PT784684E - ''péptidos recontinantes derivados do anticorpo mc3 anti-ba46, métodos para a sua utilização e métodos de hmnanização de péptidos do anticorpo'' - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Péptidos recombinantes derivados do anticorpo Mc3 anti-BA46, métodos para a sua utilização e métodos de humanização de péptidos do anticorpo"

Campo Técnico

Este invento refere-se ao diagnóstico e terapia de tumores neoplásicos, particularmente carcinomas da mama humanos, bem como ao campo de engenharia de proteínas particularmente a humanização de anticorpos.

Antecedentes do Invento 0 glóbulo gordo do leite humano (HMFG) pode ser utilizado como fonte de material antigénico para a preparação tanto de anticorpos policlonais como monoclonais para utilizar no diagnóstico e tratamento de cancro da mama, bem como no estudo da superfície de células epiteliais da mama e do processamento dos seus componentes antigénicos. A membrana do glóbulo gordo é derivada da superfície apical da célula epitelial mamária durante a lactação (Patton, S., et al., Biochim. Biophys. Acta 415: 273-309, 1975). Como resultado, o HMFG, tem sido uma fonte para o isolamento de glicoproteínas membranares da mama (Taylor, P. J., et al., Int. J. Câncer 28: 17-21, 1981). Utilizando o HMFG membranar como imunogénio, foram preparados anti-soros policlonais que se provou terem especificidade para células epiteliais da mama após absorção com tecido sem ser da mama. Estes anti-soros policlonais ligaram-se especificamente a três glicoproteínas de peso molecular de 150, 70 e 46 kDa, respectivamente (Ceriani, R.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 582-6, 1977).

Foram utilizados anticorpos monoclonais contra o HMFG na identificação de um novo componente da superfície de células epiteliais da mama, uma glicoproteína semelhante a mucina de grande peso molecular, que foi designada glicoproteína não penetrante ou NPGP (Peterson, J.A. et al., Hybridoma 9: 221-35, 1990; e Ceriani, R.L., et al., Somatic Cell Genet. 9: 415- 2 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 27, 1983) . Esta molécula foi utilizada como alvo em radioimunoterapia de cancro da mama (Kramer, E.L., et al., J. Nucl. Med. 34: 1067-74, 1993; e Ceriani, R.L., et al., Câncer Res. 48: 4664-72, 1988), no desenvolvimento de um ensaio sérico para diagnóstico de cancro da mama (Ceriani, R.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5420-4, 1982; e Ceriani, R.L., et al., Anal. Biochem. 201: 178-84, 1992) e em prognóstico de cancro da mama utilizando imuno-histoquimica (Ceriani, R.L., et al., Int. J. Câncer 51: 343-54, 1992). Esta glicoproteina não penetrante (NPGP) parece ser extremamente antigénica em ratinhos. Verificou-se que a grande maioria de anticorpos monoclonais preparados contra HMFG bem como tumores da mama tem especificidade contra diferentes epitopos desta mucina.

Contudo, as proteínas de menor peso molecular do HMFG parecem também ser importantes marcadores de superfície para células epiteliais da mama. Os antigénios de HMFG de 46 kDa e 70 kDa também se encontram no soro de pacientes de cancro da mama e podem assim ser utilizados como marcadores para cancro da mama em ensaios séricos. Adicionalmente, verificou-se que o componente de 70 kDa co-purifiçava com o complexo NPGP intacto e mostrou-se que estava ligado a NPGP através de ligações dissulfureto.

No entanto, poucos anticorpos monoclonais foram preparados contra os componentes mais pequenos do sistema do glóbulo gordo do leite humano, tal como os antigénios de HMFG de 70 kDa e 46 kDa. Embora, Peterson, J.A., et al., Hybridoma 9: 221-35, 1990 tenham sido capazes de gerar um grupo de anticorpos monoclonais contra HMFG que detectou o antigénio de HMFG de 46 kDa, incluindo o anticorpo Mc3. Verificou-se que o componente do sistema de HMFG de 46 kDa, também conhecido como BA46, estava presente no soro de pacientes de cancro da mama (Salinas, F.A., et al., Câncer Res. 47: 907-13, 1987), e verificou-se que um aumento de BA46 em circulação estava associado a uma maior carga tumoral. Adicionalmente, BA46 tem sido uma molécula alvo em radioimunoterapia experimental de tumores da mama humanos transplantados em ratinhos nus (Ceriani, R.L. et al., Câncer Res. 48: 4664-72, 1988). 3 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Nalguns carcinomas da mama, existe uma sobre-expressão do antigénio BA46 (Larocca, D. et ai., Câncer Res. 51: 4994-8, 1991). Também, no leite humano BA46 parece ter actividade anti-rotavírus que pode envolver a ligação a rotavírus (Yolken, R.H., et ai., J. Clin. Invest. 90: 1984-91, 1992) e que pode interferir com infecções virais em recém-nascidos.

Foi anteriormente relatada uma sequência de ADNc parcial de BA46 (Larocca, D., et ai., Câncer Res. 51: 4994-8, 1991) que colocou BA46 numa família de proteínas possuindo domínios semelhantes a C1/C2 dos factores V/VIII aparentados com discoidina I (Johnson, J.D., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5677-81, 1993). Os parentes mais próximos de BA46 podem ser encontrados entre as proteínas MGF-E8 de murídeo (Stubbs, J.D., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8417-21, 1990), os componentes de bovino 15/16 (Mather, I.H., et ai., Biochem. Mol. Biol. Int. 29: 545-54, 1993) e GP55 de cobaia (Mather, I.H., et ai., Biochem. Mol. Biol. Int. 29: 545-54, 1993) .

Estudos de clonagem de ADNc e de adesão celular in vitro, proporcionam provas de que BA46 é uma glicoproteína da membrana de células epiteliais da mama envolvida em interaeções intercelulares. BA46 situa-se na fraeção membranar quando isolada de células de carcinoma da mama (Larocca, D. et ai., Câncer Res. 51: 4994-8, 1991). Muito provavelmente BA46 interage com integrinas da membrana através do seu domínio semelhante a EGF contendo RGD.

Os carcinomas resultam da transformação carcinogénica de células de diferentes epitélios. Duas das características mais danificadoras dos carcinomas são o seu crescimento descontrolado e a sua capacidade para criar metástases em locais distantes do hospedeiro, particularmente num hospedeiro humano. São habitualmente estas metástases distantes que causam graves consequências ao hospedeiro, uma vez que frequentemente o carcinoma primário pode habitualmente ser removido através de cirurgia. O tratamento de carcinomas metastáticos, que raramente são removíveis, depende de terapia de irradiação e de terapias sistémicas de diferentes naturezas. As terapias sistémicas incluem presentemente, quimioterapia, radiação, terapia hormonal, agentes e 4 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ procedimentos farmacêuticos de reforço da imunidade, hipertermia e tratamento sistémico com anticorpos monoclonais. No último caso as proteínas dos anticorpos podem ser marcadas com elementos radioactivos, imunotoxinas e fármacos quimioterapêuticos.

Anticorpos monoclonais marcados radioactivamente foram inicialmente utilizados com sucesso em linfomas e leucemia e recentemente nalguns carcinomas. 0 conceito subjacente à utilização de anticorpos marcados é que o anticorpo marcado procurará e ligar-se-á especificamente ao carcinoma e o elemento radioactivo irradiará o tumor in situ. Uma vez que as partículas descarregadas durante o decaimento radioactivo viajam alguma distância através dos tumores não é necessário que todas células do carcinoma se liguem ao anticorpo marcado. A especificidade dos anticorpos monoclonais permite o tratamento selectivo do tumor ao mesmo tempo que evita a irradiação de tecidos não malignos. A utilização de radiação sistémica e de agentes quimioterapêuticos sem agentes direccionadores produz graves efeitos secundários tóxicos em tecidos normais, não malignos, tornando estas terapias indesejáveis para carcinomas e a utilização de anticorpos monoclonais radiomarcados é uma alternativa válida.

Anticorpos criados contra epítopos humanos foram utilizados para o diagnóstico e a terapia de carcinomas. São também conhecidos métodos para preparação de anticorpos tanto policlonais como monoclonais. Exemplos dos últimos são BrE-2, BrE-3 e KC-4 (p. ex., Patente US Nos 5077220, 5075219 e 4708930).

Sumário do Invento O presente invento proporciona péptidos recombinantes que se ligam especificamente e selectivamente ao antigénio do glóbulo gordo do leite humano (HMFG), BA46. Em particular, o presente invento proporciona variantes recombinantes do anticorpo Mc3, incluindo versões humanizadas de Mc3. Os péptidos Mc3 variantes são particularmente úteis para diagnóstico, prognóstico e aplicações terapêuticas no campo do cancro da mama. 5 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Os anticorpos Mc3 humanizados que mantêm a capacidade para se envolverem numa ligação de alta afinidade com o seu antigénio cognato podem ser produzidos através de novos métodos para a humanização de anticorpos. Tal humanização permite a utilização destes anticorpos para aplicações de imunodiagnóstico e imunoterapia em humanos. Várias concretizações preferidas do presente invento são enumeradas abaixo. 1. Um anticorpo Mc3 recombinante que se liga especificamente ao antigénio BA46 do glóbulo gordo do leite humano (HMFG), compreendendo o referido anticorpo: i) uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de Mc3 de murideo mostrada na Figura 12 ou uma sua variante em que pelo menos um mas menos de 30 resíduos de aminoácido foram humanizados e em que os resíduos de aminoácido dentro das CDR, os resíduos de aminoácido que contactam com as CDR e os resíduos de aminoácido que contactam com uma cadeia oposta do anticorpo são resíduos de aminoácido de murideo; e ii) uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de Mc3 de murideo mostrada na Figura 13 ou uma sua variante em que pelo menos um mas menos de 30 resíduos de aminoácido foram humanizados e em que os resíduos de aminoácido dentro das CDR, os resíduos de aminoácido que contactam com as CDR e os resíduos de aminoácido que contactam com uma cadeia oposta do anticorpo são resíduos de aminoácido de murideo; e em que pelo menos um resíduo de aminoácido oculto dentro da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve foi humanizado.

De preferência, existem entre cerca de 3 e 25 resíduos de aminoácido humanizados, de preferência entre cerca de 5 e 20, sendo ainda preferível entre cerca de 7 e 17. As regiões variáveis são humanizadas de acordo com a técnica de modificação do resíduo oculto, tal como descrito abaixo. De preferência, todas as variantes de Mc3 do presente invento mantêm um nível de avidez que é pelo menos cerca de 20% o do anticorpo de partida (i.e. o Mc3 de murideo), de preferência 6 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ pelo menos cerca de 40%, sendo ainda preferível pelo menos cerca de 60%, sendo ainda mais preferido pelo menos cerca de 80%, de maior preferência pelo menos cerca de 90%. O termo "recombinante" refere-se ao facto dos anticorpos do presente invento não serem de ocorrência natural e serem os produtos das técnicas recombinantes. 2. Um anticorpo Mc3 de murídeo recombinante de acordo com a concretização 1, em que pelo menos um dos referidos aminoácidos humanizados foi substituído pelo aminoácido correspondente da sequência de consenso humana apropriada da Fiqura 12 ou 13, para uma reqião variável da cadeia pesada ou leve, respectivamente. Podem também ser utilizados resíduos humanos não de consenso mas vulgarmente observados, mas os resíduos de consenso são os mais preferidos. 3. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com a concretização 1 ou 2, em que tanto a região variável da cadeia pesada como a região variável da cadeia leve são variantes das sequências de aminoácidos de Mc3 de murídeo tal como definido na concretização 1. 4. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com a concretização 3, em que o anticorpo compreende ainda uma região constante do anticorpo ou outro agente efector. Qualquer um de uma variedade de agentes efectores pode ser unido aos anticorpos do presente invento, tal como descrito abaixo. Por exemplo, o agente efector pode ser uma citoquina, enzima, toxina, um radioisótopo ou marcador fluorescente. 5. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com a concretização 4 em que a região constante é uma região constante de um anticorpo humano. 6 . Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações anteriores em que pelo menos cinco dos resíduos de aminoácido nas regiões variáveis da cadeia pesada ou da cadeia leve foram substituídos pelos aminoácidos correspondentes da sequência de consenso humana apropriada da Figura 12 ou 13 para uma região variável da cadeia pesada ou leve, respectivamente. 7 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 7. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações anteriores, em que na região variável da cadeia pesada pelo menos metade dos residuos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 12 foram substituídos pelos residuos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 12. 8. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações anteriores, em que na região variável da cadeia leve pelo menos metade dos residuos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 13 foram substituídos pelos residuos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 13. 9. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com a concretização 5, em que na região variável da cadeia pesada pelo menos 90% dos residuos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 12 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 12; e na região variável da cadeia leve pelo menos 90% dos resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 13 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 13. 10. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com a concretização 9 em que todos os resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 12 ou 13, para as cadeias pesada e leve, respectivamente. 11. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações anteriores e um transportador farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte. Ver, p. ex., "Remington' s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, p.a. 12. Um ácido nucleico codificando uma região variável da cadeia pesada ou leve variante tal como definido na concretização 1, em que pelo menos um resíduo de aminoácido oculto foi humanizado. 8 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 13. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a concretização 12 compreendendo a região de codificação da sequência nucleotidica mostrada na Figura 18 ou 19. As regiões de codificação são as mostradas em letras maiúsculas. 14. Um método in vitro de detecção da presença de um antigénio de HMFG ou de um seu fragmento de ligação, compreendendo: proporcionar uma amostra biológica suspeita de compreender o antigénio ou um seu fragmento; adicionar à amostra um anticorpo de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 10 sob condições eficazes para formar um complexo anticorpo-antigénio; e detectar a presença de qualquer complexo anticorpo-antigénio formado. 15. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 10 para utilização num método de diagnóstico da presença num indivíduo de um antigénio de hmfg ou de um seu fragmento de ligação, compreendendo: administrar ao indivíduo o referido anticorpo sob condições eficazes para o entregar numa área do corpo do indivíduo suspeita de conter um antigénio de HMFG ou um seu fragmento de ligação para formar um complexo anticorpo-antigénio; e detectar a presença do referido complexo anticorpo-antigénio formado. 16. Um anticorpo Mc3 recombinante de acordo com qualquer uma das concretizações 1 a 10 para utilizar num método de entrega de um agente a um local alvo que contenha um antigénio de HMFG compreendendo: ligar o referido agente ao referido anticorpo numa posição diferente da do local de ligação ao antigénio para criar um complexo agente-anticorpo; e introduzir o complexo agente-anticorpo no ambiente do referido local alvo sob condições adequadas para ligação de um anticorpo ao seu antigénio cognato. 9 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 17. Um anticorpo de acordo com a concretização 16, em que o local alvo está dentro do corpo de um indivíduo humano e a introdução de um complexo agente-anticorpo compreende a administração do complexo ao referido indivíduo.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra estruturas Fab para as quais estão disponíveis coordenadas no Banco de Dados de Proteínas ("Protein Data Bank").

As Figuras 2 e 3 ilustram os resíduos estruturais de VL e VH, respectivamente, que contactam com resíduos da CDR em Fab de estrutura tridimensional conhecida. A Figura 4 ilustra resíduos estruturais que contactam com resíduos estruturais no domínio oposto em Fab de estrutura tridimensional conhecida.

As Figuras 5 e 6 ilustram resíduos estruturais ocultos nas regiões VL e VH, respectivamente, de Fab de estrutura tridimensional conhecida. A Figura 7 ilustra anticorpos humanos que são muito semelhantes na sequência a anticorpos de murídeo de estrutura tridimensional conhecida.

As Figuras 8 (de SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO:18) e 9 (de SEQ ID N0:19 a SEQ ID NO:45) ilustram resíduos estruturais em Vl e VH, respectivamente, que provavelmente necessitam de ser conservados para reproduzir as propriedades de ligação ao ligando do anticorpo original.

As Figuras 10 (SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:47) e 11 (SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:49) ilustram as sequências nucleotídicas e as correspondentes sequências de aminoácidos das regiões VH e Vl, respectivamente, de Mc3 e dos seus respectivos péptidos líder. Os nucleótidos e aminoácidos são mostrados nos códigos de uma letra padrão. Os aminoácidos em minúsculas representam os péptidos líder. Os nucleótidos em minúsculas representam sobreposições das sequências dos iniciadores e podem, portanto, não corresponder às sequências naturais. 10 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

As Figuras 12 e 13 ilustram o protocolo de humanização (técnica de modificação do resíduo oculto) utilizado para modificar as regiões VH e vL, respectivamente, do anticorpo Mc3.

As Figuras 14 (SEQ ID NO:47) e 15 (SEQ ID NO:49) ilustram as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do anticorpo Mc3, respectivamente, humanizadas de acordo com a técnica de manutenção do resíduo oculto.

As Figuras 16 (de SEQ ID NQ:50 a SEQ ID NO:55) e 17 (de SEQ ID NO:56 a SEQ ID NO:61) ilustram os iniciadores utilizados na construção de genes codificando o anticorpo Mc3 humanizado (HuMc3).

As Figuras 18 (SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63) e 19 (SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:65) ilustram as sequências nucleotídica e proteica derivada das regiões vH e VL, respectivamente, de HuMc3V2. A Figura 20 ilustra os resultados de um ensaio de competição entre MuMc3 (anticorpo Mc3 de murídeo de tipo selvagem) ou HuMc3 (anticorpo Mc3 humanizado) e 125I-MuMc3. A Figura 21 ilustra os resultados de estudos de biodistribuição em ratinhos nus possuindo o tumor da mama transplantável MX-1 humano, mostrando a localização de IgG de controlo, MuMc3 e HuMc3 marcados com 125l a 1, 2, 4 e 8 dias após a injecção. A Figura 22 ilustra os resultados de estudos de radioimunoterapia em ratinhos possuindo o tumor MX-1. HuMc3 marcado com 131l conteve ou reduziu a massa tumoral em animais tratados, enquanto que em animais não tratados o tumor cresceu até ~20 vezes o tamanho original. A Figura 23 ilustra os resultados de estudos de biodistribuição em ratinhos possuindo o tumor MX-1, nos quais MuMc3 e HuMc3 foram radiomarcados com inln utilizando o quelante MXDTPA. 11 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Descrição Detalhada do Invento O anticorpo Mc3 oferece uma considerável promessa para utilizar na imunodetecção e imunoterapia de cancro da mama. Sabe-se que Mc3 se liga ao antigénio BA46 no glóbulo gordo do leite humano. Ver R. Ceriani et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5420-5424, 1982); R. Ceriani et al., Somatic Cell Genetícs 9: 415-427, 1983); R. Ceriani e E. Blank, Câncer Res. 48: 4664-4672, 1988); e J. Peterson et al., Hybridoma 9: 221-235, 1990) . Ver também a Publicação Internacional WO 92/07939, publicado a 14 de Maio de 1992, por Ceriani e Peterson (descrevendo o antigénio BA46).

Variantes recombinantes do anticorpo monoclonal Mc3 seriam especialmente úteis para proporcionar uma variedade de agentes de imunodiagnóstico e imunoterapia relacionados com Mc3. Uma classe particularmente desejável de tais variantes é a dos derivados "humanizados" de Mc3 que retêm a capacidade para interagir com o antigénio de hmfg BA46 com elevada especificidade e avidez; mas que exibem uma reduzida imunogenicidade em humanos. Contudo, sem se conhecer as sequências de aminoácidos das cadeias do anticorpo Mc3 (em particular das suas regiões variáveis) e sem ter as sequências de ADN disponíveis, não é praticável desenvolver tais variantes.

Tal como descrito abaixo, os presentes inventores clonaram e sequenciaram as regiões críticas do anticorpo Mc3 e descreveram agora e permitiram uma variedade de péptidos variantes de Mc3.

Adicionalmente, tal como descrito abaixo, os presentes inventores desenvolveram uma nova técnica de humanização para preparação de variantes de Mc3 nas quais a tendência para provocar uma reacção de anticorpo humano anti-ratinho (HAMA) em humanos é drasticamente reduzida ou eliminada. A técnica resultou na criação de uma classe especialmente preferida de variantes de Mc3 humanizadas nas quais determinados resíduos de aminoácido na região estrutural da cadeia variável foram selectivamente humanizados. Mostrou-se que estas variantes humanizadas de Mc3 permaneciam bastante eficazes na ligação ao seu antigénio cognato. 12 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Preparação de Péptidos Recombinantes de Mc3

Os presentes inventores seleccionaram a seguinte estratégia para a preparação e produção dos péptidos recombinantes e híbridos do presente invento. Os ADNc que codificam as regiões variáveis do anticorpo, VL e VH, das cadeias leve e pesada, respectivamente, podem ser obtidos através do isolamento de ARNm de uma célula de hibridoma e da transcrição inversa do ARNm, amplificação do ADNc através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e inserção do ADN num vector para sequenciação opcional, e para corte com enzimas de restrição. Em geral, ambas as regiões variáveis VL e VH são necessárias para reproduzir eficazmente as propriedades de ligação de um anticorpo. Existem dois tipos de regiões VL intimamente aparentados (dependendo de se a Vl é derivada da cadeia leve capa ou lambda) e estes são ainda subdivididos por convenção em várias familias de sequências (ver Kabat et al., 1991). Existem também várias familias de sequências para VH (id.) .

Os ADNc da região variável podem então ser modificados com iniciadores previamente desenhados utilizados para os amplificar por PCR ou sintetizá-los de novo, clonados num vector possuindo opcionalmente sequências de ADN codificando, p. ex., uma ou mais regiões constantes, opcionalmente sequenciados e depois transfectados para uma célula hospedeira para expressão do produto do gene recombinante. As características de especificidade da ligação dos péptidos recombinantes podem então ser determinadas e comparadas às dos anticorpos originalmente isolados.

Tendo a sequência disponível, pode-se aplicar qualquer uma de várias técnicas para a produção de variantes do anticorpo Mc3 que mantêm a ligação ao antigénio mas exibem outras características que as tornam mais desejáveis para determinadas utilizações de diagnóstico e/ou terapêuticas. Uma classe especialmente preferida de tais variantes aqui descritas são variantes humanizadas nas quais as regiões variáveis das cadeias leve e/ou pesada foram modificadas para tornar menos provável que provoquem qualquer resposta imunogénica (HAMA) em humanos. Tais variantes são assim mais 13 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ úteis para administração in vivo. Embora possam ser utilizados vários protocolos de humanização diferentes, tal como aqui descrito, desenvolvemos uma nova técnica para humanização de anticorpos que é especialmente útil porque conseque dois objectivos altamente desejáveis mas frequentemente conflituosos: (i) humanização de tantos residuos quanto possível para reduzir a probabilidade de imunoqenicidade; e (ii) manutenção da avidez do anticorpo heterólogo original. A prática do presente invento empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante e imunologia, que estão dentro da perícia na arte. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver p. ex., Sambrook, Fritsch e Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, 1989; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait Ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Ed., 1987); a série "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Gene Transfer Vectors for Mamalian Cells", (J.M. Miller e m.p. Calos Eds., 1987); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir e C.C. Blackwell, Eds.); "Cellular and Molecular Immunology" (A.K. Abbas, A.H. Lichtman e J.S. Pober, 1991 e 1993); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Siedman, J.A. Smith e K. Struhl Eds., 1987 e 1993); e "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach e w. Strober Eds., 1991).

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações aqui mencionadas, tanto supra como infra, são deste modo aqui incorporados por referência.

Para fins de ilustração tanto da potencial utilização dos anticorpos variantes aqui descritos, como da significância da expansão da sua utilidade através da humanização, pode-se considerar a utilização de radioimunoconjugados de tais anticorpos em aplicações tanto de diagnóstico como terapêuticas. Como exemplo, sabe-se que os anticorpos BrE-3 (Peterson et al., Hybridoma 9: 221, 1990; e a Patente U.S. N.° 5075219 por Ceriani e Peterson) se ligam preferencialmente a tumores de carcinomas neoplásicos porque os tumores expressam uma forma não glicosilada da mucina epitelial da mama que não 14 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ é expressa em tecido epitelial normal. Esta ligação preferencial combinada com uma baixa concentração de epítopo para estes anticorpos na circulação de pacientes de carcinoma, tais como pacientes de cancro da mama, torna os anticorpos possuindo especificidade para um epítopo de mucina uma radioimunoterapia do carcinoma potencialmente eficaz. Um radioimunoconjugado 90Y-BrE-3 provou ser altamente eficaz contra carcinomas da mama humanos transplantados para ratinhos nus. Estudos clínicos humanos mostraram que o radioimunoconjugado 90Y-BrE-3 reduz consideravelmente o tamanho de metástases de tumores da mama sem quaisquer efeitos secundários tóxicos imediatos. Para além disso, um radioimunoconjugado mIn-BrE-3 foi utilizado com sucesso para imagiologia de 15 pacientes de cancro da mama, proporcionando um direccionamento excelente para o tumor em 13 dos 15 pacientes. De todas as metástases de tumor da mama que ocorreram noutro estudo, 86% foram detectadas por mIn-BrE-3. Infelizmente, 2 a 3 semanas após o tratamento, os pacientes desenvolveram uma forte resposta de anticorpos humanos anti-murídeo (HAMA) que impediu mais administração do radioimunoconjugado. A resposta HAMA, que é observada para numerosos anticorpos monoclonais de murídeo, exclui qualquer administração de longo prazo de anticorpos de murídeo a pacientes humanos. De modo semelhante, outros anticorpos heterólogos, quando administrados a humanos, provocaram respostas de anticorpos semelhantes. A resposta humana anti-heterólogos é assim um factor substancial que limita a utilização bem sucedida de anticorpos monoclonais heterólogos como agentes terapêuticos.

Humanização de Anticorpos

Com base nos estudos descritos acima e outros, é aparente que em muitos casos os anticorpos monoclonais podem apenas ser administrados uma vez a um indivíduo devido aos efeitos prejudiciais de provocar uma resposta imunogénica. Isto é verdade para a maioria dos anticorpos heterólogos a administrar a animais mamíferos.

Foram feitas várias tentativas diferentes num esforço para contornar estes problemas, incluindo o desenvolvimento dos designados "anticorpos quiméricos" e dos "anticorpos com 15 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ CDR enxertadas" e tentativas para gerar linhas monoclonais de hibridoma humanas. Estes esforços tiveram apenas um sucesso limitado. Os "anticorpos quiméricos" são fusões directas entre dominios variáveis de uma espécie e os dominios constantes de outra. Mostrou-se que os anticorpos quiméricos murideo/humano são menos imunogénicos em humanos que os anticorpos de murideo inteiros, mas, contudo, nalguns casos é montada uma resposta imunitária à região variável de murideo. Outra redução da natureza "estranha" ou heteróloga dos anticorpos foi conseguida através do "enxerto" apenas das CDR, de um anticorpo monoclonal de murideo numa estrutura de suporte humana (i.e. a região estrutural ou "FR") antes da sua subsequente fusão com um domínio constante apropriado (Pedido de Patente Europeia, Publicação N.° 239400 para Winter; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988). No entanto, os procedimentos empregues para conseguir o enxerto das CDR podem produzir anticorpos "humanizados" que não são tão eficazes na ligação ao antigénio. Isto é, os anticorpos com CDR enxertadas resultantes tendiam a perder avidez (em muitos casos até menos de um terço da avidez original). O terceiro tipo de técnica, a utilização de linhas de hibridoma monoclonais humanas, também não foi geralmente satisfatório. Em particular, as linhas celulares monoclonais de hibridoma humano não eram muito estáveis e não eram, portanto, adequadas para produção repetida em grande escala de anticorpos monoclonais.

Uma técnica melhorada para a humanização de anticorpos monoclonais está descrita na Publicação Internacional WO 94/11509, publicada a 26 de Maio de 1994 por Couto et al. Esta técnica, aqui referida como "técnica de manutenção do resíduo oculto" ou "técnica BR-R", é também descrita abaixo.

Outra técnica melhorada para a humanização de anticorpos monoclonais é aqui descrita. Utilizando esta nova técnica, referida como "técnica de modificação do resíduo oculto" ou "técnica BR-M", produzimos péptidos Mc3 humanizados, tal como descrito abaixo. Surpreendentemente, embora a técnica de modificação do resíduo oculto envolvesse a humanização de ainda mais resíduos que a técnica BR-R descrita anteriormente e se esperasse assim que reduzisse mais a possibilidade de provocar uma resposta HAMA em humanos, mostrou-se que a variante do anticorpo Mc3 humanizada resultante mantém 16 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ substancialmente toda a avidez do anticorpo de murideo original. Uma descrição destas técnicas e aplicações ilustrativas são proporcionadas abaixo.

Como assunto geral, as caracteristicas de ligação ao ligando de um local de combinação do anticorpo são determinadas pela estrutura e disposição relativa das CDR, embora se tenha também verificado que alguns resíduos vizinhos estão envolvidos na ligação ao antigénio (Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439-473, 1990). Os derivados humanizados de anticorpos não humanos assentam em graus variáveis nas regiões determinantes de complementaridade (CDR) para proporcionar afinidade de ligação ao ligando do anticorpo, e nos resíduos estruturais (FR) que suportam as CDR para ditar a sua disposição relativamente umas às outras. A análise cristalográfica de numerosas estruturas de anticorpos revelou que o local de ligação antigénio/anticorpo é composto quase inteiramente pelos resíduos das CDR. A necessidade das CDR para formar estas estruturas, combinada com a apreciada hipervariabilidade da sua sequência primária, conduz a uma grande diversidade no local de combinação com o antigénio.

Estudos de cristalografia de raios X demonstram que as estruturas de esqueleto da Fv de diferentes anticorpos assumem uma estrutura canónica independentemente da espécie de origem, sequência de aminoácidos ou especificidade do ligando. Isto é geralmente tido como prova de que as caracteristicas da ligação ao ligando de um local de combinação de um anticorpo são determinadas primeiramente pela estrutura e disposição relativa das CDR, embora alguns resíduos estruturais vizinhos possam também estar envolvidos na ligação ao antigénio. Assim, se for pretendido conservar a especificidade fina de um anticorpo, as suas estruturas das CDR e provavelmente alguns dos resíduos vizinhos, a sua interacção umas com as outras e com o resto dos domínios variáveis, têm também de ser mantidos. Estes estudos de cristalografia apontam para a possível necessidade de reter a maior parte, se não todos estes resíduos.

Embora no início a necessidade de reter estes aminoácidos possa parecer impedir o alcance do objectivo de diminuir a imunogenicidade através de "humanização", o número de 17 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ aminoácidos real que tem de ser mantido é normalmente relativamente pequeno devido à forte semelhança entre, por exemplo, as regiões variáveis humanas e de murideo.

Utilizando a técnica de manutenção do residuo oculto ("BR-R") ou a técnica de modificação do resíduo oculto ("BR-M"), a humanização da região variável de um anticorpo não humano, p. ex., um anticorpo de murideo, começa com a identificação dos aminoácidos xenogénicos "importantes" a manter. Tanto na técnica BR-R como na técnica BR-M, os resíduos de aminoácido que estão envolvidos na ligação ao antigénio, ou que contactam as CDR e/ou uma cadeia oposta do anticorpo são colocados na categoria de resíduos "importantes" a deixar na sua forma original, p. ex., na forma de murideo.

No entanto, os dois métodos diferem grandemente, em relação ao seu tratamento dos residuos de aminoácido ocultos, i.e. aqueles possuindo cadeias laterais que não estão expostas à superfície da molécula. Em particular, a técnica BR-R foi baseada em parte nas duas seguintes proposições: (i) não se espera que os residuos de aminoácido ocultos contribuam substancialmente para a antigenicidade do anticorpo (p. ex., a resposta HAMA provocada por um anticorpo monoclonal de murideo); e (ii) a variação de tais resíduos ocultos poderá destruir a estrutura subjacente da cadeia do anticorpo, diminuindo ou destruindo assim a avidez original pela qual foi seleccionado. Assim, na técnica br-r, estes resíduos ocultos não são modificados em relação à sua forma original. Assim, por exemplo, aplicando a técnica BR-R à humanização de um anticorpo de murideo, os resíduos ocultos seriam deixados como estão na sua forma original de murideo. Depois, entre os resíduos expostos, os resíduos que constituem as CDR e os resíduos estruturais que contactam com as CDR e/ou a outra cadeia, seriam mantidos. Os outros resíduos expostos seriam de preferência humanizados. 0 método BR-M envolve tomar a decisão oposta em relação aos resíduos ocultos. Isto é, em vez de manter os resíduos ocultos na sua forma original (p. ex. na forma de murideo), estes são, de preferência, humanizados através da substituição por aminoácidos correspondentes a esses num modelo humano de consenso. 0 método BR-M foi aqui empregue na produção de 18 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ anticorpos humanizados preferidos derivados de Mc3. Inesperadamente, esta humanização adicional (que deve reduzir mais a possibilidade de uma resposta HAMA em humanos) não destruiu a capacidade das CDR para se ligarem ao antigénio cognato. Pelo contrário, tal como ilustrado abaixo, os anticorpos Mc3 humanizados produzidos através do método BR-M exibiram uma ligação com elevada avidez especifica a BA46 que era totalmente comparável com a do anticorpo de murideo original.

Embora tenha sido considerado improvável que os resíduos ocultos contribuíssem para a imunogenicidade, os presentes inventores acreditam que tais resíduos podem de facto influenciar a imunogenicidade, apesar de o modo pelo qual o fazem possa ser indirecto. Em particular, mesmo se um resíduo for relativamente inacessível ao solvente, pode contudo exercer um efeito de "empurrão" ou "puxão" nos resíduos superficiais próximos. Por outras palavras, embora os resíduos ocultos não contribuam para a estrutura primária da superfície do anticorpo, podem muito bem afectar a sua forma. Uma vez que a forma pode por sua vez influenciar a imunogenicidade, os presentes inventores realizaram a modificação dos resíduos ocultos num esforço para criar um anticorpo mais "humano". Utilizando a nossa técnica BR-M, tivemos sucesso a alcançar tal humanização sem sacrificar a avidez do anticorpo heterólogo. A humanização de um determinado resíduo é alcançada através da modificação desse resíduo para se parecer com um resíduo verificado na localização correspondente num "modelo humano de consenso". 0 modelo humano de consenso é determinado por comparação com uma variedade de anticorpos humanos tal como ilustrado abaixo.

Os resíduos importantes podem ser identificados a partir de uma estrutura tridimensional bem caracterizada. No entanto, quando não estão disponíveis dados estruturais directos, é possível utilizando a presente metodologia prever a localização de resíduos estruturais importantes através da análise de outras estruturas de anticorpos aparentados, especialmente aqueles cujas regiões variáveis pesada e leve pertencem à mesma classe. As classes de regiões variáveis 19 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ podem ser determinadas a partir da sua sequência de aminoácidos.

Um método através do qual estes aminoácidos importantes são identificados foi descrito para o caso dos aminoácidos com cadeias laterais ocultas por Padlan, E.A. (Padlan, E.A., "A Possible Procedure for Reducing the Immunogenicity of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology 28: 489-494, 1991). As estruturas da região variável de vários anticorpos foram comparadas utilizando um programa de computador que determina a acessibilidade ao solvente dos resíduos estruturais bem como os seus contactos com o domínio oposto tal como descrito por Padlan, E.A. (1991), supra. 0 exame de tal acessibilidade ao solvente em fracções revela uma semelhança muito próxima nos padrões de exposição dos domínios VH e VL. Posto em termos simples, independentemente do anticorpo particular em questão e da sua sequência de aminoácidos, os resíduos ocultos ocupam posições relativamente semelhantes na maioria dos anticorpos.

Uma análise semelhante pode ser feita através de modulação em computador, para determinar quais os aminoácidos que contactam com as CDR e quais os que contactam com o domínio oposto. Neste ponto, as estruturas Fab que estão actualmente no banco de dados Protein Data Bank (Bernstein, F.C., et ai., J. Mol. Biol. 112: 535-542, 1977) podem ser examinadas para determinar quais as FR que são provavelmente importantes na manutenção da estrutura do local de combinação. Assim, após uma cuidadosa inspecção de muitas estruturas tridimensionais de elevada resolução de regiões variáveis, as posições de todos os aminoácidos estruturais importantes, isto é, aqueles que contactam com as CDR, e o domínio oposto, podem ser tabeladas. Manter estes aminoácidos, bem como os das CDR e finalmente os aminoácidos de FR que possam estar envolvidos na ligação ao ligando, deve assegurar um maior grau de conservação da afinidade. A identificação exacta dos aminoácidos de FR que estão envolvidos na ligação ao ligando não pode ser generalizada uma vez que varia para diferentes anticorpos. No entanto, podem ser tomadas decisões conservativas para conservar os aminoácidos situados em FR que têm uma elevada probabilidade de contactar com o antigénio. Muitos destes resíduos estão situados adjacentes às CDR e no 20 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ terminal Ν de ambas as cadeias, porque as superfícies destas regiões tendem a ser contíguas às superfícies das CDR.

Tal como aqui descrito, é de facto possível reter todos estes aminoácidos importantes na sua forma original (heteróloga), p. ex., como estavam num anticorpo monoclonal de murídeo, e produzir ainda uma sua versão humanizada que se assemelhe substancialmente a um anticorpo humano e é assim menos provável que provoque uma resposta HAMA.

Todos os aminoácidos que se determina não serem importantes através do método BR-R ou BR-M podem ser substituídos pelos seus parceiros humanos correspondentes, de preferência seleccionados a partir de uma sequência humana de consenso tal como ilustrado abaixo.

Desenho de uma Estrutura Preferida para Utilizar na Humanização de um Anticorpo

Existem pelo menos 11 estruturas Fab, 2 de anticorpos humanos e 9 de murídeo, para as quais as coordenadas atómicas são conhecidas e estão disponíveis no Protein Data Bank. Estes anticorpos, listados na Figura 1, foram utilizados para desenvolver um "consenso posicionai" de classes importantes de resíduos estruturais, tal como descrito abaixo.

Numa primeira categoria, certos contactos entre cadeias laterais nos domínios variáveis dos 11 Fab foram recolhidos e apresentados nas Figuras 2 a 4. Os números mostrados entre parêntesis após cada resíduo correspondem ao número de contactos atómicos nos quais o resíduo está envolvido. São apresentados apenas os contactos que envolvem átomos da cadeia lateral; e os átomos são designados como estando em contacto se estiverem dentro da soma dos seus raios de van der Waals (Case e Karplus, J. Mol. Biol. 132: 343-368, 1979) mais 0,5 angstroms. O esquema de numeração ao longo da sequência é o de Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. U.S. Dept. of Health and Human Service, Publicação NIH N.° 91-3242, 1991). A Figura 2 ilustra os resíduos estruturais nos domínios VL que se crê contactarem com as CDR. Os resíduos 21 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ estruturais nos domínios Vh que se crê contactarem com as CDR estão listados na Figura 3. Os resíduos estruturais que se crê contactarem com a cadeia oposta (que presumivelmente mantém a estrutura quaternária dos domínios variáveis) estão listados na Figura 4.

Numa segunda categoria, são examinados os resíduos que apontam para dentro e os ocultos. Um resíduo que aponta para dentro é designado como oculto se pelo menos 50% da sua cadeia lateral estiver inacessível ao solvente. As acessibilidades ao solvente podem ser computadorizadas utilizando o programa de M.L. Connolly (J. Appl. Crystallogr. 16: 548-558) e as rotinas desenvolvidas por S. Sheriff e tal. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 1104-1107), tal como descrito por Padlan (Proteins: Struct. Funct. Genet. 7: 112-124, 1990); a exposição dos resíduos é definida no contexto de um domínio isolado. Os resíduos ocultos nos domínios VL, i.e. os que estão situados no domínio interior, estão listados na Figura 5. Os resíduos ocultos no domínio VH estão listados na Figura 6.

Um consenso posicionai "conservativo" (que tipicamente utilizamos) deve considerar uma posição como importante mesmo que apenas um ou poucos dos anticorpos examinados tivessem resíduos importantes nessa posição. Para fins de ilustração, pode-se observar na Figura 6 que muitas das posições dos resíduos ocultos nas regiões VH eram conservadas através da maioria dos anticorpos amostrados. No entanto, a posição 9 era ocupada por um resíduo oculto em apenas um caso (um resíduo de prolina no anticorpo HyHEL-10). Sob uma abordagem de algum modo menos conservativa, pode-se excluir tais posições que eram apenas raramente ocupadas por um resíduo importante. A sequência de consenso posicionai dos resíduos importantes variará dependendo de se os resíduos ocultos são considerados como "importantes" ou não (i.e., se se está a utilizar a técnica BR-R ou a técnica BR-M).

Aplicando esta metodologia, obtém-se o seguinte consenso posicionai conservativo para humanização de uma região VL utilizando a técnica BR-R: 1-7, 11, 13, 19, 21-23, 35-38, 43-49, 58, 60-62, 66, 67, 69 71, 73, 75, 78, 82-88, 98, 100, 102, 104 e 106. 22 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Um consenso posicionai BR-R correspondente para uma região VH é como se segue: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 18, 20, 22, 24, 27-30, 36-40, 43-49, 66-69, 71, 73, 76, 78, 80, 82, 82c, 86, 88, 90-94, 103, 105, 107, 109 e 111.

Para aplicação da técnica BR-M, um consenso posicionai conservativo para uma região VL é como se segue: 1-5, 7, 22, 23, 35, 36, 38, 43-46, 48, 49, 58, 60, 62, 66, 67, 69, 70, 71, 85, 87, 88, 98 e 100.

Um consenso posicionai BR-R correspondente para uma região VH é como se segue: 1, 2, 4, 24, 27-30, 36-40, 43-49, 66-69, 71, 73, 78, 80, 82, 86, 91-94, 103 e 105.

Estas sequências de consenso posicionais podem ser utilizadas como "moldes" convenientes para prever a ocorrência de um residuo importante num anticorpo a humanizar, tal como ilustrado abaixo. As sequências de consenso posicionai aplicam-se apenas a residuos estruturais. (Em concretizações preferidas, os residuos das CDR são sempre considerados importantes e são portanto, de preferência, mantidos. É possível, no entanto, modificar um ou mais destes resíduos das CDR sem destruir substancialmente a ligação ao antigénio).

Uma pesquisa pelas tabelas de sequências de imunoglobulinas (Kabat et al., "Sequences of Proteins of immunological Interest", 5a Ed. U.S. Dept. of Health and Human Service, Publicação NIH N.° 91-3242, 1991) mostra que muitas sequências do domínio variável são já bastante semelhantes aos anticorpos utilizados para gerar as sequências de consenso posicionais. (Ver Figura 7, na qual o grau de semelhança de sequência para vários anticorpos amostrados é mostrado entre parêntesis como "n/m" onde "n" é o número de identidades em "m" posições homólogas).

No nosso método de humanização preferido, ilustrado abaixo, não utilizamos nenhum anticorpo humano único como modelo estrutural. Em vez disso, utilizamos uma sequência de 23 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ consenso baseada nos resíduos estruturais mais representativos de uma subclasse de anticorpos humanos. Isto é, a sequência de consenso possui um número máximo de aminoácidos em comum com todas as estruturas humanas da mesma subclasse. Isto é importante porque o objectivo da humanização é evitar uma resposta imunológica contra o péptido recombinante modificado. Na prática, as sequências das cadeias variáveis xenogénicas são alinhadas com as sequências de consenso de todas as subclasses de regiões variáveis da espécie alvo e depois é registado o número de diferenças entre a sequência de consenso e os resíduos importantes correspondentes na sequência xenogénica. A(s) sequência(s) de consenso com o menor número de diferenças registado é(são) então escolhida(s). Na humanização do anticorpo Mc3, tal como ilustrado abaixo, utilizámos sequências de consenso representativas das subclasses VKIV e VHI humanas para humanização das regiões variáveis da cadeia leve e pesada, respectivamente.

Se, num certo caso, houverem demasiadas diferenças na estrutura escolhida (p. ex., mais de cerca de 16), então o mesmo procedimento de alinhamento utilizando todas as sequências humanas tabeladas pode ser repetido para descobrir uma estrutura humana específica cuja semelhança com a sequência xenogénica seja maximizada nas posições dos aminoácidos importantes. Assim, de maior preferência, a FR da espécie alvo deve ser uma sequência de consenso representativa de uma subclasse humana; mas segue-se na preferência uma estrutura representando resíduos que sejam observados bastante vulgarmente em anticorpos humanos (p. ex., sequências verificadas em vários anticorpos mesmo que não sejam um consenso); ou, isso ausente, a estrutura de qualquer anticorpo humano.

As Figuras 8 e 9 ilustram melhor que muitos dos aminoácidos importantes de FR ocorrem em posições semelhantes em anticorpos diferentes e muitos destes estão a flanquear as CDR. Entre estas posições flanqueadoras está a maioria dos resíduos estruturais que estão envolvidos em contactos com o domínio oposto tal como mostrado na Figura 4, e muitos dos que estão em contacto com as CDR tal como mostrado nas Figuras 2 e _3 acima. Para além disso, quase todos os resíduos estruturais que foram observados participarem na ligação ao antigénio 24 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (Amit, A.G. et al., Science 233: 747-753, 1986; Sheriff et

al., PNAS USA 82: 1104-1107, 1987; Padlan, E.A et al., PNAS USA 86: 5938-5942, 1989; Tulip et al., Cold Spring Harbor

Symp. Quant. Biol. 54: 257-263, 1989; Bentley et al., Nature (London) 348: 254-257, 1990, estão nestas regiões flanqueadoras.

Assim, nestes métodos preferidos para "animalização" ou "humanização", não só são mantidas as CDR, como também alguns dos resíduos imediatamente adjacentes às CDR. Estes métodos proporcionam uma muito melhor probabilidade de manter mais das propriedades de ligação ao ligando do anticorpo original e, ao mesmo tempo, produzir um anticorpo que seja muito menos provável de provocar uma resposta imunogénica numa espécie heteróloga (tal como uma resposta HAMA em humanos). A probabilidade de manter as propriedades de ligação ao antigénio do anticorpo original é ainda maior se os poucos primeiros aminoácidos nos terminais NH2 de ambas as cadeias forem também mantidos, uma vez que se verifica que alguns deles estão em contacto com as CDR tal como mostrado nas Figuras 2 e 3.

Protocolo de Humanização O desenho de um protocolo de humanização envolve a aplicação dos princípios antecedentes numa base de resíduo-a-resíduo a um anticorpo a humanizar (i.e. o anticorpo "xenogénico" ou "heterólogo", frequentemente um anticorpo de murídeo). O primeiro passo é simplesmente alinhar a sequência xenogénica com a sequência de consenso de FR humana e identificar todas a diferenças nos resíduos estruturais. Obviamente, se o resíduo humano numa dada posição no consenso for idêntico ao parceiro xenogénico, então não é necessária "humanização" nessa posição. O passo seguinte é identificar resíduos xenogénicos que difiram dos de consenso humanos mas que seja provável serem resíduos "importantes". Utilizando a técnica de manutenção de resíduos ocultos (BR-R), os resíduos "importantes" (i.e. aqueles a manter) incluem: (i) resíduos dentro de uma CDR; (ii) resíduos que é provável que contactem com uma CDR; (iii) resíduos que é provável que contactem com a cadeia oposta do 25 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ anticorpo; e (iv) resíduos ocultos. Utilizando as sequências de consenso posicionais como moldes para prever a posição de resíduos estruturais importantes, pode-se facilmente identificar um conjunto de resíduos a manter.

Sob a técnica de modificação de resíduos ocultos (ou BR-M), a sequência de consenso posicionai é ajustada para reflectir a remoção de resíduos ocultos da classe dos resíduos estruturais "importantes". Sequências de consenso posicionais de BR-M adequadas estão descritas acima.

Aplicámos com sucesso estes métodos à humanização de um anticorpo monoclonal de murídeo, Mc3, que se espera ser particularmente útil na detecção e tratamento de cancro da mama.

Uma vez seleccionados determinados resíduos para manutenção ou modificação, a construção real das regiões variáveis modificadas pode ser convenientemente alcançada utilizando amplificação por PCR com iniciadores que são feitos à medida para produzir as mutações desejadas ou através de síntese dos genes. Em concretizações preferidas, os ADN codificando as regiões variáveis humanizadas (que mantinham certos resíduos de murídeo "importantes") foram então unidos aos ADN codificando porções das regiões constantes humanas num vector híbrido. Após transfecção do vector em células de mieloma, os polipéptidos de fusão foram expressos, produzindo versões humanizadas dos anticorpos Mc3.

Os procedimentos de humanização aqui descritos são desenhados para minimizar potenciais perdas na afinidade de ligação ao antigénio que possam resultar da alteração da estrutura do anticorpo. Para minimizar mais a probabilidade de uma resposta imunológica ao anticorpo humanizado, foram utilizadas sequências de aminoácidos humanas alvo que compreendem as sequências de consenso de todas as regiões variáveis humanas apropriadas. Contudo, nem as alterações de aminoácidos exemplificadas nem as sequências alvo humanas exemplificadas são as únicas escolhas englobadas neste invento. Assim, podem ser feitas muitas outras alterações de cada aminoácido e suas permutações sem destruir substancialmente a avidez do anticorpo resultante. Isto pode 26 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ ser particularmente útil no proporcionar de um repertório alargado de derivados de Mc3, que é provável que seja bastante útil no diagnóstico e tratamento de cancro da mama. Agora que sequenciámos com sucesso as regiões variáveis do anticorpo Mc3, pode ser preparada uma variedade de péptidos Mc3 recombinantes nos quais podem ser feitas mutações conservativas (incluindo substituições, deleções e adições) que se calcula seja improvável que destruam a avidez, orientados pela informação aqui proporcionada bem como pelo conhecimento na arte. De preferência, as variantes retêm um nível de avidez que é pelo menos de cerca de 20% o de Mc3 de murídeo, de preferência pelo menos cerca de 40%, de maior preferência pelo menos cerca de 60%, ainda de maior preferência pelo menos cerca de 80%, sendo ainda preferível pelo menos cerca de 90%.

Um método conveniente para prever a adequabilidade das potenciais substituições é efectuado através da verificação de se um determinado aminoácido foi incorporado nessa posição em anticorpos de ocorrência natural conhecidos. O aparecimento do aminoácido nessa posição em anticorpos humanos e/ou de murídeo conhecidos, especialmente anticorpos possuindo estruturas semelhantes, sugere que não é incompatível com a arquitectura da região variável. Assim, embora o resíduo de consenso humano seja o preferido, podem ser seleccionadas outras substituições preferidas a partir dos resíduos que foram observados nas posições correspondentes noutro anticorpos, especialmente os que foram observados em vários anticorpos intimamente aparentados. Uma ilustração de tais comparações é descrita, por exemplo, na Publicação Internacional WO 94/11509, publicada a 26 de Maio de 1994 por Couto et al. (ver, p. ex., Tabelas 10 e 11).

Os péptidos recombinantes do presente invento podem ser proporcionados como péptidos não glicosilados mas são de preferência utilizados na forma glicosilada. Quando proporcionado na forma glicosilada, o péptido recombinante pode estar operativamente ligado a um ou mais resíduos glicosilo proporcionados pela célula eucariótica onde este é expresso ou pode ser clonado e expresso numa célula procariótica como o polipéptido nu e o resíduo ou resíduos glicosilo adicionados a partir daí, por exemplo por meio de 27 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ glicosil-transferases tal como é conhecido na arte. Exemplos de resíduos glicosilo que podem ser adicionados ao péptido recombinante do presente invento são resíduos N-glicosilados e O-glicosilados, entre outros. Os resíduos glicosilo adicionados ao péptido recombinante nu podem ter um peso molecular de cerca de 20 a 50000 daltons e de preferência de cerca de 100 a 20000 daltons ou mais, dependendo do tamanho e do peso molecular do péptido ao qual são ligados. No entanto, outros tipos de polissacáridos e pesos moleculares podem também estar presentes. Os resíduos glicosilo e outros grupos modificadores podem também ser unidos ao péptido recombinante nu do presente invento através de meios químicos tal como é conhecido na arte.

Uma CDR simples é a menor parte de um anticorpo que se sabe ser capaz de se ligar a um antigénio. As sequências das CDR de VL e VH do recombinante Mc3 exemplar são mostradas abaixo. Assim, pequenos péptidos que possuam a sequência de uma CDR simples podem ligar-se ao antigénio e são, portanto, adequados para imagiologia de tumores in vivo. Uma CDR ligada a um agente efector pode ser sintetizada quimicamente ou de forma recombinante num segmento de ADN. Tais moléculas pequenas têm uma grande penetração tumoral e propriedades de eliminação extremamente elevadas em comparação com fragmentos de anticorpos maiores. Nalguns casos, é mais conveniente produzir estas pequenas moléculas através de síntese química, tal como é conhecido na arte, em vez de o fazer através de fermentação. Em muitos casos, estes pequenos péptidos são completamente não imunogénicos e uma resposta imunitária, tal como a resposta HAMA, é completamente evitada. É também preferido ter 2 a 3 unidades de CDR por cadeia operativamente ligadas umas às outras por 1 a 10 ou mais aminoácidos e até todo o comprimento do segmento inter-CDR como posicionado nas regiões variáveis.

As regiões variáveis recombinantes das cadeias pesadas e leves podem ser obtidas individualmente ou em pares VH/VL ou ligadas a um agente efector tal como uma ou mais regiões constantes ou suas porções, um fármaco, uma enzima, uma citoquina, uma toxina, um anticorpo inteiro ou qualquer outra molécula ou radioisótopo. Os fragmentos das regiões variáveis recombinantes podem ser sintetizados quimicamente tal como é 28 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ conhecido na arte ou a partir dos segmentos de ADN codificando as regiões variáveis não humanas. Isto pode ser conseguido através de amplificação por PCR do ADN com iniciadores sintetizados para conterem a mutação ou mutações desejadas tal como é conhecido na arte. De modo semelhante, os fragmentos codificando as regiões variáveis recombinantes podem ser quimicamente sintetizados ou obtidos através de métodos de clonagem estabelecidos de digestão de restrição, ligação, mutagénese e semelhantes, tal como é conhecido na arte. É possível combinar por exemplo uma cadeia leve quimérica com uma cadeia pesada humanizada e vice-versa. De preferência, no entanto, tanto as cadeias pesada como leve são humanizadas.

Existem vantagens na utilização de diferentes variantes moleculares do péptido recombinante dependendo das aplicações específicas para as quais são pretendidas, algumas das quais estão listadas abaixo. a) Moléculas mais pequenas penetram nos tecidos alvo mais eficientemente e são eliminadas do corpo muito mais rapidamente que moléculas maiores. b) Moléculas de cadeia simples podem ser manipuladas e sintetizadas mais eficientemente que moléculas de múltiplas cadeias. c) Muitas destas variantes podem ser sintetizadas eficientemente e de modo não dispendioso em bactérias, incluindo os recombinantes não glicosilados. d) Moléculas bifuncionais ou multifuncionais podem transportar agentes efectores, tais como enzimas, citoquinas, toxinas, radioisótopos, fármacos e outras moléculas, até um tecido alvo. e) Ter um reportório de variantes pode ser especialmente útil em cenários de diagnóstico/terapêuticos em que versões particulares derivadas de uma estrutura básica de anticorpo podem ser mais ou menos úteis num dado indivíduo ou numa dada classe de indivíduos ou ao longo do tempo de administração.

Os péptidos recombinantes e os péptidos híbridos do presente invento englobam CDR e/ou regiões variáveis recombinantes, fragmentos de anticorpo tais como Fab, Fab', 29 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ F(ab')2 e semelhantes, ver, p. ex., 0'Kennedy, R. e Roben, P. (0'Kennedy, R. e Roben, P., "Antibody Engineering: an OverView", Essays Biochem. (England) 26: 59-75, 1991). As regiões variáveis podem também ser combinadas com regiões constantes, fragmentos catalíticos, enzimas, hormonas e outras moléculas tais como fármacos e ligantes, transmissores e toxinas, entre outros. Uma vez que a especificidade e afinidade do anticorpo podem direccioná-lo eficazmente para um local específico contendo o seu antigénio cognato, tais combinações podem ser ferramentas especialmente eficazes para imagiologia, terapia e diagnóstico.

Polipéptidos de Ligação ao Antigénio de Cadeia Simples

Um método para construir polipéptidos de ligação ao antigénio de cadeia simples foi descrito por Bird et al. (Bird, R.E., et al., Science 242: 243-246, 1988; Bird, R.E., et al., Science 244: 409, 1989). Os Fv de cadeia simples (scFv ou sFv) são péptidos recombinantes de cadeia simples contendo tanto VL como VH com um ligante tal como um péptido ligando as duas cadeias (VL-ligante-VH) . A engenharia pode ser feita ao nível do ADN, caso em que é necessário conhecimento da sequência. Estes péptidos recombinantes têm a estabilidade conformacional, dobragem e afinidade de ligação ao ligando dos fragmentos de imunoglobulinas da região variável de cadeia simples e podem ser expressos em E. coli (Pantoliano, M.V., et al., Biochem. (US) 30: 10117-25, 1991). O péptido ligante que liga as duas cadeias pode ter um comprimento variável, por exemplo, cerca de 2 a 50 resíduos de aminoácido e de preferência cerca de 12 a 25 resíduos, e pode ser expresso em E. coli (Pantoliano, M.V., et al., 1991, supra). Um péptido recombinante tal como um scFv pode ser expresso e preparado a partir de E. coli e utilizado para direccionamento para tumores. Os perfis de eliminação para os fragmentos scFv nalgumas situações são vantajosos relativamente aos dos anticorpos normais, dos fragmentos Fab, Fab' ou F(ab')2 (Colcher, D. et al., J. Natl. Câncer Inst. 82: 1191-7, 1990). Outro tipo de péptido recombinante compreende um VH-ligante-VL e pode ter cerca de 230 a 260 aminoácidos. Um gene sintético utilizando codões de E. coli pode ser utilizado para expressão em E. coli. Um péptido líder de cerca de 20 aminoácidos, tal como o Trp LE pode ser utilizado para dirigir a segregação 30 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ proteica para ο espaço ou meio periplasmático. Se este péptido líder não for naturalmente clivado, o péptido recombinante sFv pode ser obtido através de clivagem ácida da única ligação peptídica asp-pro situada entre o péptido líder e a região de codificação de sFv (Houston, J.S. et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Recombinant Produced in E. coli", PNAS (USA) 85(16): 5879-83, 1988). A construção, as propriedades de ligação, o metabolismo e o direccionamento para tumores dos péptidos recombinantes Fv de cadeia simples derivados de anticorpos monoclonais podem ser conduzidos tal como anteriormente descrito (Milenic, D.E., et al., Câncer Res.(US) 51(23 ptl): 6363-71, 1991; Yokota, et al., "Rapid

Tumor Penetration of a single-chain Fv and Comparison with Other Immunoglobulin Forms", Câncer Res. (US) 52(12): 3402-8, 1992). Este tipo de péptido recombinante proporciona uma penetração tumoral extremamente rápida e uma distribuição homogénea pela massa tumoral em comparação com IgG ou os fragmentos de ig Fab ou F(ab')2. scFv-Fxn ou Fxn-scFv bifuncionais

Um exemplo deste tipo de péptido recombinante é um VL-ligante-VH com um agente efector tal como uma hormona, enzima, citoquina, toxina, transmissor e semelhantes. Estes péptidos recombinantes híbridos podem ser preparados tal como descrito por McCarney et al., (McCarney, J.E. et al.,

"Biosynthetic Antibody Binding Sites: Development of a Single-Chain Fv Model Based on Antidinitrophenol igA Myeloma MOPC 315", J. Proteln Chem. (US) 10(6): 669-83, 1991). Um péptido recombinante híbrido bifuncional contendo um fragmento B de ligação a Fc da proteína A de estafilococos amino-terminal a uma região Fv recombinante de cadeia simples da presente especificidade está também englobado e pode ser preparado tal como anteriormente descrito (Tai, M.S., et al., Bíochem. 29(35): 8024-30, 1990). Neste exemplo de um péptido recombinante híbrido do presente invento está um fragmento B de Estaf. A (anti-Fc)-polipéptido scFv. A ordem é ao contrário da dos casos normais. Este FB-sFv pode ser codificado num único gene sintético e expresso como um péptido em E. coli. Este péptido recombinante é um bom exemplo de um polipéptido de cadeia simples direccionável multifuncional útil. Um 31 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ péptido recombinante híbrido compreendendo também anticorpos para um receptor de carcinoma humano e angiogenina faz também parte do presente invento. A angiogenina é um homólogo humano da ARNase pancreática. Este é um efector peptídico anticorpo-enzima semelhante a F(ab')2. Outro péptido recombinante híbrido compreendendo uma VH-cadeia pesada CHl-ARNase pode ser expresso numa célula que segregue uma cadeia leve quimérica do mesmo anticorpo. Mostrou-se que um anticorpo segregado de estrutura semelhante causa a inibição do crescimento e a síntese proteica de células K562 que expressam o receptor da transferrina humana (Rybak, S.M., et al., "Humanization of Immunotoxins", PNAS 89: 3165-3169, 1992).

Anticorpos Biespecíficos

Um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo pode ser incorporado num péptido recombinante biespecífico tal como descrito, por exemplo, por Greenman et al. (Greenman, J., et al., Mol. Immunol. (England) 28(11): 1243-54, 1991). Neste exemplo, foi construído um F(ab')2 biespecífico, compreendendo dois F(ab') unidos por uma ligação tioéter. Anticorpos biespecíficos podem também ser obtidos quando são unidos dois anticorpos inteiros. Outro modo de obter anticorpos biespecíficos é através da mistura de cadeias de diferentes anticorpos ou seus fragmentos. Deste modo o ramo "esquerdo" do anticorpo biespecífico tem uma função enquanto que o ramo "direito" tem outra.

Bibliotecas de Apresentação Fágica

Os péptidos recombinantes de acordo com este invento podem ser pesquisados com um sistema de fagos filamentosos. Este sistema pode também ser utilizado para expressão de quaisquer genes de anticorpos ou seus fragmentos bem como para pesquisa de variantes de anticorpos mutadas tal como descrito por Marks et al. (Marks, J.D., et al., "Molecular Evolution of Proteins on Filamentous Phage. Mimicking the Strategy of the Immune System", J. Mol. Biol. (England) 267(23): 1607-10, 1992). Uma biblioteca de genes de VH e VL ou seus recombinantes pode ser clonada e apresentada à superfície de um fago. Os fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente a vários antigénios podem ser isolados tal 32 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ como relatado por Marks (Marks, J.D., "By-Passing Immunization. Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage", J. Mol. Biol. (England) 222(3): 581-97, 1991).

Modificações Covalentes de Oligossacáridos

Os presentes péptidos recombinantes sozinhos ou na forma de péptidos híbridos compreendendo anticorpos e seus fragmentos, podem ser, p. ex., covalentemente modificados utilizando porções de oligossacáridos oxidados. Os péptidos recombinantes híbridos podem ser modificados no resíduo de oligossacárido com um péptido marcado com um radioisótopo tal como I ou com um quelato tal como um quelato de acido dietilenotriaminopenta-acético com mIn. A utilização de oligossacáridos proporciona uma localização mais eficiente para um alvo que a obtida com anticorpos radiomarcados nas lisinas ou tirosina das cadeias de aminoácidos (Rodwell, J.D. et al., "Site-Specific Covalent Modification of Monoclonal Antibodies: In Vitro and In Vivo Evaluations", PNAS (USA) 83: 2632-6, 1986).

Os fragmentos derivados das regiões variáveis podem ser ligados por um ligante peptídico ou não peptídico tal como é conhecido na arte. Exemplos de ligantes peptídicos são as polilisinas, os fechos de leucina, EGKSSGSGSEJKVD (SEQ ID NO:66) e (GGGGS)x3 (SEQ ID NO:67), e polímeros não peptídicos, entre outros.

Agentes efectores tais como péptidos e não péptidos podem também ser ligados aos péptidos recombinantes do presente invento. Estes incluem polímeros não peptídicos, monómeros, átomos, etc., que são discutidos abaixo.

Noutro aspecto, este invento proporciona um polipéptido que compreende pelo menos o péptido recombinante do presente invento e pelo menos um agente efector operativamente ligado ao péptido, suas combinações e suas misturas. Os agentes efectores que podem ser utilizados neste invento compreendem péptidos tais como as regiões constantes de um anticorpo, citoquinas, enzimas, toxinas, polímeros não peptídicos, monómeros e átomos tais como metais. Os polipéptidos do presente invento englobam péptidos ligados através de ligações 33 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ dissulfureto, incluindo polímeros peptídicos produzidos e segregados por uma célula que expressa um péptido do presente invento.

Numa concretização particularmente preferida, o agente efector pode compreender um átomo tal como um radioisótopo, uma enzima ou um marcador fluorescente. Estes agentes efectores são adequados para ensaios in vivo e in vitro porque permitem a identificação de complexos formados pelo péptido do presente invento. Os radioisótopos são particularmente preferidos para imagiologia in vivo. A marcação de polipéptidos é conhecida na arte (Greenwood, F.C. et al., Bíochem. J. 89: 114-123, 1963). Quando é utilizado um polipéptido glicosilado, o radiomarcador pode ser ligado ao resíduo glicosilo tal como é conhecido na arte (Hay, G.W. et al., em "Methods in Carbohydrate Chemistry", Vol 5: 357, Whistler, R.L. Ed., Academic Press, NY e London, 1965). Os agentes efectores compreendendo um monómero podem ser agentes terapêuticos, imunogénicos ou de diagnóstico, radioisótopos, monómeros de ADN ou ARN, ligantes químicos, quelantes químicos, moléculas transmissoras, suas combinações, ou suas combinações com polímeros peptídicos e não peptídicos ou copolímeros e átomos. Exemplos de agentes terapêuticos são os fármacos antineoplásicos tais como a vincristina, fármacos de intercalação, adriamicina, enzimas, toxinas e hormonas, entre outros. Exemplos de agentes imunogénicos são outras vacinas contra tumores tais como carcinomas ou para outros fins. Exemplos de agentes de diagnóstico são radioisótopos e enzimas, entre outros. Exemplos de agentes terapêuticos, imunogénicos e de diagnóstico são toxinas, vacinas e radioisótopos, entre outros. Exemplos de radioisótopos são mln, 35S, 90Y, 186Re, 225Ac, 125I e 99rnTc, entre outros. Exemplos de monómeros de ADN e ARN são A, T, U, G, C, entre outros. Exemplos de ligantes químicos são ditiobis(succinimidil)-propionato e bis-(sulfossuccinimidil)suberato, entre outros. Exemplos de moléculas transmissoras são AMPc e GMPc, entre outros. Exemplos de toxinas são a cadeia A de ricina e a cadeia A da abrina, entre outros.

Quando o agente efector é um polímero não peptídico ligado ao polipéptido recombinante do presente invento, pode compreender um polímero de éster, éter, vinil, amido, imido, 34 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ alquileno, arilalquileno, cianato, uretano ou isopreno, polímeros de ADN, polímeros de ARN, seus copolímeros e seus copolímeros com polímeros ou monómeros peptídicos, ou ter átomos ligados a ele. São seus exemplos poliésteres, poliéteres, polietilenoglicóis, polivinilos, resinas de poliamido e poli-imido, polietilenos, politetrafluoroetileno, poli(etileno)tereftalato, polipropileno, borracha de silicone, isoprenos e seus copolímeros, copolímeros de silicone e ácido poliláctico ou poliglicólico carbonatado ou colagénio, e semelhantes. Particularmente preferidos são materiais biodegradáveis e bio-reabsorvíveis ou bioabsorvíveis, que se destacados do polipéptido e deixados na circulação sistémica não danificarão os tecidos endógenos. Sendo o agente efector um péptido pode compreender anticorpos tais como IgA, igG, IgM, IgE ou IgD, a região constante de anticorpos de uma espécie diferente da região variável ou seus fragmentos, e as CDR, regiões variáveis, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 de anticorpos das classes descritas acima, hormonas, enzimas, transmissores peptídicos e anticorpos inteiros, suas combinações, e suas combinações com polímeros não peptídicos, copolímeros, monómeros e átomos tais como radioisótopos. Exemplos de transmissores peptídicos e hormonas adequados para utilizar aqui são a insulina, hormona do crescimento, FSH, HL, endorfinas e TNF, entre outros. Exemplos de enzimas são a peroxidase, LDH, fosfatase alcalina e galactosidase, entre outros.

Os polipéptidos do presente invento podem ser proporcionados como uma composição antitumoral juntamente com um transportador ou diluente, de preferência um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. 0 péptido recombinante antitumoral e o polímero híbrido aqui proporcionados podem estar presentes na composição numa quantidade de cerca de 0,001 a 99,99 %p, de preferência cerca de 0,01 a 20 %p, e ainda de maior preferência cerca de 1 a 5%p. No entanto, outras quantidades são também adequadas. Os transportadores no geral, e os transportadores farmaceuticamente aceitáveis em particular são conhecidos na arte e não é necessário descrê-los mais aqui. O transportador pode ser proporcionado num contentor estéril separado ou misturado com o polipéptido. Tipicamente são adequadas solução salina, soluções aquosas alcoólicas, soluções salinas com 35 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ albumina e soluções de propilenoglicol. No entanto, podem também ser utilizadas outras. Quando utilizado para fins terapêuticos, o material proteico tem de ser de uma pureza adequada para administração humana, e a composição pode conter outros ingredientes tal como é conhecido na arte. São seus exemplos outros fármacos antineoplásicos tais como adriamicina e mitomicina, citoxano, PALA e/ou metotrexato, entre outros. No entanto, podem também ser adicionados outros fármacos terapêuticos, transportadores ou diluentes, adjuvantes imunológicos e semelhantes. Quando a composição descrita acima é utilizada para imagiologia in vivo, pode compreender cerca de 0,001 a 99,9 %p de péptido recombinante e de preferência cerca de 0,01 a 25 %p de péptido recombinante. Tipicamente, quando a composição é utilizada para fins terapêuticos pode conter cerca de 0,001 a 99,9 %p de péptido recombinante e de preferência cerca de 0,01 a 30 %p de péptido recombinante. Quando utilizada para purga ex vivo de células neoplásicas de fluidos corporais tais como o fluido raquidiano, a composição pode compreender cerca de 0, 0001 a 50 %p e de preferência cerca de 0,01 a 20 %p de péptido recombinante. Quando aplicado ao diagnóstico in vítro de tumores tais como carcinomas, a composição do presente invento pode compreender cerca de 0,001 a 35 %p de péptido recombinante e de preferência cerca de 0,01 a 10 %p de péptido recombinante. No entanto, outras quantidades são também adequadas.

Para anticorpos Mc3, tais produtos têm uma utilidade especial no tratamento de tumores da mama. Os péptidos Mc3 recombinantes "humanizados" ou "parcialmente humanizados" serão assim úteis para o diagnóstico e tratamento de cancros da mama em humanos. Espera-se que os anticorpos Mc3 humanizados sejam particularmente adequados para administração repetida a um indivíduo e para terapia a longo prazo, tal como no caso de metástases e/ou de recorrência de tumores. De todos os recombinantes descritos e englobados aqui, os mais adequados para aplicações in vivo são os que exibem pouca ou nenhuma ligação a antigénios séricos e a células normais, tal como Mc3. Adequados para utilizações in vítro e ex vivo são os que exibem boa ligação a antigénios de células tumorais tais como o antigénio de células de carcinoma e fraca ou nenhuma ligação a células normais, tal como Mc3. Apesar de um paciente poder ter em circulação uma quantidade interferente de uma 36 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ molécula que se possa ligar ao péptido recombinante, o péptido pode ainda ser administrado após a remoção de tal molécula sérica através de procedimentos ex vivo ou através de administração de doses de lavagem do péptido recombinante ou do polímero peptidico do presente invento.

Um estojo para o diagnóstico de tumores tais como carcinomas pode compreender, por exemplo, uma composição compreendendo polipéptidos variantes de Mc3 do presente invento, um suporte sólido, imunoglobulinas de uma espécie diferente que se liguem selectivamente às regiões constantes do anticorpo variante Mc3, proteína G ou proteína A, e instruções para a sua utilização. Este estojo de diagnóstico pode ser utilizado através da ligação covalente do antigénio ou do péptido recombinante do presente invento ou de uma sua proteína de fusão a um suporte sólido por meio de um ligante tal como é conhecido na arte. Numa concretização particularmente preferida, o suporte é revestido com um polipéptido tal como albumina metilada tal como descrito na Patente U.S. N.° 4572901. Quando uma amostra biológica é adicionada a um poço, o péptido recombinante ou polímero peptidico do presente invento ligar-se-á a qualquer antigénio BA46 presente na amostra biológica. Se for utilizado um ensaio competitivo, uma quantidade conhecida do péptido recombinante e a amostra são adicionadas ao antigénio ou seu péptido híbrido no suporte sólido. A partir daí, podem ser adicionadas γ-globulina, proteína G ou proteína A na forma marcada para detecção. Anticorpos monoclonais podem ser preparados tal como descrito por Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C., "Continuous Culture of Fused Cell Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256: 495-497, 1975). Adequados para utilizar neste invento são anticorpos tais como igG, igM, IgE, IgA e IgD. A proteína A, proteína G e y-globulina podem ser obtidas comercialmente. É aqui proporcionado um estojo de diagnóstico para detecção de tumores tais como carcinomas, e mais particularmente carcinomas humanos, que compreende uma composição anti-BA46 compreendendo um péptido ou polímero peptidico recombinante e um agente efector compreendendo uma enzima, um radioisótopo, um marcador fluorescente e/ou um péptido compreendendo a região constante de um anticorpo da 37 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ espécie para a qual é pretendido, ou seus fragmentos capazes de se ligar a imunoglobulinas anti-região constante, proteína G ou A, anticorpo antitumoral, imunoglobulinas anti-região constante, proteína G ou proteína A, anticorpo antitumoral, imunoglobulinas anti-região constante, proteína G ou proteína A, um suporte sólido possuindo operativamente ligado a ele um antigénio que se liga especificamente ao péptido recombinante anti-BA46 do presente invento e o anticorpo, e instruções para a sua utilização. Quando o agente efector compreende um péptido, tal como a região constante de um anticorpo da espécie alvo, o suporte sólido pode ter operativamente ligado a si mesmo um anticorpo que se ligue especificamente a uma porção de uma proteína de fusão diferente do antigénio do presente invento. Isto permite a ligação do péptido recombinante antitumoral à molécula de antigénio agora ligada ao suporte sólido. Qualquer complexo formado entre o péptido recombinante do presente invento e o antigénio tumoral no suporte permanecerá, assim, ligado ao substrato sólido. Um ensaio competitivo pode então ser conduzido através da adição ao antigénio no suporte sólido de uma quantidade conhecida do antigénio BA46 e da amostra. A quantidade de antigénio presente na amostra pode ser obtida a partir de uma curva de diluição através da adição de imunoglobulinas anti-região constante, proteína G, proteína A ou outras moléculas de ligação ao anticorpo, p. ex., marcadas, para se ligarem ao péptido recombinante híbrido que está agora ligado ao suporte. Este estojo pode ser utilizado num ensaio competitivo onde a molécula de antigénio no suporte compete com o antigénio na amostra por uma quantidade conhecida do péptido recombinante do presente invento. 0 ensaio foi descrito por Ceriani, R.L., et al. (Ceriani, R.L., et al., Anal. Biochem. 201: 178-184, 1992), sendo o seu texto relevante aqui incorporado por referência.

Um tumor tal como um carcinoma pode ser visualizado In vivo e/ou diagnosticado através da administração a um indivíduo, suspeito de possuir um carcinoma, de um péptido ou polímero peptídico recombinante anti-BA46 do presente invento na forma radiomarcada, numa quantidade eficaz para alcançar as células tumorais e se ligar a elas, e detectar qualquer ligação localizada do péptido ou polímero peptídico recombinante marcado ao tumor. Tipicamente, o péptido ou 38 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ polímero peptídico recombinante do presente invento pode ser administrado numa quantidade de cerca de 0,001 a 5000 mg/kg de peso por tratamento, de preferência de cerca de 0,01 a 5000 pg/kg de peso por tratamento e de maior preferência de cerca de 0,1 a 500 pg/kg de peso por tratamento. No entanto podem também ser utilizadas outras quantidades. Os radiomarcadores que podem ser utilizados são inIn, 125I, 99mTc, e 131I, entre outros. Estes radioisótopos podem ser detectados com vários aparelhos de contagem de radioactividade e imagiologia conhecidos na arte e em ampla utilização pela comunidade médica. A presença de um tumor tal como um carcinoma pode também ser diagnosticada in vitro através do contacto de uma amostra biológica com o péptido ou polímero peptídico recombinante antitumoral do presente invento para formar um complexo péptido recombinante antitumoral-antigénio com qualquer antigénio tumoral presente na amostra, e detectando qualquer complexo formado. A amostra biológica é tipicamente obtida a partir de um indivíduo tal como um humano suspeito de estar afligido com o tumor. Amostras biológicas adequadas são soro, sangue, expectoração, fezes, líquido linfático, líquido raquidiano, secreções pulmonares e urina, entre outros, de preferência sangue ou soro. Claramente, qualquer fonte de fluido, tecido e semelhantes pode ser preparada para utilizar neste método tal como é conhecido na arte.

Numa concretização preferida do método de diagnóstico in vitro, os péptidos ou polímeros peptídicos recombinantes anticarcinoma adicionados à amostra biológica compreendem um polipéptido variante Mc3 marcado. Os materiais de marcação adequados foram descritos acima. Este método pode ser praticado, com o estojo contendo o suporte sólido descrito acima, como um ensaio competitivo tal como divulgado por Ceriani, R.L. et al., supra.

Os presentes péptidos recombinantes são também aplicáveis à purga de células neoplásicas, tais como células de carcinoma, de amostras biológicas, sejam amostras de fluidos ou de tecido. A purga de células neoplásicas de uma amostra de fluido é parte do presente invento e pode ser praticada através do contacto de um fluido biológico suspeito de 39 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ compreender células neoplásicas com o péptido recombinante do presente invento, que é capaz de se ligar selectivamente a um antigénio das células neoplásicas e permitindo que o péptido se ligue ao antigénio, e da separação do complexo péptido recombinante-célula do resto do fluido.

Este método pode ser utilizado para purga de células indesejadas ex vivo através da extracção de uma amostra biológica de um paciente, eliminação das suas células neoplásicas através de separação dos complexos péptido recombinante-célula ou através da adição de um efector tal como complemento ou uma toxina ou um marcador radioactivo que possa actuar sobre a célula, e depois a realimentação da amostra purgada ao paciente. Isto é tipicamente adequado para utilizar com punções lombares onde o fluido raquidiano é isento de células neoplásicas tais como células de carcinoma antes da re-injecção. Outros fluidos podem também ser tratados deste modo.

Os presentes péptidos ou polímeros peptídicos recombinantes podem também ser aplicados à avaliação histoquímica da presença de células neoplásicas tais como células de carcinoma num tecido obtido a partir de um indivíduo suspeito de estar afligido por um carcinoma através de métodos que são padrão na arte, tais como a preparação de secções de tecido e fixação num substrato sólido para permitir a aplicação do péptido e depois a avaliação de qualquer ligação a células neoplásicas na amostra tal como indicado através da formação de complexos entre o péptido recombinante e os antigénios das ou nas células. 0 crescimento ou o tamanho de um tumor primário metastizado ou neoplasia tal como um carcinoma pode ser inibido ou reduzido através da administração a um indivíduo necessitado do tratamento de uma quantidade eficaz dos péptidos ou polímeros peptídicos recombinantes antitumorais do presente invento. Tipicamente, os péptidos ou polímeros peptídicos recombinantes podem ser administrados numa quantidade de cerca de 0,001 a 2000 pg/kg de peso corporal por dose e de preferência de cerca de 0,01 a 500 pg/kg de peso corporal por dose. Doses repetidas podem ser administradas tal como prescrito pelo médico assistente. No entanto, outras 40 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ quantidades são também adequadas. Geralmente, a administração do péptido ou polímero peptídico recombinante é conduzida através de infusão de modo a que a quantidade de radiomarcador, toxina ou outro agente efector presente que possa produzir um efeito prejudicial possa ser mantida sob controlo através da variação da taxa de administração. Tipicamente, a infusão de uma dose pode durar algumas horas. No entanto, está também aqui contemplada a infusão constante de uma dose para fins terapêuticos que permitirá a manutenção de um nível constante do polipéptido híbrido no soro. A infusão do péptido ou polímero peptídico recombinante do presente invento pode ser conduzida como se segue. Uma cânula intravenosa (i.v.) pode ser previamente tratada, p. ex. com NaCl a 0,9% e albumina de soro humano a 5% e colocada para administração intravenosa. A dose prescrita do péptido ou polímero peptídico recombinante pode ser infundida como se segue. Opcionalmente, pode ser infundido inicialmente um péptido ou polímero peptídico recombinante não marcado. 30 minutos após o termo da infusão do não marcado, pode ser infundido péptido ou polímero peptídico recombinante marcado com mln e/ou 90Y. A infusão i.v. pode compreender um volume total de 250 ml de NaCl a 0,9% e albumina de soro humano a 5% e ser infundida durante um período de cerca de 2 horas dependendo de quaisquer efeitos secundários dependentes da taxa observados. Os sinais vitais devem ser tomados todos os, p. ex., 15 minutos durante a infusão e de hora a hora após a infusão até estabilizarem. Um exame físico cardiopulmonar minucioso pode ser feito antes e no final da infusão. Medicamentos incluindo acetaminofeno, difenidramina, epinefrina e corticosteróides podem estar preparados para tratamento de reacções alérgicas que venham a ocorrer. A administração do péptido ou polímero peptídico recombinante do presente invento pode ser repetida conforme considerado desejável pelo médico. Tipicamente, uma vez administrada uma primeira dose e a imagiologia indicar que pode haver uma redução no tamanho do tumor, primário ou metastizado, podem ser administrados tratamentos repetidos de 1 em 1 a de 100 em 100 dias e de preferência de cerca de 2 em 2 a 60 em 60 dias. Estes tratamentos repetidos podem ser continuados durante um período de até cerca de 2 anos, e nalguns casos mesmo por períodos de tempo mais longos ou até ao desaparecimento 41 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ completo do(s) tumor(es). A administração dos péptidos ou polímeros peptídicos recombinantes do presente invento é tipicamente mais útil para fins terapêuticos quando um tumor primário foi, por exemplo, excisado. Assim, é de preferência para limpeza após intervenção cirúrgica ou em casos de metástases cancerosas que o presente método é mais útil. É também aqui proporcionada uma sequência nucleotídica (ADN ou ARN) codificando um polipéptido variante Mc3; e vectores compreendendo adn codificando Mc3, operativamente ligados a um promotor adequado para expressão dos polipéptidos. Tipicamente, vectores capazes de se replicarem tanto em células eucarióticas como procarióticas são adequados. Quando é desejada a preparação de um polipéptido recombinante glicosilado o vector é de preferência adequado para transfecção de células hospedeiras eucarióticas.

Este invento engloba também uma célula hospedeira que foi transfectada com o vector híbrido descrito acima. Hospedeiros adequados são hospedeiros procarióticos e eucarióticos tais como bactérias, levedura e células de mamífero tais como células de insecto e células de hibridoma não produtoras, entre outros. Os vectores e/ou plasmídeos adequados para a transfecção de cada um destes tipos de hospedeiro são conhecidos na arte e não necessitam de ser melhor descritos aqui. Também conhecidos na arte são os métodos para clonagem de sequências de ADN em cada um destes tipos de vectores e para transfecção dos diferentes tipos de células hospedeiras. 0 péptido recombinante que se liga especificamente a qualquer antigénio pode ser produzido através de um método que compreende a clonagem do polidesoxirribonucleótido recombinante do presente invento num vector para formar um vector híbrido, a transfecção de uma célula hospedeira com o vector híbrido permitindo a expressão do péptido recombinante e o isolamento do polipéptido ou de suas misturas. 0 segmento de ADN codificando o polipéptido recombinante pode ser obtido através de síntese química ou através de modificação específica do local da sequência codificando a região variável das espécies xenogénicas através de amplificação por PCR com iniciadores especificamente desenhados tal como é conhecido na arte. Os fragmentos de ADN podem também ser preparados através de PCR com iniciadores que introduzem um codão stop num 42 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ posição desejada tal como é conhecido na arte. O método pode ainda compreender o permitir que os péptidos recombinantes expressos interajam uns com os outros para formar péptidos recombinantes de cadeia dupla, compreendendo uma ou ambas as cadeias do péptido recombinante pelo menos uma CDR xenogénica ou região variável da cadeia leve ou pesada do anticorpo ou seu fragmento, modificada tal como descrito acima. Faz ainda parte do presente invento um método de produção de um péptido recombinante híbrido compreendendo um péptido efector e uma região humanizada que se liga especificamente ao antigénio, compreendendo o método a transfecção de uma célula hospedeira com o vector híbrido do presente invento transportando uma sequência de ADN codificando a região humanizada e o péptido efector, o permitir a expressão do péptido recombinante e o isolamento do péptido recombinante ou suas misturas. As técnicas para obtenção de ARNm, conduzindo transcrição inversa e amplificação de ADN por PCR, síntese química de iniciadores, clonagem de sequências de ADN num vector, transfecção de uma célula hospedeira e purificação de polipéptidos a partir de um meio de cultura são conhecidas na arte e não necessitam de ser melhor descritas aqui.

Como ilustração dos métodos aqui descritos, os presentes inventores realizaram a clonagem, sequenciação e humanização do anticorpo monoclonal de murídeo Mc3 que é provável que seja particularmente útil no diagnóstico e tratamento de cancro da mama humano. 0 Mc3 é um anticorpo de murídeo que reage com o antigénio do glóbulo gordo do leite humano BA46. Construímos primeiro uma versão quimérica de Mc3 tal como descrito nos Exemplo 1-3 abaixo. A seguir, humanizámos com sucesso as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de Mc3 utilizando a técnica BR-M tal como aqui descrita.

Os resultados descritos abaixo confirmaram que podíamos humanizar Mc3 sem sacrificar a avidez. Em particular, não detectámos diferenças significativas entre as formas original e humanizadas de Mc3, tal como medido através das suas afinidades (3xl08 vs. 6,2χ108 M”1, respectivamente) e da sua capacidade para competir pela ligação ao antigénio. Num modelo de ratinho para cancro da mama humano, verificou-se que doses 43 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ únicas de Mc3 humanizado radiomarcado eram distribuídas ao local do tumor e ajudavam a prevenir o crescimento do tumor.

Os exemplos apresentados abaixo são proporcionados como mais orientações para o praticante de vulgar perícia na arte e não se pretende de sejam entendidos como de algum modo limitantes do presente invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Clonagem de ADNc Codificando as Cadeias VL e VH do Anticorpo Monoclonal de Murídeo Mc3

Os ADNc codificando as regiões variáveis de Mc3 foram clonados, utilizando reacção em cadeia da polimerase (PCR). Os iniciadores de PCR utilizados eram específicos para os péptidos líder e para as regiões constantes, respectivamente. Assim, as regiões variáveis estavam contidas nos produtos de PCR mas não se sobrepunham com os iniciadores. Os iniciadores de PCR foram adquiridos em Novagen (Madison, Wisconsin). A Novagen produz colecções de iniciadores especificamente para clonagem de ADNc codificando regiões variáveis de ADNc de murídeo. 0 substrato para a PCR foi ARN poliadenilado isolado a partir de hibridomas de Mc3 (Ceriani, R.L., et al., Somatic Cell Genet. 9(4): 415-27, 1983). Estes detalhes experimentais para clonagem de ADNc codificando regiões variáveis de anticorpos, utilizando PCR, foram anteriormente descritos (Couto, J.R., et ai., Hybridoma 12(1): 15-23, 1993; e Couto, J.R., et al., Hybridoma 12(4): 485-489, 1993).

Em resumo, os procedimentos aqui utilizados foram a transcrição inversa (RT) de ARN codificando as regiões variáveis e a subsequente amplificação dos ADNc através da reacção em cadeia da polimerase. 0 ARN poliadenilado foi isolado com um estojo de isolamento de ARNm FAST TRACK (TM) (InVitrogen Corp., San Diego, CA).

Um conjunto de iniciadores de PCR de Ig de murídeo foi adquirido em Novagen (Madison, WI) e o ADN complementar (ADNc) foi preparado com um estojo de PCR de ARN (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT). 44 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Dois iniciadores diferentes e degenerados do "péptido lider" combinados com um único iniciador da "região constante" degenerado foram utilizados para cada um dos isolamentos, e em cada caso foram efectuados três isolamentos independentes. Assim, isolámos três clones de ADNc independentes codificando a região variável da cadeia pesada (VH) e outros três clones independentes codificando a região variável da cadeia leve (VL) . Estes produtos de PCR foram directamente inseridos no vector de clonagem TA pCRii (invitrogen) . Em cada caso foram sequenciadas ambas as cadeias das inserções resultantes. As sequências dos três isolados independentes VH eram todas idênticas tal como as sequências dos três isolados VL independentes. As sequências de ADN de VH e VL e as suas sequências proteicas derivadas são mostradas nas Figuras 10 e 11, respectivamente.

Sequência nucleotídica da região do péptido sinal de VH: A seguinte sequência codifica um péptido sinal funcional. Esta sequência, no entanto, pode não ser a natural uma vez que através da utilização de um iniciador de PCR que é específico para a primeira parte do péptido sinal, para clonar o ADNc de VH, perdemos a informação da sequência original para essa região. Assim, os primeiros 26 nucleótidos da seguinte sequência podem ser diferentes no gene natural. ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT GTC CAC TCT (SEQ Π) NO:68)

Sequência proteica derivada do péptido sinal de VH:

Os primeiros 9 aminoácidos da seguinte sequência podem não ser idênticos aos originais. Ver a nota para o ADN codificando o péptido sinal acima. MKCSWVILFLLSGTAGVHS (SEQ ID NO:69)

Sequência nucleotídica do péptido sinal de VL: A seguinte sequência codifica um péptido sinal funcional. Esta sequência, no entanto, pode não ser a natural uma vez que através da utilização de um iniciador de PCR que é específico para a primeira parte do péptido sinal, para clonar o ADNc de 45 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ VL, perdemos a informação da sequência original para essa região. Assim, os primeiros 19 nucleótidos da seguinte sequência podem ser diferentes no gene natural. ATG GAG TTC CAG ACC CAG GTC TTT GTA TTC GTG TTT CTC TGG TTG TCT GGT GTT GAC GGA (SEQ Π) NO:70)

Sequência proteica do péptido sinal de VL:

Os primeiros 7 aminoácidos da seguinte sequência podem não ser idênticos aos originais. Ver a nota para o ADN codificando o péptido sinal acima. MEFQTQVFVFVFLWLSGVDG (SEQ ID NO: 71)

Sequência completa de VH e VL

As sequências nucleotídica e de aminoácidos completas para a região variável da cadeia pesada de Mc3 é mostrada na Figura 10. As sequências nucleotídica e de aminoácidos completas para a região variável da cadeia leve (capa) de Mc3 é mostrada na Figura 11. A identificação das sequências foi feita através da sua comparação com as bases de dados publicadas por Kabat et al., supra. Os aminoácidos são mostrados no código de uma letra. Os aminoácidos em minúsculas representam os péptidos líder. Os nucleótidos em minúsculas representam sobreposições da sequência do iniciador e podem, portanto, não corresponder às sequências naturais.

Exemplo 2: Construção de Genes de ChMc3, Versão Quimérica de Mc3 com Regiões Constantes Humanas

Os fragmentos de ADN codificando as regiões VH e VL bem como os péptidos líder apropriados foram amplificados, através de PCR, directamente a partir dos respectivos clones pCRII descritos acima, utilizando iniciadores que continham locais de restrição terminais apropriados para inserção nos vectores de expressão. Os iniciadores utilizados para este fim foram como se segue:

Nome do iniciador: J065

Local de Restrição Terminal: Sall Especificidade do iniciador: Cadeia capa, região J 46 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Direcção do iniciador: anti-sentido Sequência do iniciador: GTCGACTTAC G TTT TAT TTC CAA GTT TGT CCC CGA GCC (SEQ ID NO:72)

Nome do iniciador: J066

Local de Restrição Terminal: Nhel

Especificidade do iniciador: Cadeia pesada, região J Direcção do iniciador: anti-sentido Sequência do iniciador: GCT AGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT TC (SEQ ID NO:73)

Nome do iniciador: J067

Local de Restrição Terminal: EcoRV

Especificidade do iniciador: Cadeia capa, péptido sinal Direcção do iniciador: com sentido Sequência do iniciador: GATATC CACC ATG GAG TTC CAG ACC CAG GTC TTT GTA TT (SEQ ID NO:74)

Nome do iniciador: J06S

Local de Restrição Terminal: Hpal

Especificidade do iniciador: Péptido sinal da cadeia pesada Direcção do iniciador: com sentido Sequência do iniciador: GTTAAC CACC ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATT CTC TT (SEQ ID NO:75) A ADN-polimerase Vent (New England Biolabs Inc.) foi utilizada nestas PCR devido à sua elevada fidelidade. As condições de reacção foram tal como descrito no catálogo de New England Biolabs. Os produtos de PCR resultantes codificando VH e VL foram primeiro inseridos em pBluescript II (TM) (Stratagene) que tinha sido digerido com BcoRV. Os clones intermédios resultantes foram então digeridos com as enzimas de restrição apropriadas, ver acima, e as inserções de ADN foram transferidas para os vectores pAH4604 e pAG4622, respectivamente.

Estes vectores, que codificam uma região constante gama 1 humana ou uma região constante capa humana, foram desenvolvidos (Coloma, M.J., et al., J. Immunol. Methods. 152(1): 89-104, 1992) e gentilmente proporcionados por S.L.

Morrison (Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, UCLA). 47 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

As inserções foram novamente sequenciadas em ambas as direcções directamente nos vectores pAH4604 e pAG4622. Ambos os vectores foram derivados de pSV2 (Mulligan, R.C. e Berg, P. Science 209: 1422-1427, 1980), e contêm fragmentos genómicos codificando os domínios constantes da cadeia pesada ou leve. Os vectores aceitam ADNc que codificam as regiões Fv. Para ligar os ADNc de Fv aos vectores, foram adicionadas extremidades de restrição aos ADNc num conjunto de reacções de PCR, utilizando os iniciadores J065, J066, J067 e J068. O vector da cadeia leve pAG4622 contém o gene para a região constante da cadeia κ humana, incluindo o intrão J-C. Codifica a xantina-guanina-fosforibosil-transferase ou gpt (Mulligan, R.C. e Berg, p. PNAS (USA) 78: 2072-2076, 1981) como marcador seleccionável dominante. Aceita o ADNc de VL de murideo entre o local de ligação ao ribossoma (Kozak, M. Nucleic Acids Res. 12: 857-872, 1984), que é precedido pelo promotor de VH do anticorpo monoclonal de murideo anti-dansilo 27.44 (Coloma, M.J., et al., J. Immunol. Methods 152(1): 89-104, 1992) e o intrão J-C. O intrão J-C contém o estimulador da cadeia k (Potter, H., et al., PNAS (USA) 81: 7161-7165, 1984; e Emorine, L. et al., Nature 304: 447-449, 1983) . O vector da cadeia pesada pAH4604 contém o gene para a região constante da cadeia pesada γΐ, mas não o intrão J-C. Codifica a histidinol-desidrogenase ou hisD (Hartman, S.C. e Mulligan, R.C., PNAS (USA) 85: 8047-8051, 1988) como marcador seleccionável dominante. Aceita o ADNc de Vh de murideo entre o local de ligação ao ribossoma do promotor de dansilo e o gene da γΐ constante. O vector contém também uma inserção que codifica o estimulador da cadeia pesada (Rabbitts, T.H., et al., Nature 306: 806-809, 1983).

Exemplo 3: Preparação e Caracterização dos Anticorpos Mc3 Quiméricos (ChMc3)

Todos os procedimentos utilizados neste Exemplo foram descritos em pormenor em publicações anteriores (Couto, J.R., et al., Hybridoma 12(1): 15-23, 1993; e Couto, J.R., et al., Hybridoma 12(4): 485-489, 1993). As condições de cultura de tecidos foram geralmente como se segue: células SP2/0-Agl4 (Shulman, M., et al., 1978, abaixo) foram cultivadas em Meio 48 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ de Eagle modificado por Dulbecco (DME): soro fetal bovino (FBS), 90:10 (v/v) ou numa mistura de DME:RPMI:FBS, 45:45:10 (v/v/v) ou RPMI:FBS, 90:10 (v/v). Foram adicionadas penicilina e estreptomicina para prevenir crescimento bacteriano. Quando foi utilizado meio isento de soro, este continha um suplemento de HL-1 tal como orientado pelo fabricante (Ventrex Labs., Portland, ME) . O meio de congelação foi DMSO a 10% em soro bovino.

Em resumo, após verificação da sequência, ambas as construções plasmidicas foram sujeitas a electroporação para células de mieloma SP2/0-Agl4. Os sobrenadantes dos transfectantes estáveis foram ensaiados quanto à presença do anticorpo quimérico. O anticorpo quimérico segregado foi primeiro capturado por anticorpo policlonal de cabra anti-cadeia capa humana ligado a uma placa e subsequentemente revelado com um anticorpo secundário policlonal de cabra anti-cadeia gama humana radiomarcado. O anticorpo quimérico foi também ensaiado quanto à ligação a uma preparação de glóbulo gordo do leite humano (HMFG) ligada à placa.

Os transfectantes estáveis expressando o anticorpo quimérico que se ligaram a HMFG foram primeiro clonados e depois cultivados em meio livre de soro e livre de proteínas (Sigma n.° de cat. S2772). O ChMc3 foi então purificado a partir do meio utilizando uma coluna de proteína A (BioRad). O anticorpo purificado correu como uma única banda larga em SDS-PAGE não redutor a 7,6%. A sua migração no gel coincidiu com a de outros anticorpos purificados carregados no mesmo gel. Sob condições redutoras esta banda foi resolvida em duas bandas de aproximadamente 53 kDa e 29 kDa, respectivamente, e a sua migração coincidiu com a de outros anticorpos reduzidos carregados no mesmo gel.

Exemplo 4: Determinação da Afinidade de ChMc3 para HMFG

As constantes de afinidade anticorpo-antigénio para o anticorpo quimérico murídeo-humano (ChMc3) foram determinadas através da obtenção do valor inverso da concentração de anticorpo monoclonal não marcado em competição dando 50% de ligação tal como descrito por Sheldon et al., Biochem. Cell Biol. 65: 423-428, 1987). O protocolo para o ensaio foi como se segue. 49 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Placas de microtítulo (Dynatech, Chantilly, VA) foram preparadas com HMFG de acordo com técnicas padrão (tal como descrito por Ceriani et al., em "Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines" (T.J. McKern et al., eds.), págs. 398-402, New York, Plenum Press, 1984). A cada poço foram adicionados 25 μΐ de 125I-Mc3 em tampão RIA (soro fetal bovino a 10%, TRITON (TM) X-100 a 0,3%, azida de sódio a 0,05%, pH 7,4, em solução salina tamponada com fosfato), e competiram com 25 μΐ de anticorpo de murídeo não marcado ou anticorpo quimérico murídeo-humano em tampão de RIA a concentrações finais no intervalo nanomolar.

As iodações foram efectuadas com 125I (17 Ci/mg, Nordion

International Inc., Kanata, Ontario, Canadá). 50 pg de anticorpo monoclonal Mc3 foram marcados (a uma actividade especifica de «10 mCi/mg) utilizando o método de cloramina T tal como descrito por Ceriani, R.L. e Blank, E.W. Câncer Res. 48: 4664-4672, 1988). Quando as cpm do anticorpo Mc3 de murideo (MuMc3) radiomarcado ligado foram representadas num gráfico no eixo dos yy e o logaritmo da concentração namolar (nM) do anticorpo MuMc3 não marcado competidor ou do anticorpo quimérico murideo-humano (ChMc3) foi representado no eixo dos xx, os anticorpos exibiram perfis de competição semelhantes (Figura não mostrada). A afinidade do anticorpo quimérico purificado (ChMc3) para HMFG foi determinada como sendo 5χ108 Μ”1, o que se aproxima muito da constante de afinidade observada para o anticorpo de murideo Mc3 de 3χ108 M”1. Para além disso, determinámos em experiências de competição que ChMc3 compete tão bem como Mc3 contra a ligação do Mc3 radiomarcado a HMFG. Assim, foram conservadas tanto a afinidade como a especificidade do anticorpo de murideo original no seu equivalente quimérico. Estes resultados de afinidade e competição indicam ainda que os anticorpos são autênticos.

Exemplo 5: Identificação de um Modelo de Consenso Humano para Orientação da Humanização de Mc3

Pensámos que a versão humanizada de Mc3 menos imunogénica seria uma em que as sequências de VL e VH se aproximassem das sequências de consenso das subclasses de VL e VH humanas, 50 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ respectivamente. Assim, em vez de escolher as sequências de VL e Vh de um anticorpo em particular como alvos, escolhemos as sequências de consenso das subclasses humanas VKIV e VHI, para Vl e VH, respectivamente (Kabat, e.a. et al., "Sequences of proteins of immunological interest. U.S. Dept. Health and Human Services", NIH, 1991) .

Estas regiões variáveis humanas de consenso são as mais semelhantes às regiões variáveis correspondentes de Mc3. A maioria dos resíduos estruturais importantes era idêntica nas estruturas de consenso de murídeo e humana, mas algumas não eram. O modelo de consenso humano para a região variável da cadeia pesada de Mc3 é mostrado na Figura 12 e aquele apara a região variável da cadeia leve é mostrado na Figura 13.

As posições nas quais o resíduo de murídeo diferiu do resíduo de consenso humano foram então analisadas de acordo com a técnica BR-R ou a técnica BR-M, para determinar se o resíduo deve ou não ser modificado para humanização, tal como ilustrado abaixo.

Exemplo 6: Aplicação da Técnica de Modificação do Resíduo Oculto (BR-M) à Humanização de Mc3

Utilizando a técnica de modificação do resíduo oculto (ou técnica BR-M), os resíduos "importantes" a manter incluem: (i) resíduos dentro de uma CDR; (ii) resíduos que é provável que contactem com uma CDR; (iii) resíduos que é provável que contactem com a cadeia oposta do anticorpo. Em contraste com a técnica BR-M, os resíduos ocultos podem ser, e de preferência são, humanizados. A posição provável na sequência dos resíduos "importantes", foi determinada através da aplicação de um consenso posicionai conservativo desenvolvido para aplicação da técnica BR-M, tal como descrito acima. 0 consenso posicionai para VL foi como se segue: 1-5, 7, 22, 23, 35, 36, 38, 43-46, 48, 49, 58, 60, 62, 66, 67, 69, 70, 71, LO OD CO CO oo 98 e 100. Para VH, foi como se segue: 1, 2, 4, 24, 27 1 CO o 36- 40, 43-49, 66-69, 71, 73, 78, 80, 82, 86, 91-94, 103 e 105. A aplicação do método br-m à humanização das regiões variáveis de Mc3 é ilustrada resíduo-a-resíduo na Figura 12 e 51 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ na Figura 13, para as cadeias pesada e leve de Mc3, respectivamente. O protocolo de humanização de BR-M pode ser resumido como se segue (utilizando os termos mostrados na Figura 12 e Figura 13): Sob o título "Mantidos de murídeo":

Sim (mesmo que o humano)

Sim (CDR)

Sim (contacta com a CDR)

Sim (cont. intercadeias) Não resíduo de murídeo idêntico ao consenso humano, não é necessária humanização resíduo de murídeo diferia do consenso humano mas o resíduo parecia estar dentro da CDR, é mantido o de murídeo resíduo de murídeo diferia do consenso humano mas era provável que o resíduo contactasse com a CDR, é mantido o de murídeo resíduo de murídeo diferia do consenso humano mas era provável que o resíduo contactasse com a cadeia oposta, é mantido o de murídeo resíduo de murídeo não se encaixou nas categorias anteriores e foi humanizado (através da substituição pelo resíduo de consenso humano)

Sob o título "Humanizados": n/a

Humanizados

Humanizados (BR) Não humanizado resíduo de murídeo idêntico ao consenso humano, não é necessária humanização resíduos humanizados se não forem resíduos de murídeo "importantes" (tal como descrito acima) indica que era provável que o resíduo humanizado fosse um resíduo oculto (um tal resíduo teria sido mantido sob a técnica BR-R) mantido um resíduo de murídeo que foi considerado "importante" 52 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Tal como mostrado na Figura 13, a versão final humanizada de VK difere apenas em três posições FR da correspondente sequência de consenso humana de VKIV (Kabat, E.A. et al., "Sequences of proteins of immunological interest". U.S. Dept. Health and Human Services, NIH, 1991). As diferenças entre a cadeia pesada humanizada e o consenso humano para VHI são mais numerosas, 13 posições FR. Contudo, uma fracção considerável de anticorpos humanos pertencentes a esta subfamilia contém mais diferenças nas posições FR das suas próprias sequências de consenso que VH de HuMc3. Assim, por exemplo, encontrámos certas estruturas de VHI com até 29 diferenças em relação às suas próprias sequências de consenso. 0 número de resíduos estruturais ocultos que foram mudados de murídeo para humano foi de 7 em VK e 5 em VH.

Exemplo 7: Aplicação da Técnica de Manutenção do Resíduo Oculto" (BR-R) à Humanização de Mc3

Utilizando a técnica de manutenção de resíduos ocultos, são mantidos todos os resíduos de murídeo que seja provável estarem ocultos.

Para aplicar a técnica BR-R à humanização de Mc3, todos os resíduos "Humanizados (BR)" marcados das Figuras 12 e 13 teriam sido deixados na sua forma de murídeo original. Outros aspectos do protocolo de humanização seriam idênticos. A sequência de aminoácidos de uma forma humanizada por BR-R da região variável pesada de Mc3 é mostrada na Figura 14 (utilizando o código de aminoácidos padrão de uma letra; as letras minúsculas indicam o péptido líder). A sequência correspondente para a cadeia leve de Mc3 é mostrada na Figura 15.

Exemplo 8: Construção de Genes de HuMc3, Versões Humanizadas dos Genes de Mc3 Quiméricos

As regiões inteiras a humanizar foram sintetizadas através do método de PCR de oligonucleótidos sobreponíveis (Ye, Q.Z. et al., Blochem. Biophys. Res. Commun. 186(1): 143-9, 1992). Oligonucleótidos de tamanhos variáveis de 49 a 101 nucleótidos, foram sintetizados num sintetizador de ADN PCR- 53 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Mate ΕΡ modelo 391 (Applied Biosystems, Foster City CA.) utilizando colunas de 40 nmol, ciclo 1:63, sem Tritilo. Os oligonucleótidos não foram purificados antes da sua utilização e as suas concentrações foram estimadas utilizando a fórmula c = [ (A260) /30 ] pg/μΐ.

Os iniciadores utilizados na construção dos genes de HuMc3 são mostrados nas Figuras 16 e 17. As condições de PCR foram como se segue: 150 nM de cada um de quatro oligonucleótidos internos longos (100-101meros), 2 μΜ de cada um de dois iniciadores terminais curtos (49-66meros), 200 μΜ de cada dNTP, KC1 10 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,8, (NH4)2S04 10 mM, TRITON (TM) X-100 a 0,1%, MgS04 6 mM. A ADN-polimerase Vent (New England Biolabs), 2 unidades por 100 μΐ de reacção, foi adicionada após o Ficheiro 2, abaixo, (inicio quente). Um sistema de PCR GENEAMP (TM) 9600 (Perkin Elmer Cetus) foi programado com a seguinte série de ficheiros ligados: Ficheiro 1 = [(95°, 5 min), (1 min rampa até 70°), (5 min pausa)]; Ficheiro 2 = [(96°, 5 s) (55°, 10 s) (72°, 30 s)]x3; Ficheiro 3 = [(96°, 5 s) (60°, 10 s) (72°, 30 s)]x29;

Ficheiro 4 = [ (72°, 10 minutos)] ; Ficheiro 5 = [ (5o, sempre)] .

O Ficheiro 4 foi repetido no final da PCR, após adição de dNTP extra (a 120 μΜ cada) e 1 unidade de ADN-polimerase Vent (por 100 μΐ de reacção).

Os fragmentos de ADN sintético foram primeiro inseridos em pBLUESCRiPT li (TM) (Stratagene) digerido com EcoRV. Uma vez confirmadas as sequências das cassetes de ADN sintético nos pequenos plasmideos intermédios, fragmentos de restrição apropriados foram então transferidos para os plasmideos de expressão. VH, codificada num fragmento EcoRV-Nhel foi inserida em pAH4604 e VK, codificada num fragmento £coRV-Sall foi inserida em pAG4622 (Coloma, M.J. et al., J. Immunol. Methods. 152(1): 89-104, 1992; Couto, J.R. et al., Hybridoma 12(1): 15-23, 1993; e Couto, J.R. et al., Hybridoma 12(4): 485-489, 1993) .

As sequências nucleotidica e a correspondente polipeptidica da região VH humanizada de HuMc3v2 são mostradas na Figura 18. As sequências nucleotidica e a correspondente polipeptidica da região VL humanizada de HuMc3v2 são mostradas na Figura 19. 54 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Exemplo 9: Preparação do Anticorpo Mc3 Humanizado (HuMc3)

As regiões variáveis humanizadas do Exemplo 5 (HuMc3) foram clonadas nos vectores de expressão pAG4622 e pAH4604. Tal como descrito no Exemplo 2 acima, estes vectores foram utilizados para expressar o anticorpo recombinante resultante. A construção e expressão dos genes do anticorpo humanizado foram efectuadas tal como descrito para o anticorpo quimérico no Exemplo 3 (bem como Couto, J.R. et al., Hybrídoma 12(1): 15-23, 1993; e Couto, J.R. et al., Hybrídoma 12(4): 485-489, 1993). A linha celular de mieloma não produtora SP2/0-Agl4, ATCC:CRL 1581 foi transfectada e foram isolados clones produtores de anticorpo tal como descrito no Exemplo 3 e em Couto, J.R. et al., Hybrídoma 12(1): 15-23, 1993; e Couto, J.R. et al., Hybrídoma 12(4): 485-489, 1993. A produção do anticorpo foi reforçada através do método padrão de adição de OPTIMAB (TM) (catálogo Gibco 680-191 OSD) ao meio de cultura a uma concentração de 1% de cada um dos componentes A e B.

As colónias que segregaram os maiores niveis de anticorpo para os sobrenadantes foram subclonadas em meio livre de soro e livre de proteinas. Os niveis de anticorpo no meio foram medidos através de técnicas de radioimunodetecção padrão (Couto, J.R. et al., Hybrídoma 12: 15-23, 1993). Um anticorpo de captura de cabra anti-k humana ligado a uma placa foi utilizado com um anticorpo secundário de cabra anti-k humana marcado com I e os valores obtidos foram comparados com os de uma curva de diluição padrão obtida em paralelo utilizando uma imunoglobulina IgGik humana não relacionada (catálogo Sigma 1-3889). O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura de transfectantes Sp2/0-Agl4 através de um método semelhante ao do Exemplo 3. Os anticorpos monoclonais segregados foram concentrados através de uma membrana de ultrafiltração Amicon DIAFF (TM) YM30 e purificados utilizando uma coluna de proteína A (Ceriani et al., Anal. Biochem. 201: 178-184, 1992). A pureza foi verificada através de SDS-PAGE. HuMc3 correu como uma banda única em SDS-PAGE não redutor a 7,6%. Sob condições redutoras, foram observadas duas bandas 55 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ com pesos moleculares aparentes de aproximadamente 53 kDa e 29 kDa.

Exemplo 10: Comparação funcional de HuMc3 e MuMc3 A afinidade de HuMc3 para HMFG foi medida de modo semelhante à do método descrito no Exemplo 3, para confirmar que tinha uma actividade de ligação comparável à dos anticorpos de ratinho e quimeras dos quais tinha sido derivado.

MuMc3, HuMc3 e uma IgGik humana de especificidade não relacionada foram radiomarcados tal como no Exemplo 4. As actividades especificas obtidas foram entre 6 e 20 mCi/mg.

Foram conduzidos estudos de ligação tal como delineado anteriormente. Resumidamente, foram preparadas placas de microtitulo utilizando camadas sucessivas de BSA (albumina de soro bovino) metilada, glutaraldeido e uma preparação de HMFG deslipidado (Ceriani R.L. et al., PNAS USA 74: 582-586, 1977). Cada poço foi revestido com 100 ng de HMFG. Foram conduzidas experiências de competição através da adição a cada poço de uma quantidade padrão de 125I-MuMc3 e uma diluição apropriada de MuMc3 ou HuMc3 não marcado em tampão de RIA (soro fetal bovino a 10%, TRITON X-100 (TM) a 0,3%, azida de sódio a 0,05%, pH 7,4, em PBS). Para a determinação das constantes de afinidade, cada anticorpo foi testado em competição contra si mesmo. A constante de afinidade foi calculada como o inverso da concentração do anticorpo monoclonal não marcado competidor que deu 50% da ligação máxima.

As afinidades observadas do MuMc3 e HuMc3 para uma preparação de glóbulo gordo do leite humano foram respectivamente de 3*108 M_1 e 6*108 M_1. Estes números confirmam que os anticorpos recombinantes mantêm actividade de ligação a HMFG, e que o procedimento de humanização não alterou substancialmente a afinidade do anticorpo original.

Diferenças nos epitopos reconhecidos por dois anticorpos relacionados podem ser detectadas quando ambos competem pela ligação ao seu antigénio comum. A Figura 20 mostra os resultados obtidos quando foi utilizado MuMc3 radiomarcado em 56 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ experiências de competição contra MuMc3 não marcado (círculos vazios) ou HuMc3 não marcado (círculos a cheio). Os valores no eixo dos yy representam a quantidade de I-MuMc3 ligado na presença de anticorpo não marcado competidor, relativamente à ligação na ausência de anticorpo competidor. Os resultados mostram que MuMc3 e HuMc3 competem igualmente bem contra MuMc3 marcado, indicando que se ligam a epítopos idênticos ou intimamente aparentados.

Exemplo 11: Estudos de Biodistribuição

Sabe-se que o antigénio HMFG está associado a células cancerígenas da mama humana e foi utilizado como alvo para detecção e terapia mediada por anticorpos. Tal como descrito anteriormente, HuMc3 foi desenhado para ser um agente de direccionamento útil para transportar efectores farmacológicos, tais como radioisótopos, para locais de tumores. Neste Exemplo, o anticorpo HuMc3 radioiodado e o controlo MuMc3 foram utilizados em estudos de biodistribuição num modelo de ratinho de carcinoma da mama humano para confirmar que a actividade de ligação demonstrada nos ensaios de placas de microtítulo eram também observáveis in vivo.

Ratinhos nu/nu atímicos, com 11 a 12 semanas de idade, foram adquiridos em Simonsen (Gilroy, CA). Eles foram mantidos em gaiolas e leitos esterilizados e alimentados com granulado de ratinho Purina 5058 esterilizado por irradiação e água da torneira esterilizada acidificada até pH 2,5. Os ratinhos foram mantidos a uma temperatura de 25,6°C até 28,9°C num ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuro. O tumor mamário humano transplantável MX-1 foi obtido em EG&G Mason Research Institute (Worcester, MA) (Inoue K. et al., Chemother. Pharmacol. 10: 182-186, 1983). O tumor foi estabelecido em ratinhos nu/nu nas nossas instalações de acordo com protocolos padrão. Os tumores foram então criados durante 22 dias e foi iniciada radioimunoterapia experimental em ratinhos cujo volume tumoral médio era de aproximadamente 100 mm3. Os volumes tumorais foram medidos com um compasso de espessura e calculados através da multiplicação do comprimento x largura χ altura da massa tumoral e dividindo por 2. Os tumores foram ordenados de acordo com o volume tumoral e os 57 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ ratinhos foram agrupados de modo a que cada grupo tivesse aproximadamente o mesmo volume tumoral médio. O anticorpo MuMc3, HuMc3 e a igG-lK humana de controlo (Sigma 1-2889) foram utilizados marcados com 131I tal como descrito nos Exemplos 4 e 10, excepto que foi utilizado Na131I em vez de Na I. As actividades especificas foram de 2,15 mCi/mg, 9,0 mCi/mg e 11,2 mCi/mg, respectivamente. Os ratinhos foram injectados com 10 pCi de anticorpo marcado como um bolo único. Os tecidos foram dissecados, pesados e contados a vários momentos após a injecção e foi calculada a percentagem de dose injectada/grama de tecido, tendo em conta o decaimento radioisotópico. A Figura 21 mostra os resultados dos estudos de biodistribuição. As quatro barras para cada tecido mostram a actividade presente após 1, 2, 4 e 8 dias, respectivamente (média ± erro padrão para 5 animais sacrificados a cada momento). Os anticorpos MuMc3 e HuMc3 marcados com 131I persistiram no aumento tumoral durante um período de pelo menos 4 dias (painéis do meio e inferior) . Em todos os tecidos, o anticorpo ligado diminuiu estavelmente durante este período. Em comparação, a quantidade de anticorpo não específico marcado com 131I que se localizou no local do tumor era muito menor (painel superior).

Assim, HuMc3 mostrou a mesma especificidade tumoral que MuMc3. Aos 4 dias após a injecção, a percentagem de HuMc3 injectado no local do tumor era de 21,3% e aos 8 dias era de 11,1%. A actividade específica relativa nos tecidos foi de 2:5:1 (tumor:pulmão) e 25:1 (tumor:músculo) aos 4 dias. A actividade específica relativa era superior 8 dias após injecção.

Exemplo 12: HuMc3 como agente direccionador para radioterapia de cancro da mama

Uma vez que o anticorpo HuMc3 se liga e se dirige eficazmente para o antigénio BA46, é um transportador adequado para levar uma dose terapêutica de radioactividade a um local de tumor. Isto foi demonstrado directamente no modelo tumoral 58 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ ΜΧ-1 de murídeo do Exemplo 11, utilizando uma dose maior de radioactividade. Ο I foi um radioisotopo util para este fim por duas razões óbvias: é fácil de trabalhar com ele para fins experimentais, e possui as propriedades que se sabe serem adequadas para radioimunoterapia. Em particular, emite partículas com mais energia que 125I e 99mTc e é portanto capaz de proporcionar uma maior dose de radiação por mCi; para além disso, a radiação é parcialmente na forma de partículas beta, que são facilmente absorvidas por tecidos vizinhos. Outros radioisótopos frequentemente utilizados para radioimunoterapia incluem inIn e 90Y.

Assim, o anticorpo HuMc3 foi radiomarcado com 131I, tal como no Exemplo 11, para uma actividade específica de 9,0 mCi/mg. Ratinhos nu/nu possuindo MX-1 foram preparados como anteriormente. Foi dado a cinco ratinhos nu/nu atímicos possuindo tumores MX-1 uma única injecção i.p. de 500 pCi de 131I-HuMc3, diluído em PBS (solução salina tamponada com fosfato) contendo BSA a 0,1%. Os volumes tumorais foram seguidos durante 30 dias após a injecção, utilizando o método do compasso delineado no Exemplo anterior. Seis ratinhos serviram de grupo de controlo e não foram injectados com anticorpo marcado.

Tal como mostrado na Figura 22, o tamanho inicial do tumor para os grupos tratados e não tratados foi de aproximadamente 100 mm3. Nos ratinhos tratados, o tamanho médio do tumor diminuiu para 42 mm3 no dia 30 (linha inferior) . Em contraste, os tumores no grupo de não injectados cresceram continuamente até alcançarem um tamanho médio final de 2100 mm3 (linha superior). Não ocorreram mortes em nenhum dos grupos nos primeiros 30 dias após a terapia. Aos 61 dias, todos os cinco animais tratados estavam ainda vivos e um animal não tinha nenhum tumor detectável. Estes resultados sugeriram que HuMc3 era mais eficaz em radioimunoterapia que os anticorpos monoclonais específicos para outros epítopos BA46 (Peterson et al., 353: 1-8, 1994 em "Antigen and Antibody Molecular Engineering in Breast Câncer Diagnosis and Treatment", Plenum Press NY). 59 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Exemplo 13: Eficácia de HuMc3 radiomarcado utilizando um agente quelante

Foram conduzidas ainda outras experiências para demonstrar a adequabilidade do Mc3 humanizado como agente direccionador para radioterapia.

Tal como é conhecido de um praticante de vulgar perícia na arte, quando o anticorpo é para utilizar num arranjo clínico ou com um isótopo que tenha uma semivida curta, é geralmente preferível proporcionar o anticorpo pré-conjugado com um grupo ligante, que seja por sua vez capaz de receber o radioisótopo pouco tempo antes da utilização. Exemplos preferidos de tais grupos de ligação são os quelantes. Ver, geralmente, Brechbiel, M.W. et al., Bioconjugate Chem. 2: 187-194, 1991). Um exemplo de um grupo de ligação quelante preferido é MXDTPA. 0 quelante pode ser proporcionado na forma purificada e conjugado com o anticorpo utilizando tampões que são essencialmente isentos de iões metálicos. 0 conjugado é geralmente armazenado num ambiente livre de metais para evitar a ocupação do local de ligação no quelante. Imediatamente antes da utilização, o conjugado pode ser misturado com um radioisótopo adequado, tal como mIn ou 90Y, sob condições e a uma razão molar que permita que essencialmente todos os radioisótopos sejam capturados e mantidos muito ligados pelo conjugado.

Foram conduzidas experiências para confirmar que o HuMc3 podia ser marcado com um quelante sem perturbar a actividade de ligação a HMFG, tal como observado nos Exemplos anteriores. 0 MXDTPA foi obtido em 0. Ganson no NIH, Bethesda, MD. 0 MXDTPA foi conjugado com o anticorpo de acordo com protocolos padrão (Brechbiel, M.W. et al., Inorg. Chem. 25: 2272-2281, 1986), como se segue: Foram preparados cerca de 3-5 mg de anticorpo recombinante ou de anticorpo de controlo IgGi-fc humano através de diálise de um dia para o outro a 4°C contra 1 litro de NaCl 0,15 M e tampão HEPES 0,05 M, pH 8,6. O MXDTPA foi dissolvido em água livre de metais num volume de 50 μΐ por cada 5 mg. A conjugação foi realizada através da combinação do anticorpo com a solução de MXDTPA, e incubação durante 19 h à temperatura ambiente. O MXDTPA livre foi removido do anticorpo 60 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ conjugado através de diálise contra 3 mudas de tampão acetato de amónio, pH 6,8, durante 24 h cada. O inin de qualidade farmacêutica foi obtido em Amersham, Arlington Heights, IL. A marcação foi efectuada através da adição do mIn ao anticorpo conjugado tal como anteriormente descrito (Blank, E.W. et ai., Câncer J. 5: 38-44, 1992). As actividades especificas foram de 6 mCi/mg e 1,7 mCi/mg para o MuMc3 e HuMc3, respectivamente. A integridade do anticorpo marcado com mIn foi determinada através de cromatografia liquida de alta pressão (HPLC). A bomba de HPLC Perkin Elmer modelo 250 foi utilizada com uma coluna de filtração em gel de 600 χ 7,5 mm TSK 250.

Foram corridas amostras de 0,1 ml compreendendo 1 χ 105 cpm num tampão de NaCl 0,15 M e fosfato 30 mM, pH 6,5 a 0,5 ml/min e uma pressão de 70 bar. Fracções de 0,5 ml foram recolhidas e contadas. Essencialmente toda a radioactividade eluiu a uma posição correspondente à de uma igGi padrão.

Foram conduzidos estudos de biodistribuição utilizando um anticorpo marcado com mIn no modelo de ratinho de tumor da mama humano MX-1, como no Exemplo 11. Cada ratinho recebeu uma única dose de 10 pCi (diluído em PBS contendo BSA a 0,1%) através da veia caudal.

Os resultados são mostrados na Figura 23. Tanto o anticorpo MuMc3 (painel superior) como o anticorpo HuMc3 (painel inferior) concentraram-se no local do tumor e persistiram aí ao longo do período da experiência. Isto confirma que a capacidade de HuMc3 para se localizar no local do tumor é comparável à do anticorpo de murídeo do qual deriva, e que a localização é independente do método de marcação ou do radioisótopo utilizado. 61 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: CÂNCER RESEARCH FUND OF CONTRA COSTA

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PÉPTIDOS RECOMBINANTES DERIVADOS DO

ANTICORPO ANTI-BA46 Mc3, MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO, E MÉTODOS DE HUMANIZAÇÃO DE PÉPTIDOS DE ANTICORPOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 75 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: MORRISON & FOERSTER (B) RUA: 755 Page Mill Road (C) CIDADE: Paio Alto

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94304-1018 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US95/11683 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 14-SET-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE:

(A) NOME: TYLER DYLAN (B) NÚMERO DE REGISTRO: 37,612 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 27633-20001.40 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (415) 813-5600 (B) TELEFAX: (415) 494-0792 (C) TELEX: 706141 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

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Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Pro Trp Ile Tyr 20 25 62 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:2: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Asp Ile Vai Met Thr Gin Leu Vai Vai Met Cys Lys Ser Ser Gin Ser 15 10 15

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 20 25 30

Pro Pro Leu Leu Ile Tyr 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Asp Ile Vai Leu Gin Leu Vai Vai Leu Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile 15 10 15

Gly Asn Asn Leu His Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Leu Leu Ile Lys 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Asp Ile Vai Leu Gin Met Ala Vai Met Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai 15 10 15

Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Arg Trp Ile Tyr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 63 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Ile Gin Met Thr Gin Leu Ala Vai Ile Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie 15 10 15

Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Thr Lys Leu Leu Vai Tyr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Asp Vai Vai Met Thr Gin Leu Vai Ala Ile Cys Arg Ser Ser Gin Ser 15 10 15

Leu Vai His Ser Gin Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gin Pro 20 25 30

Lys Vai Leu Ile Tyr 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Asp Ile Gin Met Gin Leu Ala Vai Ile Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile 15 10 15

Asn Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Ile Leu Leu Ile Tyr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Vai Leu Met Gin Thr Leu Vai Ala Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gin Thr 15 10 15

Ile Leu Leu Ser Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Ser 20 25 30

Pro Leu Leu Ile Tyr 35 64 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Asp Ile Met Gin Leu Ala Vai Ile Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His 1 S 10 15

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Ser Pro Leu Leu Vai Tyr 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Vai Arg Phe Tyr Leu Ile Met Asp Ala 15 ío 15

Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Phe Thr Leu Leu 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Vai Asp Arg Phe Ser Thr Asp Phe Leu 1 5 10 15

Ile Vai Asp Ala Tyr Tyr Cys Gin Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr 20 25 30

Phe Ala Thr Leu Ile 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 65 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Ile Vai Asp 15 10 15

Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Thr Leu 20 25 30

Ile (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Vai Arg Phe Tyr Leu ile Met Asp Ala 15 10 15

Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Gly Arg Asn Pro Thr Phe Thr Leu Ile 20 25 30 (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID N0:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Vai Arg Phe Asp Tyr Leu Ile Leu Asp 15 10 15

Ala Thr Tyr Cys Gin Gin Gly Ser Thr Thr Pro Arg Thr Phe Thr Leu 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Vai Asp Arg Phe Thr Phe Leu Ile Vai 15 10 15

Asp Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Thr Leu 20 25 30 66 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Phe Thr Ser Arg Ser Gin Ser Vai Arg Phe Thr Asp Tyr Leu Ile Leu 15 10 15

Asp Ala Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Ala Leu Pro Arg Thr Phe Thr 20 25 30

Leu Ile (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

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Asp Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Pro Thr Phe Thr 20 25 30

Leu Ile (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID N0:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

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Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 67 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

Vai Leu Glu Vai Leu Leu Cys Ala Phe Asp Phe Lys Tyr Trp Met Ser 15 10 15

Trp Vai Arg Gin Leu Glu Trp Ile 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20:

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Trp Vai Arg Gin Arg Leu Glu Trp Ile Ala 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Vai Leu Glu Pro Vai Leu Leu Cys Vai Asp Ile Thr Ser Asp Tyr Trp 15 10 15

Ser Trp Ile Arg Lys Asn Leu Glu Tyr Met 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22:

Leu Gin Met Vai Ile Cys Ala Tyr Thr Phe Asp Tyr Trp Ile Glu Trp 15 10 15

Vai Lys Gin Arg Leu Glu Trp Ile 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 68 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Vai Leu Glu Vai Vai Met Cys Ala Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Vai 1 S 10 15.

Asn Trp Vai Lys Gin Gin Glu Trp Ile 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24:

Leu Glu Vai Met Leu Cys Ala Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn 15 10 15

Trp Vai Arg Gin Ser Leu Glu Trp Vai Ala 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25:

Glu Vai Leu Gin Vai Vai Met Cys Ala Tyr Thr Phe Ser Asn Gly Ile 15 10 15

Asn Trp Vai Lys Gin Leu Glu Trp lie 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:26: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Vai Leu Glu Vai Leu Leu Cys Ala Phe Thr Phe Arg Cys Ala Met Ser 15 10 15

Trp Vai Arg Gin Lys Leu Trp vai Ala 20 2S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 69 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27:

Val Leu Glu Vai Leu Ile Cys Vai Phe Leu Gly Tyr Gly Vai Asn Trp 15 10 15

Val Arg Gin Leu Glu Trp Leu 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

Glu Ile His Pro Asp Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Asp Lys Phe Ile Arg Asn Leu Leu Met Val Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala 20 25 30

Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO : 29 :

Ala Ser Arg Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 15 10 15

Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Met Leu Asp Ala Tyr 20 25 30

Tyr Cys Ala Arg 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30:

Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

Arg Ile Ile Arg Tyr Leu Leu Val Asp Ala Tyr Tyr Cys Asn 20 25 30 70 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO :31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31:

Glu lie Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr His Glu Arg Phe Lys 15 10 15

Gly Lys Ala Phe Ala Ala Met Leu Leu Asp Tyr Tyr Cys Leu His 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:32: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32:

Tyr Ile Asn Pro Gly Lys Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly Thr Thr Leu Vai Ala Met Leu Leu Asp Ala Tyr Phe Cys Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33:

Gin Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser 15 10 15

Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Arg Asp Ser Vai Leu Met Leu Asp Tyr 20 25 30

Tyr Cys Thr 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 71 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (χί) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34:

Tyr Asn Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Ile Ala Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly Thr Leu Vai Ala Met Leu Leu Asp Ala Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:35: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35:

Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Thr Vai Lys 15 10 15

Gly Arg Phe Ile Arg Leu Leu Met Leu Asp Ala Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:36: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36:

Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 10 15

Arg Leu Ile Lys Vai Leu Met Leu Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:37: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37:

Leu His Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ala Tyr Trp Gin Thr Vai Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 72 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38:

Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Thr Vai Vai 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:39: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39:

Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Vai Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:40: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40:

Gly Asn Tyr Asp Phe Asp Gly Trp Thr Leu Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:41: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41:

Ser Phe Tyr Gly Gly Ser Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp 15 10 15

Thr Leu Vai (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42:

Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Thr Vai Vai 1 5 10 73 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:43: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43:

Ser Glu Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Thr Leu Vai 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:44: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:44:

Tyr Ser Ser Asp Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Thr Leu Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45:

Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Thr Leu Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 409 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..408 74 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:46: ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Lys Cys Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTG CAA CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG 96 Vai Hls Ser Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys 20 25 30 CCT GGA GCT TCA ATG AAG ATA TCC TGC GAG GCT TCT GGT TAC TCA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 ACT GGC TAT ACC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA ATG AAC CTT 192 Thr Gly Tyr Thr Met His Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Met Asn Leu 50 55 60 GAG TGG ATT GGA CTT ATT AAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GTC TAC AAC 240 Glu Trp ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Vai Tyr Asn €5 70 75 80 CAG AAG TTC CAG GAC AAG GCC ACA TTA ACT GTA GAC AAG TCA TCC GGC 288 Gin Lys Phe Gin Asp Lya Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Gly 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTC CTC AGT CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 100 105 110 TAT TTC TGT GCA AGA CGT TGG AGA TAT ACT ATG GAC TAT TGG GGT CAA 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Trp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125 GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA G 409

Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 136 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 75 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47:

Met Lys Cys Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Vai His Ser Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser MeC Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45

Thr Gly Tyr Thr Met His Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Met Asn Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Vai Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Gin Asp Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Gly B5 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Trp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125

Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser S-sr 130 135 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 382 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..381 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:48: ATG GAG TTC CAG ACC CAG GTC TTT GTA TTC GTG TTT CTC TGG TTG TCT 48

Met Glu Phe Gin Thr Gin Vai Phe Vai Phe Vai Phe Leu Trp Leu Ser 15 10 15 GGT GTT GAC GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC AAA TTC ATG TCC 96

Gly Vai Asp Gly Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 76 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ ACA TCA GAG GGA GAC TGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT 144 Thr Ser Glu Gly Asp Trp Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 GTG AGT ATT GGT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT 192 Vai Ser Ile Gly Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 50 55 60 AAA CTG CTG ATT TAC TCG GCA TCC TCC CGG TAC ACT GGA GTC CCT GAT 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp 65 70 75 80 CGC TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACG GAT TTC ACT TTC ACC ATC AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAT 336 Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr 100 105 110 ACT TCT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAC TTG GAA ATA AAA 381 Thr Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 115 120 125

C 382 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 127 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49:

Met Glu Phe Gin Thr Gin Vai Phe Vai Phe Vai Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Vai Asp Gly Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Glu Gly Asp Trp Vai Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 Vai Ser Ile Gly Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp 65 75 80 70 77 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95

Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr 100 105 110

Thr Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 115 120 12S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:50: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 58 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:50: GATATCCACC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGT 58 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:51: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51: GCTAGCTGAG GAGACGGTGA CCAGGGTTCC TTGACCCCAA TAGTCCATAG TATATCT 57 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:52: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52: TAAGTCCAAT CCACTCAAGG TTCATTCCAG GGCTCTGCTT CACCCAGTGC ATGGTATAGC 60 CAGTGAATGA GTAACCAGAA GCCTTGCAGG AGACCTTCAC 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53: GATTGGACTT ATTAATCCTT ACAATGGTGG TACTGTCTAC AACCAGAAGT TCCAGGACAA 60 100

GGCCACATTA ACTGTAGACA AGTCAACGAG CACAGCCTAC 78 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:54: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54: CAATAGTCCA TAGTATATCT CCAACGTCTT GCACAGAAAT AGACTGCCGT GTCCTCAGAT CTCAGACTGC TGAGCTCCAT GTAGGCTGTG CTCGTTGACT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:55: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55: TCCTGTCAGG AACTGCAGGT GTCCACTCTG AGGTCCAGCT GGTGCAGTCT GGAGCTGAGG TGAAGAAGCC TGGAGCTTCA GTGAAGGTCT CCTGCAAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:56: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56: GATATCCACC ATGGAGTTCC AGACCCAGGT CTTTGTATTC GTGTTTCTCT GG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:57: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57: GTCGACTTAC GTTTTATTTC CACCTTTGTC CCCGAGCCGA ACGTGAATGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:58: TTGTATTCGT GTTTCTCTGG ttgtctggtg ttgacggaga cattgtgatg acccagtctc CAGACTCCCT GGCTGTGTCA CTGGGAGAGA GGGCCACCAT 60 100 60 100 52 50 60 100 79 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59: TCAGCAGTTT AGGAGATTGT CCTGGTTTCT GTTGATACCA GGCTACACCA ATACTCACAT 60 CCTGACTGGC CTTGCAGGTG ATGGTGGCCC TCTCTCCCAG 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:60: ACAATCTCCT AAACTGCTGA TTTACTCGGC ATCCTCCCGG TACACTGGAG TCCCTGATCG 60 100

CTTCAGTGGC AGTGGATCTG GGACGGATTT CACTCTCACC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 100 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61: CCCGAGCCGA ACGTGAATGG AGAAGTATAA TGTTGCTGAC AGTAATAAAC TGCCACGTCT 60 TCAGCCTGCA GACTGCTGAT GGTGAGAGTG AAATCCGTCC 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 424 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 80 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:62: QATATCCACC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 60 CCACTCTGAG GTCCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GAGCTTCAGT 120 GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACTC ATTCACTGGC TATACCATGC ACTGGGTGAA 180 GCAGAGCCCT GGAATGAACC TTGAGTGGAT TGGACTTATT AATCCTTACA ATGGTGGTAC 240 TGTCTACAAC CAGAAGTTCC AGGACAAGGC CACATTAACT GTAGACAAGT CAACGAGCAC 300 AGCCTACATG GAGCTCAGCA GTCTGAGATC TGAGGACACG GCAGTCTATT TCTGTGCAAG 360 ACGTTGGAGA TATACTATGG ACTATTGGGG TCAAGGAACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGC 420 TAGC 424 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:63: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 136 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63:

Met Lys Cys Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Vai His Ser Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45

Thr Gly Tyr Thr Met His Trp Vai Lys Gin Ser Pro Gly Met Asn Leu 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Vai Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Gin Asp Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Trp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 402 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 60 81 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:64:

GATATCCACC ATGGAGTTCC AGACCCAGGT CTTTGTATTC GTGTTTCTCT GGTTGTCTGG 120 180 240 300 360 402

TGTTGACGGA GACATTGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT CACTGGGAGA

GAGGGCCACC ATCACCTGCA AGGCCAGTCA GGATGTGAGT ATTGGTGTAG CCTGGTATCA

ACAGAAACCA GGACAATCTC CTAAACTGCT GATTTACTCG GCATCCTCCC GGTACACTGG

AGTCCCTGAT CGCTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACGGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG

TCTGCAGGCT GAAGACGTGG CAGTTTATTA CTGTCAGCAA CATTATACTT CTCCATTCAC GTTCGGCTCG GGGACAAAGG TGGAAATAAA ACGTAAGTCG AC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 127 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65:

Met Glu Phe Gin Thr Gin Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Vai Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Vai Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 Vai Ser Ile Gly val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr 100 105 110 Thr Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:66 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:66:

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Lys Vai Asp 1 5 10 82 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:67: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67:

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 S 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:68: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:68: ATGAAATGCA GCTGGGTCAT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT CCACTCT 57 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:69:

Met Lys Cys Ser Trp Vai Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Vai His Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:70: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO :70 : ATGGAGTTCC AGACCCAGGT CTTTGTATTC GTGTTTCTCT GGTTGTCTGG TGTTGACGGA 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 83 ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:71:

Met Glu Phe Gin Thr Gin Vai Phe Vai Phe Vai Phe Leu Trp Leu Ser 15 10 15

Gly Vai Asp Gly 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:72 : (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72: GTCGACTTAC GTTTTATTTC CAAGTTTGTC CCCGAGCC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:73: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73: GCTAGCTGAG GAGACGGTGA CTGAGGTTC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:74: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74: GATATCCACC ATGGAGTTCC AGACCCAGGT CTTTGTATT 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75: GTTAACCACC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT TCTCTT 36

Lisboa

Claims (18)

1. ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo Mc3 recombinante modificado que se liga especificamente ao antigénio BA46 do glóbulo gordo do leite humano (HMFG), compreendendo o referido anticorpo: i) uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de Mc3 de murideo mostrada na Figura 12 ou uma sua variante em que pelo menos um mas menos de 30 resíduos de aminoácido foram humanizados e em que os resíduos de aminoácido dentro das CDR, os resíduos de aminoácido que contactam com as CDR e os resíduos de aminoácido que contactam com uma cadeia oposta do anticorpo são resíduos de aminoácido de murideo; e ii) uma região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos de Mc3 de murideo mostrada na Figura 13 ou uma sua variante em que pelo menos um mas menos de 30 resíduos de aminoácido foram humanizados e em que os resíduos de aminoácido dentro das CDR, os resíduos de aminoácido que contactam com as CDR e os resíduos de aminoácido que contactam com uma cadeia oposta do anticorpo são resíduos de aminoácido de murideo; e em que pelo menos um resíduo de aminoácido oculto dentro da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve foi humanizado.
2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um dos referidos aminoácidos humanizados é da posição correspondente na sequência de consenso humana apropriada da Figura 12 ou 13, para uma região variável da cadeia pesada ou leve, respectivamente.
3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que tanto a região variável da cadeia pesada como a região variável da cadeia leve são variantes das sequências de aminoácidos de Mc3 de murideo tal como definido na reivindicação 1.
4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo compreende ainda uma região constante de anticorpo ou outro agente efector. ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 2/4
5. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que a região constante é uma região constante de um anticorpo humano.
6. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que o agente efector é uma citoquina, uma enzima, uma toxina, um radioisótopo ou um marcador fluorescente.
7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que pelo menos cinco dos resíduos de aminoácido na região variável da cadeia pesada ou na região variável da cadeia leve foram substituídos pelos aminoácidos correspondentes da sequência de consenso humana apropriada da Figura 12 ou 13, para uma região variável da cadeia pesada ou leve, respectivamente.
8. 8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que na região variável da cadeia pesada pelo menos metade dos resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 12 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 12.
9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que na região variável da cadeia leve pelo menos metade dos resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 13 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 13.
10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, em que na região variável da cadeia pesada pelo menos 90% dos resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 12 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 12; e na região variável da cadeia leve pelo menos 90% dos resíduos listados como humanizados ou humanizados (BR) na Figura 13 foram substituídos pelos resíduos correspondentes da sequência de consenso humana da Figura 13.
11. 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10 em que todos os resíduos listados como humanizados ou ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 3/4 humanizados (BR) foram substituídos pelos resíduos correspondentes das sequências de consenso humanas da Figura 12 ou 13, para as cadeias pesada e leve, respectivamente.
12. 12. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores e um transportador farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Ácido nucleico codificando uma região variável da cadeia pesada ou leve variante tal como definido na reivindicação 1, em que pelo menos um resíduo de aminoácido oculto foi humanizado.
14. 14. Sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13 compreendendo a região de codificação da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:62 ou 64.
15. 15. Método in vitro de detecção da presença de um antigénio de HMFG ou de um seu fragmento de ligação, numa amostra biológica, compreendendo: proporcionar uma amostra biológica suspeita de compreender o antigénio ou um seu fragmento adicionar à amostra um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 sob condições eficazes para formar um complexo anticorpo-antigénio; e detectar a presença de qualquer complexo anticorpo-antigénio formado.
16. 16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para utilizar num método de diagnóstico da presença de um antigénio de HMFG ou um seu fragmento de ligação, num indivíduo, compreendendo: administrar ao indivíduo o referido anticorpo sob condições eficazes para o entregar numa área do corpo do indivíduo suspeito de conter um antigénio de HMFG ou um seu fragmento de ligação, para formar um complexo anticorpo-antigénio; e detectar a presença do referido complexo antigénio-antigénio.
17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para utilizar num método de entrega de ΕΡ Ο 784 684/ΡΤ 4/4 um agente a um local alvo que contenha um antigénio de HMFG compreendendo: ligar o referido agente ao referido anticorpo numa posição diferente da do local de ligação ao antigénio para criar um complexo agente-anticorpo; e introduzir o complexo agente-anticorpo no ambiente do referido local alvo sob condições adequadas para ligação de um anticorpo ao antigénio seu cognato.
18. 18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, em que o local alvo está dentro do corpo de um indivíduo humano e a introdução de um complexo agente-anticorpo compreende a administração do complexo ao referido indivíduo. Lisboa,