADN que inclui a sequência de ácidos nucleicos que codifica a celulase de componente único, o estimulador, o terminador e outros elementos, respectivamente, e para os inserir em vectores adequados que contenham a informação necessária para efectuar a replicação são bem conhecidos dos peritos na matéria (consultar, por exemplo, a publicação de Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Pode utilizar-se vantajosamente quer uma célula que inclua uma cadeia de ADN quer um vector de expressão de acordo com o invento, tal como foi definido anteriormente, enquanto célula hóspede na produção recombinante da celulase de componente único. A célula hóspede pode ser transformada graças à cadeia de ADN integrando convenientemente a cadeia de ADN no cromossoma hóspede de modo a obter uma célula hóspede recombinante. Em geral, considera-se que esta integração constitui uma vantagem devido ao facto de ser mais provável que a sequência de ADN se mantenha estável na célula. A integração de estruturas de ADN no cromossoma hóspede pode ser levada a cabo de acordo com os métodos convencionais como, por exemplo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Em alternativa, a célula pode ser transformada com um vector de expressão, tal como foi descrito anteriormente em relação aos diferentes tipos de células hóspedes. 15 O caldo ou meio utilizado nos processos de acordo com o invento para fermentar a célula hóspede recombinante daí resultante pode ser qualquer meio convencional que seja adequado para o crescimento da célula em questão. Os meios adequados como, por exemplo, meios mínimos ou complexos, podem ser adquiridos no mercado ou podem ser preparados de acordo com os métodos publicados (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). A celulase de componente único pode ser recuperada do caldo através de processos convencionais, entre os quais se incluem, embora não se limitem a estes, a separação das células do caldo através de centrifugação ou de filtração, caso seja necessário, após a ruptura molecular das células, precipitando os componentes proteicos do sobrenadante ou da filtração através da utilização de um sal como, por exemplo, o sulfato de amónio, sendo em seguida efectuada a sua depuração através de uma grande variedade de processos cromatográficos como, por exemplo, a cromatografia de intercâmbio iónico, a cromatografia de afinidade ou outros processos semelhantes, sendo o método de recuperação real dependente do tipo de enzima em questão.

Numa forma de concretização específica a celulase de componente único é uma celulase que mostra uma actividade celulásica perante a celulose amorfa como, por exemplo, uma endo-B-D-1,4-glucanase. Numa forma de concretização preferencial a celulase de componente único cataliza a hidrólise da celotriose, por exemplo, a endo-B-D-1,4-glucanase. Numa forma de concretização específica a endo-B-D-1,4-glucanase pode derivar da Humicola insolens, por exemplo, da estirpe da Humicola insolens DSM 1800 (depositada na Deustche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D 3300, a 1 de Outubro de 1981, de acordo com as provisões estabelecidas no Tratado de Budapeste). A endo-B-D-1,4-glucanase pode possuir um domínio de ligação diferente sobre a celulose e, em consequência, pode causar a hidrólise das 16 cadeias de celulose nas zonas cristalinas do substrato de celulose, por exemplo, a Endoglucanase V. A Endoglucanase V foi isolada da H. insolens e apresenta um peso molecular de cerca de 43 kDa e um pi de cerca de 5.2, sendo descrita no pedido de patente dos Estados Unidos N° 940,680, apresentado no dia 28 de Outubro de 1992, e incorporado neste documento como referência. Em alternativa, a endo-p-D-l,4-glucanase pode não possuir um domínio de ligação diferente sobre a celulose e, deste modo, opera nas regiões amorfas do substrato celuloso, por exemplo, a Endoglucanase I. A Endoglucanase I apresenta um peso molecular de cerca de 50 kDa e um pi de cerca de 5.5. Esta foi isolada da H. insolens, tendo sido clonada e expressa em Aspergillus, e estando descrita no pedido de patente dos Estados Unidos N° 940,680, apresentado no dia 28 de Outubro de 1992, e incorporado neste documento como referência. A dosagem da celulase adicionada oscila entre cerca de 0,02% e 1,0% (em peso), no caso do papel impresso secado em forno. A duração de tratamento enzimático é de entre cerca de 5 e cerca de 120 minutos, a uma temperatura que oscila entre cerca de 35° C e cerca de 75° C. 5.5. Separação de tintas, acetinados e tóneres da pasta de papel

Depois de efectuado o tratamento enzimático, as partículas de tinta são eliminadas da pasta de papel. Em seguida, pode proceder-se à separação da tinta da pasta de papel através dos métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, a eliminação mecânica de tintas; a flutuação; a eliminação químico-mecânica de tintas; e a química aglomerativa (consultar, por exemplo, a publicação de McBride, 1994, Pulp and Paper, Abril 1994, Miller Freeman Publishers, San Francisco, CA, pág. 44). Em seguida pode proceder-se à lavagem da pasta de papel aceite. 17

Depois de se levar a cabo a separação da tinta e do acetinado, a pasta de papel sem tinta passa a ser adequada para produzir papel de acordo com os métodos convencionais.

6. EXEMPLOS 6.1. EXEMPLO 1 6.1.1. Materiais e Métodos

Procedeu-se à colocação de 110 g de papel branco fotocopiado/impresso por uma impressora laser, com quadrados de 1 polegada e seco ao ar (s.a.) numa máquina de desintegração de papel British (fornecida pela empresa Testing Machine Inc., Amityville, NY) com água previamente aquecida e desionizada (40° C), em aumentos graduais de modo a conseguir uma consistência de 5%. Neste ponto, o pH era de 9.2. Após a desintegração preliminar o pH foi ajustado com ácido sulfurico 4 N, de modo a diminuir para 7.5. Procedeu-se à adição da quantidade pretendida de enzima, quer a Novozym®342 (Novo Nordisk A/S; derivada da Humicola insolens e descrita na Patente dos Estados Unidos N° 4,435,307, com uma actividade específica de 675 ECU/g), quer a Endoglucanase I (com uma actividade específica de 2,500 ECU/g) ou a Endoglucanase V (com uma actividade específica de 7500 ECU/g), diluída numa solução tamponada (0,05 M de fosfato sódico, com um pH de 7.0) e continuou-se a proceder à desintegração durante mais 20 minutos. A Endoglucanase I e a Endoglucanase V também derivam da Humicola insolens e são descritas no pedido de patente dos Estados Unidos N° 940,680.

Procedeu-se à adição da pasta de papel desintegrada e tratada a cerca de 14 L de água corrente a 50° C na unidade de eliminação de tintas Lamort (Lamort SA, Vitry-le-Francois, França). A mistura de pasta de papel foi retirada durante 30 minutos, de modo a eliminar todo o ar obstruído existente e derivado da etapa de desintegração. Nessa altura, procedeu-se à recolha de uma amostra de 1 L de 18 pasta de papel de modo a calcular os dados relativos à luminância da referida pasta de papel. Em seguida, a unidade de eliminação de tintas foi colocada em funcionamento e esteve a funcionar a uma velocidade rotativa de 1100 rpm durante 10 minutos. Durante o referido período de 10 minutos produziu-se uma eliminação manual constante das partículas de tinta que flutuaram para a superfície. Em seguida, procedeu-se à recolha, à filtração, à secagem e à pesagem das referidas partículas de desperdício.

Procedeu-se à drenagem das partes aceites que permaneciam na unidade e foram feitas almofadas de luminância a partir de uma parte da pasta. Procedeu-se à passagem de quatro litros de pasta de papel aceite através de um filtro de malha Tyler normalizada 80 até se proceder à sua mistura com um litro de aumentos destinados a estimular a lavagem da pasta. A pasta de papel obtida a partir deste processo foi recolhida e suspensa em 2,5 litros de água desionizada, tendo sido feitas almofadas de luminância a partir da pasta lavada. Procedeu-se depois à filtração, à secagem e à pesagem das partículas de desperdício ou do material que passou através do filtro.

Formaram-se almofadas de luminância sobre um papel filtrante de 15 cm num filtro Buchner coberto com um filtro de malha de plástico 200. O peso mínimo por almofada foi de 3 gramas. Procedeu-se à prensagem das almofadas húmidas entre papeis de secagem e colocaram-se estes em anéis de contenção Tappi, enquanto secavam até adquirir os níveis de humidade atmosférica. Os valores de luminância foram obtidos através da utilização de um medidor de luminância Photovolt Modelo 577 (Photovolt Corp., Indianapolis, IN 46225) tendo sido efectuadas seis leituras individuais tanto sobre a parte superior como sobre a parte inferior da almofada de pasta de papel. Foi feita a média dos referidos valores; tendo sido utilizada a luminância final das almofadas equivalente à 19

média das leituras obtidas tanto sobre a parte superior como sobre a parte inferior. 6.1.2. Resultados

Os resultados obtidos com a Novozym®342 são ilustrados na Figura 1. Cada ponto de amostra contém três pontos de dados que representam as amostras recolhidas a partir da unidade de eliminação de tintas do alimentador, após a etapa de flutuação e depois de ter sido efectuada a lavagem das partes aceites resultantes da flutuação. Nas Figuras 1, 2 e 3 estes pontos de amostra aparecem representados, respectivamente, por barras pretas, brancas e cinzentas. O aumento na luminância atingiu o seu máximo a um nível de adição de 25 ul/100 o.d. g de desperdícios.

Os resultados obtidos através da utilização da Endoglucanase V são ilustrados na Figura 2. A forma geral da curva de resposta ao longo do controlo, 25, e as dosagens de 50 ul parecem ser semelhantes às da Novozym®342. Neste caso não se observou um aumento no valor da luminância no alimentador, como tinha sido observado em relação à Novozym®342.

Os resultados obtidos através da utilização da Endoglucanase I são ilustrados na Figura 3. Nesta, não se observa uma relação óptima entre dosagem/comportamento no que se refere a níveis de dosagem baixos, como tinhá sido observado em relação à Novozym®342 e à Endoglucanase V. Acima da margem de dosagem examinada, a luminância continuou a melhorar. Os níveis da luminância do alimentador aumentaram à medida que as dosagens foram aumentadas. A presença de partículas de tinta maiores aumentou graças a um maior aumento na luminância, observado ao longo da unidade de flutuação comparativamente ao menor aumento que foi observado ao longo da lavagem. 20

Claims

Os resultados mostram que se pode obter uma eliminação de tinta de maior qualidade caso se utilize a Endoglucanase I em lugar de um preparado com vários componentes. 6.2. Exemplo 2 6.2.1. Materiais e Métodos A Endoglucanase I de H. insolens DSM 1800 foi submetida a um exame sobre papel impresso a jacto de tinta, isento de madeira, numa experiência simples, na qual em primeiro lugar os desperdícios foram reduzidos a pasta de papel em água desionizada com 5% de consistência, a 45° C durante 30 minutos e com um pH inicial de 7.5. A pasta de papel foi diluída na unidade de eliminação de tintas até adquirir uma consistência de cerca de 2%, tendo-se em seguida adicionado a quantidade necessária de Endoglucanase I no tampão com 0,05 M de fosfato e um pH de 7.5 e tendo-se procedido à mistura de tudo durante um período adicional de 30 minutos a 50° C. Procedeu-se ao enchimento de uma unidade de eliminação de tintas e colocou-se em funcionamento um ciclo de flutuação de 10 minutos. Durante os 40 minutos, o pH da pasta de papel aumentou até atingir um pH de 8 a 8.2. Em seguida, tal como no exemplo anterior, procedeu-se à lavagem da pasta de papel aceite. Foi extraída uma amostra de matéria utilizada antes do início da fase de flutuação e foi retirada uma nova amostra no fim da referida fase de flutuação. Foram feitas almofadas de luminância da forma descrita no Exemplo 1. A pasta de papel lavada foi também submetida a uma análise de imagem, de modo a calcular as quantidades de tinta. Cada uma das determinações da contagem de tinta foram levadas a cabo do mesmo modo. 21 6.2.2. Resultados Os resultados obtidos relativamente à Endoglucanase I são ilustrados nas Figuras 4 e 5. A Endoglucanase I apresentou uma curva de resposta sem nenhum ponto óptimo. A luminância da pasta de papel lavada continuou a aumentar à medida que aumentava a dosagem da enzima. A resposta equilibra-se após cerca de 300 ECU/kg de desperdícios. Os resultados da Figura 5 indicam que os valores de luminância são inversamente proporcionais ao conteúdo em tinta. Lisboa, 3 de Julho de 2001. Pela Requerente

Adjunlo do Agente Oficial de Propriedade Indusfrial R. D. João V, 9-2.° df.°-1250 LISBOA 22 REIVINDICAÇÕES 1. Método destinado a eliminar tintas, acetinados e tóneres de papel impresso, caracterizado por incluir as seguintes etapas: (a) redução do referido papel impresso a pasta de papel, até atingir uma consistência superior a cerca de 3%, de modo a obter uma pasta de papel; (b) tratamento da pasta de papel com pelo menos uma celulase de componente único, embora não em presença de produtos químicos de eliminação de tintas seleccionados a partir do grupo constituído por hidróxido sódico, silicato sódico e peróxido, numa quantidade suficiente para libertar as tintas, os acetinados e os tóneres da referida pasta de papel; e (c) separação das tintas, dos acetinados e dos tóneres libertados da pasta de papel.
2. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a consistência de acordo com a etapa (a) ser de entre 3,5% e 40%.
3. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a consistência de acordo com a etapa (a) ser de entre 10% e 20%.
4. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o pH da pasta de papel de acordo com a etapa (a) ser superior a 6.5.
5. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o pH da pasta de papel de acordo com a etapa (a) ser superior a 8.5.
6. Método de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por incluir, além disso e antes de ser levada a cabo a etapa (b), a redução do pH da pasta de papel de acordo com a etapa (a) até que seja de entre 6.5 e 8.5, através da adição de um agente acidifícante. 1
7. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o referido papel impresso ser reduzido a pasta de papel de acordo com a etapa (a) durante um período de tempo de entre 2 e 10 minutos.
8. Método de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por incluir, além disso, durante o tratamento enzimático da referida pasta de papel de acordo com a etapa (b), a redução da referida pasta de papel durante pelo menos 20 minutos.
9. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o referido papel impresso ser reduzido a pasta de papel de acordo com a etapa (a) durante pelo menos 20 minutos.
10. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por incluir, além disso, após a realização da etapa (a), a diluição da pasta de papel pelo menos duas vezes.
11. Método de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por se proceder à diluição da pasta de papel antes de se levar a cabo a etapa (b).
12. Método de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por se proceder à diluição da pasta de papel depois de se levar a cabo a etapa (b).
13. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a celulase de componente único ser a endo-C]-D-l,4-glucanase.
14. Método de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por a endo-D-D- 1.4- glucanase ter capacidade para catalizar a hidrólise da celotriose.
15. Método de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por a endo-D-D- 1.4- glucanase ser um derivado da Humicola insolens. 2
16. Método de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por a endo-D-D- 1.4- glucanase ser a Endoglucanase I.
17. Método de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por a endo-D-D- 1.4- glucanase ser a Endoglucanase V.
18. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a celulase de componente único ser uma celobiohidrolase.
19. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se proceder ao tratamento da pasta de papel com uma celulase de componente único de acordo com a etapa (b) durante pelo menos cinco minutos.
20. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se proceder ao tratamento da pasta de papel com uma celulase de componente único de acordo com a etapa (b) a uma temperatura de entre 30° C e 75° C.
21. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por as tintas, os acetinados e os tóneres libertados serem separados da pasta de papel através de flutuação.
22. Método de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por, após a etapa de flutuação, se proceder à lavagem da referida pasta de papel.
23. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por incluir o tratamento da pasta de papel com mais de uma celulase de componente único. 3
24. Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por incluir, além disso, o tratamento da pasta de papel de acordo com a etapa (a) com uma celulase de componentes múltiplos.
25. Método destinado a eliminar tintas, acetinados e tóneres de papel impresso, caracterizado por incluir as seguintes etapas: (a) adição de pelo menos uma celulase de componente único, embora não em presença de produtos químicos de eliminação de tintas seleccionados a partir do grupo constituído por hidróxido sódico, silicato sódico e peróxido, numa quantidade suficiente para libertar as tintas, os acetinados e os tóneres do papel impresso suspenso em água para o referido papel impresso suspenso; (b) tratamento simultâneo do papel impresso suspenso de acordo com a etapa (a) com a referida celulase de componente único e redução do referido papel impresso a pasta de papel até atingir uma consistência superior a 3%, de modo a obter a pasta de papel; e (c) separação das tintas, dos acetinados e dos tóneres libertados da pasta de papel. Lisboa, 3 de Julho de 2001.

Adjunto do Agente Oficiei d· Propriedade Indus/rial R. D. João V, 9-2° dt.°-í260 LISBOA 4