PT77910B - Synthetic heat-stable enterotoxin polypeptide of escherichia coli and multimers thereof - Google Patents

Description

Descrição Detalhada do Invento

I - ST sintática

0 presente invento abrange os polipéptidos produ. zidos sinteticamente, com a sequência de resíduos de amino ácidos de pelo menos catorze resíduos de amino ácidos , no terminal carboxilo, da enterotoxina termoestável (ST) produzida pela Escherichia coli (E, coli). Os polipéptidos sintáticos deste invento, sob a forma de monómeros ou multímeros, são úteis como imunogánEos ou partes de vacina que podem ser usados para protecção contra infecçães diarreicas produzidas pela E. coli que produz tais toxinas bem como contra infecções produzidas por outras bactérias como a Klsbsiella pneumoniae que produz toxinas semelhantes. Os polipéptidos ST sintéticos, monómeros e multimeros, e os anticorpos que se lhes opõem são também úteis em diagnósti. cos para avaliar a presença de organismos produtores de ST, como a E, coli.

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Quando usados comt/vacinas para imunização, os polipêptidos sintéticos ST podem ser usados sozinhos, como ê o caso do multímero polimêrico ST (P-ST) ou usados ligados a um suporte como um conjugado que ê o caso de monómeros ST (Fi-ST) e multimeros ST. A ST sintética imunogênea estâ pre sente numa quantidade efectiva nessa vacina e está dispersa ou dissolvida num diluente fisiologicamente tolerável.

Os suportes conjugados, particularmente úteis, incluem a enterotoxina termo-lâbil da E. coli (LT) bem como a menor subunidade B daquela toxina (LT B). São também úteis os suportes como a imunoglobulina G porcina (PIG), hemociani na "keyhole limpet" (KLH), tetanus toxoide, poli-L-(Lys:Glu) aglutinina do amendoim, ovalbumina, aglutinina da soja, albumina do soro bovino (BSA), albumina do soro humano e outros semelhantes.

Os diluentes fisiologicamente toleráveis ou aceitáveis incluem água, soro fisiológico, soro fisiológico tam penado com fosfato (PBS) e outros semelhantes, e tipicamente incluem ainda um adjuvante. 0 adjuvante completo de Freund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFA) e o alúmen são adjuvantes típicos usados, bem conhecidos na arte e obtêm-se no comércio em fontes várias.

A ST imunogênea contida numa vacina está presente numa "quantidade efectiva", quantidade esta que depende de um certa número de factores como bem se sabe na arte da imunologia. Nesses factores estão incluídos o peso do co_r po e espécie de animal a ser imunizado, □ suporte quando este é usado e o agente utilizado para associaar a ST ao su. porte, o adjuvante quando usado, a duração da protecção desejada e o protocolo de imunização utilizado.

Por exemplo, em estudos de inoculação, ratos receberam de cerca de 1500 atê cerca de 2500 unidades antígenas

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(definidas na Secção III B, a seguir) depois de imunizados com um ST conjugado, num protocolo em que a uma injecção intraparentêrica se seguiram duas doses per os de reforço. Noutro estudo de imunização, coelhos receberam de cerca de 25D0 até cerca de 3000 unidades antigenas de um conjugado contehdo ST e ficaram protegidos.

0 peso de ST sintético nestas vacinas depende das antigenicidades da preparação de ST utilizada e do conjugado contenda ST. Assim, sabBndo que ratos ficaram protegidos quando imunizados com um total de cerca de 1500 atê cerca de 2500 unidades antigenas de vacina contendo ST, administraram-se cerca de 1500 atê cerca de 2500 microgramas de um conjugado M-ST--LT B por rato, enquanto que se administraram apenas de cerca de 100 atê cerca de 300 micrjo gramas do conjugado P-ST--LT B por rato, para atingir resul_ tado semelhante. Utilizou-se um total de cerca de 600 microgramas de P-ST não associado (não conjugado) em coelhos para obter um titulo de antisoro suficiente para indicar protecção contra o perigo de ataque.

Ve-se assim que a quantidade de ST necessária para se obter uma "quantidade efectiva" pode variar amplaménte. 0 perito na arte pode no entanto obter a quantidade efectiva utilizando os processos de rotina laboratoriais da discussão e citações seguintes.

A ST sintética do presente invento mostra antigenicidade, quer como monómero sozinho quer ligada a um supo_r te proteico como conjugado, quer como multlmero sozinho quer ligado a um suporte como conjugado, qua ê pelo menos cerca de 10% da exibida pela ST nativa, biológica, obtida da E. coli que injecta seres humanos e outros animais. Sabe-se que a ST biologica, monómero que ocorre naturalmente, contêm seis resíduos Cys que formam trÊs ligações intramoleculares, intrapolipéptido dissulfureto de resíduos de eis.

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-26tina. A presença de ligaçães dissulfureto da cistina tem-se mostrado necessária (Chan et al., supra) para a acção da ST que ocorre naturalmente.

Dois dos seis resíduos Cys da ST podem combinar-se, teoricamente, de 15 maneiras diferentes para formar uma ligação dissulfureto de um resíduo de cistina. As mesmas seis combinaçães de pares de resíduos Cys são possíveis para a formação de uma segunda ligação dissulfureto e portanto apenas resta uma combinação para a terceira ligação dissulfureto. Assim há um total teoricamente possível de noventa (l5x6xl) isfimeros de estrutura secundária de cada sequência de resíduos de amino ácidos primários de ST que contêm seis resíduos Cys e dois ou três ligações dissulfureto.

Contudo, devido à dificuldade prática de formar uma ligação cistina dissulfureto entre pares de resíduos Cys contíguos dos quais haja dois pares na molécula de ST e suas possíveis redundantes estruturas, haverá consideravelmente menos do que noventa isfimeros de estrutura secundária contendo duas ou três ligações dissulfureto. Os pares específicos de resíduos Cys que formam as ligações dis sulfureto presentes na ΞΤ que ocorre naturalmente, não são conhecidos.

Foi agora descoberto que uma ST sintática, imuno logicamente activa, pode ser preparada tendo uma primeira sequência de resíduos de amino ácidos que ê substancialmejn te a mesma da ST biológica que ocorre naturalmente, mas cu. ja segunda estrutura, determinada pela formação da ligação dissulfureto, á diferente da de ST que ocorre naturalmente. Encontrou-se actividade antigênica nas moléculas da ST sintática monómera contendo apenas uma ligação intrapolipátido cistina dissulfureto entre os pares de resíduos Cys presejn tes. Obtêm-se uma antigenicidade melhorada na ST monómera

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sintética pela formação de duas ligações dissulfureto entre dois pares de intrapolipéptidos de resíduos Cys, enquanto quo se obtém actividade antigénica máxima pela formação de três ligações intrapolipéptido dissulfureto entre trãs pares de resíduos Cys. Para formas multímeras de ST sintêti ca estS presente, como adiante se verá, pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipéptido cistina dissulfureto ou uma ligação intramolecular, interpolipéptido cistina dissulfureto.

A ST sintética aqui utilizada é descrita como estando nas formas monémeras ou multímeras. A ST sintética monémera contém pelo menos os catorze resíduas de amino áci. dos (14-mero) abaixo indicados na Fórmula I, incluindo os vários grupos-R descritos. A ST sintética multimera contém uma pluralidade de pelo menos 14-mero unidades de repetição de ST sintética. Num certo arranjo, as unidades de repetição de ST sintética do multímero estão ligadas entre si de cabeça-a-cauda, isto ê, a amina do terminal amino de uma unidade de repetição está ligada por uma ligação amida ao carboxilo do terminal carboxilo de uma segunda unidade de repetição da ST sintética para formar um multimero contendo pelo menos duas unidades de repetição de ST.

Os multimeros ST contendo unidades de repetição ST ligadas entre si cabeça-a-cauda serão por vezes aqui referidas como dímeros, trímeros, tetrãmeros e os multimeros semelhantes de ST indicarão o número de unidades de repet_i ção de ST contidas no multímero. Um multímero dimero de ST será aqui abreviadamente designado pela férmula ST/ST, um multimero trímero de ST pela férmula abreviada ΞΤ/ΞΤ/ST e semelhantes, com cada "ST" representando pelo menos o 14-mero polipêptido cuja sequência se mostra na Fórmula I.

Outro arranjo deste invento é um multímero ST aqui referido como "ST sintético polímero", como "polímero

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ST sintático" ou como "P-ST". Neste arranja as unidades de repetição individuais do polipáptido ST estão ligadas entre si por ligaçães interpolipêptido cistina dissulfureto forma das entre os resíduos Cys das unidades de repetição de ST. Cada uma das unidades de repetição de ST do polímero sintê tico ST contám também pelo menos 14 resíduos de amino ácidos indicados na Fórmula I.

As formas multlmeras de ST deste invento podem também ser descritas em termos frequentemente usados na qui mica dos polímeros. Usando esta terminologia, o multimero cabeça-a-cauda ST, no qual as unidades de repetição, com uma sequência de resíduos de amino ácidos da ST, estão ligados entre si por uma ligação amida entre o grupo carboxilo do carboxi-terminal de uma unidade de repetição e o grupo amina do amino-terminal de uma outra unidade de repetição, pode tambám ser descrito como um oligopolimero (oligómero) de cadeia linear ST, ou como um bloco oligómero cujos blocos de repetição têm a sequência de resíduos de amino ácidos de um polipáptido ST. 0 polímero ST, anteriormente des. crito, cujas unidades de repetição, com uma sequência de re slduos de amino ácidos de ST, estão ligadas entre si por li gaçães interpolipêptido cistina dissulfureto, pode ser descrito, crê-se, como um polímero interligado ou recticulado cuja pluralidade de unidades de repetição têm a sequência de resíduos de amino ácidos de um polipáptido ST e cujas in terligaçães são fornecidas pelas ligaçães interpolipêptido cistina dissulfureto.

Ainda que retendo a acima mencionada terminologia, os referidos multimeros, contendo unidades de repetição tendo substancialmente só uma sequência de resíduos de amino ácidos de ST, podem ser designados por homo-oligopolimeros ST de cadeia linear ou por homopolímeros interliga dos (rocticulados) respectivamente. Os multimeros podem tambêp conter unidades de repetição com diferentes sequên-

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cias ou comprimentos de resíduos de amino ácidos, podendo neste casa os referidos multimeros serem designados por co-oligopolímeros ST de cadeia linear ou copolimeros interligados (recticulados).

Note-se que as acima mencionadas formas multímeras de ST sintética representam apenas duas dos muitos mui. timeros ST possíveis. Por exemplo quando o multímero refe rido como multimero cabeça-a-cauda ou como homo-oligopolimero de cadeia linear com duas unidades de repetição, é preparado por oxidação ds um primeiro polipêptido de 36 re síduos com uma sequência de resíduos de amino ácidos corres, pondente aos de dois polipéptidos ST, forma-se também alguma ST polímera com ligações interpolipêptido cistina dissul. fureto (um homopolímero reticulado). As unidades de repeti ção desse homopolímero recticulado contêm duas das 18-mero sequências de resíduos de aminoácidos de ST na unidade de repetição. Um copolímero pode ser preparado pela oxidação dos primeiros polipéptidos da ST 18-mera ao mesmo tempo que os primeiros polipéptidos da ST multimera 36-mera para obter um material recticulado ou interligado, cujas unidades de repetição têm uma sequência de resíduos de amino ácidos do polipêptido ST.

A palavra "sintética" aqui empregue significa que a molécula do polipêptido ST ou a unidade de repetição do polipêptido foi construída por meios químicos (sinteti. zada quimicamente) mais do que por meios biológicos (sintetizada biologicamente) como a da E. colique produz ST por ocorrência natural ou por técnicas de engenharia genética. Os polipéptidos sintéticos estão portanto liures de proteínas que ocorrem naturalmente ou de seus fragmentos.

A bom conhecida síntese química em fase sólida, na qual re síduos de amino ácidos bloqueados se juntam de modo seriado para se obter um polipêptido, 6 o método preferido de síntese e encontra-se descrito □ seguir.

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-30Um polipóptido sintético de acordo com este inve_n to inclui a sequência de amino ácidos como monómero, sozinho ou como unidade de repetição de um multímero, tomada da esquerda para a direita e na direcção do terminal-amino para o terminal-carhoxilo, representada pela sequência de Fórmula I

Fórmula. I

R¹

a

CysCR^JCysÍR^GluLeuGysCR^CysCR^jTyi/Asn) 9 h I i J

R·⁵

c

ProAlaCys(R^'¹')Ala(Thr) GlyCysR^fl_sn(Ty_r)

onde os três resíduos de amino ácidos específicos entre parêntesis são, cada um, uma alternativa ao resíduo de amino ácido imediatamente precedente na sequência;

a, b, c, d, e e f, (a-f) e g, h, i, j, k el

(g-l) são números inteiros tendo cada um o valor zero ou

um, com a condição de que se o valor de qualquer dos a-f ,3

1 2

ou g-l for zero, o grupo correspondente R , R, ,

_n>, _p6 ,„1-6 , _nn „7 „8 „9 „10 „11 ^a„12 ou Rp, (R _f-) ou R , R_h, R^, R^ , R_k ou R_x ,

R"

r\ R⁵ d’ e

7 1 7

(^Rg_l estará ausente e quando um grupo R^f ^est^ ausente o átomo de enxôfre do resíduo Cys tendo ausente um grupo Rq_6- forma uma ligação cistina dissulfureto enquanto que se o valor de qualquer um dos a-f ou g-l for um, o corresΤ··6 7-12

pondente grupo ^Rg j?- ou g"*i '

estará presente;

,1-6

os grupos R - quando tomados individualmente a-r

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são partes iguais ou diferentes ligadas ao átomo de enxôfre do resíduo Cys e são escolhidos entre o grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo contendo de 1 atê cer ca de 4 átomos de carbono, um grupo alquil substituído contendo de 2 atê cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contendo de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e um gru po acilo substituído contendo de 2 atê cerca de 10 átomos de carbono;

7-12

Rg i são resíduos de amino ácidos, iguais ou diferentes, alternativos a cada resíduo Cys imediatamente pre cedente; e

pelo menos dois dos a-f e dois dos g-1 são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de que o polipêptido sintético contenha pelo menos uma ligação intra molecular cistina dissulfureto formada de pelo menos dois resíduos Cys presentes.

Quando em forma de monómera pela menos uma das

acima ligações dissulfureto á uma ligação intramolecular,

intrapolipêptido cistina dissulfureto, formada entre pela

menos dois resíduos Cys presentes no polipêptido antigêneo.

/

Quando o polipêptido antigêneo esta em forma de multímero que contenha uma pluralidade de unidades de repetição de p_o lipêptido, pelo menos uma das ligações dissulfureto acima mencionadas pode ser uma ligação intramolecular, intrapolijoé ptido cistina dissulfureto, formada entre pelo menos dois resíduos Cys presentes em cada unidade de repetição de p_o lipêptido, ou essa ligação dissulfureto pode ser uma liga ção intramolecular, interpolipéptido cistina dissulfureto, formada entre um de pelo menos dois resíduos Cys presentes numa primeira unidade de repetição e uma outra de pelo menos dois resíduos Cys presente numa segunda unidade de repetição. Vê-se portanto que urna ligação intramolecular cis tina dissulfureto está presente em ambas as formas, monóme62 226

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ra e multímera, de ST. Na ST monómera aquela ligação cistina dissulfureto é uma ligação intrapolipêptido enquanto que na ST multímera o dissulfureto pode ser uma ligação in terpolipêptido ou uma ligação intrapolipêptido.

Nas formas monómera e multímera da ST sintética, em relação ao acima referido polipéptido sintético antigênico ds Fórmula I, de preferência:

"e" ê zero quando "a" ê zero

"d" é zero quando "b" ê zero, e

"f" ê zero quando "c" ê zero; e

cada "g" e "k" é zero quando "a" for zero,

cada "h" e "j" é zero quando "b" é zero, e

cada "i" e "1" é zero quando "c" for zero.

A sequência mostrada na Fórmula I sem os três ami no ácidos específicos alternativos e grupos R alternativos e substituintes, corresponde à sequência de catorze resídjj os de amino ácidos do terminal carboxilo da ST Ib e é homó Ioga aos resíduos de amino ácidos numerados de 59 a 72 da ST Ia a partir do amino-terminal. Os catorze resíduos de amino ácidos compreendendo os amino ácidos 59 a 72 da ST Ia, diferem da sequência acima ilustrada na Fórmula I sem os seus amino ácidos alternativos e os grupos R na posição 65 onde um resíduo de asparagina (Asn) substitui um resíduo de tirosina (Tyr) na posição ll^ã a contar do terminal amino da ST Ib (resíduo na posição 8 a partir do carboxi-terminal) e na posição 72 (carboxi-terminal) onde um resíduo de tirosina substitui o resíduo indicado de asparagina.

Assim, o resíduo Tyr imediatamente à direita do quarto resíduo Cys a partir do amino-terminal (Tyr-65) pode ser substituído pelo resíduo Asn que está entre parênte sis na fórmula acima mencionada. Uma substituição semelhajn te de um resíduo Tyr por um resíduo Asn pode também ocorrer

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no carboxi-terminal e está indicada pelos parêntesis do re slduo Tyr final.

A sequência análoga de catorze resíduos amino ácidos da ST Ic é a mesma da ST Ib excepto para a posição 69 na ST Ic onde um residuo de treonina (Thr) substitui um resíduo de alanina (Ala) da ST Ib. Essa substituição também está ilustrada na fórmula acima mencionada pelo resíduo Thr entre parêntesis.

Prefere-se em especial que pelo menos um dos quatro resíduos de amino ácidas da terminal amino presentes na sequência de dezoito resíduos da molécula ST Ib, também esteja presente na sua sequência posicionai natural na ST sin tática. Prefere-se ainda mais qus todos esses quatro amino ácidos adicionais estejam presentes na ST sintética na mesma sequência posicionai natural que têm na ST Ib.

Os quatro amino ácidos adicionais preferidos do terminal amino da molécula da ST sintética correspondem aos amino ácidos numerados de 55 a 58 da ST Ia e são idênticos aos quatro amino ácidos na ST Ib. Três dos quatro amino ácidos da ST Ic diferem quer dos da ST Ia quer da ST Ib, nas posições 55 a 58 da ST Ia. Assim, usando o sistema de nomes alternativos entre parêntesis acima referido, o poli péptido 4-amino ácidos (4-mero) do terminal amino da ST sintética de fórmula I, num arranjo predilecto, tem uma ss quência, tomada da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, representada como abaixo se indica na Fórmula II:

Fórmula II

Asn(Ser)Thr(5er)Phe(Asn)Tyr

onde os amino ácidos entre parêntesis podem substituir o

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-34resíduo de amino ácido imediatamente precedente.

0 polipáptido monómero sintático contám pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipóptido dissulfureto, de preferência duas ligações intramoleculares, intra

polipáptido dissulfureto e, ainda melhor, três ligações intramoleculares, intrapolipêptido dissulfureto. Crê-se que as ligações dissulfureto formam-se entre pares de resíduos Cys de R^ e R , e R, e R , bem como entre os resíduos Cys de R^ e Rp, quando a-f têm o valor zero.

1 2

Contudo, os resíduos de R e R, bem como os de 3 4 a b

R e R , são pares contíguos, adjacentes. Por consequência, C O

os polipáptidos ST sintáticos contendo uma ligação dissulfureto podem ter antigenicidades e estruturas secundárias substancialmente semelhantes, sem atender a que essa ligação dissulfureto se forme entre os resíduos Cys de R^ e R^

2 5 3 θ

ou de R? e R"\ Atribuem-se resultados semelhantes às esD B

truturas secundárias resultantes da ligação dissulfureto entre os resíduos Cys de R^ e R^ mais do que e Rp e semelhantes .

0 primeiro polipáptido sintêtizado antes da formação oxidativa de uma ligação intramolecular, intrapolipéjD tido dissulfureto contám pelo menos dois resíduos Cys, de

modo que o valor de pelo menos dois dos g-1 são zero e os 7-12

correspondentes grupos R . estão ausentes. Devido à seg—x

melhança da estrutura secundária que se obtêm pela formação de uma ligação intramolecular, intrapolipêptido cistina dissulfureto, entre um de dois resíduos Cys contíguos e outro resíduo Cys, cria-se a condição adicional para os mo nómeros e multímeros preferidos da ST sintática de que pelo menos um par de resíduos não-contíguos Cys, entre os re síduos Cys que precedem os grupos > esteja presente.

Esse par á escolhido entre o grupo dos resíduos Cys que pre

cedem R⁷, R? e R?, R^⁰, R⁷, R® e R?¹ e R?, R^ e R*². Quang n i j g n k ij i

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to às posições dos resíduos de amino ácidos na ST Ib, os p_a res de resíduos Cys não contíguos no monómera sintático ST são escolhidos entre o grupo dos numerados 5 ou 6 e 9 ou 10, 5 ou 6 e 14, e 9 ou 10 e 17, a contar do amino-terminal da ST Ib 18-mero polipáptido.

As moléculas de ST sintática multímera que estão ligadas entre si cabeça-a-cauda contêm de preferência pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipéptido cistina dissulfureto, por unidade de repetição. As ligações intrapolipêptido cistina dissulfureto presentes em cada unidade de repetição destes multimeros estão de preferência entre os mesmos resíduos Cys como as presentes nas moléculas monóuieras. A presença de duas ligações intrapolipéptido entre os resíduos Cys de cada unidade de repetição á no entanto preferível, conquanto a situação mais desejável seja a presença de três ligações intrapolipéptido cistina dissulfureto, por unidade de repetição.

Para as moléculas polímeras sintáticas de ST onde as unidades de repetição do polipáptido ST estão ligadas e_n tre si por ligações intramoleculares, interpolipéptido cis/

tina dissulfureto, crê-se não ser necessário que os dois re síduos Cys presentes sejam não contíguas. £ no entanto pre ferido que aqueles resíduos Cys sejam não contíguos como acima foi discutido.

Alárn da sua sequência de resíduos de amino ácidos, uma molécula monómera sintética de ST contendo uma ligação intrapolipéptido cistina dissulfureto entre os seus seis re síduos Cys, é também convenientemente caracterizada pela sua actividade antigênica que é peio menos 10% da actividade antigênica da ST biológica contendo três ligações dissul fure to. As diferenças de mobilidade em cromatografia de camada fina e em electroforese, entre moléculas de ST monómera sijn têtica contendo três ligações intramoleculares, intrapolipji

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ptido dissulfureto, e os valores da literatura para a ST biológica, podem também ser úteis para caracterizar as mo lêculas ST sintéticas contendo uma ligação intramolecular, intrapolipéptido dissulfureto, quando tal ST sintética puder formar três intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfuretos.

Uma vez que podem também ocorrer pares semelhantes de resíduos Cys que não os particularmente preferidos em moléculas ST sintéticas monómeras contendo duas ligações intramoleculares, intrapolipéptido dissulfureto, tais moléculas ST são também convenientemente caracterizadas por terem uma actividade antigénica de pelo menos 10/ da da ST biológica contendo três ligações dissulfureto. A mobilidade da cromatografia de camada fina e da electroforese ê de novo útil para caracterizar moléculas ST sintéticas monóme ras contendo duas ligações intramoleculares, intrapolipéptido dissulfureto, quando o terceiro dissulfureto pode também ser formado.

A antigenicidade de uma ST sintética como percentagem da antigenicidade da ST biológica é aqui a seguir dis cutida em detalhe na Secção II. Genericamente, contudo, a percentagem de antigenicidade de uma ST sintética ê uma medida relativa da quantidade de anticorpos de ST anti-biológica que reconhecem uma ST sintética, comparada com a ST biológica reconhecida pelos mesmos anticorpos de ST anti-biológica. Os cálculos de antigenicidade são baseados sobre o peso de antígeno ST usado e são independentes do facto do antigênio avaliado ser monómero ou multímero.

Tem também sido encontrada antigenicidade adequada para as moléculas ST sintéticas onde os átomos de enxôfre dos resíduos Cys compreendem porções de ligações que não as da cistina dissulfureto. Devido a esse facto, os re síduos Cys da acima referida sequência de Fórmula I para a

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ST sintética mostram-se ligados a grupos R^ cuja identidade ê a seguir discutida.

Note-se contudo que por ser necessária pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipéptido cistina dissul fureto, para haver actividade antigênica na ST sintética mo nómera, e quando for desejada actividade biológica, podem não estar presentes todos os sois grupos R^ numa molécula ST sintética . Melhor será que só quatro desses grupos possam estar presentes em qualquer molécula. Assim, por exemplo, onde os resíduos Cys de R^ e R_e estão combinados para formar uma ligação intramolecular, intrapolipéptido cistina dissulfureto, os valores de

a" e "e" são zero (ver 4 d

;<5 r2, R³, R⁴

abaixo), os grupos R^- e R³- estão ausentes o __

as □ c

e Rp podem estar presentes na molécula ST sintética monúmera.

Para marcar a presença de uma, duas ou trÊs ligaçães intrsmoleculares de dissulfureto de resíduos de cistina formados entre os seis resíduos Cys, cada um dos grupos R 1-6 foi também referenciado com uma letra subscrita a-f. Cada letra subscrita representa um número inteiro com o valor zero ou um. Para arranjos mais preferidos, acrescente-se a condição de que "e" seja zero quando "a" fer zero,

"d" seja zero quando "b" for zero, e "f" seja zero quando "c" for zero, com a condição adicional de que pelo menos um "a", "b" ou "c" deva ser zero, ainda com a condição adicional de que esteja presente urna ligação dissulfureto entre os respectivos pares de resíduos Cys para os quais urn valor subscrito de zero e exige que outro valor subscrito seja também zero.

Cada um dos grupos R^_^- presente na ST sintética pode ser hidrogénio. Neste caso, o resíduo Cys ao qual o grupo R^ está ligado não está substituído pois que hidrogénio é urn grupo normal ligado ao átomo de enxôfre de um

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resíduo Cys. A presença de hidrogénio ligado ao átomo de enxôfre de uma cisteína ê simbolizada aqui pelas designações Cys ou Cys H.

1—6

Os grupos R podem também ser grupos alquilo

3— Γ

que contenham de 1 atê cerca de 4 átomos de carbono. São exemplos destes grupos ^{0 mB}til-, etil-, propil-, _i-propil-, rt-butil-, i-butil- e outros semelhantes.

1-6

Os grupos R_a~j?“ podem ainda ser grupos alquilo substituídos contendo de 2 atê cerca de 20 átomos de carbono, incluindo os substituintes, grupos como arilo, arilo substituído, hidroxilo, amino, carboxilo, carboxamido, halo, vinilo substituído, tio substituído e outros semelhantes.

São exemplos destes grupos alquilo substituídos o benzilo, alfa-tolilo, 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, 2-aminoetilo, carboximetilo (-CH^CO^H), carboxamidometilo (-Ch^CONl·^) £-clorobenzil, etileno-bis-acrililo, 2-tioetanocarboxilo (-sch₂ch₂co₂h) e outros semelhantes.

Incluído entre os grupos alquilo substituídos,

1—6

dos quais podern ser escolhidos os grupos p-, está um grupo de ligação útil para juntar a ST sintética a uma outra molécula como seja urn suporte antígeno como a subunid^ de B de uma toxina termolâbil (LT) da E. coli. São exemplos destes grupos de ligação os diacrilatos como o bis-acrilato de etileno que pode reagir uma dupla ligação com um átomo de enxôfre de um grupo Cys, por uma reacção de adição de Michael, enquanto deixa livre a segunda dupla ligação para ligar a um suporte; ácido tioacêtico, ácido tio propiónico, cisteína e N-2-hidroxietil-2-tiosuccinimida que podem formar ligações mistas dissulfureto com um átomo de enxôfre de um resíduo Cys e podem reagir com outra molécula, por exemplo um suporte, através dos seus grupos carboxilo, grupo amino da cisteína ou grupo hidroxietilo, respectivamente.

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Num aspecto prático menos preferido, urn grupo r! p- pode ser um grupo acilo contendo de 1 atê cerca de 8 átomos de carbono, ou urn grupo acilo substituído contendo de 2 atê cerca de 10 átomos de carbono. São exemplos de grupos acilo contendo de 1 a cerca de 8 átomos de carbono, o formilo, acetilo, propionilo, hexanoilo, benzoílo e outros semelhantes. São exemplos de grupos acilo substituí, dos contendo de 2 atê cerca de 10 átomos de carbono o 2-metaxiacetilo, 3-etoxipropionilo, 4-clorobenzoílo, 3-carboxipropionilo (um aducto de anidrido maleico) e outros semelhajg tes. Os grupos acilo e acilo substituídos são menos preferidos devido às suas ligações tioêster não serem particula_r mente estáveis em meio aquoso.

a-f

Quando todas as

1—6

Qs grupos R^x _f- podem estar presentes separadame_n a™· 1—6

te numa molécula ST sintética, ou misturas de grupos R podem estar presentes numa molécula ST.

letras

subscritas a-f de uma molécula ST sintética monómera -1-6

zero, os grupos R,

tiverem o valor zero, os grupos R^^-^- estarão ausentes e es. tarão presentes três ligações intramoleculares, intrapolipjê ptido cistina dissulfureto.

As letras subscritas a-f podem também todas ter valores de zero e os grupos R “- estarem ausentes numa mo lêcula ST sintética polimerizada (P-ST) onde estão presentes ligações intramoleculares, interpolipéptido cistina dis sulfureto, entre as unidades de repetição do polipêptido da ST sintética. Podem também estar presentes em P-ST, ligações intramoleculares, intrapolipêptido cistina dissulfureto, dentro das unidades de repetição da ST sintética. Em média as unidades de repetição deste polímero contêm pelo menos cerca de 2 destas ligações interpolipéptido cistina, por unidade de repetição. Por consequência prefere-se que pelo menos dois dos a-f e dois dos g-1 tenham valor zero p_a

ra estas unidades de repetição de polipêptido, e que pelo

1“6 7-12

menos dois grupos R _p- e dois grupos correspondentes R

^a-r g-1

62

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-40estejam ausentes devido à formação de pelo menos duas ligações interpolipêptido cistina dissulfureto.

A antigenicidade e a actividade biológica podem

também ser obtidas usando moléculas ST sintéticas contendo

pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipêptido

cistina dissulfureto, entre os pares de resíduos Cys como 1 5 2 4 3 6

os da Fórmula I ligados a R e R , R, e R ., ou R e R„ que ³ a e b d e r

correspondem às posições numeradas 5 e 10, 6 e 14 e 9 e 17 a partir do terminal arnino da molécula ST Ib, respectivamer» te, quando os resíduos Cys não incluídos na ligação dissulfureto forem substituídos por resíduos de amino ácidos alternativos, iguais ou diferentes. Os resíduos de amino áci dos preferidos alternativos aos resíduos Cys da Fórmula I, não fornecem carga iónica ao polipêptido sintético quando o polipêptido sintético se dissolve em solução aquosa de va lores de pH fisiológicos; isto ê, os resíduos de arnino ácidos alternativos preferidos estão livres de cargas iónicas quando parte do polipêptido está em solução aquosa.

Os resíduos de amino ácidos alternativos aos grupos Cys sem ligações dissulfureto estão ilustrados na Fórmu

7 8 9 10 11

la I pelos grupos entre parêntesis R , R?, R., R? , R?/e 22 9 η í j K

Rj_ cada um dos quais pode substituir o resíduo Cys precedente, e onde os índices g-1 são números inteiros com o valor zero ou um. Nos polipéptidos de ST sintética preferidos, se "a" for zero, "g" e ”k" são, cada um deles, zero; se "b" for zero, "h" e "j" são cada um deles, zero; e se ”c" for zero, "i” e "1" são, cada um deles, zero.

Os resíduos de amino ácidos alanina (Ala) e serina (Ser) são exemplos de aminoácidos alternativos preferidos que são úteis para substituir resíduos Cys. As activi. dades biológica e antígenica fornecidas pelas moléculas ST sintéticas, com resíduos Cys substituídos por resíduos Ser, estão ilustradas a seguir.

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A descrição acima, relativa aos grupos R -R_ e 7 12 ar

R -Rj. é igualmente aplicável aos polipéptidos da ST sintática contendo os catorze resíduos de amino ácidos indica dos na fórmula I e aos polipéptidos da ST sintática mais preferidos, contendo 18 resíduos de amino ácidos, cuja sequência, tomada da esquerda para a direita e na direcção do terminal-amino para o terminal carboxilo, está represeri tada pela Fórmula III, abaixo indicada:

FORMULA III

R¹ RJ?

I^a I

Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys(R^)cys(R^)Glu

LeuCys(R5)Cys(R¹⁰)Tyr(Asn)ProAlaCys(R?;¹)Ala(Thr)Gly ι 1 j K

Cys(r!2)Asn(Tyr)

onde os resíduos de amino ácidos entre parêntesis 16 7 12

e R -R~ e R -R, são como atrás definidos, a f 9 1

Tanto os polipáptidos sintéticos preferidos da fórmula I como os polipéptidos sintéticos, ainda mais prefje ridos, de Fórmula III podem também incluir um grupo adicional R^^ ligado ã amina do amino-terminal do polipêptido, o_n

m

de "m" ê zero, R estã ausente e a amina do amino-terminal m .

não está substituída. Se o valor de "m" for um, R^ pode sor um péptido contendo de 1 atê cerca do 58 resíduos de amino ácidos, um grupo de ligação, e a porção acilo de um ácido carboxilico contendo de 1 até cerca de 20 átomos de

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carbono, formando uma ligação amida com a amina do resíduo do terminal amino.

Quando inclui resíduos de ainino ácidos adicio

fn

nais ligados ao terminal amino do polipêptido sintético do polipêptido de 14 resíduos da Fórmula I, os resíduas de amino ácidos adicionais, num arranjo preferido, têm a sequência do amino-terminal para o carboxi-terminal, indicada atrás na Fórmula II. A adição da sequência de resíduos de amino ácidos de Fórmula II à sequência preferida de catorze resíduos de amino ácidos fornece a sequência dos mais preferidos polipêptidos de 18 resíduos de amino ácidos, da Fórmula III que por si só corresponde às sequências de resíduos de amino ácidos do carboxi-terminal da ΞΤ Ia e da ST Ic e da sequência inteira ST Ib escritas todas juntas como uma única sequência.

Num aspecto prático preferido do polipêptido dos

catorze resíduos, o valor de "m" é um e R^ g uma cadeia Π1

contendo a sequência de resíduos de quatro amino ácidos, de Fórmula II. Num aspecto prático ainda mais preferido, os resíduos de amino ácidos, alternativos, entre parêntesis, de Fórmula II estão ausentes e R_m ê uma cadeia de pêptidos contendo a sequência de resíduos de amino ácidos dos quatro resíduos do amino-terminal da ST Ib; isto é, AsnThrPheTyr, da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo.

A ligação de 58 ou 54 resíduos de amino ácidos a 14 ou 18 resíduos, polipêptidos sintéticos ΞΤ, respectivamente, pode fornecer uma sequência de polipêptidos sintétj. cos correspondente à sequência da ST Ia nativa ou da ST Ic. Contudo, uma vez que as sequências de resíduos de amino ácj. dos, de preferência catorze e ainda melhor dezoito, de Fórmulas I e III respectivamente, podem fornecer actividades antigénica e biológica substancialmente iguais ou melhores

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do que as da ST nativa, não são necessários nem desejados polipêptidos sintéticos contendo sequências de amino ácidos mais compridas do que cerca dos 18 resíduos de amino ácidos de Fórmula III de modo a estarem de acordo com toda a sequência da ST Ia e ST Ic. No entanto os resíduos de amino-ácidos adicionais podem ser vantajosamente ligados ao terminal amino dos polipáptidos de Fórmulas I e III.

Assim pode ser desejável incluir um resíduo adicional Cys ao polipêptido do terminal amino para usar como meio de Fixação do polipêptido sintético a uma outra molécula, por exemplo um suporte ou um grupo de ligação. Quando usado nestas condições ê conveniente empregar um grupo bloqueador do átomo do enxÔfre que não um grupo bloqueador de Fase sólida, convencional, para evitar que o amino-terminal Cys adicionado Forme uma ligação cistina dissulfureto com um resídua Cys interior da sequência. Uma maneira para que o Stomo de enxôfre de Cys possa ser bloqueado durante a sín tese s selectivamente desbloqueado, ê através do uso de uma isotioureia análoga a Cys que, na cisão, resulta na formação de um resíduo Cys.

/

Noutro arranjo preferido, uma pluralidade de polj. pêptidos ST sintética 14-mera ou 18-mera pode ser ligada e_n tre si, de cabeça-a-cauda, para Formar um arranjo de ST mui. tímera deste invento. Este multímero contém pelo menos dois dos polipáptidos ST antígenos e de preferência duas a três dessas unidades de repetição, ligadas entre si por uma ligação amida formada entre o grupo amino do terminal amino de um polipêptido e o grupo carboxilo do carboxi-terminal do segundo polipêptido. Um exemplo de ST multímera, de cabeça-a-cauda, contendo trinta e seis resíduos de amino ácidos e tendo a sequência de resíduos de amino ácidos de dois polipáptidos ST Ib como unidades de repetição, á descrita em detalhe aqui a seguir.

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-44-

Cada unidade adicional de repetição ST pode ter a sequência indicada na Fórmula I atrás citada. As molêcju las ds ST sintética multímera que contêm uma pluralidade de unidades de repetição de ST sintética, ligadas cabeça-a-cauda podem ser preparadas pelo método sintético de fase sólida a seguir descrito na Secção II. Devido às dificuldades envolvidas na síntese de grandes moléculas de polipê£ tidos, ê preferível que esses multímeros cabeça-a-cauda cojn tenham cerca de 2 até cerca de 3 unidades de repetição de ST.

Num outro arranjo preferido, o grupo R^ pode ser um polipêptido sintético cuja sequência de resíduos de amino ácidos corresponde a uma proteína ou polipêptido que não a ST, Por exemplo as sequências determinantes de resíduos de amino ácidos de uma toxina como a da subunidade E. coli LT B podem ser utilizadas para fornecer um antigênio ou imu nogéneo combinado, contra ambas as toxinas. Têm sido encori tradas sequências de resíduos de amino ácidos úteis, corres, pondendo a determinantes da subunidade LT B, nas posiçães 37 até 62 /“LT B-(37-62)_7 e nas posições 27-36 /“LT B-(27-36)_7 a partir do terminal amino da LT B da qual Dallas et al., Nature, 288:499-501 (1982) relatou a sequência completa de resíduos de amino ácidos. Essas sequências de resíduos de amino ácidos estão indicadas a seguir, da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo:

LT B-(36-62) MetValIluIluThrPheMetSerGly GluThrPheGlnValGluValProGlySerGlnHisIluAspSerGlnLys,

e

LT 8-(27-36) TyrThrGluSerMetAlaGlyLysArgGlu.

0 grupo carboxilo do resíduo do carboxi-terminal de qualquer dos polipôptidos indicados acima, pode ser ligado à amina do resíduo do amino terminal da ST por uma li gação amida. Esta ligação dá-nos outro exemplo de como unia

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ligação cabeça-a-cauda pode ser útil nalguns arranjos de ST multímera, cono atrás se descreveu. Os polipêptidos LT B-(27-3ó) e LT B-(37-62) podem também ser ligados entre si, de cabeça-a-cauda, de modo a fornecer um ^{cori a s}—

quência completa desde a posição 27 atê à 62 da subunidade LT B, ao terminal amino da ST.

E especialmente conveniente usar a técnica de fase sólida, cujas etapas foram anteriormente discutidas, para sintetizar um primeiro polipéptido ST não-oxidado tendo o referido polipéptido LT B ligado ao resíduo do terminal

amino da ST. Esse primeiro polipéptido ê depois oxidado pa, 13

ra fornecer 0 amino terminal, grupo R_m , da ST substituída. Tais moléculas ST serão referidas daqui em diante por LT B-(27-36)--ST ou por LT B-(37-62)—ST para assinalar a presença de arnibos os polipêptidos relacionados com a subunidade LT B como ligados a uma ST.

Cada um dos referidos polipêptidos LT B-(27-36)--ST e LT 8-(37-62)-ST foram, separadamente, ligados a igual pe, so de toxoide de tétano usando glutaraldeído de modo semelhante ao discutido na Secção UI A a seguir. Vacinas preparadas de 400 microgramas dos 2 conjugados purificados fo rarn injcctadas separadamente em coelhos em adjuvante comple, to de freund, seguidas (14 dias mais tarde) de doses de reforço com a mesma quantidade de imunogêneo em adjuvante incompleto de Freund, e, sete dias depois, de doses de reforço da mesma quantidade de imunogêneo em alúmen. Sete dias depois (dia 28) os coelhos foram sangrados e foram recolhidos os anticorpos à ST e à subunidade B. Qs títulos desses anticorpos contra a subunidade B nativa e ST,sintética deram valores de 10 e 160-320, respecticamente, para 0 imunogêneo LT B-(27-36)--ST, e valores de 160 e 1280, respectiva. mente, para 0 imunogêneo LT B-(37-62)--ST. Assim, os conjjJ gados de ambos os polipêptidos ligados são imunogênicos bem como antigénicos (Quadro 2).

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460 grupo R^ pode também ser grupo de ligação além do resíduo Cys adicionado. Entre esses grupos de ligação estão os produtos de reacção dos polipéptidos sintéticos e: (i) ácidos omega-amino-monocarboxilicos contendo de cerca de 3 até cerca de 6 átomos de carbono, tal como a beta-alanina e o ácido 6-arninohexanoico, (ii) um ácido d_i carboxilico ou urr. cloreto ácido ou um anidrido ácido contendo de cerca de 3 até cerca de 8 átomos de carbono como ácido maleico, ácido fumárico, anidrido succínico, anidrido ftálico e outros semelhantes, (iii) um ácido carboxilico contendo mercaptan bloqueado, incluindo 2 a cerca de 4 átomos de carbono na cadeia ácida, como uma isotioureia, um derivado dos ácidos tioglicólico ou tiopropiénico (iv) um di-aldeído contendo de cerca de 2 até cerca de 8 átomos de carbono, como o gluteraldeido ou £-ftaldeido e outros semelhantes.

Assim, os grupos ligantes contenda grupos livres amino, carboxilo, mercapto e aldeído podem ser usados para ligar um polipêptido sintético a uma outra molécula, por exemplo um suporte.

pode também ser a porção acilo de um ácido

monocsrboxllico contendo de 1 até cerca de 20 átomos de

carbono formando uma ligação amida com a amina do resíduo

do terminal amino do polipêptido sintético. São exemplos

de tais grupos ácidos monocarboxílicos os ácidos acético,

propiónico, hexanoico, láurico, mirístico, esteárico, ole_i 13

co e outros semelhantes. Um grupo R_m de ácido gordo de ca deia longa como o estearoilo é vantajosamente ligado a uma ST sintética para avaliações de hemo-aglutinação passiva, enquanto que os grupos R^ de cadeia curta, como o acetilo, ligados à ST conferem actividade antigénica ligeiramente mais fraca do que a do polipêptido de 18 resíduos seus deri vados,

Assim, os polipéptidos de ST sintética de Fórmulas

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13

I e III contendo o grupo R^ - podem ser representados pelas sequências de resíduos de amino ácidos indicadas nas Fórmulas I-A e III—A abaixo, tomadas da esquerda para a direita e na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal

Fórmula I-A

Ry-Cys(Rg)Cys(R®)GluLeuÇys(R?)Cys(Rj°)Tyr(Asn)

R³

c

12·

ProAlaCys(R^''')ftla(Thr)GlyCys(R^^Z)flsn(Tyr)

Fórmula III—A

Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys(R^)Cys(R^)Glu

11'

LeuCys(RpCys(R¹°)Tyr(Asn)ProAlaCys(R^¹)Ala(Thr)Gly

Cys(R|2)ft_sn(Tyr)

onde cada resíduo de amino ácido específico entre

parêntesis ó uma alternativa ao resíduo de amino ácido ime*712 13

diatamente precedente, e R R . - e R^x - são como atrás

a-r g-1 m

se indicaram.

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-48-

Um arranjo deste invento contendo o grupo R^ligado ao resíduo do terminal amino de uma ST sintética de 18 resíduos que também contenha duas ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina. dissulfureto, está representado, da esquerda para a direita e na direcção do termi nal amino para o carboxi-terminal, pela fórmula

R^-Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys(Rp CysGluLeuCysCysTyr(Asη)ProA1aCys(Rl·¹)A1a(Thr)

,_I i

I R⁵

GlyCysAsn(Tyr) e

onde as linhas entre resíduos Cys representam ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto, cada um dos seis resíduos de amino ácidos específicos

entre parêntesis é uma alternativa ao resíduo de amino ácido imediatamente precedente, e R^, R^, R? R^¹ e R¹³ _sg_{0 co}

^r a’ e g k m —

mo anteriormente se definiu.

A ST sintética de 18 resíduos (l8-mera) predilecta, com três ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto, ê representada pela sequência de res_í duos de amino ácidos indicada na fórmula IV, abaixo, tomada da esquerda para a direita, na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal:

Fórmula IV

Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys f i

CysGluLeuCysCysTyr(Asn)ProAlaCysAla(Thr)

GlyCysAsn(Tyr)

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fc

onde as linhas entre resíduos Cys representam ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto e cada um dos seis resíduos de amino ácidos específicos entre parêntesis ê uma alternativa para o resíduo de amino ácido imediatamente precedente.

0 referido polipêptido sintático de Fórmula IV, representado como contenda também o grupo R^"⁵- ligado ao resíduo do terminal/amino, é indicado a seguir, da esquerda para a direita e na direcçao do terminal amino para o carboxi-terminal:

R'''^Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCysCysGluLeuCysCys

Tyr(Asn)ProAla(Thr)CysAlaGlyCysAsn(Thr)

II - Preparação de ST sintética

0 polipáptido ST de 18 resíduos (ST Ib) sob forma não oxidada foi sintetizado pelo bem conhecido processo da fase sólida usando um Gintetizador de Péptidos Modelo Beckman 990B, da Beckman Instruments Co., Berkeley, CA. Ver Houghten et al_e, Int, 3. Pept. Prot, Res., 16:311-320 (1980) e Merrifield, 0, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) cujas revelações são aqui citadas para referência.

Resumidamente foi utilizado para cada síntese,

1,00 grama (0,2-0,6 miliequivalentes/grama) de resina de benzidrilamina sendo o resíduo de amino ácido protegido inicial o ácido alfa-0-benzil-N-5oc-aspártico. Para os resta_n tes resíduos de aminoácidos foram utilizados os habituais grupos protectores de cadeia lateral: 0-(^-bromobenzioxicarbonilo) para a tirosrna, 0-benzilo para a treonina, serina e ácido glutêmico e o S-metoxibenzilo para a cisteina. Os

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-50

amino ácidos protegidos foram recristalizados em solventes adequados obtendo-se, por cromatografia de camada fina, manchas únicas. As uniões eram conduzidas espsciaimente usando um excesso dez vezes molar de amino ácido e diciclo hexilcarbodiimida, ambos protegidos, em relação ao número de miliequiualentes do amino ácido inicial do terminal-N. Pode também ser usado um excesso duas vezes molar de ambos os reagentes. Para a asparagina juntou-se uma quantidade molar igual de N-hidroxi-benzotriazolo ao amino ácido prote gido e usou-se como solvente a dimetilformamida. Todas as reacções de união completaram-se em mais de 99/ pelo ensaio do ácido picrico de Gisin, Anal» Chem. Act., 58:248-249 (1972).

Tratou-se uma porção (l g) do polímero polipépti do protegido resultante com dois mililitros de anisolo e 20 ml de ácido fluoridrico anidro e foi condensada no vaso da reacção à temperatura da neve carbónica. A mistura resultante foi agitada a 42 durante 1 hora para cindir os gropos protectores e remover o polipêptido da resina. Depois de evaporar o ácido fluoridrico a uma temperatura de 42C por uma corrente de N^, extraiu-se o resíduo com êter dietílico anidro, três vezes, para eliminar o anisolo e secou-se no vácuo o resíduo.

0 material seco ao vácuo foi primeiro extraído com ácido acético 5/ aquoso (3 vezes 50 ml cada) seguido de extracçÕes usando ácido acético 50/ aquoso (4 vezes 50 ml). A primeira extracção removeu polipêptidos de baixo peso molecular e tirosina que foi usada nalgumas preparações para proteger os grupos Cys mercapto. A segunda extracção separou o polipêptido livre da resina. Após diluição com água até uma concentração de ácido acético de 10-20/, liofilizoju -se a solução resultante obtendo-se o primeiro polipêptido, monómero não oxidado.

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Um primeiro polipáptido monómero de 14-resíduos típico assim produzido 6 representado pela sequência de re síduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita e na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal, indicada a seguir na Fórmula V:

Fórmula V

Cys(R^)Cys(R^)GluLeuCys(R?)Cys(R^)

Tyr( Asn) ProAlaCys (R^)Ala(Thr) GlyCys(R^²) Asn(Tyr)

onde cada um ficos entre parêntesis no ácido imediatamente se indicou.

dos resíduos de amino ácidos especíé uma alternativa ao resíduo de ami7-12

precedente e os R - são como atrás

Um primeiro polipáptido monómero sintática, contendo 18 resíduos de amino ácidos, típica, assim produzido ó representado pela sequência de resíduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal indicada a seguir na Fórmula UI:

Fórmula VI

Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys(R²)Cys(R^)Glu

LeuCys(R^)Cys(R'';^)Tyr(Asn)ProAlaCys(R?'‘'')Ala(Tyr)

¹ J κ

GlyCys(R^²)Asn(Tyr)

onde cada um dos seis resíduos de amino ácidos

específicos entre parêntesis ê uma alternativa ao resíduo 7-1?

de amino ácido imediatamente precedente e os R^"/ - são de. finidos como anteriormente.

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-52-

Um primeiro polipáptido monómero cuja sequência de amino ácidos corresponde às sequências indicadas nas Fórmulas I ou III pode também ser preparado de modo a que nele pelo menos 2 dos a-f e g-1 sejam zero, de forma que pelo menos dois resíduos Cys (Cys H) estejam presentes como anteriormente se viu. Tais polipáptidos podem tambám incluir o grupo R^ anteriormente discutido.

0 primeiro polipáptido monómero pode ser utilizado na fase de oxidação, no estado de pureza obtido depois da referida liofilizaçao ou pode aumentar-se a sua pureza pela passagem através de colunas cromatográficas contendo resinas Sephadex G-10 ou G-50 (Pharmacia, Piscataujay, N.3.) e/ou DEAE-Sephacel (Pharmacia) seguindo o mátodo de Staples et al., supra. Em qualquer caso á importante que o primeiro polipáptido monómero assim preparado esteja protegido contra oxidação prematura. Por consequência as manipulações do primeiro polipáptido monómero a seguir â sua separa ção do suporte resinoso e a remoção dos grupos protectores, dos grupos funcionais contendo resíduos de amino ácidos, são realizados em condições não-oxidantes.

Após oxidação dos grupos Cys sulfidrilo para formar ligações intramoleculares cistina dissulfureto, descrita a seguir, deixa de haver grupos sulfidrilo livres. A pre sença ou ausência de grupos sulfidrilo livres, grupos Cys mercapto, foi determinada pelo mátodo de Ellman, Arc.h. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959).

0 produto em brutc, polipáptido monómero oxidado, foi purificado por filtração gel sobre Sephadex G-10 (Pharmacia) seguida de cromatografia de permuta de iões, sobre DEAE-Sephacel (Pharmacia). A análise de amino ácidos, ele£ troforese em gel e papel e outra informação cromatográfica, indicaram todas um produto homogáneo. 0 rendimento total foi de aproximadamente 25/ do teórico. As preparações de

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ST sintética obtidas sm 5 ocasiões diferentes foram examina das quanto à sua potência biológica e antigenicidade. Todas deram substanclalmente as mesmas respostas aqui descritas para a preparação referida.

Os multímeros de ST polímera cuja pluralidade de unidades de repetição de ST ligadas entre si por ligações intramoleculares, interpolipóptido cistina dissulfureto, fo ram preparados a partir dos produtos de polipêptido monómeros acima preparados, seguindo c processo de oxidação a seguir descrito.

Pelo mótodo acima referido da fase sólida preparou, -se um primeiro dímero dcí ST multímera (ST/ST) com ligações de cabeça-a-cauda. Então preparou-se um primeiro ST/ST multímero, onde cada urna das unidades de repetição tinha a sequência ST Ib 18-mera, por adição em sórie de 36 resíduos de amino ácidos adequadamente bloqueados, seguindo-se o processo antericr para o primeiro polipêptido ST 18-mero e repetin do depois a mesma sequência para os 18 resíduos seguintes atê que o primeiro polipêptido 36-mero ficasse pronto.

Processo de Oxidação para a ST Monómera

De acordo com o que foi dito preparou-se um primeiro polipêptido com a sequência de 18-resíduos da ST Ib, e ficou com a sequência de resíduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal, indicada na Fórmula VII, a seguir:

F ó r muia VII

AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTyrProAlaCys

AlaGlyCysAsn

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-54-

Este primeiro polipêptido (50 miligramas) foi adicionado sob agitação branda a uma solução aquoso 0,1 mo lar de carbonato de amónio (pH 7,8-8,3) para se obter uma concentração final de 1 mg do primeiro polipêptido desbloqueado por ml de solução. Continuou-se a agitar brandamejj te durante um período de 5 a 15 minutos à temperatura arnbi. ente e obteve-se uma solução límpida do primeiro polipépti do.

Continuou-se a agitar brandemente ã temperatura ambiente por um período total de 8 horas durante o qual se fez contactar oxigénio molecular (0^) do ar com a solução, como agente oxidante para oxidar os seis resíduos Cys e foj? mar três ligações intramoleculares, intrapolipêptido cist.ina dissulfureto. A perda de grupos sulfidrilo livres foi. acompanhada com o reagente de Ellman /~Ellnan, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959^.7 v erificando-se estar 15%, 40%, 60% e 98% completa, às 0,5, 1,5, 2,5 6 8,0 horas respectivamente.

0 polipêptido oxidado resultante foi recolhido por liofilização, Poderia ser usado em bruto mas foi purificado em coluna de cromatografia.

0 material em bruto passou primeiro por uma coluna (l,5x80 cm) de Sephadex G-50 (Pharmacia) equilibrada com acetato de amónio 0,1 molar. Foram recolhidas fracções de

3,5 ml/20 min. com materiais que se encontraram nas fracções

12-15 e 22-28. 0 conteúdo destas fracções foi recolhido por

liofilização e fcrneceu 10 e 36 mg respeetivamente. 0 mate rial das fracções 22-28 era ST sintética monómera, como era indicado por a sua eluição estar em posição idêntica à encontrada por cromatografia da ST biológica. À ST polímera sintética, cuja preparação se apresenta mais adiante, foi também obtida nesta separação.

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A discussão seguinte refere-se à ST monómera e a ela segue-se una discussão da preparação de moléculas ST sintética multímera sob o título de "Preparação de ST Multímera".

A ST sintética monómera parcialmente purificada podia de novo ser usada tal qual mas foi ainda mais purifi cada por cromatografia em DEAE-3io Gel A (Bio Rad, San Raphael, CA) coluna 1,0 x 25 cm. A eluição foi realizada em gradiente, com a principal quantidade de material eluindo entre 50 e 100 milimolar de cloreto de sódio. 0 material foi recolhido por liofilização.

0 material liofilizado foi redissolvido em Sgua e dessalgado numa coluna de Sephadex G-25 (Pharmacia). 0 material resultante foi recolhido por liofilização produzindo 28 mg de ST sintética pura, representando um rendimento de 56% em relação ao peso do primeiro polipóptido em bruto. A análise de amino Scidos da ST sintética assim pre parada deu os seguintes valores baseados num polipóptido de 18 resíduos (valores teóricos entre parêntesis):

Scido aspSrtico	1,93 (2,0)
treonina	1,98 (2,0)
ido glut&mico	0,97 (1,0)
prolina	1,05 (1,0)
glicina	1,00 (1,0)
alanina	2,00 (2,0)
leucina	1,05 (1,0)
tirosina	1,89 (2,0)
fenilalanina	0,96 (1,0)
cisteina (como
ácido cisteico)	5,80 (6,0)

A actividade biológica desta ST sintética foi d_e terminada pela avaliação, em ratinhas bébé, de Giannella,

íjí. 226

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-56Infect. Itnmunity, 14:95-99 (1976) e verificou-se ser substancialmente a mesma da ST biológica como se mostra na Figura 1. Na Figura 2 mostra-se uma identidade substancial das respostas secretórias em segmentos de ileum entre as moléculas sintéticas e as biológicas de ST.

A muito importante antigenicidade da ST sintética foi comparada com a da ST biológica, por reactividade a anti corpos à ST biológica, usando a técnica ELISA de Klipstein et al., Infect, Immunol., 37:550-557 (1982). Estes resultados estão indicados na Figura 3 que mostra que a antigenicidade da ST sintética desta preparação era cerca de 70% da da ST biológica. Contudo a Figura 4 indica que a seroneutralização dos efeitos secretórios por soros hiperimunes era quási idêntica.

Localização de Ligações Intramoleculares Dissulfureto na ST

monómera

As três ligações intramoleculares, intrapolipéptido dissulfureto, formam-se a diferentes velocidades. Esta descoberta permitiu identificar a localização dos pares de resíduos Cys que combinam para formar ligações dissulfureto.

Assim, outras preparações do referido primeiro polipéptido foram oxidadas em condições semelhantes e os grupos sulfidrilo livres foram alquilados com ácido iodoacêtico ou iodoacetamida em alturas diferentes durante a reacção de oxidação. Os polipéptidos resultantes, parcialmente oxi. dados e parcialmente alquilados, foram então analisados quanto à sequência usando um Sequencer Beckman Modelo 890 (Peckman Instruments Co.) para determinar quais os resíduos Cys que foram alquilados e em que altura durante a reacção de oxidação. A proporção de resíduos Cys alquilados em determinadas posições na ST parcialmente alquilada, parcialmeri te oxidada, comparada com a ST não oxidada e toda alquilada,

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reflecte a localização e a ordem de formação das ligações dissulfureto.

Foi usado, em relação às moles de resíduos Cys, um excesso dez vezes molar de agente alquilante. A mistura re_a gente de oxidação-alquilação foi agitada durante dez minutos a seguir à adição de agente alquilante, seguida da adição de ditiotreitol dez vezes em excesso em relação ao agente alqui; lante e de nova agitação durante uma hora para consumir o agente alquilante.

Verificou-se que as ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto, na ST sintética monómera formam-se entre o primeiro e o quinto, o segundo e o qua£ to, e o terceiro e o sexto, resíduos Cys a partir do terminal amino; os resíduos Cys correspondem aos resíduos da ST Ib numerados 5 e 10, 6 e 14, e 9 e 17, respectivamente, a partir do terminal amino. Aqueles resíduos Cys correspondem

também aos resíduos Cys ligados a R’'" e R^, R? e Rj, e R^ e ₆ /a a e ’ b d’ c

Rrespectivamente, cujas posições a partir do carboxi-terminal no polipêptido de 18 resíduos aqui preparado são análo gas às posições de carboxi-terminal no polipêptido de 14 resíduos indicado na Fórmula I.

A velocidade de formação tem a ordem

Cys de RÍ; e r\ seguidos dos resíduos Cys de R^ b d ³ 1 5 ^c

pois seguidos pelo resíduos Cys de R^ e R\ Se a partir do amino-terminal da ST Ib, a ordem de das ligações dissulfureto foi entre os resíduos

depois 9 e 17, seguidos de 5 e 10,

dos resíduos e Rp b denumerarmos formação Cys 6 e 14,

A primeira e a segunda estrutura da ST monómera assim preparada, foi, do amino-terminal boxi-terminal, portanto:

sintética para o car-

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-58AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCys

TyrProAlatysAlaGlyCysAsn

onde as linhas que ligam os resíduos Cys representam as ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto, formadas entre aqueles resíduos.

A velocidade de formação das ligações intramoleculares, intrapolipéptido cistina dissulfureto em função do pH, usando o referido primeiro polipêptido de ST humana e a oxidação com oxigénio molecular posto em contacto com uma solução, brandamente agitada, contendo 1 mg/ml do primeiro polipêptido, está indicada a seguir:

pH	Moles de -S-Sformadas/hora
5,0	0,30
6,0	0,45
7,0	0,90
8,0	1,50
9,0	1,20
10,0	0,75

A velocidade de agitação e a temperatura também afectam a velocidade de oxidação. Qualquer aumento numa ou em ambas, permite obter uma maior velocidade de oxidação e de formação de ligações dissulfureto.

Foi também realizado um estudo para avaliar o efeito do pH na oxidação do primeiro polipêptido. Assim utilizou-se de novo o primeiro polipêptido 18-mero já referido,

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que foi oxidado à temperatura ambiente, a uma concentração de 1,0 mg por ml, até que não fossem detectados grupos sulfidrilo livres com o reagente Ellman, como anteriormente se referiu. Os primeiros polipéptidos foram dissolvidos numa solução aquosa contendo amónia 0,1 molar. Após dissolução, fizeram-se baixar os valores do pH das soluções usando uma solução de ácido acético 50% aquoso. Depois de liofilizar e sem purificar determinaram-se as antigenicidades relativas à antigenicidade da ST biológica usando a técnica ELISA anteriormente discutida. Os resultados estão indicados abaixo:

-1 pH	Antigenicidade
	(/ de ST biológica)
8,5	75 (39)
8,0	60 (32)
7,8	300 (159)
7,7	250 (132)
7,6	150 (79)
7,4	23 (12)
7,2	46 (24)

Comparação das Propriedades Físicas da ST Biológica e da ST

Sintética Monómera

A cromatografia em camada fina usando placas plásticas revestidas a celulose (Eastman Kodak, Inc., Nutley, NO) e um solvente de butanol:ácido acéticozágua (200:30:75 partes em volume, respectivamente) permitiu obter um valor R^ de 0,307 para a referida ST sintética preparada com trôs ligações intrapolipéptido dissulfureto. Staples et al., supra, relatam um valor R^. de 0,8-0,9 usando o mesmo sistema de solventes e placas de vidro revestidas a celulose (Eastman).

A electroforese em papel a pH 2,1, 5QQ volts duran

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te 90 minutos à temperatura ambiente forneceu um Rp de 0,80 relativo à lisina para a referida ST sintética. Staples et al, supra, usando electroforese de camada fina sobre celulo se a pH 1,9 descreveu para a ST biológica uma mobilidade que era sensivelmente igual à do ácido glut&mico. A conversão da mobilidade do ácido glut&mico nas condições de Staples et al. para a da lisina nas condições usadas para a ST sintética dá um Rp relativo de 0,50 para a ST biológica.

Resultados preliminares de determinações d8 dispej? são ótica rotativa usando a referida ST sintética e a sua coj? respondente biológica, mostraram que as duas moléculas são di. ferentes.

Moléculas ST Sintéticas Monémeras Contendo Duas Ligações

Dissulfureto

Foram preparados polipêptidos sintéticos de 18-reslduos análogos às moléculas ST Ib humanas de modo substancialmente igual ao acima descrito, excepto por se terem subs tituído os pares de resíduo Cys no primeiro polipêptido e re

sultantes moléculas ST monómeros oxidadas, por grupos alter7-12

nativos R , - que não fornecem carga iónica ao polipêptido ST sintético quando esse polipêptido se dissolve em solução aquosa a valores fisiológicos do pH. As moléculas de ST sin têtica assim preparadas foram então avaliadas quanto às suas actividades antigênicas e biológicas. Qs grupos £ - usados nestas determinações foram o amino ácido resina (Ser).

0 primeira polipêptido a partir do qual foram preparadas estes análogos da ST Ib sintética tinha a sequência de amino-ácidos, tomada da esquerda para a direita na direç: ção do amino-terminal para o carboxi-terminal, indicada na Fórmula VIII, abaixo:

Fórmula VIII

AsnThrPheTyrCys(R⁷)Cys(R®)GluLeuCys(R^)Cys(R^]:^Q) zii 9 í o n i j

TyrProAlaCys(R£ )AlaGlyCys(R^ )Asn

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nativa ao

7-12

onde cada grupo R^ era um resíduo Ser de altejç resíduo Cys imediatamente precedente.

Para este grupo de ensaios imunológicos bem como para todos os outros ensaios semelhantes, as moléculas da ST Ib sintática hapténica e ST Ib biológica foram primeiramente associadas à imunoglobulina porcina G (PIG) como suporte em quantidades e condições substancialmente iguais, como se refere adiante na Secção IV. Apareceram então antisoros aos imunogénios assim produzidos. A capacidade daqueles dois antisoros de reconhecer cada uma das moléculas ST foi medida e comparada pela técnica ELISA, já referida, de Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982). 0 reco

nhecimento da ST sintética purificada e da ST biológica pelos seus próprios antisoros foi estabelecido a 100% e as quantidades de reconhecimento para cada uma das outras moléculas ST foi então calculada de acordo. 0 ensaio com ratinhos bébô foi usado para determinar a actividade biológica.

Assim, para estas determinações comparativas, fo7-12

ram utilizados pares de R , - nos quais o valor de quatro g—i

dos g-1 era zero, enquanto que o valor de dois dos g-1 era 7-12

um. Os pares de grupos de alternativa R^ - utilizados fo

ram aqueles cujos pares que precedem os resíduos Cys estão

indicados na Fórmula I para o polipêptido de 14 resíduos a

serem ligados aos grupos R^ e R^, R^ e R„, e R² e R^. Estes

grupos correspondem aos resíduos Cys numerados 5 e 10, 6 e

14, e 9 e 17, respectivamente, a partir do amino-terminal da 7-12

sequência de aminoácidos da ST Ib._ Os grupos R_n - para os

7 11 9 0"

quais g-1 eram um, eram portanto R e R. , R . e 10 g k í

θ Rj , respectivamente, da sequência de amino ácidos da Fórmula VIII. 0s resultados destas comparações estão indicados no Quadro 1 ao mesmo tempo que os padrões da ST Ib biológica, da acima preparada ST Ib sintética e da ST Ia porcina.

R*², e R®

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-62-

QUADRO 1

Actividades Relativas Antiqênicas e Biológicas

ST Avaliada	Avaliação
Anti- , Sin. STA (/)	Anti- 9 Biol.-STZ (/)	Ratinho-bêbé (/)
R?+Rí1 q k	45	62	66 (8,2 ng3)
Ser
r!+rí2	21	43	46 (12,0 ng3)
Ser
Rh+R -° h j	41	74	92 (6,0 ng3)
Ser
Ib biológica	35	100	100 (5,7 ng3)
Ib sintética	100	263	120 (5,3 ng3)
Ia porcina	3	45 O4	10 (55 ng3)

Notas:

1 - Percentagem de reconhecimento da ST ensaiada, pelo antisoro face à ST sintética.

2 - Percentagem de reconhecimento da ST ensaiada, pelo antisoro face ã ST biológica.

3 - Nanogramas necessários para dar uma relação visceras/cojr

po inteiro de 0,083.

4 - Este valor parece ser anormalmente elevado, afectado por

um factor de entre cerca de 1,5 até cerca de 2.

Os resultados do Quadro acima ilustram diversos aspectos do presente invento. Primeiro, uma substancial activjL dade imunológica, p. ex. a antigenicidade, pode ser obtida sem a presença de três ligaçães dissulfureto na molécula ST.

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Segunda, facto relacionado, não são necessários todos os resíduos Cys e alguns podem ser substituídos por outros resídjj os de amino ácidos. Terceiro, a actividade biológica que p.o de conduzir à diarreia num animal vacinada pode ser reduzida enquanto se mantém uma actividade antigénica substancial. Uma quarta caracteristica deste invento, ilustrada nos resultados acima mencionados, é que a molécula da ST Ib biológica e a mo lécula da ST Ib sintética contendo três ligações dissulfureto são entidades imunologicamente diferentes, sublinhando portaj} to as diferenças anteriormente notadas nas caracteristicas cromatográf icas, electroforêtica e de dispersão óptica rotja tória das duas moléculas. Assim, os anticorpos à ST biológica reconheceram a ST sintética 263% melhor do que reconheceram a ST biológica. De.modo semelhante, os anticorpos à ST sintética reconheceram a ST biológica só 35% do que reconheceram a ST sintética.

A diferença entre as moléculas das ST sintética e natural ê ainda reforçada pela ST Ia (porcina) que foi dificilmente reconhecida pelos anticorpos à ST sintética, mas foi reconhecida de cerca de 10 até cerca de 100 vezes melhor pelos anticorpos à ST biológica do que pela própria ST bioló gica, tomando em consideração o facto de que o valor 450% pjo de ser anormalmente elevado. Mesmo que o valor de 450% fosse demasiado alto, digamos afectado por um factor de cerca de 5, os anticorpos à ST Ib biológica reconheceram a ST Ia porcina pelo menos 20 vezes melhor do que o fizeram os anticorpos à ST Ib sintética. Se as moléculas de ST Ib biológica e sintética fossem iguais, os anticorpos a cada uma delas deveriam reconhecer a ST Ia porcina com a mesma ou aproximada eficiência. Uma vez que decididamente não ê este o caso, as moléculas de ST Ib biológica e ST Ib sintética têm de ser diferentes ainda que ambas contenham as primeiras sequências de amino ácidos idênticas e ambas contenham três ligações intramoleculares dissulfureto.

u2 226

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-64Outras Preparações da ST Monómera

Têm sido preparados outros primeiros polipêptidos e moléculas ST (i) por outras vias de oxidação, (ii) com outras sequências de amino ácidos a partir da ST Ib (iii) com

7 12

substituições de grupos R , - diferentes, (iv) com grupos R^2f" Gys alquilados e (u) com grupos R^ ligados ao resíduo de amino ácido do N-terminal da molécula ST Ib de 18 resíduos. Muitos destes materiais foram avaliados quanto às suas actividades antigênicas e/ou biológicas, pelas técnicas ELISA, supra, e dos ratinhos-bêbês, respectivamente, usando antisoros à ST sintética, preparados em (3) a seguir. Os re sultados de diversas destas preparações e avaliações estão citadas no Quadro 2,abaixo.

QUADRO 2 - OUTRAS PREPARAÇÕES

Oxidações’'"	ELISA2 (%)	Ratinho Bébê^ (%)
(l) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml; 0,1 M NH4HC03; pH 8,0; 6 hrs.	95	120 (5,3 ng)
(2) 4SC; 1,0 mg/ml; 0,1 M NH^HCO^; pH 8,0; 6 hrs.	87	80 (6,9 ng)
(3) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml; 0,1 M NH5; pH 10,3; 1,0 hr; liofilizado; 4QC; 1,0 mg/ml; tampão salino; pH 7,2; 8 hrs.	27	85 (6,5 ng)
(4) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml 0,1 M NHj; pH 10,3; ajustado com ácido acético atê pH 8,0 após 5 min.j 1 equivalente K3Fe(CN)6; 3 hrs.	inf erior a 2	N.D.4
(5) Temp. ambiente; 2,0 mg/ml; 0,1 M NH3j ph 10,3; 1 hr.; liofilizado; 49C; 2,0 mg/ml; tampão salino; 8 hrs.	13	55 (10 ng)

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-65-

(6) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml; 1,0 mg/ml; ácido perfórmico	muito infe rior a 1	N.D.
(7) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml5 0,1 M NHy pH 10,3; imediatamente ajustado após solução com ácido acé tico até pH 8,0; 22 hrs.	53	N.D.
(8) Temp, ambiente; 1,0 mg/ml; 0,1 M NHy pH 10,3; 22 hrs.	26	N.D.
(9) Temp. ambiente; 1,0 mg/ml; 0,1 Μ NH HCOy pH 8,0; 8 hrs; Sephadex G-1Q a DEAE-Bio Gel A; liofilizar	100	N.D.
(lO) Temp. ambiente; 1 mg/ml; 8 M ureia; pH 8,0; 8 hr.	7	N.D.
Alquilação
(ll) Oxidar como em (l); alquilar com uma média de 4 moles de ácido i_o doacético após a formação em média de uma ligação dissulfureto.	12	N.D.
(12) Oxidar como em (l); alquilar com uma média de 2 moles de ácido io doacético após a formação de duas li gaçoes, em média, de dissulfureto	14	N.D.
Acilo (R13) de ST (13) Ountou-se um grupo N-acetilo ao amino-terminal do resíduo de 18 amino ácidos do primeiro polipáptido antes da remoção dos grupos bloqueadores de péja tidos, seguindo-se 0 desbloqueamento e a oxidação como em (7)	53	N.D.

b2

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-66-

(14) LT B-(37-62)—ST; oxidado como em (l)	147	-j N.D.
(15) LT 8-(27-36)-ST; Temp. ambiente; 0,1 mg/ml; 0,5 M.NH4HC03; pH 8,0; durante a noite	24	N.D.
(16) LT £)-(27-36)-ST; Temp. ambiente; 1,0 mg/mlj 0,5 M NH4HC03; pH 8,0; durante a noite	121	N.D.
(17) LT 8-(27-36)-ST; temp. ambiente; 5,0 mg/mlg 0,5 M NH4HC03; pH 8,0; durante a noite j Sequências de alternativa	92	N.D.
l (18) 14 amino ácidos do carboxiI -terminal da ST Ib oxidados como em ! (9) J	65	N.D.
ΐ (19) 15 amino ácidos do carboxii -terminal da ST Ib oxidadas como em (9)	55	N.D.
8 9 (20) R° e RÍ precedendo resíduos Cys na Fórmula VIII substituídos por Ser, oxidados como em (9)	71	N.D.
(21) R? s RjJ/ precedendo resíduos Cys na Fórmula VIII substituídos por Ser, oxidados como em (9)	152	N.D.
(22) R^° e R^1 precedendo resíduos Cys na Fórmula VIII substituídos por Ser, oxidados como em (9)	27	N.D.

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Notas:

1 - Para cada um dos casos de (l) a (17) foi usado um primej.

ro polipêptido correspondendo à sequência da Fórmula VIII onde g-1 eram zero. Em (18) e (19) foram utilizados pri meiros polipêptidos correspondendo aos 14 amino ácidos e 15 amino ácidos, respeetivamente, do ST Ib carboxi-termi nal. Qs primeiros polipêptidos correspondendo às substi tuições citadas à sequência na Fórmula VIII, foram utili zados para os casos (20) a (22) e foram depois oxidados. São indicadas as condições de reacção por ordem de: temperatura; concentração do primeiro polipêptido em mg/mlJ concentração molar de ingredientes adicionados; valor do pH ao qual se inicia a oxidação; e duração do processo de oxidação. Cada solução foi agitada brandamente para fazer contactar a solução com o oxigénio molecular atmo.s férico como agente oxidante, a não ser em casos em que se especifique doutro modo. As preparações foram ensaia das sem mais purificação.

2 - A técnica ELISA, de acordo com o Quadro 1, foi conduzida

com antisoros à ST preparada como em (3) como base de comparação. Essa preparação de ST foi purificada antes da união, enquanto que a preparação (3) mostra os resul tados da preparação não purificada.

3-0 ensaio dos ratinhos bébê, segundo o Quadro 1, foi conduzido com percentagens baseadas no valor da ST biológica, estando os valores entre parêntesis em nanogramas de ST, relativos a uma proporção visceras/corpo inteiro de 0,083.

4 - N.D. = Não Determinado

5 - Crê-se que o valor de antigenicidade obtido é anormalmeri

te abaixo.

Os resultados acima mostram que se obtém a mais elevada actividade antigônica (ELISA) sob condições de oxi62 226

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-68dação em que o primeiro polipêptido sintético está presente na solução a uma concentração inferior a cerca de 2 mg/ml, o oxigénio do ar é o agente oxidante, o valor do pH está abaixo de cerca de 10, e em especial quando o valor do pH está entre cerca de 7,5 e cerca de 8,0, a temperatura de reacção está entre cerca de zero até cerca de 25BC e o tempo de reacção de oxidação ê inferior a cerca de 24 horas.

Preparação de ST Multimera

A. Dímero ST Sintético Multímero (ST/ST)

Preparou-se pela síntese em fase sólida, por etapas, descrita anteriormente, um primeiro polipêptido com uma sequência de 36 resíduos de duas moléculas ST Ib juntas cabe ça-a-cauda por uma ligação amida. A sequência de resíduos de amino-ácidos desse material, tomada da esquerda para a di. reita e na direcção do amino-terminal para o carboxi-terminal, está indicada a seguir, na Fórmula IX:

Fórmula IX

AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTyrProAlaCys

AlaGlyCysAsnAsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTyr

ProAlaCysAlaCysAsn.

Essa molécula foi então dissolvida, a uma concentração de 1 mg/ml, num tampão de bicarbonato de amónio 0,05 molar com um pH de 8,0. A solução resultante foi brandamejn te agitada na presença de oxigénio molecular atmosférico c_o mo oxidante atê que os grupos sulfidrilo livres não fossem detectados com o reagente de Ellman, supra; isto ê, durante a ncite. As moléculas ST/ST assim preparadas foram separadas dos outros materiais do meio reagente, por cromatografia em coluna, liofilizados e foram então utilizados sem mais pu. rificaçães. A análise de amino ácidos do primeiro polipêptido

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36-mero foi consistente com a sequência indicada na Fórmula IX.

A ST/ST resultante, sem purificação adicional, tinha uma antigenicidade aos anticorpos face à ST, monómera, natural, de 233 por cento comparada com a antigenicidade da ST Ib natural, aos mesmos anticorpos. A actividade biológica desta ST/ST era inferior a 1% da da ST Ib natural no ensaio dos ratinhos-bêbé, supra, até aos limites do ensaio, aqui de 640 nanogramas.

0 trímero sintético (ST/ST/ST), o tetrâmero (ST/ST/ /ST/ST) e multimeros cabeça-a-cauda mais compridos da ST sin tôtica podem ser preparados de modo semelhante. As moléculas ST sintêtita dímera e trímera são especialmente preferidas dadas as dificuldades presentes na produção de polipépti dos sintéticos que contenham mais do que um total de cerca de 60 resíduos de amino ácidos.

Os resultados da utilização do dímero sintético (ST/ST) na preparação de uma vacina estão descritos em maior detalhe na Secção V.

B. Polímero ST Sintético Multímero

0 primeiro polipêptido 18-mero de ST Ib sintética preparado como anteriormente se descreve, para ilustrar a preparação dos polímeros de ST sintética cuja pluralidade de unidades de repetição da ST sintética estão ligadas entre si por ligações intramoleculares, interpolipêptido cistina dissulfureto.

Num exemplo de preparação, a ST sintética polímera (aqui por vezes designada por P-ST) foi preparada dissolvendo o primeiro polipêptido ST sintético (l8-mero) acima prep.a rado, num tampão de bicarbonato de amónio 0,1 molar com um

υ2 226

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-70valor de pH ds 8,0, para dar uma solução com uma concentração de cerca de 1 mg/ml do primeiro polipéptido de ST sintjá tica. Foram usados volumes de 10 a 100 ml destas soluções.

A solução assim preparada foi agitada brandamente à tempera tura ambiente num copo aberto de laboratório para permitir a oxidação dos Cys mercaptans. A análise do meio reagente após um período de oxidação de cerca de 16 a 24 horas usando o reagente Ellman, supra, indicou não estarem presentes grupos sulfidrilo livres.

0 meio reagente oxidado foi liofilizado e o mate_ri al seco resultante foi re-suspenso num tampão (pH 8,0-8,5) de bicarbonato de amónio 0,1 molar, colocado numa coluna cromatográfica de Sephadex G-50 equilibrada com o mesmo tampão para separação. No gráfico da Figura 17 está ilustrada uma separação típica da ST polímera sintática (P-ST) de ST monómera sintática (M-ST) usando uma coluna destas.

A ordenada do gráfico está em unidades de densidade óptica lida a 278 nanometros. A abcissa mostra fracções numeradas de 4,5 ml, cada, de eluído recolhido da coluna. 0 eluído das fracções 5 a 9 foi recolhido como contendo a P-ST, enquanto que as fracções numeradas de 10 a 17 foram re colhidas como contendo a ST monómera sintática (M-ST).

0 fraccionamento da P-ST assim obtido, usando uma coluna contendo Bio Rad P-30 (Bio Rad, San Raphael, CA) como resina separadora, indicou que a maior parte da P-ST isolada usando Sephadex G-50 tinha um peso molecular médio de pelo menos cerca de 40 000 daltons (40 kd P-ST). Um fraccionameji to posterior dos 40 kd P-ST usando resina Bio Gel A-1,5 m (Bio-Rad), mostrou que a maior parte do material tinha um peso molecular de cerca de 400 000 daltons, com algum mater/ al de peso molecular superior a cerca de 15x10^ daltons (1500 kd P-ST). Novo fraccionamento de pesos moleculares, usando uma coluna contendo resina Bio Gel A-5 (Bio Rad) separou a P-ST de 1500 kd numa fracção que incluía P-ST de peso

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molecular superior a cerca de 15 000 000 daltons (15 000 kd P-ST) e numa segunda fracção com um peso molecular médio de cerca de 4 000 000 daltons (4 000 kd P-ST).

Os acima referidos pesos moleculares são aproximações baseadas numa forma presumivelmente globular para a P-ST e num conhecimento do volume do vazio e dos limites de exclusão da coluna, mas sem usar padrões internos de pesos moleculares conhecidos. Cada uma das acima obtidas fracçoes foi liofilizada após eluição da coluna.

Os resultados adiante descritos (Secções V e UIl) usando P-ST são para preparações purificadas em Sephadex G-50 e liofilizadas que contÊm principalmente polímeros cujo peso molecular médio é de pelo menos 40 000 daltons, isto é, as 40 kd P-ST. Actualmente prossegue a investigação relativa à antigenicidade, imunogenicidade e actividade biológica das fracçoes de P-ST com diversos pesos moleculares.

Preparações típicas de 40 kd P-ST têm uma antigenicidade a anticorpos face à ST Ib natural entre 900 e 1 500 % da antigenicidade do material natural (ST Ib) e têm uma ac tividade biológica, no ensaio dos ratinhos-bêbé, supra, de cerca de 20/, ou menos, do que a da ST Ib natural.

Processo Sintético Geral

A seguir indica-se um processo sintético geral de preparação de uma molécula ST sintética, monómera ou multímera, com pelo menos cerca de 10/ da antigenicidade da ST biológica baseada nos resultados acima mencionados e em várias outras determinações:

(l) Prepara-se um primeiro polipêptido sintético, monómero, de modo substancialmente ausente de agente oxidante. 0 primeiro polipêptido sintético inclui as sequências

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de resíduos de amino ácidos de Fórmula I, Fórmula III, Fórmula V, Fórmula UI ou Fórmula IX, e pelo menos dois resíduos

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Cys cujos grupos R^Zf” ^s^° hidrogénio, isto é, dois resíduos

Cys H, e está livre de quaisquer ligações intramoleculares,

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cistina dissulfureto e pode conter um grupo R - onde "m" ^r m

tem o valor um.

(2) Obtido 0 primeiro polipéptido assim preparado ê dissolvido ou disperso numa composição aquosa a uma concej} tração inferior a cerca de 5 mg/ml, de preferência a uma cort centração inferior a 2 mg/ml e ainda melhor a uma concentração de cerca de 1 mg/ml até cerca de 0,1 mg/ml. 0 valor do pH da composição na qual se dissolveu ou dispersou 0 primeiro polipéptido, ê de preferência alcalino e inferior a cerca de

10.5 e, melhor ainda, está entre cerca de 7,5 e cerca de 10,5.

(3) A composição contendo o primeiro polipéptido é depois posta em contacto com oxigénio molecular do ar, como agente oxidante, 0 pH da solução durante a oxidação é de preferência de cerca de 7,0 até cerca de 9,5, ou melhor de

7.5 até cerca de 9, e, melhor ainda, de cerca de 7,5 até cer, ca de 8,0. De preferência a solução é posta em contacto com 0 oxidante por meio de agitação branda em vaso aberto ao ar.

(4) Mantém-se a composição em contacto com 0 ar durante um período de cerca de 1 até cerca de 24 horas e ainda melhor de cerca de 2 h até cerca de 8 h para formar pelo menos uma ligação intramolecular, intrapolipéptido ou interpolipéptido cistina dissulfureto a partir de pelo menos dois resíduos Cys (Cys H) presentes. Para a ST sintética πιο nómera e multímeros ST cabeça-a-cauda a ligação (pelo menos uma) cistina dissulfureto ê uma ligaçSo intramolecular, intrapolipêptida, enquanto que para a ST sintética polímera (P-ST) pelo menos uma ligação cistina dissulfureto é uma ligação intramolecular, interpolipéptido. E preferível que ça da unidade de repetição ST da P-ST forme em média cerca de

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duas ligações interpolipêptido a que se formem moléculas P-ST de repetição ST.

cistina dissulfureto de modo com pelo menos duas unidades

Prefere-se na prática que, para a ST sintática monómera, a ligação dissulfureto se forme entre os resíduos Cys que precedem os pares R^ e , R^ e Rj , e R^ e R^ das Fórmulas I, III, V ou VI, que correspondem às posições dos resíduos numerados 5 e 10, 6 e 14, e 9 e 17, a partir do ami no-terminal da molécula ST Ib, respectivamente. Melhor ainda será manter o contacto entre □ oxigénio molecular e a solução durante um período suficiente para formar duas ligações dissulfureto, de preferência entre os acima mencionados pares de resíduos Cys, e, ainda com maior preferência, por um período suficiente para formar três ligações dissulfureto de novo e preferencialmente entre os referidos pares de res.£ duos Cys.

A oxidação conduz-se de preferência a uma temperatura entre cerca de Q2C e cerca de 252C.

(5) Completada a reacção de oxidação, recolhe-se a ST sintética em geral por liofilização e purifica-se, por exemplo, por coluna cromatográfica.

¹¹¹ " USOS DA ST SINTÉTICA MONOMERA

A ST sintética monómera, preparada como acima se viu, foi ligada a uma molécula de suporte ou usada sozinha nas medições ELISA dos estudos conduzidos sob a direcção do Dr. Frederik A. Klipstein da Universidade da "Rochester Medicai Center, Rochester, Neui York". Os resultados das detejr minações experimentais e processos para realizar estas detejr minações são aqui adiante discutidas na Secção IV. A não ser nos casos em que se especifique de outro modo, os estudos discutidos nas Secções III e IV foram realizados com ST sintética monómera (M-ST) deste invento.

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-74A. Propriedades

A ST Ib purificada até à homogeneidade, da estirpe 18D (042:H47) LT”/ST⁺ da E, coli humana, te m um peso molecular estimado de 1,972 e consiste em 10 aminoácidos diferentes, dispostos numa sequência de 18 amino ácidos /""Staples et al., supra_7 cuja estrutura primária foi mostrada por Chan et al., supra como sendo AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCys TyrProAlaCysAlaGlyCysAsn. Uma molécula sintática com esta estrutura primária foi preparada (Secção ll) e compararam-se as propriedades biológicas deste polipóptido com as da ST pu, ra obtida por crescimento bacteriano da estirpe 18D (ST biológica) .

Capacidade para Induzir Secreção Eluida

As ST sintética e biológica foram substancial e igualmente potentes na sua capacidade de induzir secreção fluida no ensaio dos ratinhos-bébé (Figura l) e ansas de ileum de ratos (Figura 2). As ligeiras variaçães observadas nas doses efectivas mínimas das duas toxinas em cada modelo de ensaio estiveram dentro dos limites da variação experimejg tal e, na verdade, algumas preparações posteriormente preparadas de ST sintética provocaram resposta idêntica à da ST biológica ou nativa no ensaio dos ratinhos-bébé. ExpÔr a 100BC durante 30 minutos não afectou a potência de qualquer das toxinas em ensaios com animais.

Observações anteriores mostraram que a destruição das pontas dissulfureto da ST biológica por tratamento com agentes de redução como o 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol, eliminou a sua actividade biológica (Staples et al, supra).

A exposição de ST sintética a ditiotreitol 5xlO^_Z| molar durante 60 minutos também eliminou a sua actividade secretória no ensaio dos ratinhos-bébé.

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Relações Imunolóqicas

A antigenicidade das ST biológica e sintética era semelhante quando cada uma foi testada pelo (Enzyme Linked Imunosorbent Assay - ELISA) ensaio ELISA usando antisoros hi perimunes contra a ST biológica. Quando as concentrações que deram uma densidade óptica de 0,600 a 410 nanómetros, fo ram comparadas, observou-se que a antigenicidade da ST sinté tica era 70/ da da ST biológica (Figura 3) mas a antigenicidade das toxinas era idêntica quando ambas foram ensaiadas com antisoros hiperimunes contra a ST sintética. Estes resultados foram substancialmente melhorados em preparações posteriores como se mostra no Quadro I acima, sendo a ST sin tética cerca de 3 vezes melhor do que a ST biológica, neste mesmo ensaio ELISA.

Para avaliar o efeito neutralizador dos antisoros hiperimunes contra a ST, quer a sintética quer a biológica, sobre o efeito secretório das toxinas no ensaio dos ratinhos-bêbê, deram-se a três ratos (por cada ponto apurado) 100 mi crolitros intraintestinalmente contendo 2 "unidades-ratos" (MU), o dobro da dose efectiva mínima (ver Materiais e Méto dos, Secção IV A) de cada toxina que tenha sido incubada, na diluição de antisoro indicada, durante 3 horas a 37SC (Figura 4). 0 número de unidades-rato neutralizadas por 1

ml de antisoro resultou de multiplicar a planeada diluição de antisoro necessária para neutralizar (isto é, produzir uma relação vísceras:carcassa de pelo menos 0,083) o efeito secretório, pelo factor 10 da diluição e pela factor 2 correspondente às 2 unidades-ratos usadas.

Qs antisoros hiperimunes contra cada uma das preparações da toxina seroneutralizaram o efeito secretório, no ensaio dos ratinhos-bêbé, das ST sintética e biológica, de modo aproximadamente igual: um mililitro de antisoro hiperimune de coelho, contra a ST biológica, neutralizou 160 MU de ST sintética e 190 MU de ST biológica, enquanto que um

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-76mililitro de antisoro hiperimune de cabra, antisoro à ST sintética, neutralizou 220 MU de ST sintética e 240 MU de ST biológica.

Imunização de Ratos

A imunização com ST sintética produziu titulos de soro antitoxina de 1:32 (quatro vezes maior do que nos controles) e títulos IgA mucosal de 1:64 (cinco vezes maior do que nos controles). A secreção de fluidos foi significativamente reduzida em grau comparável ao anteriormente observado em ratos imunizados com ST biológica semi-pura et al., Infect. Imun., 34:637-639, (l98l)_7 em· ratos inoculados quer com ST sintética quer com ST biológica e com a e.s tirpe viável produtora de ST (Quadro 3) a seguir.

QUADRO 3

Resultados da Inoculação em Ratos Imunizados

Inoculação3
Imunogêneo ST	Toxina ΞΤ(Β)	Toxina ST(S)	LT"/ST+
Sintética (s)	54 + 2	66 + 2	55 + 1
Biolõgica(B)b	83 + 9	NDC	69 + 2

Notas:

a - Média +. erro padrão da percentagem média de secreção reduzida em ratos imunizados quando comparados com animais não imunizados e inoculados de modo idêntico.

b - Informação de Kleipstein et al., Infect. Immun., 34:637-639 (1981).

c - Não Determinado

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Qs resultados acima mencionados mostram que a imunização com a toxina ST produzida sinteticamente, de estrutu ra baseada na da ST humana, oferece protecção contra o ataque de estirpes enterotoxigéneas, produzindo ST, da E. coli de origem humana.

Podem encontrar-se mais detalhes dos estudos discdj. tidos nesta secção (III A) em Klipstein et al., Infect. Immun. , 39:117-121 (1983) cujas revelações são aqui citadas pa ra referência.

B. Conjugados ST-LT

Os resultados discutidos nesta secção referem-se a composições de conjugados e às suas propriedades obtidas por interligação (recticulado) sob diversas condições, da ST sin têtica (Secção II) quer à holotoxina LT quer à sua componente nãoi tóxica, a subunidade B como suporte que ê responsável pela ligação da toxina a receptores específicos sobre a superfície da mucosa. A eficácia de uma vacina que consiste na ST sintética interligada com a subunidade B para provocar respostas específicas da antitoxina do soro e da mucosa, a cada uma das toxinas componentes, é também demonstrada, obtendo-se assim uma forte protecção, em ratos imunizados, contra o ataque de ambas as formas de toxina ou da LTLC viável heteróloga que produzam quer ST quer LT.

Conjugação da ST à LT

A ST sintética foi conjugada à holotoxina LT partindo de uma relação molar de ST para LT de 100:1, usando re laçÕes de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) para o total de proteína conjugada, entre 0,5:1 e 40:1 (Figura 5). A união de uma quantidade máxima de ST à LT ocorreu a uma relação de EDAC para conjugado, de 1:1; contudo, a esta relação, mantinha-se uma toxicidade residual de LT em

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grau inaceitável. Um aumento da relação EDAC para proteína conjugada resultou num decréscimo progressivo da toxicidade da LT residual mas isto era acompanhado de uma corresponde_n te redução da antigenicidade de ambas as toxinas no conjuga do.

Uma relação EDAC/conjugado de 20:1 dei/comt/resultado um conjugado com um grau aceitável de reduzida toxicidade de LT (0,3%), mas a antigenicidade de ambas as toxinas componentes foi reduzida a menos de 25% àquela relação, indicajn do que este conjugado não teria efeito antigêneo. Estas observações levaram à substituição, pela subunidade B não tó xica, da LT, rodeando-se assim o problema da toxicidade resi. dual da LT.

Conjugação da ST à Subunidade B

A ST sintética foi conjugada à subunidade B, a paj? tir duma relação molar inicial de ST para subunidade B, de 100:1, usando relações EDAC/proteína conjugada entre 0,5:1 e 40:1. 0 modo de incorporar ST e as variações de antigenicidade foram semelhantes às observadas para conjugar ST à LT excepto em que a quantidade máxima de ΞΤ unida aconteceu a uma relação EDAC/conjugado de 2:1. A toxicidade do conjugado obtido a esta relação estava confinada à da ST presente; foi reduzida até 0,3% da da toxina não atenuada.

Uma relação EDAC/conjugado de 2:1 foi portanto uti. lizada nos estudos que recorreram à ST radio-marcada para de. terminar a influência da relação molar inicial ST/subunidade B, sobre a quantidade de ST incorporada no conjugado. Mistjj raram-se dez nanomoles de ST (5 nanomoles de ST não marcada mais 5 nanomoles de ST radio-marcada) confia 0,1 nanomoles de subunidade B, obtendo-se relações molares de ST inicial para subunidade B de 5:1 atê 100:1 (Figura 6). 0 aumente

da relação ST inicial/subunidade B resultou numa união de

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-79quantidades progressivamente maiores de ST h subunidade B. Ainda que uma relação ST inicial/subunidade B de 25:1 tenha produzido um conjugado final que continha mais de 90% de ST, numa base molar, a proporção de ST em base de peso era apenas de 25/oj este último valor aumentou quando se usaram re lações molares iniciais maiores.

Antiqenicidade de Conjugados

0 efeito da concentração da EDAC na composição e na antigenicidade das toxinas individuais nos conjugados fi nais foi avaliado conjugando ST à subunidade B em relação molar de 50:1 usando uma relação EDAC/conjugado que variou entre 1:1 e 2:1 (Figura 7). A conjugação máxima de ST ocor reu a uma relação EDAC/conjugado de 2:1, contudo, relações superiores a 1,5:1 deram como resultado uma repentina queda na antigenicidade da ST e um declínio moderado na antigenici. dade da subunidade B. 0 número máximo de unidades antigenas ST (derivado de multiplicar a percentagem de toxina presente pela percentagem da sua antigenicidade) foi obtido a uma relação EDAC/conjugado de 1,5:1.

Foi portanto usada uma relação EDAC/conjugado de 1,5:1 nos estudos que determinaram o efeito da relação molar inicial da ST/subunidade B sobre a composição e propriedades do conjugado final. Do aumento da relação molar inicial ST/subunidade B de 50:1 para 100:1 resultou numa propoj: ção progressivamente maior de ST no conjugado final (Figura 8).

Uma vez que se obtêm variações da relação molar inicial quando se mantém constante a quantidade de ST (300 nanomoles) e se reduz a quantidade de subunidade B adicionada (de 6 até 3 nanomoles) a relação EDflC/ST deminuiu, enquan to que a relação EDAC/subunidade B subiu, quando as relações molares iniciais subiram. Veriricou-se ainda nesta variação

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-so- EMBl

que enquanto a antigenicidade da ST subiu ligeiramente a da subunidade B descia moderadamente. 0 saldo destes dois fa£ tares (composição e antigenicidade) foi que do aumento da relação molar inicial resultavam quantidades progressivameri te maiores de unidades antigâneas ST com uma correspondente baixa de unidades antigenas da subunidade B no conjugado fi nal.

Propriedades da Vacina Usada para Imunização

Mostrou-se anteriormente que a subunidade B é um antigeno mais fraco do que a holotoxina LT, numa base molar /""Klipstein et al., Infect. Imroun., 31:144-150 (l98l)_7 e estudos preliminares indicam que, em termos de unidades antígenas, ê um antigeno mais fraco do que a holotoxina LT ou a ST sintética. Isto conduz à selecção de uma vacina que contenha mais antigenicidade da subunidade B do que da ST.

0 antigeno foi produzido conjugando a ST inicial e a subunidade B numa relação molar de 50:1 usando uma rela ção EDAC/conjugado de 1,5:1. 0 conjugado continha 36% (em peso) de ST com 85% de antigenicidade e 0,13% de toxicidade persistente, e 64% (em peso) de subunidade B que retinha 89% da sua antigenicidade. Quando ensaiada directamente (por exemplo, em amostras não ajustadas para conter 100% de cada toxina) a vacina continha 37 unidades antlgenas ST e 59 de subunidade B, por 100 microgramas e tinha uma toxicidade residual de ST de 0,06%.

Resultados da imunização

A ratos imunizados com a vacina acima referida foram dados 1000 microgramas de primeira imunização por via intraparentérica (i.p.) seguidos de duas doses de reforço de 3 000 microgramas per os (p.o.). Estudos anteriores mostraram que, nos ratos imunizados com LT por este processo, o

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grau da resposta antitoxina e de protecção estava correlacio nada com a dosagem total p.o. /""Klipstein et al., Infect. Immunol., 31:144-150 (l98l) ; Klipstein et al., Infect. Immunol., 37:1086-1092 (1982); Klipstein et al., Infect. Immunol. 31:252-260 (l98l)_7· Este esquema de imunização atingiu 2 200 unidades antigenas de ST e 3 450 da subunid£ de B.

Os titulos do soro IgG antitoxina em relação a ST foram aumentados 4 vezes e em relação à subunidade 8 aumenta dos 5 vezes sobre os valores nos ratos não imunizados, de controle. Os titulos da antitoxina Iga da mucosa secretória em relação à ST e à subunidade B foram 7 vezes maiores nos ratos imunizados do que nos controles. Os ratos imunizados foram significativamente protegidos contra o ataque da LT ou da ST quer biológica quer sintética, bem como contra organis mos viáveis heterólogos que produzam estas toxinas, quer a sós quer em conjunto, como se mostra no Quadro 4, a seguir:

QUADRO 4

Resultados da Inoculação em Ratos Imunizados com l/acina de

Subunidade 8-ST Interligadas

% de Secreção Reduzida Após Inoculação com :

Toxina LT	LT+/ST"	LT+/ST+	T oxina ST(B)b	T oxina ST(S)b	LT"/ST+
94+3	61 + 2	68±2	97+3	78 + 1	76 + 2
0,5 ngc	q c 5 ng	5 ng	108,d	108,d	io8,d

Notas:

a - Os valores representam a média _+ erro médio padrão. Uma secreção reduzida de mais de 50?ó representa uma diferença significativa (P menor do que 0,001) entre ratos imunizados e não imunizados.

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-82b - ST(b) significa ST biológica e ST(S) significa ST sintética.

c - Quantidade de toxina inoculada em nanogramas (ng). d - Número de organismos inoculados.

Os resultados acima mostram que a ST purificada, sinteticamente preparada, pode ser usada na obtenção de um antígeno não-tóxico, efectivo, quando interligada à subunidade B da toxina LT, ultrapassando-se assim um grande obstá culo na criação de uma vacina prática, segura, que ofereça protecção contra estirpes de ETEC que produzam qualquer das formas ST ou LT de toxina. Os resultados anteriores mostrja ram que interligando uma preparação semipura de ST biológica com LT se obtém um antígeno no qual a ST adquiriu antiqe nicidade em função da união à molécula LT de grande peso mo lecular, e no qual, em condições de conjugação adequada, se manteve a maior parte da antigenicidade das toxinas componeri tes enquanto que as suas propriedades tóxicas eram muito reduzidas /""Klipstein et al., Infect. Immunol», 37:550-557 (1981)_7.

Ainda que a vacina com ST biológica ofereça forte protecção em animais imunizados contra o ataque de estirpes de ETEC que produzam qualquer forma de toxina, a composição heterogénea do componente de toxina ST semipura exclui niti damente a sua adopção ao uso do homem. A metodologia complicada e aborrecida envolvida no processamento da ST bioló gica atê pureza total torna difícil a produção deste materi al em larga escala, muito menor ainda em escala comercial.

Os resultados anteriores indicam que a ST produzida sinteti camente pode ser preparada em grandes quantidades e que constitui uma vacina igualmente eficiente.

As condições de reacção dos conjugados derivados da ST sintética que dão uma incorporação máxima de ST no su porte e também propriedades óptimas em termos de antigenici

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dade residual e de toxicidade, diferem das anteriormente observadas para conjugar a ST biológica semipura à LT. Em ambas as circunstâncias (l) foi necessária uma quantidade crítica do reagente de conjugação carbodiimida para unir a quantidade máxima de ST ao suporte, (2) a proporção da ST presente no conjugado final dependia da relação molar inicial de ST misturada com LT, e (3) o aumento da relação da carbodiimida para ambas as toxinas no conjugado resultava num de£ línio progressivo tanto na antigenicidade como na toxicidade das toxinas interligadas. No caso da ST biológica semipura foram identificadas as condições de conjugação que produziam um conjugado com uma incorporação máxima de ST na LT e, ao mesmo tempo, não só retinham a maior parte da antigenicidade como reduziam marcadamente a toxicidade de ambas as toxinas interligadas.

Isto não ocorreu contudo quando a ST sintética foi conjugada à LT. A máxima união de ST sintética à LT deu-se a uma relação carbodiimida/conjugado muito mais baixa, sendo nestas condições, a toxicidade da LT residual deste conjugado inaceitavelmente alta. A redução da toxicidade da LT para níveis aceitáveis só foi conseguida com relações carbodiimida/toxina que afectaram gravemente a antigenicidade de am bas as toxinas interligadas. Estes resultados levaram a rodear o problema substituindo a subunidade 8 não tóxica pela holotoxina LT como suporte.

A proporção de antigenicidade (expressa em unidades antígenas) de cada uma das toxinas componentes presentes no conjugado final derivado de interligar a ST sintética à subunidade 8, pode ser alterada fazendo variar as condições das reacções de conjugação. Assim na presença de uma concen tração adequada de carbodiimida, uma baixa relação molar ini ciai de ST/subunidade B produziu um conjugado com antigenicj^ dade predominantemente ST enquanto que uma alta relação molar produziu um conjugado onde a antigenicidade da subunidade B era a mais elevada.

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-84ObseruaçBes preliminares sugerem que a ST sintética ê um antígeno mais eficiente do que a subunidade B. Isto levou à selecção de um antígeno interligado para avaliação por imunização de ratos, que continha aproximadamente um te.r ço de actividade antigénica ST e dois terços de subunidade B. Quando administradas em grandes doses p.o., essa vacina provocou uma resposta pelo menos 4 vezes maior de an.titoxina do soro e mucosa contra ambas as toxinas componentes, ofe recendo assim protecção significativa contra o ataque de ambas as toxinas ST e LT e das bactérias viáveis heterólogas que produzam qualquer forma de toxina.

Uma vez que todas as estirpes de ETEC provocam diar; reia através da produção de toxinas LT ou ST, quer sozinhos quer em conjunto, a subida suficientemente forte de resposta da antitoxina a cada uma destas toxinas, oferece protecção uniformemente eficiente contra todas as estirpes de ETEC qualquer que seja □ serotipo somático, o antígeno fimbrial específico ou tipo de toxina produzida. Mostrou-se ser este o caso no acima referido estudo de ratos imunizados com a va cina de ST/subunidade B interligadas.

A imunização com LT administrada exclusivamente por via parentérica provocou só uma resposta de antitoxina de soro IgG que oferece aos ratos uma protecção apenas pass.a geira, enquanto que a imunização de reforço p.o. ofereceu prolongada protecção devida à activação da antitoxina Ig da mucosa secretória. /""Klipstein et al., Infect. Immun., 37: :1086-1092 (l982) e Klipstein et al., Infect. Immun., 27:81-86 (1982)_7.

Os títulos de antitoxina IgA da mucosa secretória, em relação tanto à ST como ã subunidade B, em ratos imunizados per os com a vacina interligada no estudo acima, excederam os que anteriormente se consideraram necessários para oferecer protecção prolongada a ratos imunizados apenas com

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LT. Torna-se claro que a vacina interligada deverá ser admi nistrada por via oral. Os dados acima são insuficientes para determinar quando é que uma primeira imunização por via parenteral ê um pré-requisito para uma imunização subsequente p.o. eficiente uma vez que é este o caso dos ratos imunizados com LT Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (l98l); Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982); e Klipstein et al., Infect. Immun. 27:81-86 (l980)_7 e dos ratas e cães imunizados com toxoide de cólera /”Pierce et al., Infect. Immun., 21:185-193 (1978); Pierce et al.,

0. Infect. Dis., 135:888-896 (l977)_J.

Podem ser encontrados discutidos nesta secção (III B) fect. Dis., 147:318-326 (1983), tadas para referência.

mais detalhes dos estudos em Klipstein et al., 0. Incujas revelações são aqui çi

C.

Imunizações de ST sintática em Ratos

Imunoqenicidade da ST e da subunidade B

Foram imunizados ratos com doses graduais de unidades antígenas quer da subunidade 8 quer da ST sintática associada à imunoglobulina G porcina (PIG; Materiais e Métodos na Secção C) como se mostra na Figura 9. Aos ratos que receberam doses variáveis da primeira imunização i.p., receberam também duas imunizações de reforço p.o. de 1 000 unidades antígenas cada, e os ratos que receberam doses variáveis de reforço p.o. receberam todos uma primeira imunização i.p. de 200 unidades antígenas. Ratos imunizados com ST foram inoculados com y/estirpe Tx 452 LT~/ST⁺ humana e ratos imunizados com a subunidade 8 foram inoculados com a estirpe PB 258 LT⁺/ST^- humana.

0 aumento imunização primária

de doses de unidades antígenas quer da i.p. quer das de reforço p.o. de ambos

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-86os antígenos deu como resultado aumentos paralelos nos títulos de antitoxina e no grau de protecção contra o ataque dos respectivos organismos. Os valores dos titulos da antitoxina IgG do soro subiram proporcionalmente mas foram permanentemente mais pequenos, uma ou duas vezes, do que os titulos de antitoxina IgA da mucosa.

Foram necessárias doses de ambos os antígenos de 100 unidades de antígeno para a primeira imunização i.p. e um total de 2 000 unidades antigenas para as doses de reforço p.o. (isto ê, duas doses de reforço de 1 000 unidades antígenas cada), para alcançar aumentos de pelo menos 4 vezes, nos títulos de antitoxina IgA da mucosa e protecção significativa (isto é, maior do que 50% de secreção reduzida) contra o ataque da estirpe que produz respectivamente LT ou ST.

Protecção contra uma estirpe LT /ST

Para determinar a dose mínima de unidades antigenas de ST ou da subunidade B, necessária para alcançar forte protecção contra uma estirpe que produza ambas LT e ST, foram imunizados ratos com cada toxina em separado, usando uma primeira imunização i.p. de 200 unidades antigenas seguida de doses variáveis de unidade antigenas de doses de reforço p.o. e foram inoculados .com as estirpes que produzem respe£ tivamente LT ou ST e com a estirpe H 10407 LT⁺/ST⁺ humana (Figura 10).

Só se alcançou forte protecção contra a estirpe

4* z 4*

LT /ST com uma dose de reforço p.o. total de 2 000 unidades antigenas. Em cada caso, o grau de protecção contra a estir pe LT /ST foi menor do que para a estirpe que produziu somente a toxina homologa simples.

Condiçães de conjugação para a vacina

As observações precedentes indicam que a vacina

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éptima deverá conter iguais proporções antigénicas de cada toxina componente. Mostrou-se na Secção 8, acima, que quando a relação de carbodiimida para a proteina conjugada total se mantém constante a 1,5:1 em peso, o aumento da relação mo lar inicial de ST misturada com a subunidade B produz um cori jugado final com progressivamente mais antigenicidade ST e menos antigenicidade da subunidade B.

Quando se fez variar a relação molar inicial de ST/subunidade B entre cerca de 60:1 até cerca de 75:1, verificou-se que uma relação de cerca de 70:1 deu como resultado um conjugado que consistia em 50% de cada toxina componente, em peso, e continha 460 unidades antigenas ST e 440 da subunidade B, por miligrama (figura ll). Todos os conjugados a seguir discutidos nesta secção foram preparados desta maneira. Em 5 lotes consecutivos o número médio de unidades antí genas por miligrama foi de 474 para a ST e da 460 para a sub unidade B, usando as proporções acima referidas.

Propriedades da vacina

(i) Imunoqenicidade

Para confirmar o facto de que a imunogenicidade dos componentes interligados da toxina em forma de vacina é a mesma dos componentes individuais, foram imunizados ratos com uma primeira imunização i.p. de 200 unidades antíqe nas ST seguida de doses graduais de reforço p.o. de ST dadas quer na forma de vacina quer associadas ao suporte PIG imuno logicamente não específico. Os resultados estão indicados na figura 12. Como se pode ver na Figura 12, a resposta de antitoxina e o grau de protecção contra a estirpe humana LT"/ST⁺ foram substancialmente idênticos em ratos imunizados com ambas as formas de ST conjugada.

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-88(ii) T oxicidade

Um ensaio com quantidades graduais (pelo teor proteico) de ST sozinha ou da vacina em ratinhos-bébé mostrou que a vacina continha 0,14 unidades-rato de actividade ST por micrograma, o que representou 0,08% do valor de 175 unidades-rato por micrograma de ST sozinha (Figura 13). Quari do quantidades graduais, quer da ST sozinha quer da vacina, foram ensaiados em ansa de ileum de rato, a ED^g da vacina, 2,6 microgramas, representou 0,08.% do valor de 2,0 nanogramas para a ST sozinha (Figura 14). A subunidade 8 sozinha tinha um ED_5Q de 95 nanogramas nas ansas de ileum o que representava 0,2% do valor de 0,19 nanogramas para a holotoxj. na LT, Hâ incerteza quanto à actividade secretória ser devida à própria subunidade B ou a uma manifestação ligeira de contaminação com LT.

Para averiguar se a componente subunidade B contribuía para a actividade secretória residual da vacina no ensaio com ansas de ileum de rato, foram ensaiadas doses gra duais de vacina, após inactivação pelo calor da subunidade B (ou o seu contaminante LT) expondo-a a 652C durante 1 hora.

A resposta secretória à vacina aquecida e não aquecida foi a mesma, excluindo assim o papel da subunidade B nesta resposta. Estas observaçães indicam que a toxicidade de uma dosagem de vacina contendo 1000 unidades antígenas de cada toxina componente consistiria no equivalente a 1,7 microgramas de ST não atenuada.

(iii)

Protecção contra estirpes humas e porcinas

Imunizaram-se ratos com uma primeira imunização i.p. de vacina contendo 200 unidades antígenas de cada toxina componente e 2 doses de reforço p.o., cada uma com 1 000 unidades antígenas de cada toxina componente. Isto fez levantar os títulos de antitoxina IgG de soro, em relação a ambas as toxinas componentes, de 3 vezes, e os títulos de

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antitoxina IgA da mucosa de 5 vezes em relação à ST e de 6 vezes em relação à subunidade B. Os ratos imunizados ficaram significativamente (P menor do que 0,00l) protegidos contra o ataque de estirpes viáveis humanas ou porcinas que produzam toxina LT ou ST, quer sozinhos quer em conjunto, como se mostra no Quadro 5, abaixo.

QUADRO 5

Resultados da inoculação em ratos imunizados com vacina interligada

Origem	T oxicidade	Estirpe	Serotipo	/ de Secreção Reduzida
Humana Porcina Humana Porcina Humana Porcina	LT+/ST" LT+/ST" LT+/ST+ LT+/ST+ LT"/ST+ LT‘/ST+	PB 257 P 263 H 10407 P 1362 Tx 452 P 987	015:H" 08:H19 O78:H11 0149:H b 078:H12 09 :H“	74 + 1 72 + 3 61 + 1 73 + 2 79 + 2 81 + 2

Notas:

a - Média +, erro médio padrão da percentagem de secreção re- duzida em ratos imunizados quando comparada com animais não imunizados inoculados de modo semelhante. Valores acima de 50/ representam uma diferença significativa (P menor do que 0,00l) entre os dois grupos.

b - A identificação completa deste serotipo foi duvidosa.

Administrou-se uma primeira imunização parentôrica a um grupo adicional de ratos por via subcutânea (s.c.) usan do alúmen como adjuvante, preparado como anteriormente se descreveu, para a imunização LT /"Klipstein et al., Infect. Immun. 37:1086-1092 (l982)_/. Por se ter verificado que este caminho necessitava o dobro da dosagem usada para a via

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-9 Οι.p, para uma eficiente primeira imunização LT, a dosagem s. c. da vacina administrada foi dobrada para 400 unidades antí genas; a dose p.o. manteve-se em 1000 unidades antígenas. Isto multiplicou pelo menos 5 vezes os titulos de antitoxina IgA da mucosa em relação a ambas as toxinas componentes e ofereceu protecção significativa contra o ataque, com secreção reduzida em 77 +_ 3/ contra a estirpe humana LT⁺/ST“, e em 71 +. 2% contra a estirpe humana LT~/ST⁺,

Os resultados acima indicam que, quando avaliada à maneira de Klipstein et al_e, Infect. Immun., 31:144-150 (1981) a antigenicidade da ST produzida sinteticamente é substancialmente a mesma da subunidade B. Foi essencial para esta comparação exprimir a dosagem da toxina conjugada em termos de unidades antígenas e não com base no peso.

Esta informação levou a modificar as condições de conjugação anteriormente usadas para interligar a ΞΤ sintética à subunidade B, Secção B supra, para produzir uma vaci na que contenha igual proporção antigénica de ST e subunida de B. A antigenicidade da componente ST sintética sob a forma de vacina mostrou-se ser idêntica à desta toxina quari do dada associada a um suporte de imunoglobulina não especí fica. A imunização de ratos com vacina, administrada naque las doses de unidades antígenas que se revelaram eficientes para cada uma das toxinas componentes quando dadas em separado, elevaram fortemente a resposta antitoxina a cada uma das toxinas componentes e ofereceram protecção significativa contra estirpes viáveis ETEC que produzam LT ou ST, quer sozinhas quer em conjunto. A observação de imunizações com ca da toxina componente dada em separado, indicou que a protecção dada pela vacina contra a estirpe LT⁺/ST⁺ podia ser atri buída a ambas as toxinas componentes.

Franz e Robertson relataram que os antisoros contra a ST porcina reagem com a ST de estirpes ETEC de origem porcina, bovina e humana Infect, Immun», 33:193-198 (1981^7

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-91Qs resultadas acima indicam que se pode obter protecção-cru zada com imunização com qualquer toxina qualquer que seja a sua origem. Assim, a imunização com a vacina inter-ligada contendo a subunidade B derivada da LT porcina, e a ST sintética baseada na estrutura da ST humana, forneceu protecção-igualmente forte contra as estirpes humana e porcina que produzam LT e ST.

No estudo acima a imunização foi dada por meio de uma primeira imunização parentérica seguida de doses de reforço p.o. porque se verificou anteriormente que no modelo animal rato (l) ê necessária uma primeira imunização parenté rica para se obter uma imunização de reforço p.o. de alta eficiência, (2) somente a imunização p.o. levanta os títulos da antitoxina IgA da mucosa e (3) somente se obtêm uma prolongada protecção quando é administrada uma dose suficiente p.o. que faça subir os títulos da IgA da mucosa de, pelo menos, 4 vezes. A imunização com a vacina interligada por este caminho, produziu aumentos desta ordem nos títulos de ant toxina IgA da mucosa, em relação a ambas as toxinas componeji tes. A via subcutânea (s.c.) e adjuvante de alúmen mostraram ser igualmente eficientes para imunização.

Mais detalhes dos estudos discutidos nesta secção (III C) podem ser encontrados em Klipstein et al., Infect. Immun,, 40:924-929 (1983), cujas revelações são aqui citadas para referência.

D. Imunização de St Sintética em Ratos e Coelhos

Os resultados acima discutidos (Secção III C) foram obtidos no rato usando imunizações i.p. seguidas de doses de reforço p.o.. Os resultados a seguir discutidos foram obtidos tanto em ratos como em coelhos usando a via per os de administração para ambas as imunizações, primária e de reforço.

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-92

Os resultados a seguir indicam que a via per os de imunização é tão eficiente como a via i.p.. Além disso faz-se notar que a vacina não causou diarreia em nenhum ani mal quando administrada p.o. nem causou secreção fluida quando instilada nas ansas do ileum da coelho.

Estudos em Ratos

(i) imunização i.p./p.o.

Ratos receberam uma primeira imunização com 200 AU (Antigen Units: unidades antígenasj ver Materiais e Métodos, Secção IV D) de vacina administrada i.p. com adjuvante completo de Freund (FCA) seguida de duas doses de reforço p.o. de 1 000 AU cada. Esta dosagem foi escolhida porque se mostrou (Secção C, supra) ser a quantidade mínima necessária para oferecer protecção significativa (P menor do que 0,00l) contra o ataque de estirpes viáveis que produzam qualquer forma de toxina. Esta imunização aumentou 4 vezes os títulos antitoxina no soro e pelo menos 6 vezes na mucosa para cada toxina componente da vacina (Quadro 6, a seguir) e forneceu um índice de protecção (Pi) de 3,4 contra o ataque da LT e /

de 4,0 contra o ataque da ST (Figura 15).

QUADRO 6

Resposta Antitoxina e Grau de Protecção em ratos Imunizados

Via de imunização !	Antitoxina a Ba	Antitoxina a ST	PI
Soro	Mucosa	Soro	Mucosa	Versus LT	Vereuã ST
i.p./p.o.	4	6	4	7	3,4	4,0

a - Os valores representam o factor de aumento no inverso da média geométrica do título em animais imunizados em. relação aos de controle.

b - PI = índice de protecção.

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(ii) Outros caminhos de Imunização

Para determinar a eficiência de outras vias parentêricas, adjuvantes e sistemas de entrega per os, foi dada a grupos adicionais de 4 ratos cada uma primeira imunização com 400 AU de vacina por via subcutânea (s.c.) usando alúmen como adjuvante tal como anteriormente se descreveu para a LT /~Klipstein et al., Infect, Iroroun., 37:1086-1092 (1982)_/; seguiram-se duas doses p.o. de reforço, cada uma de 1 000 AU, administradas quer 2 horas após cimetidina p.o. quer na forma de microesferas dependentes do pH sem pretratamento com a cimetidina. Quando inoculados com a estirpe Tx 452 LT“/ST⁺, cada um destes processos alternativos para imunizar produziu o mesmo grau significativo (P menor do que 0,00l) de secreção reduzida como o que se obteve usando a via i.p. com FCA seguida de doses de reforço p.o. administradas após a ci metidina. Estes resultados estão indicados no Quadro 7, a seguir.

QUADRO 7

Eficiência de vias alternativas, adjuvantes e sistemas de entrega da vacina ern ratos

Primeira imunização	Imunização de reforço	Protecção
Via/Adjuvante	Via/Protecção	Versus LT~/ST+a
i.p./FCA	p.o./cimetidina	79 + 2
s.c./alúmen	p.o./cimetidina	71 + 2
s.c./alúmen	p.o./microesferas	67 + 2

Nota:

a - Média +. erro médio padrão (SEM) de secreção reduzida (em percentagem) em animais imunizados quando comparados com controles não imunizados inoculados de modo semelhante. Valores superiores a 50% representam uma diferença signi ficativa (P menor do que 0,00l) entre os dois grupos.

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-94Estudos em coelhos

(i) imunização i.m./p.o.

Quatro coelhos receberam uma primeira imunização com 500 AU de vacina administrada intramuscularmente (i.m.) com FCA, seguida de duas doses p.o. de reforço de 1 000 AU cada. Isto fez aumentar de 5 vezes os títulos antitoxina no soro, e 4 vezes na mucosa, para cada componente da vacina. Os valores PI foram superiores a 9 contra o ataque quer da LT quer da ST. Esta informação está indicada na Figura 16 e no Quadro 8, a seguir

QUADRO 8

Resposta antitoxina e grau de protecção em coelhos imunizados

Via de imunização	Antitoxina con tra Ba	Antitoxina cojn tra ST	j PIb
Soro	Mucosal	Soro	Mucosal	vs LT	vs ST
i.m.c/p.o.	5	4	6	4	9,3	: 10,3
p·o./p.0 *	3	5	2	4	8,6	. 8 j 1 i

Notas:

a - Os valores são o factor de aumento no inverso da média geométrica do título em animais imunizados em relação aos de controle.

b - PI = índice de protecção.

c - i.m. = intramuscular

(ii) imunização p.o./p.o.

Quatro coelhos receberam imunização com 1 000 AU de vacina administrada p.o. em 3 ocasiões. Isto fez aumentar 4 vezes os títulos antitoxina na mucosa mas não no soro e forneceu forte protecção com valores PI superiores a 8 contra

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o ataque de qualquer das formas da toxina. Esta informação está também indicada no Quadro 8, supra.

Toxicidade da vacina

Estudos prévios (Secção III C) mostraram que a toxicidade da componente ST da vacina é reduzida atê 0,15% da toxina não atenuada. A dosagem de 1 000 AU de vacina conte ria assim o equivalente a 1,7 microgramas de ST não atenuada (0,15% vezes α componente de 50% de ST de 2,2 miligramas). A toxicidade desta dosagem de vacina e de quantidades maiores de ST não atenuada foi avaliada em animais não imunizados.

(i) A administração p.o. de 1 000 AU de vacina a oito coelhos e 20 ratos não produziu efeitos adversos como diarreia, e a instilação desta dosagem de vacina em quatro ansas de ileum em dois coelhos não provocou qualquer resposta fluída.

(ii) A administração p.o. de 250 microgramas de ST não atenuada, -a dois coelhos e a ratos não provocou diarreia. A instilação de 25 microgramas de ST não atenuada não causou qualquer secreção fluída nas ansas do ileum de quatro coelhos; foi necessária uma dosagem de 50 microgramas para dar uma relação positiva fluido/comprimento de 1,1 +_ 0,3 (média + SEM).

Os resultados do estudo acima estabelecem a eficiência de imunização com uma vacina preparada usando a ST sin têtica deste invento num modelo animal experimental, coelhos além de ratos. Demonstrou-se a protecção em ambos os modelos animais pelo uso da técnica das ansas de ileum. A aplicabilidade desta técnica à protecção, em condições em que to do o intestino intacto se encontra agudamente colonizado por estirpes enterotoxigénicas de E. coli, tem sido confirmada em ratos imunizados com LT /""Klipstein et al. , Infect. Immun. , 28:163-170 (l980)_7.

A mesma dosagem p.o. da vacina (l 000 AU) adminis62 226

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-96trada depois de uma primeira imunização parentêrica, resultou num grau de protecçao consideravelmente mais forte, como se manifesta através dos valores P.I., em coelhos do que em ratos. Esta diferença pode em parte ser atribuível ao intervalo mais comprido entre imunizações usadas nos coelhos (14 dias versus 4 dias nos ratos) e talvez a diferenças na sensibilidade ao ataque da toxina. Provavelmente também indica que os coelhos respondem melhor ã imunização com a vacina do que os ratos. Esta dosagem usada foi o mínimo considerado necessário para alcançar protecção significativa contra estirpes viáveis enterotoxigenicas em ratos (Secção C, supra).

0 facto desta dosagem ser também eficiente para ani mais experimentais maiores, dando-lhes forte protecção, apon ta para a sua utilidade no ser humano e no gado. Isto também é sugerido pelas observações de Svennerholm et al. que a dosagem de imunização p.o. de 500 microgramas de toxina de cólera, subunidade B, ê suficiente para obter uma resposta intestinal significativa de antitoxina IgA em voluntários humanos /~Lancet, 1:305-308 (l982)_7·

/

Os resultados do presente estudo indicam a imunização exclusivamente p.o. de coelhos com a vacina ST sintêtica-B obteve o mesmo elevado grau de protecção que o atingido por imunizações de reforço p.o. a seguir a uma imunização parentêrica.

Mais detalhes dos estudos discutidos nesta secção (III D) podem ser encontrados em Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893 (1983), cujas revelaçães são aqui citadas para referência.

E. Reactividade cruzada com Klebsiella ST Enterotoxina

A dmarreia epidemica entre crianças em infantários

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-97tem sido atribuído à Klebsiella pneumoniae. A enterotoxigenicidade de várias estirpes Klebsiella foi verificada em ensaios com filtrados de culturas livres de células em ansas de ileum de coelho, em ensaios na célula adrenal Y1 ou nos tecidos do ovário do "hampster" chinês para a toxina termo-lábil (LT) e no ensaio dos ratinhos-bébé, supra, para a to xina termo-estável (ST). As enterotoxinas Klebsiella LT e ST identificadas nestes ensaios não foram purificadas e desconhece-se a sua relação com toxinas semelhantes produzidas pela E. coli.

Klipstein et al., 3. Infect, Dis (1983) relatam a purificação da toxina ST aparente homogeneidade e referem-se à sua ca com a E„ coli ST. As revelações dessa aqui citadas para referência.

42:838-841 da Klebsiella até relação imunológipublicação são

Foram obtidas enterotoxinas naturais de estirpes Klebsiella ΤΞ 9 (serotipo 19), isoladas do intestino de um paciente portcriquenho com "sprue tropical" cujo filtrada de cultura tinha anteriormente mostrado ser capaz de provocar uma resposta positiva no ensaio dos ratinhos-bêbé, e foram também obtidas da estirpe da E. coli 18 D (Q42:H47), estirpe que só.produz ST, isolada das fezes de uma criança com diarreia aguda. As toxinas foram purificadas pelos métodos descritos por Staples et al., 3. Biol Chem., 255:4716-4721 (l980) para purificar ST humana da estirpe 18 D da E. coli.

Após três processos consecutivos de separação cromatográfica usada para purificação, a toxina resultante ficou purificada por um factor de 148 em relação ao material originalmente obtido, e a cromatografia em camada fina do ma terial purificado revelou uma só banda. A Klebsiella ST purificada foi tão potente como a E. coli ST no ensaio dos ratinhos-bébé, dentro dos limites de variação experimental para esse ensaio. Além disso, o tratamento da Klebsiella ST com

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-98

ditiotreitol 5χ10“⁴ molar durante 60 minutos eliminou a sua

actividade secretória no ensaio dos ratinhos-bêbé, como oco.r

re com a E. coli ST. Usando a técnica da dupla sanduíche

ELISA como se viu na Secção III A acima, IV A aqui a seguir

e em KliDstein et al., Infect. Immun. 39:117-121 (1983), ueque

rificou-se/a antigenicidade da Klebsiella ST era 69';a da da E» coli ST,

Devido às semelhanças funcionais entre a E. coli ST e a Klebsiella ST era interessante averiguar se a vacina que era eficiente contra a E. coli ST também oferecia proteç: ção contra a Klebsiella ST. Utilizou-se para estas imunizações a vacina contendo um conjugado da E. coli LT subunidade B e ST sintética como se descreve na Secção III D acima.

A ratos Sprague»Dauíley pesando entre 150 e 175 gra mas foi dada uma primeira imunização com a vacina contendo 200 unidades antígenas de ambas, ST e LT subunidade B, por via intraperitoneal com adjuvante completo de Freund. A isto seguiram-se, em intervalos de quatro dias, duas imunizações de reforço p.o. de 1 000 unidades antígenas cada, administra das duas horas depois da administração p.o, de cimedeina (TAGAMET'S' que se pode obter em Smith Kline e French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) a uma dosagem de 50 mg/kg de peso de corpo para eliminar a secreção gástrica.

Ratos de controle não imunizados e ratos imunizados, 4 a 6 dias depois da última imunização de reforço, foram inoculados por instilação de doses graduais de toxina ST nas ansas do ileum, durante 18 horas, como se descreve na Secção III D acima, Secção IV D e em Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893 (1983). Cada ponto dos dados relativos à secreção fluída (apresentados como média +. erro médio padrão) derivou da inoculação de 4 ou 5 ratos imunizados e de 5 ratos controle. 0 índice de protecção (Pi) foi determinado dividindo a dosagem de toxina, em animais imunizados, que produ-

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-9950% da dose efectiva (ED^g) em ani

ziu a mesma secreção que mais não imunizados, pelo valor nos animais não imunizados.

Os resultados desta determinação estão indicados graficamente na Figura 18 onde os dados relativos ao ataque da L. coli ST em ratos imunizados são os indicados na parte de baixo dos gráficos da Figura 15, enquanto que os dados relativos ao ataque com Klebsiella ST são os nascidos neste estudo. Como se pode ver, o índice de protecção (Pi) contra o ataque da L, coli ST foi de 4,0 enquanto que contra a Klebsiella ST foi de 2,6. Os resultados indicados no gráfico da Figura 18 mostram que a vacina contendo um conjugado sintético ST deste invento também oferece alguma protecção contra a enterotoxina ST produzida pela Klebsiella pneumoniae.

- Materiais e Métodos para a ST Monómera

Secção A

Produção da Enterotoxina

0 procedimento completo para a síntese e purificação da ST sintética usado não só aqui como nas seguintes sec ções, está descrito em detalhe na Secção II.

A ST biológica foi purificada até à homogeneidade a partir de filtrados de cultura da estirpe 18 D por uma mo dificaçâo /“Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (l982)_7 dos métodos descritos por Staples et al., supra.

As quantidades de toxinas foram baseadas na sua concentração proteica determinada pelo método de Lou/ry et al., J, Biol Chem. , 193:265-275 (1951).

Avaliação da Potência Secretória

A capacidade de doses graduais de toxinas causarem secreções foi avaliada pelos ensaios dos ratinhos-bébé e ansas

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-100—

do ileum do rato usando métodos publicados /""Giannella, Infect. Immun., 14:95-99 (1976) e Klipstein et al., Infect. Immun., 34:637-639 (l98l)_7. Uma unidade-rato (MU) no ensaio dos ratinhos-bébé é definida como a quantidade de toxjL na que produz uma relação em peso de vlsceras/carcassa de pelo menos 0,083.

Produção de flntisoro Hiperimune

Em cabras e coelhos produziu-se antisoro hiperimune contra a ST biológica como anteriormente se descreveu /"""Klipstein et al., Infect, Immun., 37:550-557,(l982)_7. As sociou-se ST sintética a imunoglobulin G porcina (PIG) mistij rando ST com PIG numa relação molar de 100:1, usando uma relação em peso de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida/ /proteina do conjugado total de 2:1, num tampão de fosfato 0,1 molar, pH 7,0, durante 18 horas, a 4SC. Este conjugado continha 47% ST em peso e 98% ST em moles. A ST conjugada retinha 73% da sua antigenicidade, determinada pelo ensaio "Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) usando antisoros hiperimunes, de cabra e coelho, contra a ST biológica numa técnica de dupla sanduíche anteriormente descrita /""Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982)J· θ conjugada continha assim 343 unidades antigenas (derivadas de multiplj. car a percentagem de ST presente em peso, pela percentagem da sua antigenicidade) por miligrama de proteina. Os animais foram imunizados intramuscularmente com adjuvante completo de Freund (FCA) para a primeira imunização e com adjuvante incompleto de Freund para a imunização de reforço dada um mês mais tarde. As cabras receberam 1 100 seguidas de 2 300 unidades antigenas ST, e os coelhos receberam 300 seguidas de 500 unidades antigenas ST.

Imunização e Inoculação de Ratos

Ratos bébé Sprague-Daiuley foram imunizados com con

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jugado de ST sintética/PIG por meio de uma primeira imunização intraperitoneal de 350 unidades antígenas ST dada com adjuvante completo de Freund, seguida, a intervalos de 4 dias, de duas doses p.o. de reforço contendo 700 unidades ari tígenas ST cada, que foram administradas 2 horas depois da administração p.o. de cimetidina para eliminar a acidez gástrica. Cinco dias depois da última dose de reforço, foram inoculadas pela instilação durante 18 horas num só ansa fechada de ileum, de concentrações que provocam secreção máxima em ratos não imunizados: 5 nanogramas quer da ST sintétj.

ca quer da biológica e 0,1 ml de um caldo de cultura conten9

do 10 organismos viáveis por mililitro da estirpe Tx 452 (Q78:H12) da E. coli humana que produz ST. Cinco ratos não imunizados e três ratos imunizados foram inoculados com cada um destes materiais de ensaio. Os valores estão expressos como médias +. erros médios padrão da secreção reduzida, em percentagem, em ratos imunizados quando comparadas com os controles não imunizados; em cada caso mais do que 50/ de secreção reduzida representa uma diferença significativa (P menor do que 0,00l) entre os dois grupos, de acordo com o teste-t de Student para duas médias independentes.

Resposta antitoxina ã imunização

Na altura da inoculaç-jao, as lavagens de soro e de mucosa são processadas como anteriormente se descreveram /""Klipstein et al., Infect, Immun. , 37:1086-1092 (l982)_/ e ensaiadas pela técnica ELISA, em dupla sanduíche, na qual ari tisoro hiperimune de cabra contra a ST sintética, foi usado como fase sólida e a ST sintética foi usada como antígeno. Klipstein et al., Infect. Immun. , 37:1086-1092 (1982) verifj. caram que em ratos imunizados de modo semelhante com LT sé podiam ser detectadas a antitoxina da imunoglobulina G (igG) do soro e a antitoxina da imunoglobulina A (IgA) da mucosa, portanto, a antitoxina contra a ST sintética foi avaliada sé para estas duas classes de imunoglobulina usando IgG antirato

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do coelho juntamente com antisoro anticoelho da cabra conjugado à fosfatase alcalina para as amostras de soro, e IgA s_e cretório antirato da cabra juntamsnte com antisoro anticabra do coelho conjugado à fosfatase alcalina (Miles Research La boratories, Elkhart, Indian) para as amostras da mucosa. Os valores citados são a média geométrica dos titulos em 9 ratos imunizados e em 5 ratos de controle não imunizados.

Secção B

Preparação de Enterotoxina

A holotoxina LT purificada foi preparada pelos métodos descritos por Clements e Finkelstein, Infect. Immun», 24:760-769 (1979) a partir da estirpe 711 (FILT) da E, coli, uma derivada transformada da K-12 portadora do(s) gene(s) LT do plasmldio Ent da estirpe porcina P307. A subunidade B foi separada da holotoxina LT pelas técnicas cromatogréficas descritas por Clements et al., Infect. Immun., 29:91-52 (1980). A homogeneidade da toxina LT e da sua subunidade B foi confirmada por electroforese de gel poliacrilamida como descrito por Clements e Finkelstein, supra.

A 5T biológica obtida pelo crescimento da estirpe " 18 D (042:H47) da E. coli do homem, foi purificada pelos métodos descritos por Staples et al., supra, com a modificação de que a purificação final até à homogeneidade foi obtida por eluição na cromatografia por camada fina, como descrito por Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982). A ST sintética, consistindo na mesma sequência de 18 amino-áçi dos descritos por Chan el at., supra, para a obtenção de ST pura por crescimento da estirpe 18 D, foi preparada usando um sintetizador de péptidos Beckman modelo 990 B (Beckman Instruments Co, Irving, Ca) pelos métodos descritos na Secção II. Verificou-se que a toxina sintética era substancial, mente idêntica à obtida por técnicas de cultura (ST biológica) em termos de potência secretória, no ensaio dos ratinhos-bêbé, e de antigenicidade determinada pelo ensaia imunoadsoj?

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-103uente ligado a enzimas (ELISA) e por seroneutralização da a_c tividade secretória, no ensaio dos ratinhos-bébé, pelo antisoro hiperimune quer à toxina sintética quer à biológica, Secção III, acima,

A quantidade usada de toxinas, expressa em peso, foi baseada na concentração proteica determinada pelo método de Loiury et al., supra. Os equivalentes molares vieram de valores publicados de um peso molecular de 91 450 daltons p_a ra LT /""" Clemente et al., Infect. Immun., 29:91-97 (l9B0)__7, de 57 400 para as 5 subunidades B polímeras ("polymeric 5 B subunits") /^-Gill et al., Infect.'Immun., 33:677-682 (l981_7 e 1972 daltons para ST, Staples et al,, supra.

Radio-iodação da ST

A ST sintética foi radio-iodada pelo método cloramina-T de Hunter, Proc. oc. Exp. Biol. Med. , 133:989-992 (1970) usando processos anteriormente descritos, para a ST biológica pura, por Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982).

A toxina radiomarcada continha 3x10⁵contagens por minuto e 71 unidades-rato por micrograma (versus 175 unidades-rato por micrograma para a toxina não marcada), determinado pelo ensaio dos ratinhos-bébé no qual uma unidade-rato é definida como a quantidade que produz uma relação peso dos intestinos/ /peso da carcassa de pelo menos 0,083.

Conjugação

A ST foi conjugada quer com a LT quer com a subuni dade B juntando l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) a misturas das to xinas em tampão de fosfato 0,1 molar, a pH 7,0, durante 18 horas a 4SC. 0 conjugado foi então exaustivamente dialisado contra água durante 48 horas a 4SC usando um saco de diálise para isolar um peso molecular de 12 000, saco que reteve toda

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a LT (ou a subunidade S) e a ST conjugada mas não a ST não conjugada nem a EDAC. Repetidas determinações mostraram que a diálise contra água quer da LT quer da subunidade B so zinha, resultava numa perda de 10% devida a precipitação. Portanto a quantidade de ST conjugada baseou-se no incremento da proteína Loiury presente no dializa^do em excesso de 90% da quantidade inicialmente junta quer de LT quer de subunida de B. A quantidade de ST conjugada radio-iodada foi acertada por comparação da radio-actividade dos conjugados finais, com a inicialmente fornecida, usando um contador auto-gama vendido sob o nome comercial PRIAS^J PGD da Packard Instrument Co., Doiuners Grove, IL.

Propriedades do Conjugado

A não ser que se especifique de outro modo, a concentração de cada conjugado foi ajustada de modo a representar 100% da toxina específica ensaiada em estudos que comparam as propriedades das toxinas conjugadas com as da toxina não atenuada. A toxicidade LT foi comparada ensaiando séries de diluições (2 X) ds LT sozinha e na forma conjugada, no ensaio da célula adrenal Y1 de Sack et al., Infect. Immun., 11: :334-336 (1975). A toxicidade ST foi comparada estabelecendo a dose mínima efectiva de séries de diluições de ST sintética sozinha, ou em forma conjugada no ensaio dos ratinhos-bêbê de Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982).

A antigenicidade foi determinada por meio de ELISA. 0 antisoro hiperimune monoespecífico de cabra, quer contra a LT quer contra a subunidade B da cólera /"Clements et al., Infect. Immun., 29:91-97 (l980)_/ foi usado com antisoro anti-cabra do coelho, conjugado com fosfatase alcalina (Miles Research Laboratories, Elkhart, Ind.). Para a ST, o antisoro hiperimune contra a ST biológica pura quase desenvolveu em cabras e coelhos como anteriormente se descreveu /"Klipstein et al», Infect. Immun., 37:550-557 (l982)_/, foi usado

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na. técnica da sanduíche dupla ac mesmo tempo que o antisoro anti-cabra do coslho conjugado à fcsfatase alcalina; os va lares dos conjugados foram comparados aos da ST sintética neste ensaio. Começando em 10 microgramas, foram feitas d_i luições em série (2 X) dos conjugados e da toxina em causa.

A concentração a que estas preparações deram uma adsorváncia de 0,600 a 410 nanometros, foi usada para comparar a antigenicidade da toxina nas formas conjugada e não atenuada.

Processos de Imunização

A ratos foi dada uma primeira imunização intraperitoneal (i.p.) usando o adjuvante completo de Freund, segui, da de duas doses de reforço per os (p.o.) com 4 dias de intervalo. A imunização p.o. foi dada via tubo intragástrico 2 horas depois da adrninis traçãn p. o. de cimetidina (vendida sob a marca comercial TAGAMET\y por Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico), a urna dosagem de 50 mg/ /kg de peso de corpo para eliminar a secreção gástrica.

Processos de inoculação

Ratos foram inoculados uma semana depois da última dose de reforço, pela instilação do material em ensaio numa só ansa fechada, de 10 cm de ileum durante 18 horas como a_n teriormente descrito /~K1ipstein et al., Infect. Immun,, 31: :144-150 (l98l) e 32:1100-1104 (l98l)J7. Estudos anteriores estabeleceram uma correlação entre uma significativa protecção neste sistema de ensaio e a alcançada em ratos imunizados atacados por contaminação intestinal do intestino intacto /""Klipstein et al., Infect. Immun. , 28:163-170 (l980)_/. As doses de ataque foram as que provocaram secreção máxima em animais não imunizados: 0,5 nanograma de LT, 5 nanogramas da ST sintética ou da ST biológica e 0,1 mililitro de caldo de culturas contendo 10 organismos viáveis por mililitro de LT⁺/ST" estirpe PB-258 (015:H~), LT⁺/ST⁺ estirpe H-10407

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-106(078:Hll) e LT"/ST⁺ estirpe Tx 452 (078:H12). Cada ponto da informação foi determinada a partir de 3 a 5 ratos imunizados e os valores citados são a média jh erro médio padrão (SEM) do grau de secreção reduzida em ratos imunizados, em relação ao valor determinado a partir de 5 ratos não imunizados igualmente atacados. Uma secreção reduzida de 50% foi significativa (P menor que 0,00l) para cada material de ataque, em face do _t-teste de Student para duas médias independentes.

Resposta antitoxina

Os títulos de antitoxina do soro e mucosa contra a ST sintética e subunidade B, componentes da vacina, foram de. terminados nas lavagens do soro e mucosa de ratos imunizados pelo método ELISA usando técnicas descritas nos estudos ante, riores, mostraram que a resposta antitoxina de ratos imunizei dos com LT por via i.p./p.o. está confinada à da associada com soro IgG e mucosa IgA /"Klipstein et al·, Infect. Immun., 37:1086-1092 (l982)_/. Por esta razão, no presente estudo só foram ensaiadas toxinas destas classes de imunoglobulina. Para a antitoxina contra a subunidade B, a subunidade B foi usada como fase sólida; para a antitoxina contra a ST sintê tica foi usado como fase sólida o antisoro hiperimune contra a ST sintética produzido numa cabra e a ST sintética foi usa. da como antígeno na técnica da dupla sanduíche. Para as amostras de soro, adicionaram-se IgG anti-rato de coelho e anrisoro anticoelho de cabra conjugado com fosfatase alcali na; para as lavagens de mucosa, usaram-se IgA secretário anti-rato de cabra e antisoro anti-cabra de coelho, conjuga dos com fosfatase alcalina (Miles Research Laboratories, Elkhart, Inc.), Os valores citados referem-se ao aumento do inverso da média geométrica do titulo em amostras de 5 ra tos imunizados ern relação a 5 ratos de controle não imunizados. Os titulos de antitoxina nos animais de controle foram de 1:2 quer contra a ST quer contra a subunidade B em todas

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as amostras, excepto o titulo do soro contra a ST que foi de 1:4.

Secção C

Preparação da vacina

Preparou-se holotoxina LT purificada a partir da estirpe 711 (FILT) da E. coli, uma derivada transformada da K-12 portadora do(s) gene(s) LT do plasmídeo Ent da estirpe P307 porcina, e foi separada nas suas subunidades por técnicas cromatogrãficas como se viu na Secção B. fl ST sintética, constituída pela mesma estrutura dos 18 primeiros aminoácidos, descrita por Chan et al., supra, da ST pura obtida por purifi. cação de culturas da estirpe 18D, foi preparada de acorde com a Secção II, supra.

A quantidade usada de toxinas baseou-se nas suas concentrações proteicas determinadas pelo método de Louiry et al., supra; os seus equivalentes molares foram obtidos de valores publicados referentes a um peso molecular de 57 400 daltons para a forma polimêrica de cinco unidades B e 1972 daltons para a ST, como se viu na Secção B.

A ST conjugada à subunidade B juntando l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (Sigma Chemical Ca., St. Louis, MO); numa relação em peso de 1,5:1, à proteina total de misturas com várias relações molares de toxinas, num ta_m pão fosfato O,1M, a pH 7,0, durante 18 horas a 4QC; o conjugado foi então exaustivamente dializado contra água e processado depois como se descreve na secção B, acima.

Propriedades da vacina

A antigenicidade das toxinas componentes na vacina foi determinada por meio do ensaio ELISA acima descrito na Secção 8. Para a subunidade B usou-se antisoro hiperimune

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-108monoespecífico da cabra, contra a subunidade B da LT humana, com antisoro anti-cabra do coelho conjugados com a fosfatase alcalina (Miles Research Laboratories Elkhart, Ind,). Para a ST usou-se antisoro hiperimune contra a ST sintética dese£ volvida em cabras e coelhos (Secção IV, A, acima) numa têcni ca de sanduiche dupla simultaneamente com antisoro anti-cabra do coelho conjugado com fosfatase alcalina. Começando com 10 microgramas, fizeram-se diluições (2 X) em série dos conjugados e da toxina em causa. Compararam-se as concentra ções às quais o conjugado e a toxina deram uma adsorv&ncia de 0,600 aos 410 nanómetros e exprimiu-se o valor do conjuga do como percentagem do da toxina não atenuada. A percentagem de antigenicidade vezes 1 000 deu o valor em unidades ari tígenas por miligrama de vacina.

A toxicidade residual da vacina foi determinada comparando os valores, para a ST e para a vacina, da (i) dose mínima efectiva no ensaio dos ratinhos bêbé, no qual se define uma unidade-rato como sendo aquela quantidade que dã uma relação, em massa, de visceras/carcassa de pelo menos 0,083 e (ii) ED,-g (dose que produz metade da secreção máxima) em ansas fechadas de ileum de ratos não imunizados.

Conjugação 5T

Nos casos em que os ratos foram imunizados com ST sintética sozinha, a toxina estava associada a imunoglobulina G porcina (PIG) numa relação molar de toxina/PIG de 100:1 e a relação em peso de carbodiimida para a proteina total conjugada era de 1:1. Este conjugado continha 46/ de ST, em peso, e tinha 470 unidades antigenas ST por miligrama.

Processos de Imunização

A não ser que se especifique de outro modo, aos ratos foi dada uma primeira imunização intraperitoneal (i.p.)

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usando o adjuvante completo de Freund seguida de duas doses de reforço per orais (p.o.) em intervalos de 4 dias. A imu nização perorai foi dada via tubo intragástrico 2 horas depois de administrar cimetidina (vendida sob o nome comercial TAGAMETvy por Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) com uma dosagem de 50 miligramas/quil£ grama de peso de corpo, para evitar a secreção gástrica.

Processos de Inoculação

Os ratos foram inoculados, 4 a 6 dias depois da úl

tima dose de reforço, por instilação numa única ansa de 10

centímetros, fechada, do ileum distai, durante 18 horas, de 9

0,1 ml de caldo de culturas contendo 10 organismos viáveis por mililitro. Cada ponto da informação final foi obtido de 3 a 5 ratos imunizados e os valores citados representam a média +. erro médio padrão do grau de secreção reduzida em ratos imunizados quando comparada com a de 5 ratos não imuni zados inoculados com os mesmos organismos. A secreção reduzida quando superior a 50% é considerada como forte protecção pois que para cada caso foi significativa (P menor do que 0,001) pelo ensaio jt de Student para duas médias independentes.

Resposta antitoxina

Os títulos das antitoxinas do soro e mucosa foram determinados por ELISA por técnicas já descritas na Secção B. Para a antitoxina contra a subunidade B, usou-se a subunidade B como fase sólida; para a antitoxina contra ST, foi usado como fase sólida o antisoro hiperimune de cabra contra a ST sintética e usou-se ST sintética como antigeno na tácnica da sanduíche dupla. Como os estudos anteriores mostraram que a imunização com LT administrada por i.p./p.o. levanta apenas os titulos das antitoxinas IgG do soro e IgA da mucosa /"~Kli pstein et al., Infect. Immun., 37;1086-1092 (l982)_7 só foi

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avaliada a antitoxina destas classes de imunoglobulina. Para as amostras de soro, juntou-se antisoro anti-coelho de ca bra e IgG antirato de coelho conjugados à fosfatase alcalina (Miles Research Laboratories, Elkhart, Ind.). Os valores ci. tados referem-se ao aumento do inverso da média geométrica do título em 5 ratos imunizados sobre o de 5 ratos de contro le não imunizados.

Secção D

Preparação da vacina

Preparou-se holotoxina LT purificada a partir da estirpe 711 (FILT) da E„ coli, uma derivada transformada K-12 portadora do(s) gene(s) LT do plasmídio Ent da estirpe porei na P307, e separou-se nas suas subunidades por técnicas cromatogrâficas como se referiu na Secção Β. A homogeneidade da holotoxina LT e da sua subunidade 8 foi também confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida como se viu na Secção Β. A ST sintética, constituída pela mesma estrutura dos primeiros 18 amino ácidos, do polipêptido descrito por Chan et al., supra, continha três ligações intramoleculares cistina dissulfureto. A ST sintética era aquele produto cuja preparação específica foi dada na Secção II, acima. 0 proces^ so de conjugação usado foi o mesmo que o discutido na Secção III com excepção da relação molar de ST sintêtica/subunidade B que foi de 70:1.

Propriedades da vacina

As propriedades da vacina foram determinadas como na Secção III C. As concentrações às quais a vacina e as não atenuadas ST e subunidade B deram uma absorvância de 0,600 a 410 nanémetros, foram comparadas e o valor de cada componente da vacina foi expresso em percentagem do da mesma toxina em forma não atenuada. A percentagem da antigenicida

···:

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de vezes 1 OOO deu o valor etn unidades antígenas (AU) por mg na vacina. A vacina usada continha 450 AU de cada toxina componente por mg de proteína e as doses de imunização descritas como 1 000 AU continham esta quantidade de antiqe nicidade para cada toxina componente em 2,2 mg de vacina.

Processos de imunização

A não ser que se especifique de outro modo, os ratos receberam uma primeira imunização intraperitoneal (i.p.) usando o adjuvante completo de Freund (FCA), seguida quatro dias mais tarde por duas doses p.o. de reforço dadas em intervalos de 4 dias. A imunização perorai foi dada via tubo intragástrico duas horas depois da administraçãoo.o. de ci metidina (vendida sob a marca comercial TAGAMLTvíx por Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) numa dosagem de 50 mg/kg de peso de corpo, para eliminar a secreção gástrica. Quando administrada p.o. sob a forma de micro esferas, encapsulava-se 1 000 AU de vacina por técnicas bem conhecidas, usando hidroxipropilmetilceluloseftalato (compos_ to HP-50, Sinetsu Chemical, Tokyo, Oapan) como revestimento sensível ao pH,

Coelhos receberam uma primeira imunização quer por via intramuscular (i.m.) usando FCA ou p.o. usando tubo intragás tricoseguiu-se, duas semanas mais tarde, a administração de duas doses de reforço dadas com duas semanas de ijn tervalo. Ambas as imunizações p.o. foram precedidas, 2 horas antes, por uma injecção i.m. de 30 mg de cimetidina.

Resposta antitoxina

Na altura da inoculação, as lavagens do soro e mucosa das ansas inoculadas foram processadas /“Klipstein et al., Inf ect. Immun., 37:1086-1092 (l982)_7 e determinaram-se os títulos de antitoxina por ELISA usando técnicas citadas

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-112na Secção 8. Para a antitoxina contra a subunidade B, usolj -se a subunidade B como fase sólida; para a antitoxina con tra ST usou-se como fase sólida o antisoro hiperimune de ca bra contra a ST sintética e a ST sintética foi usada como antígeno na técnica da sanduíche dupla. Como os estudos a_n teriores, usando LT como antígeno, mostraram que a imunização ip/po levanta somente os titulos de antitoxinas de soro com imunoglobulina G (IgG) e de mucosa com Iga /"Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (l982)_7, só foram avaliadas as antitoxinas destas classes de imunoglobulina. Os valores citados representam □ aumento do inverso da média geométrica do título em 4 ou mais animais imunizados, sobre o de 5 animais de controle não imunizados, excepto para os soros de coelho onde foram comparadas amostras pre- e post-imunização, do mesmo animal.

Processos de inoculação

Animais imunizados foram inoculados 4 a 7 dias depois da última imunização de reforço pela instilação de doses graduais quer de ST quer de LT em ansas fechadas do ileum, durante 18 horas, como anteriormente foi descrito por Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (l98l); Sack, Infect. Immun., 8:641-648 (1973). A toxina foi instilada, em 0,5 ml de soro normal, numa só ansa de cada rato e, em 1,0 ml de caldo de soja Trypticase (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) em atê 10 ansas de cada coelho. Os valores apresentados para cada ponto da informação sobre secreção fluída representam a média +. erro médio padrão (SEM) de 3 a 5 ratos de controle e imunizados e em ansas de 6 coelhos de controle e 4 coelhos de cada grupo de imunização. 0 índj. ce de protecção (Pl) foi determinado dividindo aquela dosagem de toxina em animais imunizados que provocam a mesma secreção que a dose 50% efectiva (ED_5Q) em animais não imuniza dos, pelo valor em animais não imunizados.

Foram também inoculados ratos com 0,1 ml de um cald

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g

de cultura contendo 10 organismos viáveis da estirpe Tx 452 (Q78:H12) da LT“/ST⁺ por ml. Os resultados exprimem-se como média +. SEM da percentagem de secreção reduzida em ratos imu nizados quando comparada com o valor em 5 animais de controle não imunizados inoculados de modo semelhante, A diferença estatística entre a secreção nos grupos imunizados e os de controle foi determinada pelo ensaio t de Student para duas médias independentes.

V - Utilização da ST multimera

Ligaram-se moléculas ST multímeras, preparadas como acima, a uma molécula de suporte, em determinações também conduzidas sob a direcção do Dr. Frederick A, Klipstein, supra. Os resultados dessas determinações são discutidos a se guir.

A. Vacinas Contendo Moléculas ST Monómeras e

Multímeras

prepararam-se três vacinas. A primeira continha ST sintética monómera (aqui por vezes referida como M-ST), a / segunda continha ST dímera de multimeros cabeça-a-cauda, por vezes aqui referida como ST/ST enquanto que a terceira vacina a ST polímera cujas unidades de repetição estão ligadas entre si por ligações intramoleculares, interpolipêptido cis tina dissulfureto, aqui por vezes referida como P-ST. A síntese de cada um dos produtos acima referido foi descrita na Secção II. Cada uma das moléculas de ST foi ligada à subuni dade B da toxina termolábil (LT) da E. coli como se viu na secção VI A.

Propriedades das Preparações de ST Sintética

Quando analisada pela técnica ELISA usando antisoros hiperimunes contra um conjugado de M-ST, a antigenicidade

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-114da ST/ST não conjugada foi 3 vezes maior e a antigenicidade da P-ST não conjugada foi 15 vezes maior do que a M-ST não conjugada. Os gráficos da Figura 19 ilustram os resultados das antigenicidades destas determinações.

Quando se analisaram pelo ensaio dos ratinhos-bábô quantidades graduais de cada preparação de ST, os valores pa ra uma unidade-rato foram de 5,7 nanogramas para a M-ST, 45 nanogramas para a ST/ST e 18,2 nanogramas para a P-ST. Assim, a ST/ST livre tinha 1,3% da potência secretória da M-ST, enquanto que a P-ST tinha 31% da potência secretória da M-ST.

Conjugação com a subunidade B

Cada uma das três preparações de ST sintática foi interligada à subunidade B de LT usando uma relação molar inicial variável de ST/subunidade B. As antigenicidades dos conjugados assim preparados estão ilustradas pelos três gráficos da Figura 20 como função da percentagem em peso de toxina e também da relação molar inicial das duas toxinas no conjugado. Note-se que interligar ("crosslinking") uma toxj.

i

na a um suporte ê diferente de interligar um polip_>ptido por ligação interpolipêptido cistina dissulfureto.

Os conjugados que continham porções em peso iguais de ST e de subunidades B foram obtidos de reacções em que as relações molares iniciais de ST/subunidade B foram de 45:1 para a M-ST e de 40:1 para a ST/ST. Não foram utilizadas re laçÕes de P-ST/Subunidades B suficientemente grandes para obter este conjugado.

A antigenicidade das toxinas não foi afectada pela reacção de interligação de modo que o conjugado M-ST—subuni dade B que continha proporções iguais em peso de cada toxina componente tinha 500 unidades antígenas de cada componente. Em contraste, os conjugados das preparações ST hiperantigéni

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-115cas (ST/ST e P-ST) com proporções aproximadamente iguais de unidades antígenas de cada toxina componente continha apenas 25/ de ST/ST e 9/° de P-ST, em peso.

Como a proporção em peso de subunidade B era maior à medida que o peso de ST baixava, a quantidade de unidades antígenas 8 era máxima nos conjugados que continham o mínimo de ST. Entre os conjugados que continham proporções iguais de unidades antígenas de cada toxina componente, a vacina M-ST tinha 500 unidades antígenas por miligrama, a vacina ST/ /ST continha 725 unidades antígenas por miligrama e a vacina P-ST tinha 9QQ unidades antígenas por miligrama de cada tox.i na componente.

A toxicidade residual de vacinas preparadas a partir das duas operações de ST multimera era 10 vezes menor do que a da vacina preparada com M-ST. Isto foi atribuída prin cipalmente ao facto destas vacinas conterem quantidades mais pequenas de ST.

Ainda que as preparações de ST multimera fossem inicialmente menos tóxicas do que a M-ST, as suas toxicidades eram também menos fortemente atenuadas pela reacção de inte_r ligação conjugante. Assim a toxicidade de cada preparação de ST foi comparada com o seu valor original; a toxicidade da M-ST foi reduzida 727 vezes pela reacção de interligação, a da P-ST foi reduzida 256 vezes e a da ST/ST foi reduzida apenas 44 vezes. No Quadro 9 mostram-se várias propriedades destas vacinas.

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jiãmian

-116QUADRO 9

Propriedades de vacinas Inter-Liqadas Obtidas Usando a Subunidade 3 e

Diferentes Preparações de ST Sintética

Reacção	de conjugação		Uacina		1000 AU	de Uacina
	Molar*3	Peso	p/ p	AU/mg	ld	Quantidade	ToxicidadeO.
STa	ST:B	ST	B	ST	B	Uac0	STr	ST
H-ST	45;l(0,5)	52	48	510	500	2,00	1040	900
ST/ST	20:1(0,7)	25	75	849	737	1,38	345	97
P-ST	10:1(0,9)	9	91	1300	917	1,11.	100	108

Notas:

a - Preparações de ST no conjugado. M-ST=ST sintética monómera;

ST/ST = ST multímera sintética dimera, de cabeça-a-cauda; P-ST = = ST polímera contendo ligações interpolipéptido cistina dissulfureto.

b - Relação molar inicial da preparação ST/subunidade B da LT. Os valores entre parêntesis mostram a relação em peso de glutaraldeidc para proteina total na reacção.

c - Percentagem relativa, em peso de cada toxina em cada conjugado.

d - Unidades antígenas (AU) de cada toxina por miligrama de vacina conjugada.

e - Quantidades de vacina conjugada em miligramas necessária para fornecer 1 000 AU de cada toxina componente.

f - Quantidade de ST em microgramas contida numa vacina conjugada que forneça 1 000 AU de cada toxina.

g - Quantidade equivalente de potência secretória ST não atenuada, em nanogramas, determinada pelo ensaio dos ratinhos-bébô numa vacina conjugada contendo 1 000 AU de cada toxina.

Imunização de Ratos com Vacinas ST—Subunidade B

Imunizaram-se grupos de ratos com duas vacinas:

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-117(i) M-ST interligada, a uma relação 70:1 para a subunidade B, pela reacção da carbodiimida como atrás se descreveu e na Secção IV B para obter um conjugado que continha 51 por cento de M-ST e 49/ de subunidade B, em peso, com 450 unid,a des antigenas de cada toxina componente por mg; e (ii) P-ST interligada, a uma relação molar inicial de 10:1, à sub unidade B pela reacção da glutaraldeido (discutida na Secção VI A) para dar um conjugado que continha 9% de P-ST e 91/ da subunidade B, em peso, e que continha 1 300 unidades antígenas de M-ST por mg e 917 AU de subunidade B. por mg. As dosagens usadas basearam-se na quantidade de unidades antigenas de M-ST por mg de cada vacina. Todos os ratos receberam uma primeira imunização com 200 unidades antigenas M-ST e do. ses variáveis de imunizações de reforço per os (p.o.) tais que as dosagens totais p.o. variaram entre 500 e 3 000 unida des antigenas M-ST.

A resposta aos conjugados de M-ST e P-ST contendo vacinas foi idêntica quando se expressou a imunização p.o. total em unidades antigenas M-ST como resulta do exame da Figura 21A, Quando se expressa como imunização total p.o., cada vacina fez aumentar, de modo semelhante e dependente da dose, a resposta antitoxina M-ST IgA da mucosa, e observou-se um grau semelhante de protecção contra a inoculação com LT /ST⁺ viável de E. coli.

Havia contudo uma diferença chocante quando as dosagens p.o. eram expressas com base na quantidade, em peso, de ST administrada. Assim, o exame da Figura 21 B ilustra que a P-ST foi marcadamente mais eficiente, isto á, a dose p.o. de conjugado P-ST necessária para dar 50% de secreção reduzida em ratos inoculados foi de 70 microgramas o que á 15 vezes menos do que 1 050 microgramas do conjugado M-ST necessário para dar aquele resultado.

Qs resultados acima mencionados no Quadro 9 e na Figura 21 ilustram várias caracteristicas do presente invento.

Primeiro, ambas as preparações de ST multímera mostraram uma antigenicidade, em peso, melhorada em relação à ST monómera. Depois, ambas as preparações mostraram, no ensaio dos ratinhos-bêbê, toxicidade reduzida como moléculas livres e como conjugados com a subunidade B da LT. A preparação altamente antigénica P-ST produziu uma vacina com maior potência antigênica mas com toxicidade substancialmente idêntica à da vacina derivada da ST/ST, A vacina P-ST—Subunidade B tinha quâsi duas vezes a potência antigénica de ambas as toxinas componentes (ST e subunidade B) mas apenas cerca de um décimo da toxicidade ST residual da vacina M-ST--Subunidade B.

Ainda mais, a quantidade (380 microgramas) de P-ST necessária para fazer uma vacina contendo 1 000 unidades antígenas de cada toxina componente foi cerca de um quarto da quantida^ de (l 490 microgramas) de M-ST necessária para preparar tal vacina.

E também importante notar que a antigenicidade das preparações de ST multímera, determinadas por ELISA, está re lecionada com a sua imunogenicidade como se verifica pela sua eficiência ern aumentar a resposta antitoxina e em oferecer protecção contra a inoculação em animais experimentais imuni zados. Como a antigenicidade da ST em conjugados ê função tanto da proporção da ST no conjugado como do grau de antiqe nicidade resultante da reacção de conjugação interligada, a expressão da dosagem do conjugado numa base de peso não fornece informação significativa a menos que se meça directamejn te a antigenicidade. Quando a antigenicidade da ST é determinada por uma avaliação directa do conjugado usando uma têjc nica ELISA e expressa em unidades antígenas, então a imuniz^ ção com M-ST, conjugada quer com a subunidade B quer com um suporte proteico imunologicamente não específico, produz uma resposta dependente da dose dos níveis anti-toxina da mucosa e qm grau de protecção contra a inoculação com estirpes viáveis produzidos por toxinas /""Klipstein et al., Infect. Immun,, 40:924-929 (l983)_7.

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Os resultados acima mostram ainda que a imunização quer com a vacina M-ST quer com a P-ST suscita uma resposta idêntica quando as dosagens são expressas em unidades antígje nas M-ST. Aquelas observações também confirmam a correlação entre antigenicidade e imunogenicidade pois que a P-ST foi 15 vezes mais antigênico do que a M-ST, determinada par ELISA, e 15 vezes mais imunogênica, em peso, do que a H-ST o era em ratos imunizados.

Os estudos acima mencionados também incluem duas modificações que não se encontram em relatórios anteriormente publicados. A primeira foi que a subunidade B foi obtida di. rectamente de uma estirpe K-12 da E, coli que tinha sido modificada por técnicas de recombinação para produzir apenas subunidade B humana de preferência a obter aquela subunidade por processos de dissociação da holotoxina LT porcina, como se tem feito no passado. A segunda modificação foi a do glu, taraideido ter sido substituído por uma carbodiimida como re agente interligante.

A união usando glutaraldeido tem certas vantagens quando comparadas com uniões usando carbodiimidas. Primeiro, fornece uma efectiva interligação da ST à subunidade B sem afectar a antigenicidade de qualquer das toxinas. Segun do, produz uma mais eficiente união da ST à subunidade B de modo que podem ser obtidas vacinas contendo proporções igual, mente antigênicas de ST e subunidade B, a partir de relações molares iniciais de ST/subunidade B mais baixas reduzindo por, tanto significativamente a quantidade de ST necessária para fazer uma vacina. Terceira, ao contrário do que com as carbodiimidas, há uma considerável experiência que atesta a segurança da administração de conjugados de glutaraldeido a S£ res humanos /"Ver Cockroft et al., 3. Allerq. Clin. Immunol., 60:56-62 (1977); Levine et al., Infect. Immun., 21:158-162 (1978); e Relyveld. Proqr. Clin. Biol. Res., 47:51-76 (l980)_7.

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B. Outras Vacinas Contendo Moléculas 5T Monómeras

e Polímeras

Prepararam-se mais conjugados de duas, entre as três anteriormente descritas preparações de ST sintética, a M-ST e a P-ST com a subunidade B da LT. Foram examinados os efeitos de diferentes relações molares iniciais ST/subunidade B. Com base no peso molecular da ST sintética monómera (M-ST), bem como os de diferentes agentes interligantes. Os agentes utilizados neste estudo foram a l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC), dimetilsuberimidato (DMS) e glutaraldeido (GA).

Os resultados de alguns destes estudos estão indicados nos gráficos da Figura 22 para a P-ST associada quer com DMS quer com EDAC. Os resultados do uso de GA estão indicados no painel à direita da Figura 20 (painel C). Como se pode ver, tanto o DMC como GA dão maiores antigenicidades ST (unidades antigenas por miligrama) a relações molares ini ciais mais baixas de P-ST/subunidade B do que as obtidas usari do EDAC. No Quadro 10, a seguir, pode ver-se informação relativa aos diversos conjugados.

QUADRO 10

Propriedades das Vacinas Preparadas a partir da Subunidade B e de Diferentes Preparações ST com Diferentes Agentes de Ligação

— Reacção	de conjugação	Vacina	1000 AU	de Vacina
□ 1	Agente*3	Molar0 ST:B	Peso %d ST B	AU/mge ST B	Quantidade Vacf ST9	T oxicidade^ ST
M-ST	EDAC(1,5)	70:1	51 49	492 467	2,20	1122	1276
P-ST	EDAC(l,5)	30:1	36 64	651 687	1,51	540	332
M-ST	DMS(l,0	50:1	46 54	455 508	2,20	1012	770
P-ST	DMS(l,0)	10:1	12 88	1620 780	1,33	160	172
M-ST	GA(0,5)	45:1	52 48	510 500	2,00	1040	900
P-ST	GA(0,6)	| 30:1	30 70	4130 679	0,25	75	92 _

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Notas:

a - Preparações ST usadas no conjugado M-ST = ST sintética monómera; P-ST = ST polímera contendo ligações interpolipéptido cistina dissulfureto.

b - Agentes de ligação utilizados para preparar o conjugado EDAC = l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida;

DMS = dimetilsuberimidato; GA = glutaraldeido. Os valo res entre parêntesis indicam a relação em peso de agente ligante/proteina inicial total presente no meio reagente de ligação.

c - relação molar inicial da preparação ST/subunidade B da LT.

d - peso relativo de cada toxina em cada conjugado.

e - unidades antígenas (AU) de cada toxina por miligrama de vacina conjugada.

f - quantidade de vacina conjugada, em miligramas, necessária para formar 1 000 AU de cada toxina componente.

g - quantidade de ST, em peso, em microgramas contida num co_n jugado de vacina que fornece 1 000 AU de toxina.

h - quantidade equivalente de potência secretória ST não atenuada, em nanogramas, numa vacina conjugada contendo 1000 AU de toxina ST, determinado pelo ensaio dos ratinhos-bébé.

A informação acima ilustra a superioridade da ST sijn tética polímera (P-ST) sobre a ST sintática monómera (M-ST) nu ma base em peso. Essa superioridade não parece depender do agente de ligação usado, ainda que os diferentes agentes mostrem alguns efeitos. Assim o glutaraldeido (GA) e o dimetilsuberimidato (DMS) parecem dar conjugados superiores, quer de P-ST quer de M-ST em relação à subunidade B, quando comparados com os da carbodiimida (EDAC).

Os detalhes experimentais relativos aos estudos acima, além daqueles já fornecidos, encontram-se na Secção VI B, a seguir.

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-122C. Imunoqenicidads da 5T Polímera Não-Conjuqada

Cada uma das acima descritas preparações de ST mos. trou ser antigênica e cada uma ê definida como tendo pelo me nos 10% da antigenicidade da ST biológica, natural, numa base de peso. Essas antigenicidades são reveladas pelas determinações ELISA. Além disto, as preparações de ST acima referi, das, quando associadas a um suporte proteico como a subunidja de 8 da LT ou como a imunoglobulina G porcina, mostraram ser imunogênicas em ratos e coelhos. Contudo, tanto quanto se sa be, as preparações de ST monómera (M-ST) são haptênicas e não são imunogênicas quando usadas sozinhas, sem suporte associado.

A imunização com ST conjugada com um suporte protei. co que não seja um imunogêneo activo ê um desperdício pois que uma parte do conjugado não é imunologicamente activa. A porção subunidade B dos conjugados ST—subunidade B é, evidentemente, parcialmente imunogênica e realmente induz a pro. dução de anticorpos. Contudo não se podem obter facilmente quantidades suficientes da holotoxina ou da subunidade B para se obter uma vacina económica e, quando produzidas por técnicas de engenharia genética, as preparações de tais suportes proteicos podem conter impurezas indesejáveis.

Seria portanto altamente benéfico que se pudesse preparar um imunogêneo totalmente sintético para uma vacina na qual praticamente todo o conjugado fosse imunologicamente activo. A preparação de ST polímera P-ST devido ao seu elevado peso molecular médio, solubilidade, antigenicidade e eficácia como imunogêneo associado a um conjugado, pareceu ser esse suporte, imunologicamente activo, para um polipêpti do sintético que corresponda na sequência de resíduos de ami no ácidos a uma região determinante, imunogênica e antigênica, da subunidade B da LT, tal como a sequência referida no Quadro 2, supra. Foram portanto realizados estudos de imuno genicidade usando preparações de P-ST não conjugada, como primeiro passo para a produção do polipéptido conjugado P-ST—LT B.

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-123Foram imunizados coelhos com P-ST não conjugado, seguindo-se duas doses de reforço com P-ST. As determinações ELISA revelaram que os soros obtidas dessas imunizações tinham títulos elevados contra a ST monémera sintética (M-ST) como antígeno. De facto, um titulo de soro de 1:2500 forneceu metade da saturação máxima do antígeno M-ST.

Os títulos obtidos são suficientes para indicar que não é necessário o suporte para imunizar e proteger contra a inoculação de P-ST não conjugado. Esses titulos são também suficientes para sugerir que a P-ST pode, por si própria, ser usada como suporte de conjugação para um polipépti, do subunidade B da LT, sintético e imunogênico, para se obter um imunogéneo totalmente sintético, quási todo imunologicameri te activo que dê protecção tanto para os patogeneos que produzam ST como LT. CrÊ-se que a M-ST, administrada com o mes, mo protocolo destes estudos, isto é, não conjugada a um suporte, substancialmente não induziria anticorpos anti-ST.

Os processos usados para obter estes resultados estão discutidos na Secção VI C a seguir.

VI - MATERIAIS E MÉTODOS PARA A ST MULTIMERA

A. Vacinas Contendo M-ST, ST/ST e P-ST

Preparações de Enterotoxina

Foram usadas três preparações de ST sintética. A ST sintética monémera (M-ST) utilizada nestas preparações é aquele material que contém a mesma sequência de 18 resíduos de aminoácidos da que foi descrita para a ST Ib humana, natural, por Chan et al., 0, Biol, Chem., 256:7744-7746 (l9Bl), cujas propriedades biológicas e antigênicas são substancialmente idênticas às da ST nativa. A preparação e propriedade da M-ST foram discutidas nas Secções II e III, atrás. A pre.

paração de ST/ST utilizada é o polipêptido contendo 36 amino ácidos, isto ê, o dímero cabeça-a-cauda da ST Ib humana, cojn tendo 18 amino ácidas, cuja preparação foi atrás discutida na Secção II. A ST polímera (P-ST) ê aquele material cujas múltiplas unidades de repetição ST estão ligadas por ligações intramoleculares, interpolipêptido cistina dissulfureto. A preparação de P-ST foi também aqui descrita na Secção II.

As preparações ST/ST e P-ST foram purificadas por passagem através de uma coluna de cromatografia Sephadex G-50, liofilizadas e foram usadas sem mais purificação.

A subunidade 8 foi obtida de culturas de E. coli, estirpe pDF 87, uma derivada de K-12 transformada portadora do plasmídeo da subunidade 8 da estirpe H 10407 da E, coli humana ^/""Clement et al., Infect. Immun., 40:653-658 (l983__7 e foi purificada pelas técnicas cromatográficas descritas em Clement et al., Infect. Immun., 29:91-97 (ΐ98θ). A quantidji de de toxinas usadas baseou-se nas suas concentrações prote.i cas determinadas pelo rnêtodo de Lornry et al., 0. Biol. Chem. , 193:265-275 (l95l); os equivalentes molares vieram de valores publicados para a subunidade B (57400 daltons para as 5 subunidades polímeras) e ST nativa (1972 daltons) como se viu atrás e ern Gill et al., Infect. Immun. , 33:677-682 (1981) e Staples et al., 3. Biol. Chem., 255:4716-4721 (l9B0), respe_ç tivamente.

Condições de Conjugação

Três preparações diferentes de ST sintética foram interligadas à subunidade B LT misturando relações molares iniciais variáveis daguelas toxinas na presença de glutaraldeido (GA) da Sigma, Grau I (Sigrna Chemical Co., St. Louis, n0). A relação GA/proteina total da mistura de toxinas variou em cada reacção de modo a gue a relação GA/subunidade B se mantivesse constante e igual a 700:1 molar. Esta concentração de GA mostrou dar interligação eficiente sem atenuar

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-125a antigenicidade da subunidade B. Depois de duas horas de reacção à temperatura ambiente, os conjugados foram exaustivamente dializados contra tampão TEAN (Tris, EDTA, azida de sódio, cloreto de sódio) a quatro graus centígrados e depois processados como aqui se descreveu e em Klipstein et al., D. Infect. Dis., 147:318-326 (1983).

Propriedades dos Conjugados

A antigenicidade das preparações da ST sintética, quer sozinha quer na forma conjugada, foi determinada pela técnica ELISA em sanduíche dupla usando antisoros hiperimunes de M-ST de cabra e coelho, como se descreve em Klipstein et al., 3. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) e Klipstein et al., Infect. Immun., 39:117-121 (1983). A antigenicidade da subunidade B nos conjugados foi determinada por ELISA antis£ ro hiperimune de cabra contra subunidades B humanas. A anti genicidade de cada toxina componente do conjugado ê expressa ern percentagem da da respectiva toxina não atenuada, concomi tantemente avaliada; a percentagem de antigenicidade de cada toxina componente vezes 1 000 deu o número das suas unid_a des antígenas por miligrama de vacina. A antigenicidade das duas preparações de ST multímera em conjugados é expressa em termos de unidades antígenas de M-ST.

A toxicidade ST residual das vacinas foi determina, da como anteriormente se descreveu por Klipstein et al.,

Infect. Immun. , 37:550-557 (1983) por comparação com os valei res de ST não atenuada. Para cada vacina, a dosagem efectiva mínima foi determinada pelo ensaio dos ratinhos-bébé, no qual cada unidade-rato ê definida como aquela quantidade que produz uma relação em peso de vísceras/carcassa de pelo menos 0,083.

Processos de Imunização

A ratos Sprague-Darvley de 150-175 gramas foi dada

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uma primeira imunização intraperitoneal (i.p.) usando o adjjj vante completo de Freund, seguida de duas imunizações de reforço per os (p.o.) em intervalos de 4 dias. As imunizações p.o. foram aplicadas via tubo intragástrico duas £u3^ras depois da administração p.o. de cimetidina (TAGAMET'-' de Smith Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) a uma dosagem de 50 mç/kg de peso de corpo para evitar a secreção gástrica.

Processos de Inoculação

Os ratos foram inoculados 4 a 6 dias depois da úl tima imunização de reforço, pela instilação de 0,1 ml de um

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caldo de cultura contendo 10 organismos viáveis por ml de

E. coli LT~/5T⁺ estirpe Tx 452 (Q78:H12) numa só ansa fechada, de 10 cm, do ileum distai, durante 18 horas, como se des. creve atrás e em Klipstein et al., Infect. Immun., 34:637-639 (l98l) e em Klipstein et al., Infect, Immun., 40:924-929 (1983). Cada valor da informação foi determinado em 4 a 6 ratos imunizados e os resultados expressam-se em média erro médio padrão de percentagem de secreção reduzida em ratos imunizados quando comparados com os resultados em 5 ratos de contro le não imunizados que tenham sido inoculados de modo 'semelhari te. Uma secreção reduzida superior a 50% representou uma di. ' ferença significativa (P inferior a 0,00l), determinada pelo ensaio _t de Student, para duas médias independentes, entre valores em animais imunizados e de controle.

Resposta flnti-Toxina

Os títulos de antitoxina IgA da mucosa ("mucosal AT") contra a M-ST e contra a subunidade B foram determinados por ELISA como atrás se descreveu e em Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 )1983) e em Klipstein et al.,

Infect. Immun., 40:924-929 (1983). Os títulos de antitoxina em animais imunizados com vacina P-ST foram determinados pela técnica da dupla sanduíche, na qual o antisoro hiperimu

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ne contra M-ST foi usado como fase sólida e a M-ST como antígeno. Os resultados exprimem-se em valores de M-ST. Os valores citados são em número médio de aumento (arredondado até ao número inteiro mais próximo) dos títulos em ratos imunizados em relação aos dos ratos de controle não imuniza^ dos. Os títulos anti-toxina nos ratos de controle foram de 1:2 contra ambas as toxinas componentes; assim, em título de 1:64 em animais imunizados representou um aumento de 6 v_e zes.

B. Outros Conjugados de Vacinas Contendo Moléculas

ST Monémeras e Polímeras

As preparações de ST sintética monómera (M-ST) e ST sintética polímera (P-ST) e seus usos foram atrás discutidos nas Secções II, III e VI A, A subunidade B da LT foi o material discutido na Secção VI A.

A ligação da M-ST da P-ST à subunidade B usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) foi produzida como se descreve na Secção IV para a M-ST, Assim as quantidades, tanto de M-ST como de P-ST, utilizadas tiveram como base ambos os materiais como monómeros.

As ligações usando glutaraldeído (GA) foram conduzidas como na Secção VI A com excepção de que a quantidade de GA utilizada está expressa como uma relação em peso de GA para a proteína total do conjugado de 0,5:1 ou 0,6:1, em vez da relação molar 700:1 de GA para a subunidade B utilizada na Secção VI A.

As ligaçães, usando dimetilsuperimidato (DMS), foram conduzidas a uma relação em peso DMS/proteína total de 1:1. Exemplo de processos com estas ligações podem ser encontrados em Carpenter et al., 0. Biol. Chem., 247:5500-5586 (1972) e em Hillel et al., Biochemistry, 16:3334-3342 (1977).

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As antigenicidades dos conjugados, o número de uni. dades antígenas (AU) por miligrama de conjugado, a quantidade de vacina contendo conjugado necessária para fornecer 1 000 AU das toxinas e a quantidade do preparado de ST nessa vacina, foram determinados como na Secção VI A. A potência secretória dos conjugados foi determinada pelo ensaio dos ra tinhos-bêbê anteriormente descrito.

C. Imunogenicidade de ST polímera não-conjuqada

A ST sintética polímera (P-ST) usada nestas determinações foi o material purificado referido nas Secções II e VI A. Os protocolos de imunização e de ELISA utilizados, f£ ram os seguintes:

Injectararn-se coelhos intramuscularmente (i.m.) no dia "zero" com uma vacina que continha 200 microgramas de P-ST dispersos em 1,5 ml de adjuvante completo de Ereund (CFA) e 1,0 ml de soro salino tamponado com fosfato (PBS-phosphate-buffered saline) com um valor de pH de 7,2. Os animais receberam injecções intraperitoneais (i.p.) de reforço de uma vacina que. continha a mesma quantidade de P-ST contida em 1,0 ml de CFA mais 1,0 ml de PBS no dia 14, seguida de uma outra injecção de reforço de uma vacina que continha a mesma quantidade de P-ST adsorvida em alúmen, mais 1,5 ml de PBS no dia 27. Obtiveram-se amostras de soro dos coelhos imunizados, pela veia da orelha no dia 34 após a primeira imuniza ção.

A ST sintética monómera (M-ST) 18-mera cuja síntese e propriedades foram discutidas nas Secções II, III e IV, e que possuía a sequência de resíduos de aminoácidos da ST Ib, supra, foi usada como antígeno nos ensaios ELISA para determinação dos títulos de antisoro. 0 antígeno foi dissolvido em PBS a pH 7,2 para fornecer uma solução de armazenagem contendo 1 mg/ml. A solução de armazenagem foi então diluída com um tampão de acetato de sódio 0,1 molar com um pH de 9,6,

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para se obter uma segunda solução de armazenagem, ou solução-mãe, contendo M-ST a uma concentração de 0,5 micrograma por mililitro.

Colocaram-se 50 microlitros da .segunda solução-mãe em cavidades de uma placa microtituladora, para obter 25 nanogramas do antígeno M-ST para cada cavidade. A placa foi então incubada numa câmara húmida durante 2 horas à temperatura de 37SC.

As cavidades foram então lavadas três vezes com uma solução PBS que continha 0,07% de polissorbato 20 (TWEEN\7 20; ICI United States, Inc., Wilmington, DE), seguindo-se duas lavagens com água destilada. Ountou-se então 100 micro litros de albumina de soro bovino (BSA) a 1/ em PBS, a cada cavidade para bloquear posições de ligação não específica e incubaram-se as soluções contendo BSA nas cavidades durante uma hora a 372C.

As soluções contendo BSA não ligada foram obtidas por agitação da placa. Sem secar primeiro a placa juntaram-se 90 microlitros de PBS a cada cavidade da Pila de cima,

/

enquanto se juntaram 50 microlitros de PBS a cada cavidade do resto da placa. Ountaram-se depois 10 microlitros de an- tisoro a cada cavidade da fila de cima e misturou-se bem. 50 Microlitros de solução contendo antisoro, de cada cavidade, foram então adicionados e misturados com os 50 microlitros de PBS, na cavidade abaixo, para se obter novas diluições ( 2X). Continuou-se a série de diluições ( 2 X) pelas restantes cavidades da placa. Terminadas as diluições, as cavi dades contendo antisoro diluído foram incubadas a 37SC durante 1 hora.

Soro anti-coelho de cabra, marcado com peroxidase, foi diluído a 1:3000 em volume com PBS contendo tambám 1% de BSA e juntaram-se 50 microlitros da solução resultante a cada

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-130

cavidade, excepto para os da fila de cima que não foram anal_i sados. As cavidades assim preparadas foram incubadas durante 1 hora a 37SC e foram então lavadas como acima se descreveu.

Preparou-se uma solução de orto-fenilenodiamina (OPD) dissolvendo uma pastilha de Substrato OPD (Pithman-tfoore, Inc», Washington Crossing, NO) em 6 mililitros de água destilada à qual se juntou também uma gota de peróxido de hidrogénio a 3%, Da solução resultante juntaram-se 80 microlitros a cada cavidade da placa microtituladora. 0 desenvolvimento de cor nas cavidades foi parado, 20 minutos depois, pela adição de 50 microlitros de ácido sulfúrico 4N a cada cavidade. A quantidade de cor presente em cada cavj. dade foi determinada medindo a densidade óptica do líquido nele contido, a 492 nanómetros.

A quantidade de anticorpos no soro de coelho neces, sária para saturar metade da M-ST antígena da placa foi depois calculada usando as técnicas padronizadas. Como resultado desses cálculos, verificou-se que havia suficientes anticorpos contra a M-ST presentes no soro de coelho imunizado para saturar metade da M-ST antígena aplicada quando se diluia aquele soro a cerca de 1:2500. Assim, por esta determinação ELISA de sanduíche dupla, obteve-se um título de antisoro de 1:2500.

VII - DIAGNÓSTICOS

Os resultados atrás discutidos ilustram amplamente que as preparações de ST sintética deste invento são antigénicas. Por exempla, a ST sintética monómera mostrou ter uma antigenicidade de cerca de 40 até cerca de 260% da ST biológica quando avaliada pelo uso de anticorpos contra a ST biológica, e uma antigenicidade de cerca de 10 até cerca de 100 por cento quando medida pelo uso de anticorpos criados contra uma preparação de ST sintética particular, isto ê, o pro

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duto purificado da preparação (3) do Quadro 2. De modo semelhante o dímero ST/ST multímero mostrou ter uma antigenic_i dade que ô cerca de 30C-350 por cento da da ST monómera (M-5T), enquanto que a ST polímera (P-ST) mostrou ter cerca de 900-1500 por cento da antigenicidade da M-ST.

As moléculas de ST sintética deste invento e em particular as formas da ST multímera podem portanto ser úteis como reagentes de diagnóstico ou como parte de um sistema de diagnóstico usado para os animais, incluindo o ser humano, que estejam infectados com bactérias como a E. cpli e Klebsiella pneumoniae que produzem toxinas ST. Os anticorpos cria, dos contra as moléculas da ST deste invente podem também ser óteis em tais diagnósticos.

Os ensaios imunológicos são os métodos de diagnóstico espscialmente preferidos de utilização das moléculas ST. São exemplos de tais ensaios as determinações ELISA já discu. tidas. Há ainda ensaios imunológicos úteis coma os radioimu ne, fluorecencia-imune e outros.

Um arranjo deste sistema de diagnóstico do invento é particularmente útil em ensaios de competição e inclui um primeiro reagente e um segundo reagente em recipientes separados. 0 primeiro reagente compreende um polipéptido ST sin tético antigênico deste invento, como a M-ST ou a P-ST como antígeno. 0 segundo reagente compreende receptores como os anticorpos que imunoreagem com a M-ST ou a P-ST e também imu noreagem com a ST biológica como as anteriormente discutidas. Um meio de indicar a presença de uma imunoreacção entre o a_n tígeno e os receptores é por outros anti-receptores, recepto

res, ligados a um marcador como seja um elemento radioactivo, 125

p. ex. I, um corante fluorescente p. ex. fluoresceina, ou uma enzima, p. ex. □ peroxidase. D meio indicador está num recipiente separado como no caso dos anticorpos anticoelho da cabra, ligado à fosfatase, com outro recipiente separado

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-132para □ seu substracto ou acompanha os anticorpos como ê o ca so dos elementos radioactivos estarem ligados por anticorpos.

Os meios indicadores podem também ser fornecidos separadamente.

A mistura de quantidades predeterminadas do primeiro e segundo reagentes na presença de uma quantidade predete_r minada de uma amostra a ser avaliada como uma amostra de fezes ou uma cultura bacteriana de uma amostra de fezes dá uma quantidade de imunoreacção assinalada pelos meios indicadores. A quantidade de imunoreacção é diferente de uma quanti dade conhecida de imunoreacção quando está presente uma ST na amostra ensaiada.

Na prática, a cultura bacteriana ê pre-incubada com o anticorpo e aquela composição é incubada depois com a P-ST que está ligada às paredes duma cadeia ELISA. Lavando a cadeia para remover qualquer anticorpo natural, complexo da ST biológica (imunoreactante) deixa um complexo imune da P-ST e anticorpo cuja presença e quantidade podem ser determinadas pelos meios indicadores.

0 uso de anticorpos biologicamente activos, intacto, inteiros, não é necessário em muitos sistemas de diagnójs tico como ê o caso do ensaio de competição discutido imediatamente acima. Mais do que isso pode ser necessária a porção amida contendo ideotipo biologicamente activo, da molécula anticorpo que se liga à ST antigénica. São exemplos de porções poliamida contendo ideotipo as conhecidas como porções anticorpo Fab e F(ab')₂ que ^s^° preparadas por reacções enzimáticas bem conhecidas sobre anticorpos tipicamente inteiros .

Anticorpos inteiros, intactos, porções Fab, F(Ab')₂ e semelhantes que contenham as regiões ideotlpicas dos anti corpos são aqui denominadas receptores. A palavra "receptor" é usada acima e nas reivindicações anexas para abranger o gru

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po daquelas moléculas pois sao úteis em produtos e técnicas de diagnóstico. Contudo, enquanto as porções de anticorpos Fab ou F(ab')2 podem ser utilizadas como receptor de um pro duto ou técnica de diagnóstico, o uso do anticorpo inteiro, intacto, é habitualmente preferido pelo menos porque a preparação de uma porção Fab ou FÍab'^ dum anticorpo exige reacções adicionais e purificação dos soros.

0 que se segue tem a intenção de ilustrar o presejn te invento mas não de o limitar. Podem ser feitas muitas va riações e modificações sem afastamento do verdadeiro espírito e âmbito dos conceitos inovadores do invento.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um polipêptido sintético que tem pelo menos cerca de 10% da antigenicidade da enterotoxina biológica termo estável da Escherichia coli incluindo a sequência residual de amino-ácidos, tomados da esquerda para a direita e na direcção da terminação amino para a terminação carboxilo, representada pela fórmula

   R'

   l^d

   R^-Cys(R⁷) Cys (R®) GluLeuCys(R⁹) Cys (R¹ °)Tyr (Asn) R³

   ProAlaCys(R^’*‘)Ala(Thr)GlyCys(R|^)Asn(Tyr)

   na qual os três resíduos específicos amino-ácidos entre parêntesis são cada um uma alternativa ao resíduo de amino-ácido imediatamente anterior na citada sequência:

   a-f e g-1 são números inteiros tendo cada um, um

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   -134valor de O a 1, com a condição de se o valor de qualquer dos i“6 7-12

   a-f ou g-1 for zero, o grupo correspondente R^f" ^{ou R}gZi "

   estará ausente e quando um grupo R^ p- estiver ausente o 3-r 1-6

   átomo de enxòfre do resíduo Cys que tem um grupo R„ „- ausen

   te formará uma ligação cistina dissulfureto, enquanto que se

   o valor do citado a-f ou g-1 for um o citado grupo correspojn

   dente R^1_í- ou R⁷~J·²-estará presente; a-f g-1

   Os citados grupos R^”p- quando tomados individualmente são as mesmas ou diferentes partes ligadas ao átomo de enxòfre do resíduo Cys e são seleccionados do grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquila contendo 1 até 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituído contendo 2 até cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contendo 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído contendo 2 até cerca de 10 átomos de carbono;

   7-12

   . - são os mesmas ou diferen9-1

   alternativos a cada resíduo Cys

   os citados grupos R tes resíduos de amino ácidos imediatamente anterior;

   pelo menos dois de a-f e dois de g-1 são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de o dito polipêptido sintético conter pelo menos uma ligação intramolecular cistina dissulfureto formada a partir de pelo menos dois resíduos Cys presentes; e

   "m" é um número inteiro que tem o valor de 0 ou 1

   com a condição de se "m" for zero está ausente e se "m"

   I3 . ^m

   for um, é seleccionado de entre 0 grupo que consiste numa cadeia que contém 1 a cerca de 54 resíduos de amino ácidos um grupo ligante e a porção acilo de um ácido carboxilico que contém 1 a cerca de 20 carbonos formando uma ligação ami da com a amina do resíduo amino-terminal.

   2 - Processo de preparação de um polipêptido sintético de acordo com a reivindicação 1 em que

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   Ref: EPG: 11-22.1

   "e" é zero quando "a" é zero "d" é zero quando "b" é zero "f" ê zero quando "c" é zero; cada "g" ê cada "k" ê zero quando "a" é zero, cada "h" e cada "j" é zero quando "b" ê zero, e cada "i" e cada "1" ê zero quando "c" é zero; e

   está presente uma ligação intrapolipeptídica cistina-dissulfureto entre os resíduos de Cys apresentados na citada fórmu

   la em liqação com R^ e R³ ou R^ e R^ ou R e R„.

   ³ * ae od cr

   3 - Processo de preparação de um polipeptido sintê tico de acordo com a reivindicação 2 onde "a", "b" e "c" são zero e estão presentes três ligações intrapolipeptido cistina dissulfureto entre os resíduos de Cys apresentados na citada fórmula ligadas a R^ e R³, R? e r\ e R³ e R^{6 * 8}.

   3 0 0 0 Sl

   4 - Processo de preparação de um polipeptido sintê tico de acordo com a reivindicação 1 na qual a citada ligação intramolecular cistina dissulfureto é uma lir-ação interpolipeptido e o citado polipeptido é uma das muitas unidades de repetição de um multimero.

   /

   5 - Processo de preparação de um polipeptido sintjé tico, de acordo com a reivindicação 1 no qual "m" tem um v_a lor de um, e o citado R^³ é uma cadeia que contém quatro resíduos de amino ácidas tendo a sequência, considerada da esquerda para a direita e na direcção de terminal-amino para terminal-carboxilo, representada pela fórmula Asn(Ser)Thr(5er)Phe(Asn)Tyr, em que os reáíduos amino ácido entre parêntesis são, cada um, uma alternativa para o resíduo amino-ácido imediatamente precedente.

   6 - Processo de preparação de um polipeptido sintético que tem pelo menos cerca de 10% de antigenicidade da

   enterotoxina biológica termo-estável da Escherichia coli inc luindo a sequência de amino ácido, considerada da esquerda

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   -136para a direita na direcção da terminaçãa-amino para a terminação carboxilo, representada pela fórmula

   R¹ R?

   I^a l^b

   Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCys(Rg)Cys(R^)Glu

   ^Rh ^r5

   I^d I ^B

   LeuCys(R?)Cys(R^)Tyr(Asn)ProAlaCys(R?'*’) Ala(Thr) Gly

   l₃ ^{1 J k}

   c

   _r6

   %

   Cys(R^) Asn(Tyr)

   na qual os seis resíduos específicos amino ácido entre parêntesis são, cada um, uma alternativa ao resíduo imediatamente precedente de amino Scido,

   r\ R?, R^, Rj, R^ e R~ são as mesmas ou diferena b c d e f

   tes metades ligadas ao átomo de enxôfre do resíduo Cys;

   a-f são números inteiros que tem um valor de zero ou um com a condição de que o valor de qualquer dos a-f for zero, o correspondente grupo Rg*”p está ausente, a condição adicional de:

   "e" ser zero quando "a" for ΖΘΓΟ "d" ser zero quando "b" for zero, e II pil ser zero quando " c" for zero;

   ainda com a condição adicional de pelo menos um dos "a", "b" ou "c" dever ser zero para que o correspondente R·*·"^ esteja ausente assim como o R^/p cujo valor subscrito ê zero quando os citados "a", "b" ou "c" são zero, e uma ligação intramolecular, intrapolipéptido cistina dissulfureto está presente entre os respectivos resíduos Cys para os quais um valor subscrito de zero requer um outro valor subscrito de zero;

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   Ref: EPC: 11-22.1

   quando um valor de a-f for um os citados grupos respectivos R^”^- sstão presentes e, tomados individualmente, são seleccionados de entre um grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo que contenha 1 a cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituido que contenha de 2 a cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo que contem 1 a cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído que contêm cerca de 2 a cerca de 10 átomos de carbono

   R⁸ R^{9 R}h’ ^Ri’

   R-θ, R?·*^- e R'}2 são os mesmos ou dif ef k 1

   rentes resíduos de amino ácidos alternativos ao precedente resíduo Cys, na qual g-l são números inteiros que tem o valor de zero ou um com a condição de que quando o valor de

   7-12

   qualquer g-l for zero o correspondente grupo R . - está a.u 9 i

   e com a condição adicional de: cada um de "g" e "k" é zero quando "a" ê zero, cada de "h" e "j" é zero quando "b" ê zero, e cada de "i" e "1" ê zero quando "c" ê zero; e

   quando o valor de qualquer de g-l ê um, os citados 7-12

   grupos correspondentes R - estão presentes.

   7 - Processo de preparação de um polipeptido sintê tico de acordo com a reivindicação 6 contendo três resíduos de cistina intrapolipeptido, formados entre os pares de resíduos Cys apresentados na citada fórmula ligados aos grupos

   n 3 „6

   ou H e R„. c f

   R¹ e R⁵, a e

   ^Rb ^{B R}d8 - Processo de preparação de um polipeptido sintê tico que tem pelo menos cerca de 10/ da antigenicidade da e_n terotoxina biológica termo estável da Escherichia coli incluindo a sequência de amino ácidos tornados da esquerda para

   a direita na direcção da terminação-amino para a terminação-carboxilo, representada pela fórmula:

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   Cef: EPG: 11-22.1

   -138R^^Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)TyrCysCysGluLeuCysCys

   ^m J _1

   Tyr(Asri)ProAla(Thr)CysAlaGlycj<sAsn(Tyr)

   na qual as linhas que ligam dois resíduos Cys repre sentam ligações intramoleculares de dissulfureto dos residuos de cistina;

   os seis residuos específicos de amino ácidos entre parêntesis sao, cada um, urna alternativa ao resíduo imediata mente precedente de amino ácido; e

   "m" é um número inteiro que tem o valor de zero ou

   um com a condição de se "m" for zero está ausente, e se 13 ^m

   "m" for um R_m & seleccionado de entre o grupo que consiste num grupo ligante e numa porção acilo de urn ácido carboxílico que contêm de 1 até cerca de 20 átomos de carbono formando uma ligação amida com α resíduo amino-terminal.

   9 - Processo de preparação de um polipêptido sintê

   tico de acordo com a reivindicação 8 no qual "m" é zero, e

   R^3 está ausente, m

   10 - Processo de preparação de um multímero sintático que tem pelo menos cerca de 10% de antigenicidade da ert terotoxina biológica termo-estável da Escherichia coli compreendendo uma pluralidade de unidades repetidas de polipéptidos incluindo a sequência de resíduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita e na direcção da terminaçao-amino para a terminação-carboxilo, representada pela fórmula:

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   LICENSE NO. 463,359-12/16/33

   Ref: EPG: 11-22.1

   -139ProAlaCys (R^ ) Ala(Thr) GlyCysR^As n(Ty r )

   ns qual os três resíduos específicos de amino ácidos entre parêntesis são, cada um, uma alternativa ao resíduo imediatamente precedente de amino ácidos na citada sequência ;

   a-f e g-1 são números inteiros tendo, cada um, um

   valor de zero ou um, com a condição de se o valor de qualquer 1—6

   um dos a-f ou g-1 for zero, o grupo correspondente R ou

   7—12 1—6 f

   R . - está ausente, e quando um grupo R está ausente o

   g-i a-r

   átomo de enxQfre do resíduo Cys tendo um grupo R_g p- ausente forma uma ligação cistina dissulfureto, enquanto que se o v_a lor dos citados a-f ou g-1 á um, o citado grupo corresponde_n

   te R”'·^-^- ou r7""}2_ _está presente; a-f g-1

   os citados grupos Rg_f- quando tomados individualmente, são as mesmas ou diferentes partes ligadas ao átomo de enxQfre do resídua Cys e são seleccionados entre o grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo contendo 1 atá cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituído ^z

   contendo 2 a cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contendo 1 a cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído contendo 2 a cerca de 10 átomos de carbono;

   7-12

   R , - são os mesmos ou difereng-1

   alternativos a cada resíduo Cys

   os citados grupos tes resíduos de amino-ácidos imediatamente precedente;

   pelo menos dois de a-f e dois de g-1 são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de o citado polipêptido sintático conter pelo menos uma ligação intramo lecular cistina dissulfureto formada a partir de pelo menos dois resíduos Cys presentes; e

   "m" ê um número inteiro que tem o valor de zero ou

   um com a condição de se "m" ê zero R^³ está ausente, e se "m"

   13 ^m

   é um, R_m ê seleccionado do grupo que consiste numa cadeia contendo 1 a cerca de 54 resíduos de amino ácidos, um grupo ligante, e a porção acilo de um ácido carboxílico contendo 1 a cerca de 20 átomos de carbono Formando uma ligação amida com a amina do resíduo amino-terminal.

   11 - Processo de preparação de um multímero sintêti co de acordo com a reivindicação 10 na qual a citada ligação intramolecular cistina dissulfureto é uma ligação intrapolipejo tido dissulfureto, as citadas unidades de repetição estão ligadas a seguir cabeça-cauda através de uma ligação amida formada entre o grupo amina do resíduo amino-terminal de uma pri meira unidade de repetição de polipéptidos e o grupo carboxílico do resíduo carboxilo-terminal de uma segunda unidade de repetição dg polipéptidos.

   12 - Processo de preparação de um multímero sintétj. co de acordo com a reivindicação 10 no qual a ligação já cita da intramolecular cistina dissulfureto ê uma ligação interpolipeptido dissulfureto, as unidades de repetição citadas estão ligadas entre si pela citada ligação interpolipéptido cistina dissulfureto formada entre os resíduos Cys das citadas unidades repetitivas de polipéptidos.

   13 - Processo de preparação de um polipéptido sintético que tem uma actividade antigénica de pelo menos cerca de 10/ da enterotoxina termo-estável da Escherichia coli com preendendo as fases de:

   (a) formação de um primeiro polipéptido que inclui a sequência de amino ácidos residuais, tomados da esquerda pa ra a direita e na direcção da terminação-amino para a terminação-carboxilo, representada pela fórmula:

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   ,1O>

   R^³-Cys(R ^f)Cys(R^)GluLeuCys(RT)Cys(Rj^U)Tyr(Asn)

   ProAla

   tys(R

   ^)Ala(Thr)GlyCysR^²Asn(Tyr)

   na qual os três resíduos específicos de amino áci- . dos entre parêntesis são cada um uma alternativa ao resíduo de amino ácidos imediatamente precedente na citada sequência;

   a-f e g-1 são números inteiros tendo, cada um, um valor de zero a um, com a condição de se o valor de qualquer

   dos a-f ou g-1 á zero os grupos correspondentes R ~ - ou

   7-12 ^a_'

   1 " estão ausentes, enquanto que se o valor dos citados

   a-f ou g-1 for um, os correspondentes grupos citados R 7-12

   R . - estão presentes; g-1

   1-6

   a-f

   OU

   os citados grupos R „- quando tomados individuala— r

   mente, são as mesmas ou diferentes partes ligadas ao átomo de enxôfre dos resíduos Cys e são seleccionados de entre o grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquila que contém 1 a cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substitu_í do contendo 2 a cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo que contém 1 a cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído que contêm 2 a cerca de 10 átomos de carbo no ;

   7-12

   os grupos citados R^ são os tes resíduos de amino-ácidos alternativos diatamente precedente;

   mesmos ou diferenao resíduo Cys ime

   os valores de pelo menos dois de a-f são um, os va lores de pelo menos dois de g-1 são zero e os correspondentes grupos R¹· 6 são hidrogénio para dois dos citados a-f cu jos valores são um de forma que o citado primeiro polipéptido

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   -142contêm pelo menos dois CysH residuais; e

   "m" ê um número inteiro que tem o valor de zero ou

   um com a condição de se "m" é zero R^ está ausente, e se

   13 ^m

   "m" ê um, R_m ê seleccionado entre o grupo que consiste numa cadeia contendo 1 a cerca de 54 resíduos de amino ácidos, um grupo ligante, e a porção acilo de um ácido carboxilico contendo 1 a cerca de 20 átomos de carbono formando uma liga ção amida com a amina do resídua amino-terminal.

   (b) dissolução ou dispersão do citado primeiro polipêptido numa composição aquosa na concentração de menos que cerca de 5 mg por ml;

   (c) contacto da referida composição com oxigánio molecular como agente oxidante, tendo a solução um pH de οεχ ca de 7,0 a cerca de 9,5 durante o referido contacto; e

   (d) manutenção do referido contacto durante um pe. ríodo de cerca de 1 até cerca de 24 horas para oxidar pelo menos dois dos citadas resíduos CysH polipêptido e para foj? mar no polipêptido oxidado pelo menos uma ligação intramolecular dissulfureto cistina a partir de pelo menos dois dos citados resíduos CysH presentes no citado primeiro polipeptido.

   14 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 no qual os valores de pelo menos quatro de a-f são um, os valores de pelo menos quatro de g-1 são zero e os correspondentes grupos R^p- são hidrogénio para quatro dos citados a-f cujos valores são um, de tal forma que o citado primeiro polipêptido contém pelo menos quatro resíduos CysH, e a polipêptido oxidado formado na fase (d) contêm pelo menos duas ligações intramoleculares dissulfureto cistina.

   15 - Processo de preparação de acordo com a reivin

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   -143dicação 13 em que os valores de cada a-f são um, os valores de cada g-1 são zero e os correspondentes grupos são

   hidrogénio de forma que o citado primeiro polipêptido contêm seis resíduos CysH e o polipêptido oxidado formado na fase (d) contêm três ligações intramoleculares dissulfureto cistina.

   16 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 em que pelo menos uma das citadas ligações intramoleculares dissulfureto cistina ê uma ligação dissulfureto intrapolipeptido.

   17 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 em que pelo rnenos uma referida ligação intramolecular cistina dissulfureto é uma ligação interpolipeptido dissulfureto.

   18 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 incluindo as fases adicionais de recolha e purifi cação do polipêptido oxidado, e de recolha da polipêptido oxidado já purificado,

   19 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 18 em que o polipêptido oxidado, purificado e recolhida é um multímero do citado primeiro polipêptido, contendo o citado multímero uma pluralidade de unidades de repetição com a sequência de resíduos d/amino ácidos do citado pri meiro polipêptido, estando as citadas unidades de repetição ligadas entre si por ligações intramoleculares, interpolipe£ tido cistina dissulfureto.

   20 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 incluindo a fase de síntese do citado primeiro pjd lipeptida sob condições de não-oxidação, e em que o citado primeiro polipêptido sintêticodo contêm uma pluralidade de unidades de repetição citadas tendo uma sequência de resíduos

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   de amino ácidos que corresponde à sequência representada pela citada fórmula, estando as citadas unidades de repetição ligadas entre si por uma ligação amida formada entre o grupo amina do resíduo amino-terminal de uma primeira unidade de re petição polipeptidica e o grupo carboxilico do resíduo carbo xílico terminal de uma segunda unidade de repetição polipept_í dica.

   21 - Processo de preparação de acordo com a reivin dicação 13 em que "m" tem um valer de um, o citado é um peptido que contem quatro resíduos de amino ácido tendo a s_e quência, considerada da esquerda para a direita e na direcção da terminação-amino para a terminação-carboxilo, representada pela fórmula Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)Tyr, na qual os resíduos amino ácido entre parêntesis são cada um uma alternativa ao resíduo imediatamente precedente amino-ácido.

   22 - Processo de preparação de um polipêptido sin tético que tem actividade imunologica de pelo menos cerca de ΙΟ/ da enterotoxina termo-estável da E. coli compreendendo as fases de

   (a) síntese sob condições de não oxidação de um primeiro polipêptido incluindo a sequência de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita na direcção do amino-terminal para o carboxilo-terminal, representado pela fórmula:

   Cys(RpCys(R^)GluLeuCys(R?)Cys(Rj^)

   Tyr( Asn) ProAlaCys (rJ;¹) Ala(Thr) GlyCys(R^²) Asn(Tyr)

   na qual a referida sequência do resíduo de amino-ácidos, sem os três resíduos específicos de amino ácidos 7-12

   entre parêntesis e os grupos corresponde aos resíduos

   de amino do polipêptido ST Ib numerados de 5 até 18 a partir do amino-terminal do citado polipêptido ST Ib,

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   -145os três resíduos específicos de amino ácidos entre parêntesis são cada um uma alternativa ao imediatamente pre cedente resíduos de amino ácidos;

   „7 „3 „9 „10 „11 „12 ~ „

   R , R , R., R. , R, e R. são as mesmas ou difeg h í j k 1

   rentes alternativas de resíduos de amino ácidos ao precedeja

   te resíduo Cys, g-1 são números inteiros que tem o valor de

   zero ou um com □ condição de se qualquer dos g-1 tiver um va.

   7-12

   lor de zero o correspondente grupo individual / | ~ está au sente, com a ulterior condição de o valor de pelo menos dois de g-1 serem zero, com a ainda ulterior condição de pelo menos um par de resíduos Cys não contínuos a partir dos resídij

   7-12

   os Cys precedendo os grupos individuais R_g χ ~ estar presente, sendo os citados pares não contíguos de residuos Cys seleccionados a partir do grupo que consiste de resíduos Cys correspondendo às posirães do resíduo amino no polipêptido 3T Ib numerados 5 ou 6 e 9 ou 10, 5 ou 6 e 14, e 9 ou 1C e 17 a partir do amino-terminal do citado polipêptido ΞΤ Ib;

   (b) dissolvendo o citado primeiro polipêptido na solução aquosa na concentração de menos que cerca de 2 mg por ml·, tendo a citada solução um pH alcalino inferior a cerca de 10,5;

   (c) pondo em contacto a citada solução com oxigénio molecular como agente oxidante, tendo a citada solução um pH de cerca de 7,0 a cerca de 9,5; e

   (d) mantendo o citado contacto durante 1 o cerca

   de 24 h para formar pelo menos urna ligação dissulfureto intramolocular entre os pares de resíduos Cys não contíguos 7-12

   precedendo os grupos R _, - apresentados na citada fórmula e g i

   seieccionados a partir da grupo que consiste em resíduos Cys correspondendo às posições omino-ácido no citado polipêptido ΞΤ Ib numerados 5 ou 6 e 9 ou 10, 5 ou á e 14, e 9 ou 10, e 17 a partir da terminação amino do citado polipêptido ST Ib.

   23 - Processo de preparação de acordo com a reiviri dicação 22 em que o citado primeiro polipêptido inclui adicionalmente ligada à terminação amino do citado polipetido a sequência de amino ácidos, tomada a partir da esquerda para a direita na direcção do amino-terminal do csrboxilo-terminal, representada pela fórmula:

   Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn).

   24 - Processo de preparação de uma vacina que compreende (a) um multímero polipêptido sintético ligado a um suporte como um conjugado e (b) um diluente fisiologicamente tolerável para o citado conjugado tendo o citado multímero polipêptido sintético pelo menos cerca de 10% da antigenicidade da enterotoxina biológica termo-estável da Escherichia coli e contendo uma pluralidade de unidades de repetiçSao de polipêptido sintético, incluindo as citadas unidades de repe, tição de polipêptidos sintéticos a sequência de resíduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita e na direcção a partir do amino-final para o carboxilo-terminal, repre sentada pela fórmula:

   em que os três resíduos de amino ácidos específicos entre parêntesis são cada um uma alternativa para o resíduo de amino ácidas imediatamente precedente na citada s.e quência;

   a-f e g-1 são números inteiros tendo cada um, um valor de zero ou um, com a condição de se o valor de qualquer

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   -1471 — 6

   dos a-f ou g-1 for zero, o correspondente grupo R _- ou 7 12 1—6 a—r

   Rç^ - estS ausente, e quando um grupo está ausente

   o átomo de enxòfre do resíduo Cys, tendo um grupo R^ _au_ sente, forma uma ligação dissulfureto cistina, enquanto que

   se o valor do citado a-f ou g-1 for um, o citado grupo R^

   7-12 ³"^Γ

   ou Rg correspondente está presente;

   os citados grupos R^/f q^uando tomados individualmente, são as mesmas ou diferentes partes ligadas ao átomo de enxòfre do resíduo Cys e são seleccionados entre o grupo que consiste de hidrogénio, um grupo alquilo contenda 1 a cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituído contendo 2 a cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contendo 1 a cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído contendo 2 a cerca de 10 átomos de carbono;

   7-12

   os citados grupos R^ são os mesmos ou diferentes resíduos de amino ácidos alternativas de cada resíduo Cys imediatamente precedente;

   pelo menos dois de a-f e dois de g-1 são 0 e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de que o referido polipêptido sintático contenha pelo menos uma ligação intramolecular cistina dissulfureto formada de pelo menos dois resíduos Cys presentes; e

   "m" é um número inteiro de valor 0 ou 1 com a condição de que se "m" for zero estará ausente e se "m" for

   13 ^m

   um, R_m será escolhido entre o grupo consistindo numa cadeia que contêm de 1 atá cerca de 54 resíduos de amino ácidos, um grupo de ligação e a parte acilo de um ácido carboxilico cort tendo de 1 até cerca de 20 átomos de carbono formando uma li, gação amida com a amina do resíduo terminal amino.

   25 - Processo de preparação de uma vacina, de aco_r do com a reivindicação 24, onde a referida ligação intramole cular cistina dissulfureto á uma ligação intrapolipéptido

   ides de repetição estão li6 J ϋ

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   -148

   dissulfureto e as referidas unida gadas cabeça-a-cauda através de uma ligação amida formada e_n tre o grupo arnina do resíduo terminal amino de uma primeira unidade de repetição polipeptídica e o grupo carboxilo do resíduo terminal carboxilo de uma segunda unidade de repetição polipeptidica.

   26 - Processo de preparação de uma vacina, de aco_r do com a reivindicação 24, onde a referida ligação intramolecular cistina dissulfureto ê uma ligação interpolipéptido dissulfureto e as referidas unidades de repetição sao ligadas pela referida ligação interpolipéptido cistina dissulfureto formada entre os resíduos Cys das referidas unidades de rep.e tição polipeptídicas.

   27 - Processo de preparação de uma vacina compreejn dendo (a) uma quantidade efectiva de um polímero contendo uma pluralidade de unidades de repetição polipeptídica e (b) um diluente fisiologicamente tolerável, sendo as referidas unidades de repetição polipeptídica ligadas por ligações intramoleculares interpolipéptido cistina dissulfureto, incluindo as referidas unidades de repetição de polipéptido sintético a sequência de resíduo de amino ácido, tomada da esquerda p,a ra a direita e na direcção dum terminal amino para um terminal carboxilo, representada pela fórmula:

   R^-Cys(R?)Cys (R^) GluLeuCys (R?) Cys(R^D)Tyr( Asn) r|

   ProAlaiysÍR^jAlaCThrjGlyiysR^AsnÍTyr)

   onde os três resíduos específicos de amino ácido, entre parêntesis, são, cada um, uma alternativa ao resíduo de amino ácido imodiatamente precedente na referida sequência ;

   62 226 LICENSE NO Ref: EPG:

   . 46 3,359-12/16/8 3,₉ r 11-22.1

   -149do a-f ou ,7-12

   ou R

   9-1

   a-f e g-1 são números inteiros com um valor de zero

   a um, com a condição de que se o valor de qualquer a-f ou g-1 1—6 7—12

   for zero, o correspondente grupo R ou R , - estará ausen

   1-6 a—r g-1

   te e, quando um grupo R _f- estiver ausente, o átomo de enx_ò 3“ ί 1 — 6

   fre do resíduo Cys com um grupo ausente R₀ forma uma ligação cistina dissulfureto, enquanto que se o valor do refeg-1 for um, o referido correspondente grupo Κθ_ρ estará presente;

   os referidos grupos R^ ^-, quando considerados individualmente, são as partes, iguais ou diferentes, ligadas ao átomo de enxôfre do resíduo Cys e são escolhidos entre o grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo contendo de 1 a cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substi tuído contendo de 2 a cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contendo de 1 a cerca de 8 átomos de carbono e um grupo acilo substituído contendo de 2 até cerca de 10 átomos de car bono ;

   os referidos grupos ácidos, iguais ou diferentes, Cys imediatamente precedente;

   „7-12 «

   R , são os 9-1

   alternativ os

   resíduos de amino a cada resíduo

   pelo menos dois de a-f e dois de g-1 são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de que o referido polipéptido sintético contenha pelo menos uma ligação intramolecular cistina dissulfureto formada da, pelo menos, dois resíduos Cys presentes; e

   "m" ô um número inteiro com o valor de zero ou um,

   com a condição de que se "m" for zero R^³ estará ausente, e, 13 ^m

   se "m" for um, R^ será seleccionado entre o grupo consistin do de uma cadeia contendo de 1 até cerca de 54 resíduos de amino ácido, um grupo de ligação e a parte acilo de um ácido carboxílico contando de 1 até cerca de 20 átomos de carbono formando uma ligação amida com □ amina do resíduo terminal amino.

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   -150-

   28 - Processo de diagnóstico incluindo um primeiro reagente e um segundo reagente em recipientes separados, com preendendo o referido primeiro reagente um polipêptido sintjê tico, tendo o referido polipêptido pelo menos cerca de 10% da antigenicidade de uma enterotoxina biológica, termo-?estável, de Escherichia coli e incluindo a sequência de resíduos de amino ácidos, tomada da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, represeri tada pela fórmula:

   ProAlaCys (R^) Ala(Thr) GlyCysR^²Asn(Tyr)

   onde as três resíduos específicos de amino ácido, entre parêntesis, sãe cada um uma alternativa ao resíduo de amino ácido imediatamente precedente na referida sequência;

   a-f e g-1 são números inteiros tendo cada um o vja

   lor zero ou um, com a condição de que se o valor de qualquer 1—6 7—12

   a-f ou g-1 for zero, o correspondente grupo R _- ou R . 3—r 3*** 1

   estará ausente, e, quando um grupo R estiver ausente, □ a-r

   átomo de enxôfre do resíduo Cys tendo ausente um grupo R^“fforma uma ligação cistina dissulfureto, enquanto que se □

   valor dos referidos a-f ou g-1 for um, o referido correspon1—6 7—12

   dente grupo Rg2f- ^ou R Ζχ “ ^estará presente;

   1—6

   os referidos R_a2f quando considerados individualmente são partes iguais ou diferentes ligadas ao átomo de en xôfre do resíduo Cys e são escolhidos entre o grupo que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo contendo de 1 atê cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituído contendo de 2 atê cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo

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   LICENSE NO. 463,359-12/16/83 Ref: EPC: 11-22.1

   -151contendo de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e um grupo acilo substituído contendo de 2 até cerca de 10 átomos de carbono 5

   7-12

   os referidos grupos são resíduos de amino

   ácidos, iguais ou diferentes, alternativos a cada resíduo Cys imediatamente precedente;

   pelo menos dois de a-f e dois de g-l são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de que o referido polipéptido sintético contenha pelo menos uma ligação intramolecular cistina dissulfureto formada de pelo menos dois resíduos Cys presentes; e

   "m" ê um número inteiro, com o valor zero ou um,

   com a condição de que, se "m" for zero, R^ estará ausente, 13 ^m

   e, se "m" for um, 1/ será escolhido entre o grupo que consiste numa cadeia contendo de 1 até cerca de 54 resíduos de amino ácidos, um grupo de ligação e a parte acilo de um ác_i do carboxílico contendo de 1 até cerca de 20 átomos de carbono, formando uma ligação amida com a amina do resíduo ter minai amino;

   compreendendo o referido segundo reagente recepto res que imunoreagem com o referido polipéptido sintético e também imunoreagem com a referida enterotoxina biológica, termo-estável;; da Escherichia coli, fornecendo a mistura dos referidos primeiro e segundo reagentes, na presença de uma quantidade predeterminada de uma amostra a ser avaliada, uma quantidade de imunoreacção, sendo a referida quantj. dade de imunoreacção diferente de uma quantidade conhecida de imunoreacção quando uma enterotoxina termo-estável está presente na referida amostra a ser avaliada, sendo a referida quantidade de imunoreacção assinalada por meios indicado^ res.

   29 - Processo ds diagnóstico de acordo com a rei2 226

   ICZEGE f-JO. 463,359-12/16/83 ef: EPG: 11-22.1

   vindicação 28 onde os referidos meios indicadores compreendem rsceptores adicionais que imunoreagern com os receptores do referido segundo reagente, e em que os referidos recepto res adicionais estão ligados a uma identificação.

   30 - Processo de preparar uma vacina compreendendo os seguintes passos:

   (a) obter o polipêptido sintético da reivindicação 1;

   (b) ligar o referido polipêptido a um suporte para formar um conjugado; e

   (c) dissolver ou dispersar urna quantidade efectiva do referido conjugado num diluente fisiolo gicamente tolerável.

   31 - Processo de preparação de urna vacina compreeri dendo os seguintes passos:

   (p) obter o multímero sintético da reivindicação io; / (b) ligar o referido multímero a um suporte para formar um conjugado; e (c) dissolver ou dispersar uma quantidade efecti-

   va do referido conjugado nurn diluente fisiolo. gicamente tolerável.

   32 - Processo de preparação de uma vacina cornpreeri do os seguintes passos:

   (a) obter o multímero sintético da reivindicação 11; (b) ligar o referido multímero a um suporte para formar um conjugado; e (c) dissolver ou dispersar uma quantidade efectiva

   LICENGE ND. 463,359-l?/ló/S3

   Ref: EPG: 11-22.1

   -153do referido conjugado num diluente fisiolonicamente tolerável.

   33 - Processo de preparação de uma vacina compreeri dendo os seguintes passos:

   (a) obter o multimero sintático da reivindicação 12;

   (b) ligar o referido multimero a um suporte para formar um conjugado; e

   (c) dissolver ou dispersar uma quantidade efectiva do referido conjugado num diluente fisiolo gicamentc tolerável.

   34 - Processo de preparação de uma vacina, compreejn dendo os seguintes passos:

   (a) obter o multimero sintático da reivindicação 12; e

   (b) dissolver ou dispersar uma quantidade efectiva do referido multimero num diluente fisiol_o gicumente tolerável.

   35 - Processo de preparação de urn polímero sintáti co de estrutura em rede, com pelo menos cerca do 1D% da anti genicidade da enterotoxina termo-estável da Escherichia coli, compreendendo uma pluralidade de unidades de repetição de p_g lipóptido incluindo a sequênciar de resíduos de amino ácidos, tomado da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, representada pela fórmula

   LICEN3E NC. 463,359-12/ló/33 Ref: EPG: 11-22.1

   -15412,

   ProAlaCys(R^)fila(Thr)GlyCysR^zzAsn(Tyr)

   onde os três resíduos específicos de amino ácidos, entre parêntesis, constituem, cada um, uma alternativa ao re síduo de amino ácido imediatamente precedente na referida sequência

   a-f e g-1 são números inteiros tendo, cada um, o

   valor zero ou um, com a condição de que, se o valor de qual.

   quer a-f ou g-1 for zero, o correspondente grupo R’'‘"’p- ou 7-12 1-6 ει—r

   RgZi - ^estará ausente, e quando um grupo estiver ausente, o átomo de enxêfre do resíduo Cys tendo ausente um

   1-6

   _a forma uma ligação cistina dissulfureto, enquanto que se o valor do referido a-f ou g-1 for um, o referido corres_J 4- _ol-6 „7-12

   pondente grupo R_a ~~ ou R^

   estará presente;

   os referidos grupos Rg"p quando considerados ind.i vidualmente são as partes, iguais ou diferentes, ligadas ao átomo de enxêfre do resíduo Cys e são escolhidos entre o gru. po que consiste em hidrogénio, um grupo alquilo contendo de 1 atê cerca de 4 átomos de carbono, um grupo alquilo substituído contendo de 2 até cerca de 20 átomos de carbono, um grupo acilo contando de 1 até cerca de 8 átomos de carbono, e urn grupo acilo substituído contendo de 2 até cerca de 10 átomos de carbonoj

   os referidos grupos ácidos, iguais ou diferentes, imediatamente precedente;

   R^7-}² são g-i

   alternativ

   resíduos de amino os ao resíduo Cys

   pelo menos dois de a-f e dois de g-1 são zero e dois resíduos Cys estão presentes com a condição de que o referido polipêptido sintético contenha pelo menos uma liga ção intramolecular cistina dissulfureto formada de pelo menos dois resíduos Cys presentes; e

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   LICENSE NO. 463,359-12/16/83 Ref: EPG: 11-22.1

   -155"m" δ um número inteiro com o valor zero ou um,

   13

   com a condição do que se "m" for zero R estará^usente e, 13 ^ίΠ

   se "m" for um, será escolhido entre o grupo que consiste numa cadeia contendo de 1 até cerca de 54 resíduos de amino ácidos, um grupo de ligação, e a parte acilo de um ácido carboxílico contendo de 1 a cerca de 20 átomos de ca_r bono formando uma ligação amida com a amina do resíduo terminal amino5

   sendo a referida pluralidade de unidades de repetição ligada entre si por ligações cruzadas vindas das liga ções intramoleculares, interpolipéptido cistina dissulfureto.

   36 - Processo de preparação do polimcro sintético de estrutura em rede, de acordo com a reivindicação 35, onde

   todos os referidos a-f são zero; todGs os referidos g-1 são zero; o referido "m" ê um; e

   o referido R^ g _um pgptido contendo a sequência residual de amino ácidos dos quatro resíduos terminais amino da ST Ib.