PT764046E - Metodo e dispositivo para misturar liquidos - Google Patents

Description

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DESCRICÀO “Método e dispositivo para misturar líquidos”

Antecedentes do invento 1. Campo do invento O presente invento refere-se a métodos e aparelhos para misturar e manejar pequenos volumes de líquido. Tal como é usado aqui e através da descrição e das reivindicações orientadas para este invento, o termo “líquido” abrange líquidos isolados e líquidos contendo matéria em partículas, qualquer que seja a sua natureza. O aparelho e o método de acordo com o presente invento tem particular aplicação em situações onde são usados e processados pequenos volumes de líquido. Um exemplo disto é o laboratório clínico onde são usados analisadores químicos com amostras líquidas que são adicionadas a reagentes e misturadas em copos de reacção separados. Estes copos de reacção são tipicamente moldados em plástico com aproximadamente as dimensões e a forma de um dedal de costura. Algumas vezes têm uma forma especial de modo a incluírem múltiplos compartimentos, janelas de observação para fins ópticos, ou são conformados para centrifugação. Habitualmente, nalgumas formas de mecanismo automático são carregados manualmente, embora tenham sido construídos carregadores automáticos. Têm sido construídos mecanismos complicados para deslocar os copos entre diferentes pontos de modo que possam ser realizadas várias operações conforme sejam exigidas pelo método de análise. No fim da análise, têm de ser retirados cuidadosamente para impedir o derramamento de materiais que podem constituir um perigo biológico. Habitualmente os volumes dos copos são bastante grandes, atingindo centenas de microlitros. A mistura da amostra com os reagentes pode ser feita de várias maneiras: emprego de forças centrífugas, turbulência devida a descarga hidráulica, barras magnéticas de agitação ou lâminas ou pás de agitação que precisam de ser limpas entre as sucessivas amostras. Os copos de plástico independentes têm paredes moderadamente espessas e uma condutibilidade térmica deficiente, o que toma difícil o rápido equilíbrio de temperatura mesmo com banhos-maria. Adicionalmente, os copos independentes podem ter um preço relativamente elevado que vai de um a vários cêntimos (de dólar) por peça.

Como depois se descreve mais completamente, têm sido feitas diversas tentativas para evitar o uso dos recipientes acima descritos. Um dos problemas mais difíceis que se

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ encontra quando se procura evitar estes recipientes é proporcionar uma mistura apropriada quando os fluidos são combinados. Numa abordagem são colocados pequenos volumes de fluido sobre um suporte deformável que pode ser deformado para constituir uma cavidade, conseguindo-se assim misturar os líquidos contidos no pequeno volume. Noutra abordagem os líquidos são aplicados em pequenas bolhas a um suporte para formar a mistura, as quais são agitadas soprando um gás sobre o líquido.

Como se verá melhor através da descrição do invento que segue, o presente invento proporciona um sistema de manejo que minimiza, diminui ou resolve completamente os problemas apresentados pelos dispositivos da arte anterior. Por exemplo, é possível manejar volumes de líquido muito pequenos, mesmo volumes de amostra inferiores a 50 microlitros. O aparelho promove a mistura da amostra líquida dentro de si próprio ou, se misturada com um ou mais reagentes, sem utilizar qualquer misturador externo que esteja em contacto com a mistura reaccional. Adicionalmente, o sistema dá um aparelho que promove uma boa condutibilidade térmica de modo que são minimizados os gradientes de temperatura através do sistema mistura. O sistema apresenta adicionalmente uma maneira simples e segura de dispor dos materiais usados e proporciona baixos custos através do uso de descartáveis e reduzidos custos de exploração ou custos da máquina devido à ausência de copos de reacção separados.

Nos dias de hoje, a instrumentação de ensaio clínico exige numerosos componentes descartáveis, quantidades relativamente grandes de reagentes, múltiplos passos para assegurar que todos os componentes re-usados são lavados e quantidades relativamente grandes de amostra. A finalidade do presente invento é minimizar o uso de reagentes e amostra, eliminar tampões, soluções de lavagem e a maioria dos descartáveis, diminuir o tamanho, a complexidade e o preço da instrumentação e reduzir o volume de resíduos sem interferir no rendimento do ensaio. Tudo isto é conseguido sem evaporação dos líquidos ou o uso de um suporte deformável. 2. Descrição da arte relacionada A patente U.S. N° 3,854,703 (Gibbs, et al.) descreve um método e um aparelho para promover a reacção entre um espécime líquido e um reagente líquido. Tal reacção é promovida aplicando os líquidos a uma superfície de suporte impermeável aos líquidos para formar uma mistura sobre a mesma. A mistura líquida é agitada dirigindo um jacto de fluido gasoso vindo da saída de uma conduta de alimentação de modo a colidir com a mesma, dando lugar a movimento relativo entre a saída e a superfície de suporte. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ j

Um sistema de manejo de fluido está descrito na patente U.S. N° 4,676,656 (Cook, et ai). Um pequeno volume de fluido é colocado sobre um suporte deformável reversivelmente que é deformado para formar uma cavidade. A medida que o fluido se prende à superfície do suporte, é agitado fisicamente e misturado à medida que o suporte é deformado. O suporte deformável pode ser utilizado para proporcionar recipientes de fluido de tamanhos variáveis, a fim de receberem diferentes volumes de fluido, à medida que um mecanismo de transporte desloca fluido de um local para outro. A patente U.S. N° 3,479,141 (Smythe, et al.) descreve um sistema de transporte para um aparelho automático de análise para uma série de amostras líquidas aquosas processadas como uma corrente fluente, sem ou com contaminação mínima entre as amostras. São empregados uma conduta de hidrocarboneto fluoretado e segmentos de silicone inter-amostra. O silicone humedece e adere à conduta de hidrocarboneto fluoretado enquanto que as amostras líquidas aquosas não o fazem. Onde são necessários a humectação e o contacto da conduta com as amostras, e em diálise, são utilizados vidro e/ou celofane, que as amostras líquidas aquosas humedecem e o silicone não.

Um aparelho medidor está descrito na patente U.S. N° 4,121,466 (Reichler, et ai). O aparelho é adaptado como um distribuidor ou um amostrador, estando a superfície da sonda de aspiração revestida com uma película delgada de líquido imiscível, com os líquidos a serem aspirados. A película imiscível delgada impede a contaminação entre segmentos de líquidos aspirados sucessivamente e também das suas fontes respectivas. Ainda, segmentos do líquido imiscível podem ser aspirados entre segmentos sucessivos de líquido para manter estes segmentos de líquido separados.

Smith, et ai, descrevem “An innovative technology for ‘random-acess’ sampling”, em Clin. Chem., 28(9), 1867-1872 (1982). É usado um fluido imiscível não reagente como uma barreira positiva entre a amostra líquida e o reagente e as superfícies interior e exterior das suas sondas respectivas, proporcionando uma superfície inerte deformável que simultaneamente impede o arrastamento e assegura a distribuição rigorosa. A patente U.S. N° 3,526,480 descreve um analisador químico automático no qual porções medidas de material de amostra são transferidas de um transportador de amostras para locais separados contendo reagente sobre uma fita analítica. O aparelho é particularmente apropriado para a transferência de uma pluralidade de locais separados e 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 4

diferentes contendo reagente. São descritas fitas analíticas perfuradas bem como locais contendo reagente que têm os reagentes adsorvidos quimicamente. A patente U.S. N° 4,575,485 (Sizto, et al.) descreve imuno-reacções ultra-sónicas melhoradas. As taxas de ligação entre os membros de um par específico de ligação, e.g., ligando-receptor, são muito melhoradas por aplicação de ultra-sons de curta duração a um meio aquoso que contém o par específico de ligação. As taxas melhoradas têm partículas utilização nos ensaios específicos de proteína de ligação. A patente U.S. N° 4,930,898 (Miller-Ihli) descreve um aparelho e um processo para a mistura ultra-sónica directa de uma amostra, utilizando uma sonda ultra-sónica inserida directamente na amostra.

Um primeiro aspecto do presente invento é um método para misturar dois ou mais líquidos. O método compreende: (a) formar uma gota de líquido que contém os referidos dois ou mais líquidos sobre uma superfície, sendo a referida gota de líquido retida sem recipiente sobre a referida superfície, e sendo a referida superfície essencialmente impermeável e não reactiva com a referida gota de líquido, e (b) aplicar energia electrostática, energia acústica ou energia oscilatória mecânica às referidas gotas misturando assim os referidos líquidos, caracterizado pelo facto de que a referida superfície é sensivelmente plana e sensivelmente não elástica e de que é aplicada energia electrostática, acústica ou oscilatória mecânica às referidas gotas, sem contacto físico com as referidas gotas além do exercido pela referida superfície. A gota pode ser obrigada a deformar-se num ambiente com corrente de ar essencialmente nula.

Um segundo aspecto do presente invento é um aparelho para misturar dois ou mais líquidos. O aparelho compreende: (a) uma superfície que é substancialmente impermeável aos referidos líquidos e não reactiva com os mesmos, (b) um distribuidor para distribuir os referidos líquidos sobre a referida superfície para formar uma gota, a qual é retida sem recipiente sobre a referida superfície, e

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ (c) meios para obrigar a referida gota a deformar-se sem deformar a referida superfície, misturando assim os referidos líquidos, sendo os referidos meios escolhidos no grupo constituído por energia acústica, energia electrostática ou energia oscilatória mecânica, caracterizado pelo facto de que a referida superfície (12) é sensivelmente plana e sensivelmente não elástica, e de que os referidos meios para obrigar a referida gota (14) a deformar-se são capazes de obrigar a referida gota a deformar-se sem haver contacto físico com os referidos líquidos além do exercido pela referida superfície.

Outro método de acordo com o presente invento refere-se ao transporte de amostras e reagentes líquidos através de um aparelho automático de análise e à mistura da amostra e dos reagentes durante o transporte. Um suporte sensivelmente não elástico e sensivelmente plano é deslocado passando por uma ou mais sondas que distribuem amostra e reagentes sobre o suporte para formar gotas constituídas, cada uma, por amostra e reagentes. É aplicada às gotas energia electrostática. energia acústica ou mecânica oscilatória sem contacto físico com as gotas, para assim misturar a amostra e os reagentes de acordo com o invento.

As gotas podem depois ser deslocadas para uma zona de detecção. As gotas podem estar num ambiente com corrente de ar essencialmente nula durante pelo menos os passos de formação e mistura.

Um aparelho automático de análise de acordo com o presente invento para misturar dois ou mais líquidos e para analisar automaticamente uma pluralidade de amostras compreende um aparelho para misturar dois ou mais líquidos de acordo com o segundo aspecto do invento e um analisador para analisar as referidas gotas, no qual existe um suporte rígido para a referida superfície sensivelmente plana, e a referida superfície é móvel; o referido distribuidor compreende uma ou mais sondas de distribuição de líquido para distribuir uma amostra e reagentes sobre a referida superfície para formar uma referida gota ou gotas, superfície esta que é sensivelmente impermeável aos referidos amostra e reagentes, e não reactiva com os mesmos, e os referidos meios para causar a deformação da gota não provocam evaporação e não distendem sensivelmente a referida superfície.

Outro aspecto do presente invento é um método para misturar dois ou mais líquidos e para detectar a presença ou quantidade de um objecto da análise numa amostra de líquido suspeito de conter objecto da análise. O método inclui deslocar uma superfície sensivelmente plana para passar por uma ou mais sondas que distribuem amostra e reagentes sobre a 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 6

superfície para formar gotas. Cada gota é constituída por uma amostra e reagentes, sendo um dos reagentes um reagente marcado ou um reagente capaz de ser marcado. E aplicada energia electrostática, energia acústica ou energia mecânica oscilatória às gotas sem contacto físico com as gotas para assim misturar a amostra e os reagentes de acordo com o primeiro aspecto do invento. A seguir, as gotas são incubadas sobre a superfície e a quantidade de sinal gerado pelo reagente marcado é determinada sem se retirar a gota da superfície. A quantidade deste sinal é relacionada com a presença ou quantidade do referido objecto da análise na referida amostra.

Outro aspecto do presente invento é um método para misturar dois ou mais líquidos e para detectar luz emitida por um meio líquido submetido a foto-activação. O meio liquido é constituído por dois ou mais líquidos misturados de acordo com o primeiro aspecto do presente invento. O método compreende: (a) aplicar o referido meio líquido a um suporte sensivelmente plano e sensivelmente não elástico e transparente, sendo o referido meio líquido retido sobre o mesmo sem recipiente, sendo o referido suporte sensivelmente impermeável ao referido meio líquido e não reactivo com o mesmo, (b) posicionar o referido suporte de tal modo que o referido meio líquido e referido suporte ficam entre duas superfícies reflectoras que sensivelmente envolvem o referido meio líquido, tendo pelo menos uma das referidas superfícies uma abertura para a luz emitida do referido meio líquido atingir um fotodetector constituído por um tubo fotomultiplicador que tem um obturador, (c) submeter o referido meio líquido a foto-activação com o referido obturador fechado, e (d) abrir o referido obturador e detectar, por meio do referido tubo fotomultiplicador, a luz emitida pelo referido meio líquido.

Outro aspecto do presente invento é um dispositivo para misturar dois ou mais líquidos e para detectar a luz emitida de um meio líquido submetido a foto-activação. O dispositivo consiste num aparelho para misturar dois ou mais líquidos de acordo com o segundo aspecto do invento, no qual a referida superfície é transparente e o referido dispositivo inclui (a) um fotodetector que compreende um tubo fotomultiplicador que tem um obturador e (b) duas superfícies reflectoras posicionadas em relação à referida superfície

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ transparente de tal modo que um meio aplicado a referida superfície transparente fica entre as referidas paredes reflectoras, as quais rodeiam sensivelmente o referido meio, tendo pelo menos uma das referidas superfície reflectoras uma abertura para a luz emitida do referido meio atingir o referido fotodetector, estando o referido meio retido sem recipiente sobre a referida superfície transparente.

Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 é uma vista por cima de uma concretização do presente invento. A Fig. 2 é uma vista lateral da concretização da Fig. 1, sem a correia serpentina que contém as tinas da amostra. A Fig. 3 é uma vista por cima de outra concretização do presente invento. A Fig. 4 é uma representação de gotas criada durante um ensaio para dioxina, utilizando uma concretização do presente invento.

Descricão das concretizações específicas O presente invento proporciona uma mistura eficaz de volumes muito pequenos de líquido, tais como 50 microlitros ou menos. O invento tem aplicação particularmente em aparelhos automáticos de análise como os usados para realizar ensaios automatizados. Neste aspecto o invento proporciona acesso aleatório a amostras e reagentes líquidos para realizar tais ensaios e para transportar tais amostras e reagentes através do aparelho, enquanto ao mesmo tempo se misturam as amostras e os reagentes e se proporciona a detecção de um sinal. Todos os passos acima são realizados usando técnicas não evaporativas e sem necessidade de um recipiente ou de um suporte deformável. Os benefícios do presente invento são conseguidos formando uma gota de líquido que contém dois ou mais líquidos sobre uma superfície sensivelmente plana e obrigando a gota a deformar-se num ambiente com corrente de ar sensivelmente nula e sem se deformar a superfície. As vias preferidas particularmente para deformar a gota são a aplicação de energia electrostática ou energia acústica à gota. O presente invento permite minimizar a utilização dos reagentes e da amostra, eliminar tampões, soluções de lavagem e muitos dos descartáveis, diminuir o tamanho, a complexidade e custo da instrumentação e reduzir o volume de resíduos sem interferir no rendimento dos ensaios.

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 8 A seguir são descritas em detalhe concretizações específicas do presente invento em referência aos desenhos juntos a título de ilustração e não de limitação. Na Fig. 1 e na Fig. 2 está representada uma concretização particular do invento. O aparelho de manejo de fluido 10 compreende um primeiro suporte 12 para se depositar gotas de líquido 14 sobre o mesmo. O suporte 12 é sensivelmente plano, sensivelmente não elástico e geralmente impermeável aos líquidos depositados. A expressão "sensivelmente plano” significa que o plano da superfície 12 é tal que as gotas de líquido colocadas sobre o mesmo não serão obrigadas a deslocar-se por gravidade do ponto de depósito, em qualquer grau apreciável. Na concretização as gotas de líquido preferivelmente permanecem no ponto de depósito.

Além disso, o suporte 12 está sensivelmente isento de membros de ligação, i.e., um membro de um par de ligação específica que tenha uma área na superfície ou numa cavidade a que se ligue especificamente e é por isso definido como complementar de uma organização espacial e polar partículas do outro membro do par. Os membros do par de ligação específica são denominados de ligando e receptor (anti ligando). Estes podem ser membros de um par imunológico tal como antigénio-anticorpo ou podem ser membros de pares tais como operador-repressor, nuclease-nucleótido, biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, duplexos de ácido nucleico. IgG-proteína A e análogos. O suporte 12 é fabricado com um material que é relativamente não elástico e sensivelmente impermeável aos líquidos depositados e não reactivo com os mesmos. O suporte é construído de tal modo que não é facilmente distendido ou deformado num grau maior que o necessário para poder ser enrolado numa bobina, numa concretização em que o suporte está alojado numa caixa. Além disso, a superfície 12 não proporciona qualquer interacção química específica, tal como interacções antigénio-anticorpo, desta superfície com os componentes da amostra líquida ou dos reagentes líquidos, e pode ser humedecida ou não pelos líquidos. Materiais apropriados para o suporte 12 são, a título de exemplo e não de limitação, poliestireno, poliuretano, “nylon”, poliésteres, polimetacrilato, polietileno, polipropileno, polifluorocarbonetos, nitrocelulose, acetato de celulose, etc.. Preferivelmente, o material é transparente e incolor ou pode ser opaco, sendo então habitualmente branco ou negro. Para certos métodos é conveniente usar um suporte que esteja revestido, por exemplo, metalizado num ou nos dois lados. Este revestimento pode ser usado para controlar a reflectividade, fenómenos electrostáticos, etc., ou podem ser proporcionados padrões que resultam em contactos eléctricos com a amostra, que permitem um processo electrolítico, uma medição foto-acústica ou produção de alinhamentos de difracção.

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ A espessura do suporte 12 έ habitualmente de cerca de 0,05 a 1 mm, preferivelmente 0,1-0,5 mm. A espessura particular escolhida dependerá da resistência do material escolhido e pode também depender da capacidade do material para conduzir calor e energia electrostática ou acústica. E evidente que a espessura do suporte deve ser tal que permita ao suporte manter a sua integridade durante a utilização no presente invento. A largura do suporte é determinada geralmente pela aplicação particular em que o invento é usado tal como num aparelho de análise automatizado. Nesta última situação, o suporte pode ser proporcionado como uma fibra, uma tira, lima folha ou uma fita flexível que possam ser enroladas num rolo ou fornecidas em caixa para facilitar a distribuição. Neste caso, o suporte 12 pode ser recolhido por um rolo na saída do aparelho. A largura da tira nestas circunstâncias é de 0,1 a 250 mm, preferivelmente de 10 a 125 mm. Em geral, é preferível que a espessura e a largura da tira sejam relativamente uniformes.

Nalgumas circunstâncias pode ser importante assegurar que o suporte 12 esteja sensivelmente isento de carga electrostática. Para este fim a superfície pode ser revestida com detergentes iónicos, ou metalizada, ou a carga pode ser controlada através de ligação à terra, esfregando com um material condutor ou sujeição à irradiação com partículas alfa.

Na Fig. 1, o suporte 12 tem a forma de uma fita flexível que está alojada numa caixa 16 e é recolhida numa caixa 18. A fita proporciona o transporte através do aparelho 10. Podem ser empregados mecanismos convencionais para accionar as fitas, tais como rodas dentadas e perfurações na fita, accionamento por atrito, rotação do carreto receptor na caixa, etc.. Adicionalmente, o comando destes mecanismos de accionamento usando unidades técnicas de microprocessador pode ser convenientemente aplicado para proporcionar sistemas automatizados. Desta maneira é mantida a deslocação suave do suporte através do aparelho. Esta concretização particular permite que todo o líquido sobre a superfície do suporte bem como as porções usadas do suporte sejam recolhidas na caixa de uma maneira segura para eventual descarte. E evidente que na anterior concretização o único artigo descartável é a caixa que contém o suporte e os líquidos usados. Não existe a necessidade de soluções especiais de lavagem para limpar qualquer dos componentes do presente dispositivo. Qualquer amostra ou reagentes que possam ter aderido à pipeta são expulsos usando uma minúscula quantidade de líquido imiscível e, como acima se mencionou, todos os líquidos são recolhidos na caixa. Evidentemente, está dentro do âmbito do presente invento deslocar o suporte 12 através de uma estação de recolha de resíduos para retirar o líquido do suporte por aspiração ou de outro modo. Caso se queira, a porção do suporte que foi usada pode ser cortada e posta num recipiente apropriado para disposição segura. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 10

Para simplificar, apenas um suporte está representado na Fig. 1, mas deve-se compreender que num aparelho analítico de acordo com o presente invento pode estar presente uma pluralidade de suportes. Opcionalmente, o suporte 12 pode ser suportado por um suporte rígido 20 (representado em parte na Fig. I e completo na Fig. 2) que pode ser feito de qualquer material que proporcione rigidez, tal como plástico rígido, metal, cerâmica ou análogo. O suporte rígido 20 pode ter a mesma largura que o suporte 12 ou pode ser mais largo ou mais estreito que o suporte 12, habitualmente não mais que 50% mais largo ou mais estreito. Altemativamente, o suporte rígido 20 é dotado com arestas arredondadas, contas, ressaltos ou secções mais espessas, para proporcionar rigidez ao suporte 12 quando o suporte 12 não é feito de material rígido. Deve-se ter presente que a rigidez do suporte 12, quer por si próprio ou através da utilização do suporte rígido 20, tem de corresponder ao tipo de mecanismo de avanço. Pode ser usada uma cobertura 15 para proteger o suporte 12 e o seu conteúdo durante a utilização. Aberturas 17 permitem o acesso de pipetas 22 e 24 ao suporte 12. A cobertura 15 pode ser feita de qualquer material adequado correspondente ao seu uso tal como plástico, metal como o alumínio, e assim por diante.

Está abrangido no âmbito do presente invento que o suporte 12 não seja móvel, embora isto seja menos preferido. Nesse caso os diversos dispositivos que têm de cooperar com o suporte são móveis. Altemativamente, o suporte 12 pode ser um disco ou uma placa descartável que possa ser montada num sistema de transporte tal como um carrocei. Noutra concretização, o suporte 12 pode ser uma placa separada suficientemente grande para acomodar as gotas de poucos ensaios, e.g., um a três. Num aspecto desta última concretização, a placa de suporte é inserida num mecanismo de transporte associado com o suporte rígido 20 e inclui como parte integrante um recipiente para uma única amostra em vez de tinas 28. O aparelho 10 compreende também meios de distribuição de líquido como as pipetas 22 e 24 para distribuir a amostra e os reagentes líquidos na forma de gotas 14 sobre a superfície do suporte 12. Bombas 23 e 25, que podem ser por exemplo bombas peristálticas medidoras ou seringas, cooperam por meio de tubos 46 e 47 com as pipetas 22 e 24 respectivamente, para permitir a aspiração e a distribuição de líquido sobre o suporte 12. Exemplos de outras bombas que podem ser utilizadas no presente invento são as capilares, piezoeléctricas, de compressão e análogas. O volume total de líquido nas gotas 14 devido à amostra e aos reagentes é habitualmente de cerca de 1 a 100 microlitros, preferivelmente menos de 50 microlitros, e habitualmente cerca de 15 a 40 microlitros. As pipetas incluindo as suas pontas habitualmente não são descartáveis. Na arte, estas pipetas são convencionais. A pipeta 22 comunica com distribuidores de amostra líquida ou tinas 28 contendo amostras a 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 11

serem testadas, as quais são transportadas passando pela pipeta 22, por meio de uma correia serpentina móvel 26. O movimento da correia 26 está programado para apresentar cada amostra com um intervalo predeterminado. A programação da correia móvel está coordenada com a programação do suporte 12, que pode ser programada com uma velocidade predeterminada, de modo a permitir períodos apropriados de incubação baseados num protocolo particular para um ensaio. As diversas partes do aparelho 10 podem ser programadas, individual ou conjuntamente de modo que a distribuição de líquido seja função da posição do suporte 12 conforme indicada pelos meios de programação. Por exemplo, para ensaios típicos a deslocação do suporte 12 pode ser programada para ser feita à razão de 1 a 10 vezes por minuto.

As pipetas 22 e 24 são deslocadas horizontal e verticalmente por meio de braços actuadores (não representados) segundo prática bem conhecida. O aparelho 10 também tem caixas de reagente 30 e 32 que contêm reagentes líquidos para realizar um ensaio. Normalmente os reagentes líquidos são diluídos previamente até uma certa concentração. As caixas 30 e 32 estão sobre a plataforma 33 que oscila para trás e para a frente, de modo que as pipetas 22 e 24 possam comunicar com as caixas 30 e 32 para adicionar reagentes líquidos às gotas 14. O movimento da plataforma 33 é programado de modo a estar coordenado com o movimento do suporte 12 assegurando que os ensaios prosseguem de uma maneira desejada.

Habitualmente, as pipetas 22 e 24 são tratadas para que o interior e o exterior das extremidades de entrada ou pontas, respectivamente 19 e 21, destas pipetas sejam mantidos humedecidos com um líquido imiscivel com o líquido a ser distribuído. O líquido imiscível está contido num depósito 27. A comunicação entre as pipetas 22 e 24 e o depósito 27 é realizada por meio dos tubos 29 e 31, respectivamente. Uma maneira de manter as pipetas humedecidas com o líquido imiscível é descrita por Reichler (supra). Para este fim, uma película fina de líquido, que é caracterizado por ser imiscível com os líquidos a serem distribuídos, é proporcionada sobre as superfícies periférica e interior das pipetas 22 e 24. A película fina tem habitualmente uma espessura de cerca de 0,001 a 1 mm, preferivelmente de 0,01 a 0,1 mm. A camada fina preferivelmente humedece as paredes periférica e interna da pipeta para excluir os líquidos a serem distribuídos. Afim de conseguir este efeito, o líquido imiscível pode ser passado pela superfície interna, podendo a superfície periférica ser humedecida por atracção superficial, ou o líquido passado pelas superfícies periféricas e o que escorre pode ser aspirado pela pipeta, ou a pipeta pode ser mergulhada num depósito deste líquido imiscível. O líquido imiscível pode ser fornecido à ponta da pipeta a partir de 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 12

um acesso diferente daquele através do qual a amostra e/ou os reagentes são fornecidos à pipeta. Contudo, o líquido imiscível pode ser fornecido através do mesmo acesso. O peso específico do líquido pode ser maior ou menor que o dos líquidos a serem distribuídos. A natureza do líquido imiscível depende do material que constitui as superfícies das pipetas 22 e 24. O líquido tem de ser capaz de humedecer o material que habitualmente será relativamente hidrófobo, isto é, preferivelmente será mais facilmente humedecido pelo líquido que pelas amostras normalmente aquosas. Os líquidos imiscíveis podem incluir óleos de silicone, óleos minerais ou vegetais, óleos de fluorocarbonetos, etc., sendo a principal condição que sejam relativamente imiscíveis com a água e tenham baixa volatilidade abaixo de 50°C. Como é preferível que os componentes da solução de teste tenham pouca afinidade com o óleo, habitualmente são preferidos óleos de fluorocarbonetos e de silicone. Preferivelmente, o líquido imiscível tem uma viscosidade de lxlO"7 - 5x10“ m:/s (0,1-500 centistokes) preferivelmente de lxl O'6 - lxl O'4 nr/s (1-100 centistokes), dependendo a viscosidade usada do líquido imiscível particular, e.g., um fluorocarboneto de viscosidade mais baixa em relação à viscosidade do óleo de silicone. Líquidos imiscíveis tendo uma viscosidade na extremidade inferior da gama anterior podem exigir mais limpeza das pontas que os da extremidade superior da referida gama. Mais detalhes sobre este assunto podem ser encontradas na patente U.S. N° 4,121,466 (Reichler), cuja descrição é aqui incorporada na totalidade como referência. Em caso algum pode haver qualquer interacção química do líquido imiscível na pipeta com a amostra líquida ou os reagentes líquidos. Habitualmente, as gotas 14 contêm não só a amostra líquida e os reagentes líquidos mas também algum líquido imiscível.

As gotas 14 são retidas sobre a superfície do suporte 12 sem recipiente. A expressão “retida sem recipiente” significa que as gotas 14 não estão encerradas em recipientes separados que tenham paredes ou barreiras físicas que delimitem o líquido. As gotas 14 são mantidas sobre a superfície do suporte 12 principalmente por meios diferentes da gravidade, tais como interacções electrostáticas e tensão superficial. A área adjacente aos pontos de distribuição de líquidos preferivelmente não terá uma barreira mecânica que contacte com a gota. Onde tal barreira é usada, a sua principal função é impedir a gota de deslizar ao longo da superfície. Para esta finalidade a superfície é dotada de depressões pouco fundas ou de elementos ligeiramente elevadas e, portanto, as gotas estão em contacto com a superfície até menos de 50% da sua altura, normalmente menos de 10% da sua altura. Está dentro do âmbito do presente invento a utilização de uma superfície que tenha uma afinidade diferente para os líquidos diferente da porção de superfície sobre a qual as gotas 14 são aplicadas, afim de ajudar a manter as gotas como entidades separadas. Outros meios seriam a aplicação de

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 13 um anel de material (camada muito fina) que impeça a humectação com óleo ou água, obrigando assim as gotas a ficarem onde são colocadas. O método para a mistura de acordo com o presente invento emprega a interacção de uma força deformadora aplicada exteriormente e as forças restauradoras de coesão (tensão superficial) da gota. A força externa é pulsatória para que ocorra uma deformação oscilante rápida da gota. São possíveis muitos modos de deformação oscilante e distinguem-se pelos alinhamentos de movimento relativo das diversas regiões da superfície da gota. A frequência, a forma de onda e a amplitude da força pulsatória externa, juntamente com a superfície e o conjunto de propriedades da gota, determinam o modo de deformação oscilante. Uma mistura rápida e eficaz exige a escolha apropriada destes parâmetros de controlo da força externa. A força externa pode ser electrostática ou mecânica. Uma força electrostática pulsatória ou um campo eléctrico oscilante podem ser aplicados carregando e descarregando alternadamente eléctrodos dispostos na vizinhança da gota. Uma força mecânica pulsatória pode ser aplicada deslocando a fita de suporte com um actuador accionado por uma bobina de voz, uma membrana piezoeléctrica ou outro transdutor electromecânico oscilatório. A amostra líquida e os reagentes líquidos são misturados num ambiente com corrente de ar essencialmente nula, para evitar a evaporação e o movimento das gotas que não sejam os convenientes para o presente invento. A expressão “ambiente com corrente de ar essencialmente nula” significa que o movimento do ar no dispositivo 10 na área em que os líquidos estão a ser misturados é insuficiente para provocar a deslocação ou a deformação das gotas de líquido 14. Também para evitar evaporação, a superfície 12 habitualmente é coberta para proporcionar um espaço mínimo para o ar acima das gotas embora proporcionando ainda acesso para a aplicação da amostra e dos reagentes. O dispositivo 10 também inclui meios 36 e 38 para misturar a amostra líquida e os reagentes líquidos em gotas 14 de acordo com o presente invento. Geralmente, os líquidos são misturados deformando as gotas 14 e isto habitualmente é executado sem distensão sensível do suporte 12. Consequentemente, embora o suporte 12 possa ser fino, e nalgumas circunstâncias flexível, o suporte 12 deve permanecer sensivelmente indeformado de modo que as dimensões de qualquer segmento do suporte 12 permaneçam sensivelmente inalteradas, habitualmente com alteração inferior a 10%, preferivelmente inferior a 1% de qualquer dimensão durante a mistura da amostra. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 14

Exemplos dos meios 36 são meios para aplicar energia electrostática ou acústica às gotas 14. A energia electrostática pode ser aplicada submetendo as gotas 14 a um campo eléctrico variável que induz a polarização das gotas 14, do que resulta a deformação das mesmas. O campo eléctrico variável pode ser produzido mudando alternadamente a polaridade de um condensador. Da deformação das gotas 14 resulta a mistura da amostra líquida e dos reagentes líquidos. Não é necessário contacto físico com as gotas 14. A frequência e a potência do campo eléctrico dependem do tamanho, viscosidade e tensão superficial da gota, quantidade de líquido imiscível em contacto com a gota, características da superfície 12 e análogos e habitualmente são determinadas empiricamente. Normalmente, a frequência do campo eléctrico é de cerca de 5 a 50.000 Hz, preferivelmente de 15 a 1.000 Hz e mais preferivelmente de 20 a 500 Hz. A potência do campo é habitualmente de 500 a 20.000 volts por centímetro, preferivelmente de cerca de 1000 a 10.000 volts por centímetro. O tempo de aplicação da energia do campo eléctrico pode variar, conforme a frequência e a potência do campo, de cerca de l a 60 segundos, preferivelmente a cerca de 5 a 20 segundos. A frequência, a potência do campo e o tempo são escolhidos de modo a não terem um efeito pernicioso sobre a amostra, os reagentes ou o rigor do ensaio.

Quando é aplicada energia acústica às gotas para misturar os líquidos, os factores acima numerados em relação ao uso de um campo eléctrico também são aplicáveis. Normalmente, a vibração necessária para misturar pode ser conseguida através do uso de energia sónica ou subsónica. Para este fim, as gotas 14 podem ser submetidas a uma frequência de cerca de 20 a 20.000 Hz, preferivelmente 20 a 2.000 Hz. A potência depende geralmente de diversos factores incluindo como a potência é ligada à gota e ao suporte. Consequentemente, a potência será determinada para cada aplicação usando os anteriores parâmetros e linhas de orientação. O tempo de aplicação da energia acústica pode variar, conforme a frequência e a potência, de cerca de 0,5 a 30 segundos, preferivelmente de cerca de cerca de 1 a 10 segundos. A potência, a frequência e o tempo são escolhidos de modo a não terem um efeito pernicioso sobre a amostra, os reagentes ou o rigor de um ensaio. A energia acústica é aplicada às gotas 14 no aparelho 10 por meio de um gerador de ondas acústicas, um altifalante ou análogos. O aparelho 10 inclui meios para medir um sinal produzido na gota 14 durante a realização do ensaio. Estes meios para medir um sinal, ou analisador, dependem do tipo de sinal produzido no ensaio, o que é abaixo descrito com maior detalhe. Em resumo, habitualmente o sinal é ou é produzido por radiação electromagnética e resulta de absorvância e dispersão de luz, fluorescência, quimioluminescência, ressonância de Raman, espectroscopia foto-acústica, electroluminescência, magnetização e análogos. Um destes 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 15

meios para medir um sinal é uma cabeça de leitura 34 situada no aparelho 10, de modo que a cabeça de leitura 34 possa examinar gotas 26 quanto à presença de um sinal. A cabeça de leitura 34 pode compreender uma fonte de luz, fotodetector. detector de onda acústica, um magnetómetro, um meio para provocar a electrólise da amostra e um fotodetector, um contador de cintilação ou análogos.

Nas Figs. 1 e 2, a cabeça de leitura 3 compreende uma porção superior ou reflector parabólico 35 que se situa directamente sobre uma porção do suporte 12 e compreende uma superfície reflectora 44. Um laser 42 comunica com a porção superior 35 por meio de uma fibra óptica 43. A cabeça de leitura 34 também compreende um tubo fotomultiplicador 40 que tem um obturador 41. O movimento da porção superior 35 verticalmente para o suporte 12 e a partir do mesmo é controlado por um braço 37 que, por sua vez, é controlado, por exemplo, por um solenoide (não representado).

Preferivelmente, o sinal é lido sem contactar mais as gotas 14. Todavia, a medição do sinal pode ser realizada puxando uma porção da gota 14 para dentro de uma câmara de leitura que está revestida com um líquido imiscível, como acima descrito. Quando o sinal é luz um sistema de lentes ou de tubo de luz apropriado pode ser incluído para recolher com alta eficiência a luz emitida por uma gota.

As amostras serão frequentemente, mas não se limitarão a, amostras de origem biológica e incluem fluidos corporais obtidos a partir do corpo de um mamífero. Os fluidos corporais são geralmente materiais líquidos ou semi-sólidos, podem ser estéreis ou não estéreis e podem conter células. O fluido corporal pode ser empregado sem mais tratamento ou pode ser tratado para retirar células, detritos e análogos. São exemplos de fluidos corporais o sangue completo, a linfa, o soro, o plasma, a saliva, o sémen e fluido cerebro-espinal. O fluido corporal pode ser retirado do corpo de um indivíduo, por exemplo, por uma seringa ou agulha, ou por expulsão natural. Outras amostras líquidas podem ser obtidas de materiais semi-sólidos ou sólidos por extracção de acordo com procedimentos conhecidos.

Amostras a serem analisadas pelo método do presente invento podem ser preparadas para separar ou lisear células, precipitar, hidrolisar ou desnaturar proteínas, hidrolisar lípidos, solubilizar objectos de análise ou semelhantes. Tal pré-tratamento pode incluir, sem limitação, centrifugação, o tratamento da amostra com um solvente orgânico, por exemplo, um álcool, preferivelmente um álcool que tenha menos de 7 átomos de carbono tal como o metanol, e tratamento com detergentes, agentes caotrópicos, hidróxido de sódio, etc.. De 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 16

acordo com isto, a expressão “amostra líquida” inclui as acima mencionadas juntamente com qualquer meio líquido produzido em resultado deste pré-tratamento e suspeito de conter um objecto de análise ou componente de interesse. Estes objectos de análise ou componentes de interesse podem incluir drogas de abuso, drogas terapêuticas, pesticidas, proteínas tais como imunoglobulinas, ácidos nucleicos e assim por diante. Os objectos de análise estão descritos com maior detalhe na patente U.S. N° 5,248.619 na coluna 6, linha 27, até à coluna 8, linha 6, cuja descrição é aqui incorporada como referência.

Os reagentes nas tinas 30 e 32 são escolhidos com base no tipo de ensaio a ser realizado. A menção de apenas dois reagentes é feita somente a título de exemplo e não pretende ser uma limitação. O número de reagentes pode ser maior ou menor conforme o formato particular de ensaio utilizado. Os dispositivos do presente invento podem ser adaptados à maioria dos ensaios que precisam de radiação electromagnética para a detecção incluindo ensaios que envolvem membros de um par de ligação específico (p.l.e.). Os ensaios podem ser competitivos ou em sanduíche, mas não precisarão de que sejam feitas separações no aparelho 10. A reacção imunológica para um ensaio do tipo sanduíche envolve habitualmente um membro p.l.e. que está ligado a um marcador e a amostra. Num protocolo competitivo, o marcador pode ser associado com um membro p.l.e. que seja análogo ao objecto de análise a ser determinado na amostra. O reagente que contém o marcador, e.g., o membro p.l.e. ligado a um marcador é denominado reagente marcado. O marcador pode não estar ligado a um elemento p.l.e. que seja complementar de um objecto de análise. Pelo contrário, o reagente pode ter um membro p.l.e. que permita ao marcador vir a ficar ligado ao membro p.l.e. ligado a um objecto de análise e, portanto, é capaz de ser marcado. Vários materiais acessórios serão frequentemente empregados num ensaio em que se empregue o presente invento. Consequentemente, os reagentes líquidos podem incluir tampões bem como estabilizadores para os componentes do meio de ensaio para os componentes do ensaio e para os passos de lavagem se necessários. Frequentemente, na adição destes aditivos podem ser incluídas proteínas tais como albuminas, ou agentes tensioactivos, particularmente agentes tensioactivos não-iónicos, promotores de ligação, e.g., polialquilenoglicóis ou análogos.

Depois da amostra e os reagentes terem sido combinados, estes podem, se desejado, ser incubados. Os membros p.l.e. são depois activados e o sinal resultante é medido. Por exemplo, se os membros p.l.e. são um marcador de enzima e o seu substrato, o substrato é adicionado e o sinal produzido é relacionado com a quantidade de objecto de análise na amostra ensaiada. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 17

Para uma discussão mais detalhada das técnicas de ensaio imunológicas a que o presente invento pode ser aplicado ver "Enzyne-Imunoassay", de Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Ver também, por exemplo as patentes U.S. Nos 3,690,834; 3,791,932; 3,817,837; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; e 4,098,876, listagem esta que não pretende ser exaustiva. O sinal vindo do marcador pode ser detectável directamente tal como com um marcador radioactivo. Por outro lado, o marcador pode ser parte de um sistema produtor de sinal (s.p.s.) que pode ter um ou mais componentes, sendo pelo menos um componente o marcador. O s.p.s. gera um sinal detectável que relaciona a quantidade de marcador ligado ou não ligado, i.e., a quantidade de marcador ligado ou não ligado ao objecto de análise que é detectado ou a um anticorpo contra este objecto de análise. Desta maneira, a quantidade de sinal é relacionado com a presença ou quantidade do objecto de análise na amostra. Podem ser empregados calibradores ou padrões contendo quantidades predeterminadas de objecto de análise, para auxiliar a relacionar a quantidade de sinal com a presença ou a quantidade de objecto de análise. O s.p.s. inclui todos os reagentes necessários para produzir um sinal detectável. Existem numerosos sistemas por meio dos quais o marcador pode produzir um sinal detectável, por exemplo, radiação magnética, calor, reagentes químicos, e semelhantes. O marcador pode produzir directamente um sinal, i.e., não são precisos reagentes adicionais para produzir um sinal. Por exemplo, numerosas moléculas orgânicas são capazes de absorver luz ultravioleta e visível, transferindo a absorção de luz para estas moléculas e elevando as mesmas até um estado de energia excitada. A energia absorvida é depois dissipada por emissão de luz com um segundo comprimento de onda. Por exemplo, moléculas fluorescentes são capazes de absorver luz com um comprimento de onda e de emitir luz com um segundo comprimento de onda. As moléculas fluorescentes apropriadas incluem fluorosceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, fícocianina, alofícocianina, o-ftaldeído e fluorescamina. Um grande número de exemplos de produtores de fluorescência são indicados por Litman, et al., patente U.S. N° 4,275,149, colunas 30 e 31, cuja descrição é aqui incorporada como referência. Outros exemplos de marcadores que podem produzir directamente um sinal são os isótopos radioactivos como o Il2\ ο I131, o C14, ο Η3, o Co37, o Se73, o P32, o S33 e análogos e corantes que são conhecidos na arte.

Altemativamente, os marcadores também podem precisar de outros reagentes para. produzir um sinal. Portanto, o sistema produtor de sinal inclui todos os reagentes necessários para produzir um sinal mensurável. Outros componentes do sistema produtor de sina incluem 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ

1S

substratos, co-enzimas, ampliadores, segundos enzimas, activadores, co-factores, inibidores, purificadores, iões metálicos, substâncias de ligação específica necessária para a ligação de substâncias geradoras de sinal e análogos. Alguns reagentes químicos como os co-enzimas, substâncias que reagem com produtos enzimáticos, outros enzimas e catalisadores, e análogos, podem ser ligados a outras moléculas ou a um suporte.

Uma grande variedade de catalisadores não enzimáticos que podem ser empregados encontram-se na patente U.S. N° 4.160,645 de UUman, cujas porções apropriadas são aqui incorporadas como referência.

Pode ser empregado um enzima ou co-enzima que proporcione a desejada amplificação produzindo um produto que absorve luz. e.g.. um corante, ou que emite luz após irradiação, e.g., um produtor de fluorescência. Altemativamente, a reacção catalítica pode dar lugar à emissão directa de luz, e.g., quimioluminescência. Um grande número de enzimas e co-enzimas para proporcionar tais produtos são indicados por Litman, et al., na patente U.S. N 4,275,149, colunas salteadas de 19 a 23. e Boguslaski, et al., na patente U.S. N° 4,318,980, colunas 10 a 14, cujas descrições são aqui incorporadas como referência.

Os compostos quimioluminescentes também são apropriados como marcadores citando-se, a título de ilustração e não de limitação, o luminol, o isoluminol, os ésteres aromáticos de acridínio, o imidazolo, éster de oxalato e análogos. Numerosos produtores de quimioluminescência são referidos por Litman, et al., na patente U.S. 4,275,149, coluna 31, cuja descrição é aqui incorporada como referência. Os produtores de quimioluminescência também podem ser usados em conjunto com foto-sensibilizadores, tais como estão descritos no documento U.S. n° de série 07/704,569, depositado em 22 de Maio de 1991, com o título “Assay Method Utilizing Induced Luminescence", cuja descrição é aqui incorporada como referência.

Um método particular para gerar um sinal em ensaios realizados de acordo com o presente invento está descrito no pedido de patente U.S. n° de série 07/704,569, depositado de 22 de Maio de 1991 (Ullman, et al.) sendo a descrição do mesmo que interessa, aqui incorporada como referência. O método compreende o tratamento da mistura reaccional sujeita de conter o objecto de análise sob condições tais que o objecto de análise, se presente, obriga um foto-sensibilizador e um composto quimioluminescente a ficarem em apertada vizinhança. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 19

Ο foto-sensibilizador gera um singleto de oxigénio e activa o composto quimioluminescente quando este está muito próximo. O composto quimioluminescente activado produz luz subsequentemente. A quantidade de luz produzida é relacionada com a quantidade de objecto de análise no meio. Mais particularmente, tal como é aplicado ao presente invento, o método, numa concretização, inclui como primeiro passo proporcionar uma combinação que compreende o supramencionado meio suspeito de conter o objecto de análise ligado a uma partícula que também tem um composto quimioluminescente associado com a partícula, um foto-sensibilizador associado com um membro de um par de ligação específica (p.l.e.) capaz de se ligar ao objecto de análise. A combinação é habitualmente tratada por irradiação com luz para excitar o foto-sensibilizador que, no estado de excitado, é capaz de activar oxigénio até um estado de singleto. A combinação é depois examinada quanto à quantidade de luminescência é relacionada com a quantidade do objecto de análise no meio. Altemativamente, o composto quimioluminescente é associado com um membro de um p.l.e. capaz de ligar o objecto de análise e a partícula a que o objecto de análise está ligado é associada com um foto-sensibilizador.

Depois de incubações apropriadas, as gotas 14 passam por uma cabeça de leitura 34, onde o sinal gerado é determinado. O aparelho do presente invento pode ser fechado dentro de uma caixa para o proteger durante a utilização e armazenagem. Estas caixas são bem conhecidas na arte e podem ser de qualquer modelo consistente com a função e a utilização do presente aparelho. Além disso, as peças móveis do aparelho são geralmente controladas por diversos suportes lógicos, para proporcionar as funções desejadas tais como a programação do suporte 12, a aspiração e distribuição de líquidos, a coordenação de outras peças do aparelho 10 e análogos. O presente aparelho pode incluir meios para controlar a temperatura interior de modo a serem obtidas temperaturas adequadas de incubação e análogos. Estes meios incluem vários mecanismos de equipamento e arrefecimento que são convencionais na arte.

Num protocolo preferido para ensaios realizados de acordo com o presente invento e que empregam um volume total de líquido inferior a 50 microlitros, a ponta da pipeta 22 é humedecida primeiramente forçando alguns microlitros de um líquido imiscível através da ponta. O liquido imiscível é mantido num depósito 27 e é fornecido à pipeta 22 por meio de uma válvula no tubo 29. Qualquer excesso de líquido imiscível pode ser distribuído na superfície de suporte 12. Depois, o líquido imiscível é reposto para humedecer a ponta da 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 20

pipeta e vários microlitros de um reagente líquido vindo da tina 32 são puxados seguidos, caso se queira, da aspiração de alguns microlitros de uma amostra líquida a partir da tina 28 ou de um segundo reagente líquido vindo da tina 32. Habitualmente, quando é aspirado um segundo reagente ou a amostra é introduzida uma pequena bolha de ar entre os dois líquidos por aspiração de uma pequena quantidade de ar. Os dois líquidos são depois distribuídos sobre a superfície de suporte 12. Altemativamente, o volume menor de líquido a ser usado é distribuído directamente sobre a superfície e o segundo líquido é depois aspirado e distribuído por cima da gota do primeiro liquido. Geralmente, as pontas das pipetas 22 e 24 são humedecidas com o líquido imiscível antes de cada aspiração e distribuição de líquido, tirando o líquido imiscível do depósito 27. As gotas podem ser postas sobre o suporte em qualquer local, desde que os bordos do suporte não interfiram com a retenção sem recipiente das gotas antes, durante ou depois da mistura dos líquidos de acordo com o invento. Algumas vezes pode ser preferível localizar as gotas sobre o suporte, de modo a maximizar a consistência dos resultados de um ensaio e evitar resultados anómalos. A seguir, é accionado um campo eléctrico para misturar os líquidos na gota 14. Depois de se misturar os líquidos, a mistura em ensaio é deixada incubar durante 0,5 a 30 minutos. Outros reagentes líquidos podem ser adicionados durante este período ou uma parte alíquota da mistura pode ser tirada com uma ponta de pipeta e posta noutra porção da superfície. Pode então ser posto outro reagente no cimo desta nova gota e a combinação ser novamente misturada como acima se descreveu. Durante todo este tempo, o suporte 12 está a deslocar-se gradualmente de uma caixa extrema adjacente 16 para a outra caixa extrema adjacente 18. Todos os passos anteriores são programados de uma maneira apropriada. A seguir a todos os passos de mistura e incubação, um sinal produzido durante o ensaio em consequência da presença ou da ausência de um objecto de análise na amostra líquida, é lido por meio de uma cabeça de leitura 34. Por exemplo, quando o sinal é uma radiação electromagnética como acontece com um marcador fluorescente ou quimioluminescente, geralmente a mistura em ensaio é irradiada e a quantidade de luz emitida é medida. Para esta finalidade, algumas vezes é útil que a superfície do suporte tenha um revestimento reflector para auxiliar a recolha da luz. Este revestimento reflector pode ser, por exemplo, um. Mylar aluminizado, disponível no comércio. O suporte 12 continua a deslocar-se para ser recolhido dentro da caixa 18 para ser deitado fora. Como acima se mencionou, está dentro do âmbito do presente invento, usar um suporte que possa ser cortado, retido ou distribuído de uma maneira segura. Embora tenham sido descritos meios de distribuição da amostra líquida, meios de distribuição de reagente e meios de remoção de líquido independentes, estas funções podem ser diversamente

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ combinadas de maneiras convencionais conforme a aplicação em causa. Por exemplo, podia ser usado um único mecanismo de pipetagem para distribuir a amostra e os reagentes conforme fosse preciso e também para retirar o líquido do suporte 12 no fim de um ensaio caso se quisesse. Várias modificações deste sistema ilustrativo serão evidentes para aplicações e instrumentação especiais, que podem incluir uma diversidade de sistemas de detecção de substâncias para a detecção e/ou medição de materiais nos líquidos.

Na Fig. 3 está representado outro dispositivo de acordo com o presente invento. O aparelho 50 compreende um suporte 52 para sobre o mesmo serem depositadas gotas de líquido 54. O suporte 52 é sensivelmente plano e geralmente impermeável aos líquidos depositados. Na Fig. 3, o suporte 52 tem a forma de uma fita flexível que está na caixa 56 e é recolhida pela caixa 58, o que proporciona o transporte através do aparelho. O aparelho 50 compreende também meios de distribuição de líquido, tais como as pipetas 62 e 64 para distribuir amostra e reagentes líquidos sobre a superfície de suporte 52 na forma de gotas 54. Como com o aparelho descrito na Fig. 1, é conveniente manter as pontas das pipetas 62 e 64 humedecidas com um líquido que é imiscível com o líquido a ser distribuído. As pipetas 62 e 64 comunicam com um depósito 67 por meio de tubos 82 e 84, e são assistidas por òombas 63 e 65. O depósito 67 contém um líquido que é imiscível com o líquido a ser distribuído. A pipeta 62 comunica com as tinas 68 que contêm as amostras a serem ensaiadas, as quais são transportadas passando pela pipeta 62. As tinas 68 são suportadas por um carrocei 66 que pode girar intermitentemente ou ser programado para apresentar cada amostra com um intervalo predeterminado. A programação do carrocei 66 é coordenada com a programação do suporte 52, o qual pode estar programado como acima se descreveu para a Fig. 1. O aparelho 50 também tem recipientes descartáveis de reagente 70 e 72 que contêm os reagentes para a realização do ensaio. A pipeta 62 comunica com o recipiente 70 por meio do tubo 69 e da bomba 78. A pipeta 64 comunica com o recipiente de reagente 72 por meio do tubo 71 e da bomba 80. A comunicação é programada de modo a coordenar-se com a programação do movimento do suporte 52.

Os números 1 a 4 dentro das gotas na Fig. 3 identificam gotas contendo o reagente (gota número 1), o reagente 2 (gota número 3), amostra e reagente (gota número 2) e a combinação dos reagentes 1 e 2 com a amostra (gota número 4). Na Fig. 3, as pipetas 62 e 64 não só distribuem amostra e reagentes como gotas 54 como acima se mencionou, como também tomam partes alíquotas precisas de cada gota 1-3 e distribuem estas partes, alíquotas para formar a gota número 4. Altemativamente as pipetas 62 e 64 distribuem partes alíquotas precisas de reagentes e amostra directamente para formar a gota número 4 (concretização não representada). Num aparelho típico de acordo com o presente invento, os recipientes 70 e 72

85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 22 são apenas dois de uma pluralidade destes recipientes, pluralidade esta que tem, por exemplo, a forma de uma roda, dá uma placa de vaivém ou análogos para proporcionar todos os reagentes necessários para realizar ensaios para uma multiplicidade de objectos de análise.

Evidentemente, está dentro do âmbito do presente invento ter recipientes 70 e 72 que depositam directamente os reagentes sobre o suporte 52 como gotas números 1 e 3 respectivamente. Neste caso, ambos os recipientes 70 e 72 estão equipados com meios de pipetagem para distribuir os respectivos conteúdos como gotas sobre o suporte 52. O aparelho 50 também compreende meios 76 para misturar a amostra líquida e os reagentes líquidos nas gotas 54 (gotas número 4) de acordo com o presente invento. Nesta concretização os meios 76 são um gerador de ondas acústicas para a aplicação de energia acústica às gotas 54. A cabeça de leitura 54 está posicionada no aparelho 50 de modo que possa examinar as gotas 54 (gotas número 4) quanto à presença de um sinal.

Exemplos O invento vai ainda ser esclarecido através do seguinte Exemplo elucidativo, que não deve ser considerado como uma limitação ao âmbito do presente invento. Percentagens e partes são ponderais, excepto quando indicadas de outro modo.

Exemplo 1

Ensaio de digoxina

No presente Exemplo, o método é um ensaio imunológico homogéneo de soro de sangue humano quanto à presença da droga digoxina. O método, que foi automatizado de acordo com o presente invento, é semelhante ao descrito no pedido de patente U.S. n° de série 08/156,181, depositado em 22 de Novembro de 1993 (Singh, et al.) cujas partes interessantes são aqui incorporadas como referência, especialmente quanto à preparação de geradores de quimioluminescência e foto-sensibilizadores e de contas de látex contendo um gerador de quimioluminescência ou foto-sensibilizador e quanto à maneira de realizar um ensaio usando estas contas.

Em referência às Figs. 1, 2 e 4, dois reagentes são pré-carregados em dois receptáculos na caixa 30 que está colocada sobre a plataforma 33, de tal modo que a pipeta 22 tem acesso a estes receptáculos. O reagente A é constituído por um tampão de pH8,2

t 85 542

EP 0 764 046 / PT (0,1M TRIS-HC1, 0,3M NaCl, 25 mM de tetra-acetato de etilenodiamina (EDTA), 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% de Dextran T-500 (R), 0,12% de Kathon (R) (um conservante comercializado por Rohm and Haas) e uma diluição a 1/320 de Reagente de Bloqueamento Heterófilo 1 (fabricado por Scantibodies Laboratory, Santee, Califórnia) com 120 pg/ml de partículas de látex suspensas na mesma. Estas partículas contêm um gerador de luminescência (tioxeno C-26 de Singh. et al., supra) e um quelato de európio, nomeadamente, Eu(TTA)3 de Singh, et al., supra, e tem anticorpos para a digoxina ligada à sua superfície por meio de uma ligação biotina-estreptavidina. O reagente B é constituído por um tampão (o mesmo do regente A) com 24 pg/ml de partículas de látex suspensas no mesmo. Estas últimas partículas foram preparadas de uma maneira semelhante à descrita por Singh et al., supra, e continham o foto-sensibilizador esquarato de tetradecilo (TDS) (preparado de maneira semelhante à descrita na patente U.S. N° 4,830,786) e tinham moléculas de digoxina ligadas à sua superfície. A amostra de soro estava contida no receptáculo 28, também acessível à pipeta 22. O suporte rígido 20 e a sua tampa 15 (ver Fig. 2) bem como os reagentes na caixa 30, foram mantidos a 32°C. As pontas de pipeta 19 e 21 foram enchidas com óleo de silicone do depósito 27, com uma viscosidade de 5x10"' nr/s (50 centistokes). As pontas eram essencialmente cilindros de polipropileno com um diâmetro interno de 1 mm, um diâmetro externo de 2 mm e um comprimento de 50 mm. A parede das pontas de pipeta era afunilada para baixo até um diâmetro externo de 1,5 mm nos últimos 4,5 mm do seu comprimento. A ponta de pipeta foi preparada para as transferências de fluido, distribuindo um ou dois microlitros de óleo de silicone para o suporte 12, que tinha a forma de uma fita. Este passo só era necessário no começo de uma passagem automatizada. O óleo de silicone era puxado do exterior da pipeta por forças capilares até uma altura de pelo menos 3 mm acima da extremidade aberta da ponta. A sequência das operações no ensaio foi a seguinte: A pipeta 22 era posta funcionar para puxar 2 μΐ de ar para dentro da sua ponta, que era depois colocada 2 mm abaixo da superfície do líquido no recipiente da caixa que contém o reagente A, e 20 μΐ desse líquido foi aspirado. A ponta de pipeta foi depois retirada do líquido e colocada sobre a posição 101 (ver Fig. 4) no suporte 12, em linha com a caixa de reagente 30 e o receptáculo de amostra 28. A ponta de pipeta foi baixada até uma altura de 1,5 mm acima do suporte 12 e o líquido, a bolha de ar e uma pequena quantidade de óleo de silicone foram depositados na posição 101 sobre a superfície do suporte 12. O volume total deitado para fora da pipeta era de 23 μΐ. A pipeta depois percorreu a mesma sequência de passos para depositar uma gota de reagente 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 24

Β na posição 102. Ο suporte 12 era uma película de Mylar D transparente, com 0,127 mm (0,005 polegadas) de espessura e 49,8 mm (1,96 polegadas) de largura. A pipeta aspirou 2 μΐ de ar e depois foi colocada de tal modo que a sua extremidade aberta penetrou na gota na posição 101 e estava a uma altura de 0,5 mm acima do suporte 12. A pipeta aspirou 15 μΐ do líquido na gota. A ponta foi retirada da gota e foram aspirados 2 μΐ de ar. A pipeta foi depois deslocada para o receptáculo 28 de amostra de soro e foi mergulhada 2 mm abaixo da superfície do líquido e foram aspirados por 3 μΐ de soro. A pipeta foi depois deslocada para a posição 103 e foi colocada 1,5 mm acima da superfície de suporte e foi distribuído um volume de 23 μΐ. Os dois volumes de líquido associavam-se numa gota à medida que eram depositados sobre o suporte, as bolhas de ar foram expulsas e um excesso de l μΐ de óleo de silicone foi distribuído sobre a gota. Um actuador misturador estava colocado exactamente por baixo do suporte 12 na posição 103 e em contacto com o mesmo. O actuador era obrigado a oscilar de aproximadamente 0,25 mm verticalmente segundo uma forma de onda quadrada a 800 Hz. A oscilação foi mantida durante 6 segundos para que o conteúdo da gota ficasse completamente misturada devido ao movimento oscilatório da superfície da gota. A reacção entre a digoxina no soro e o reagente A começou neste ponto. O suporte foi então avançado e também a correnteza de amostras e foi preparada uma segunda reacção. Quando a primeira mistura reaccional atingiu o local da pipeta 24, foi iniciada a segunda parte da reacção imunológica numa sequência de passos semelhante aos que iniciam o primeiro passo, e utilizando a pipeta 24 e somente os líquidos já presentes nas gotas sobre o suporte 12, 3 μΐ da mistura de soro e reagente A (vinda da posição 103) e 15 μΐ de reagente B da gota depositada inicialmente na posição 102 foram colocados na posição 104, relativa às três gotas originais. Um segundo actuador misturador, misturou a gota para que a reacção entre as partículas do reagente B e as partículas do reagente A pudesse começar.

Quando o suporte avançou segundo um ciclo rigorosamente atempado, a mistura na posição 104 atingiu a cabeça de leitura 34. O processo de leitura do sinal começou com um solenoide a accionar o braço 37 e a baixar sobre a gota uma campânula reflectora 35 cujos os bordos contactaram com o suporte estabelecendo uma vedação sensivelmente à prova de luz. Por baixo da gota e do suporte estava um cilindro oco reflector, um obturador electromecânico 141 e um tubo fotomultiplicador 40. Inicialmente, o obturador estava fechado. No cima da campânula reflectora estava a face extrema de uma fibra óptica 43 que conduzia luz vinda de um laser de díodo 42. O laser de díodo era ligado por um comando 25 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ computorizado através de uma fonte de alimentação externa (não representada nas Figs. 1, 2 ou 4). O laser era ligado por um segundo. Dez milisegundos depois o laser era desligado, o obturador era aberto durante um segundo e a luz emitida pela mistura reaccional era medida. Dez milisegundos depois do obturador ser fechado, o laser foi ligado novamente e o processo foi repetido. A luz total medida em seis ciclos de iluminação e detecção constituiu o sinal da amostra. O sinal foi comparado com o obtido usando controlos que tinham quantidades predeterminadas de digoxina. Desta maneira era determinada a quantidade de dioxina nas amostras. A Fig. 4 mostra as posições relativas das quatro gotas 101-104 criadas na análise de cada amostra num exemplo de utilização do método. Estas posições estão sobre o suporte móvel 12 e mudam de lugar em relação ao suporte fixo 20 à medida que o suporte 12 avança.

Por DADE BEHRING MARBURG GmbH - O AGENTE OFICIAL -

EMG.· ANTÓNIO JOÃO BA CUNHA FERRESRA Àg. Of. Pr. Ind.

Sae das Flores, 74 * 4·® ΐεοο LISBOA

Claims (20)

1. 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 1/5

   REIVINDICAÇÕES 1 - Método para misturar dois ou mais líquidos, compreendendo o referido método os passos de: (a) formar uma gota líquida (14) que contém os referidos dois ou mais líquidos sobre uma superfície (12), sendo a referida gota retida sem recipiente sobre a referida superfície, sendo a referida superfície sensivelmente impermeável à referida gota de líquido e não reactiva com a mesma; e (b) aplicar energia electrostática, energia acústica ou energia mecânica oscilatória às referidas gotas (14) misturando assim os referidos líquidos, caracterizado pelo facto de que a referida superfície (12) é sensivelmente plana e sensivelmente não elástica e de que a energia electrostática, acústica ou mecânica oscilatória é aplicada às referidas gotas (14), sem contacto físico com as referidas gotas além do que é exercido pela referida superfície.
2. 2 - Método para transportar amostras e reagentes líquidos através de um aparelho automático de análise (10) e para misturar a referida amostra e reagentes líquidos durante o referido transporte, compreendendo o referido método: deslocar uma superfície sensivelmente plana (12) de modo a passar por um ou mais tubos distribuidores de líquido (22, 24), que distribuem amostras e reagentes líquidos sobre a referida superfície para formar gotas de líquido (14) que compreendem cada uma amostra e reagentes, no qual as amostras e reagentes líquidos referidos são misturados de acordo com a reivindicação 1.
3. 3 - Método para misturar dois ou mais líquidos e para fazer ensaios quanto à presença ou à quantidade de um objecto de análise numa amostra suspeita de conter o referido objecto de análise, compreendendo o referido método: (a) deslocar uma superfície sensivelmente plana (12) de modo a passar por um ou mais tubos distribuidores de líquido (22, 24) que distribuem amostra e reagentes líquidos sobre a referida superfície para formar gotas de líquido (14) que incluem, cada uma amostra e reagentes, sendo um dos referidos reagentes um reagente marcado ou um reagente capaz de ser marcado, no qual a amostra e reagentes líquidos referidos são misturados de acordo com a reivindicação 1;

   (b) incubar as referidas gotas (14) sobre a referida superfície (12); e (c) detectar nas referidas gotas (14) sobre a referida superfície (12) a quantidade de sinal gerado, sendo a sua quantidade relacionada com a presença ou a quantidade do referido objecto de análise na referida amostra.
4. 4 - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, no qual a referida superfície (12) é uma tira flexível.
5. 5 - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, no qual a referida gota de líquido (14) é distribuída por um tubo distribuidor de líquido (22, 24) no qual o interior e o exterior de uma extremidade de entrada (19, 21) do referido tubo distribuidor de líquido é mantida humedecida com um líquido que é imiscível com o líquido a ser distribuído.
6. 6 - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, no qual o volume da referida gota de líquido (14) é inferior a 50 microlitros.
7. 7 - Método para misturar dois ou mais líquidos e para detectar luz proveniente de um meio líquido submetido a foto-activação, no qual o referido meio líquido compreende dois ou mais líquidos misturados de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o referido método os passos de: (a) aplicar o referido meio líquido a um suporte (12) sensivelmente plano e sensivelmente não elástico, sendo o referido meio líquido retido sem recipiente sobre o mesmo, sendo o referido suporte sensivelmente impermeável ao referido meio líquido e não reactivo com o mesmo; (b) posicionar o referido suporte (12) para que o referido meio líquido e o referido suporte fiquem entre duas superfícies reflectoras (44) que envolvem sensivelmente o referido meio líquido, tendo pelo menos uma das referidas superfícies uma abertura para que a luz emitida pelo referido meio líquido atinja um foto-detector que compreende um tubo fotomultiplicador (40) que tem um obturador (41); (c) submeter o referido meio líquido a foto-activação com o referido obturador fechado; e 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 3/5

   (d) abrir ο referido obturador (41) e detectar, por meio do referido tubo fotomultiplicador (40), a luz emitida pelo referido meio líquido.
8. 8 - Método de acordo com a reivindicação 7, no qual a referida luz emitida pelo referido líquido é a quimioluminescência.
9. 9 - Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, no qual o referido meio tem a forma de uma gota (14) sobre a referida tira transparente.
10. 10 - Método de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, no qual o referido suporte (12) é uma tira.
11. 11 - Aparelho para misturar dois ou mais líquidos, compreendendo o referido aparelho: (a) uma superfície (12) que é sensivelmente impermeável aos referidos líquidos e não reactiva com os mesmos; (b) um distribuidor (22, 24) para distribuir os referidos líquidos sobre a referida superfície (12) para formar uma gota (14), sendo a referida gota retida sem recipiente sobre a referida superfície (12), e (c) meios para obrigar a referida gota (14) a deformar-se sem deformar a referida superfície (12), misturando assim os referidos líquidos, sendo os referidos meios escolhidos no grupo constituído por energia acústica, energia electrostática e energia mecânica oscilatória, caracterizado pelo facto de que a referida superfície (12) é sensivelmente plana e sensivelmente não elástica e os referidos meios para obrigar a referida gota (14) a deformar-se são capazes de obrigar a referida gota a deformar-se sem haver contacto físico com os referidos líquidos além do exercido pela referida superfície.
12. 12 - Aparelho (10) para misturar dois ou mais líquidos e para analisar automaticamente uma pluralidade de amostras, compreendendo o referido aparelho de análise um aparelho misturador de acordo com a reivindicação 11 e um analisador para analisar as referidas gotas (14), no qual há um suporte rígido (20) para a referida superfície sensivelmente plana (12) e a referida superfície é móvel;

    85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ e ο referido distribuidor (22, 24) compreende uma ou mais sondas de distribuição de líquido (22, 24) para distribuir uma amostra e reagentes sobre a referida superfície (12) para formar uma gota ou gotas (14), superfície esta que é sensivelmente impermeável à gota e reagentes referidos e não reactiva com os mesmos e os referidos meios para causar a deformação da gota são não evaporativos e não distendem sensivelmente a referida superfície.
13. 13 - Aparelho de acordo com a reivindicação 12, no qual o referido analisador compreende: um fotodetector e duas superfícies reflectoras (44) posicionadas em relação à referida superfície móvel (12) de modo que cada uma das referidas gotas (14) fica entre as referidas superfícies reflectoras, que envolvem sensivelmente a referida gota, tendo pelo menos uma das referidas superfícies reflectoras uma abertura para a luz emitida pela referida gota atingir o referido fotodetector.
14. 14 - Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, no qual a referida superfície (12) é uma tira.
15. 15 - Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 13, no qual as referidas sondas de distribuição de líquido (22, 24) incluem meios para manter o interior e o exterior de uma extremidade de entrada (19, 21) das referidas sondas de distribuição de líquido humedecida com um líquido que é imiscível com o líquido a ser distribuído.
16. 16 - Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 15, no qual os referidos meios não evaporativos provocam a vibração da referida gota (14).
17. 17 - Aparelho de acordo com a reivindicação 16, no qual a referida vibração é provocada por energia acústica com frequências sónicas ou subsónicas.
18. 18 - Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 15, no qual os referidos meios não evaporativos são um campo eléctrico variável aplicado à referida gota (14).
19. 19 - Dispositivo (10) para misturar dois ou mais líquidos e para detectar luz vinda de . um meio líquido submetido a foto-activação, no qual o referido dispositivo compreende um 85 542 ΕΡ Ο 764 046 / ΡΤ 5/5 aparelho para misturar dois ou mais líquidos de acordo com a reivindicação 11, no qual a referida superfície (12) é transparente e o referido dispositivo inclui ainda: (a) um fotodetector que compreende um tubo fotomultiplicador (40) que tem um obturador (41); e (b) duas superfícies reflectoras (44) posicionadas, em relação à referida superfície transparente (12), de tal modo que um meio aplicado à referida superfície transparente (12) fica entre as referidas superfícies reflectoras (44) que envolvem sensivelmente o referido meio, tendo pelo menos uma das referidas superfícies reflectoras (44) uma abertura para a luz emitida pelo referido meio atingir o referido fotodetector, sendo o referido meio retido sem recipiente sobre a referida superfície transparente (12).
20. 20 - Dispositivo de acordo com a reivindicação 19, no qual a referida superfície transparente (12) é uma tira. Lisboa, 27. £:.T. Por DADE BEHRING MARBURG GmbH - O AGENTE OFICIAL -